TY - THES A1 - Müller-Marschhausen, Katharina T1 - Einfluss von hydrostatischem Druck auf die Integrität des endothelialen Zellverbands T1 - Physiological hydrostatic pressure affects endothelial monolayer integrity N2 - Endothelzellen kleiden als einschichtiger Zellverband die Blutgefäße aus und bilden so eine Barriere zwischen Blut und Interstitium. Der Austausch von Flüssigkeit und Makromolekülen über diese Barriere wird durch die transzelluläre und parazelluläre Permeabilität reguliert. Die parazelluläre Permeabilität ist von der Integrität der interzellulären endothelialen Junktionen abhängig. Eine Schwächung der Adhäsion und Öffnung der Tight Junctions bedingt unweigerlich einen Anstieg der Permeabilität, die bei verschiedenen pathologischen Bedingungen, z.B. inflammatorischen Ödemen und allergischem Schock, lebensbedrohlich werden kann. Unter physiologischen Be-dingungen ist das Endothel verschiedenen mechanischen Stimuli wie Scherstress durch den Blutfluß, zyklischer Dehnung durch die Wandspannung und hydrostatischem Druck durch den Blutdruck ausgesetzt. Da die Effekte des hydrostatischen Drucks auf die Biologie der Endothelzelle weitgehend unverstanden sind, sollte in der vorliegenden Arbeit der Einfluss des physiologischen hydrostatischen Drucks auf die Integrität des endothelialen Zellverbands näher untersucht werden. Sowohl in mikrovaskulären Endothelzellen als auch in makro-vaskulären Endothelzellen wurde gefunden, dass hydrostatischer Druck von 5-15 cmH2O, wie er typischerweise in Blutkapillaren in vivo herrscht, einen protektiven Einfluss auf die Endothelbarriere gegenüber permeabilitätssteigernden Einflüssen vermittelt. Es konnte gezeigt werden, dass eine extrazelluläre Depletion von Ca2+ durch EGTA zu einem Verlust von VE-Cadherin aus den endothelialen Junktionen mit Lückenbildung zwischen den Zellen führt (dargestellt durch Immunfluoreszenz) und dass dieser Effekt durch die gleichzeitige Applikation eines hydrostatischen Drucks von 15 cmH2O weitgehend verhindert werden konnte. Auch die durch Cytochalasin D induzierte Actindepolymerisation und interzelluläre Lückenbildung sowie die Dissoziation der Zellkontakte und Zellablösung nach Zugabe des Ca2+/Calmodulin-Antagonisten Trifluperazin und die Thrombin-induzierte Zelldissoziation konnten durch gleichzeitige Druckexposition von 15 cmH2O inhibiert werden. Darüberhinaus konnte mit Hilfe der Laserpinzetten-Technik gezeigt werden, dass hydrostatischer Druck die Haftung von mit VE-Cadherin beschichteten Mikroperlen an der endothelialen Zelloberfläche sowohl in Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ als auch unter Einfluss von Cytochalasin D und Trifluperazin nahezu unvermindert ermöglichte, während ohne hydrostatischen Druck die Mikroperlen unter diesen Bedingungen (Ca2+-Depletion, Cytochalasin D, Trifluperazin) nicht mehr hafteten. Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde untersucht, welche Mechanismen an den druckvermittelten Signalwegen beteiligt sein könnten. Es ist bekannt, dass cAMP und auch die Mitglieder der Rho-GTPasen-Familie Endothelbarriere-stabilisierende Funktionen haben. Es konnten jedoch keine signifikanten Veränderungen der cAMP-Konzentrationen sowie der Rho A- und Rac 1-Aktivität in makrovaskulären Endothelzellen unter hydrostatischem Druck von 15 cmH2O innerhalb von 45 Minuten nachgewiesen werden. Da Caveolin-1 in der Literatur eine Rolle in der Mechanotransduktion von zyklischer Dehnung und Scherstress zugesprochen wird, wurden im Labor generierte Endothelzellen aus Caveolin-1-defizienten Mäusen untersucht. Caveolin-1 stabilisiert plasmalemmale Invaginationen, die Caveolae, die eine Vielzahl an Molekülen mit signalgebenden und -weiterleitenden Funktionen beherbergen. In Caveolin-1-defizienten Endothelzellen war hydrostatischer Druck nicht in der Lage eine Destabilisierung des endothelialen Zellrasens durch Cytochalsin D, Trifluperazin und EGTA zu unterdrücken. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass ein physiologischer hydrostatischer Druck zur Erhaltung der endothelialen Integrität und ihrer Barrierefunktion beiträgt und Caveolin-1-vermittelte Mechanismen bei der Mechanotransduktion des hydrostatischen Drucks eine Rolle spielen. N2 - Endothelial monolayer integrity is required to maintain endothelial barrier functions and has found to be impaired in several disorders like inflammatory edema, allergic shock, or artherosclerosis. Under physiologic conditions in vivo, endothelial cells are exposed to mechanical forces such as hydrostatic pressure, shear stress, and cyclic stretch. However, insight into the effects of hydrostatic pressure on endothelial cell biology is very limited at present. Therefore, in this study, we tested the hypothesis that physiological hydrostatic pressure protects endothelial monolayer integrity in vitro. We investigated the protective efficacy of hydrostatic pressure in microvascular myocardial endothelial (MyEnd) cells and macrovascular pulmonary artery endothelial cells (PAECs) by the application of selected pharmacological agents known to alter monolayer integrity in the absence or presence of hydrostatic pressure. In both endothelial cell lines, extracellular Ca(2+) depletion by EGTA was followed by a loss of vascular-endothelial cadherin (VE-caherin) immunostaining at cell junctions. However, hydrostatic pressure (15 cmH(2)O) blocked this effect of EGTA. Similarly, cytochalasin D-induced actin depolymerization and intercellular gap formation and cell detachment in response to the Ca(2+)/calmodulin antagonist trifluperazine (TFP) as well as thrombin-induced cell dissociation were also reduced by hydrostatic pressure. Moreover, hydrostatic pressure significantly reduced the loss of VE-cadherin-mediated adhesion in response to EGTA, cytochalasin D, and TFP in MyEnd cells as determined by laser tweezer trapping using VE-cadherin-coated microbeads. In caveolin-1-deficient MyEnd cells, which lack caveolae, hydrostatic pressure did not protect monolayer integrity compromised by EGTA, indicating that caveolae-dependent mechanisms are involved in hydrostatic pressure sensing and signaling. KW - Endothel KW - hydrostatischer Druck KW - VE-Cadherin KW - endothelium KW - VE cadherin Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52039 ER - TY - THES A1 - Elfeber, Katrin T1 - Immunologischer Nachweis des Natrium-Glukose-Kotransporters SGLT1 im mikrovaskulären System des Gehirns, des Herzens und des Skelettmuskels T1 - Immunological evidence for the location of the sodium/glucose cotransporter SGLT1 in the microvascular system of brain, heart and sceletal muscle N2 - Glukose ist einer der Hauptenergielieferanten der Säugetierzellen. Aus diesem Grund wird die Glukoseaufnahme durch erleichterte Diffusion durch die GLUT (SLC2) Familie, sowie durch die Familie der sekundär aktiven Transporter SGLT (SLC5A) gesichert. In dieser Arbeit wurde ein polyklonaler Antikörper gegen SGLT1 aus Kaninchen hergestellt. Dieser Antikörper wurde für die Innunhistologie sowie für Western blots eingesetzt. Man sah eine Anfärbung von Bürstensaummembranen an Dünndarm- und Nierentubulusepithelzellen, aber in diesen Geweben nicht an Mikrogefäßen. Darüberhinaus konnten wir SGLT1 an der basolateralen Membran von Speicheldrüsenazini sehen, auch hier konnten wir SGLT1 in den Kapillaren nicht sehen. Überraschenderweise konnte SGLT1 in der Blut-Hirn-Schranke nachgewiesen werden. Auch konnte man die Lokalisation von SGLT1 in den Kapillaren des Herzens und des Skelettmuskels zeigen. Die physiologische und pathophysiologische Bedeutung dieser Lokalisationen liegt noch im Unklaren. N2 - Glucose is one of the main energy sources of mammalian cells. Therefore glucose uptake is complicatedly regulated by facilated glucose uptake via transporters of the GLUT (SLC2) family and secondary active transporters of the SGLT (SLC5A) family. For this work, a polyclonal antibody against rat SGLT1 was raised in rabbits. This antibody was used in immunohistochemistry and western blots. Brush border membranes of small intestine and kidney epithelial cells were stained, but no microvessels in these tissues. Futhermore we could see SGLT1 in the basolateral membrane of the acini of salivary glands, here we could not dectect SGLT1 in capillary endothelial cells. Surprisingly we were able to detect SGLT in the blood-brain-barrier. We were also able to show the location of SGLT1 in the capillaries of heart and sceletal muscle. The physiologial and pathophysiological impact of this locations remains to be determined. KW - Glukose KW - Endothel KW - Gehirn KW - Herz KW - Muskel KW - glucose KW - endothelium KW - brain KW - heart KW - muscle Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19221 ER - TY - THES A1 - Wiegand, Johannes Tobias Martin T1 - Einfluß der extrazellulären Ca2+-Konzentration und des Aktinfilamentsystems auf die homophile Interaktion von VE-Cadherin T1 - Modulation of the homophilic interaction of VE-cadherin by cytoskeleton tethering and free Ca2+-concentration N2 - Die Barriereeigenschaften des Gefäßendothels werden durch Verschluß- und Adhärenskontakte vermittelt. Das Ca2+-abhängige Zelladhäsionsmolekül VE-Cadherin vermittelt in Adhärenskontakten die Adhäsion benachbarter Endothelzellen. Es wurde vermutet, daß die extrazelluläre Ca2+-Konzentration und das intrazelluläre Aktinfilamentsystem die Adhäsionseigenschaften von VE-Cadherin verändern können. Daher wurden diese Einflußfaktoren mit Hilfe der Laserpinzetten-Technik untersucht. Hierzu wurden Latex-Mikroperlen mit rekombinanten VE-Cadherin-Fc-Molekülen beschichtet, die damit an VE-Cadherin-Moleküle von Endothelzellen binden und Zell-Zell-Kontakte simulieren konnten. Es zeigte sich, daß die ausschließlich durch VE-Cadherin vermittelte Interaktion zwischen Mikroperlen und Endothelzellen direkt von der extrazellulären Ca2+-Konzentration abhängig war und sich durch eine s-förmige Titrationskurve beschreiben ließ: Die Bindungshäufigkeit der Mikroperlen war bei Ca2+-Konzentrationen nahe 0,0 mM gering (26-27 %), nahm ab 0,8 mM stark zu (38 %) und erreichte bei 1,8 mM ein Maximum (65 %). Halbmaximale Bindung (KD) wurde bei 1,1 mM Ca2+ erreicht. Die Bindung war hochkooperativ (Hill Koeffizient nH = 4,6). Um die Eigenschaften des Aktinfilamentsystems zu verändern, wurden die Zellen mit Cytochalasin B, Cytochalasin D und dem Ca2+-Ionophor A 23187 inkubiert. Dabei nahm die Bindungshäufigkeit der Mikroperlen deutlich gegenüber Kontrollbedingungen ab. Es wurde gefolgert, daß ein intaktes Aktinfilamentsystem unmittelbar die Interaktion zwischen VE-Cadherin-Molekülen stärkte. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern damit neue Erkenntnisse über die Eigenschaften von VE-Cadherin: Die Adhäsion dieses Moleküls wird im physiologischen Ca2+-Bereich reguliert und ist direkt von einem intakten Aktinfilamentsystem abhängig. Es ist vorstellbar, daß die durch VE-Cadherin vermittelten Barriereeigenschaften des Endothels in vivo durch ähnliche Mechanismen reguliert werden. Ein Abfall der Ca2+-Konzentration im Interzellularspalt unter den für die Adhäsion kritischen Wert von 1,1 mM könnte durch Agonist-vermittelte Öffnung von Ca2+-Kanälen erfolgen. Eingeströmtes Ca2+ könnte seinerseits über Aktivierung von Gelsolin zur Fragmentation von Aktinfilamenten führen und so die Adhäsion weiter schwächen. N2 - The vascular endothelium is the primary barrier between the blood compartment and the bodies interstitium. Its barrier function is mediated by tight junctions and adherens junctions. The calcium dependent cell adhesion molecule VE-cadherin is responsible for cell-cell adhesion in adherens junctions. Assuming that the extracellular calcium concentration and the intracellular actin filament system can influence the adhesion properties of VE-cadherin these variables were investigated using the laser tweezer technique. Therefore, polystyrene beads were coated with purified recombinant VE-cadherin-Fc molecules, which could bind to endothelial VE-cadherin and simulate cell-cell contacts. The solely VE-cadherin mediated interaction between polystyrene beads and endothelial cells was directly dependent on the extracellular calcium concentration. It was low at extracellular calcium concentrations close to 0,0 mM (26-27 %), increased with rising calcium concentrations (38 % at 0,8 mM) and reached a maximum at 1,8 mM calcium (65 %). Semi-maximum binding (KD) was achieved at 1,1 mM calcium. The interaction was highly cooperative (Hill-coefficient nH= 4,6). The properties of the actin filament system were influenced incubating the endothelial cells with cytochalasine B, cytochalasine D and with the calcium ionophor A 23187. In presence of these substances the VE-cadherin mediated binding between polystyrene beads and cells obviously decreased. Therefore, an intact actin cytoskeleton seems to directly strengthen the interaction between VE-cadherin molecules. Taken together these results demonstrate that the interaction between VE cadherin molecules is regulated within physiological calcium concentrations und directly dependent on an intact actin cytoskeleton. It is possible that similar regulation mechanisms are present in vivo. A decrease of the extracellular calcium in the intercellular cleft below the critical concentration of 1,1 mM could be caused by an agonist mediated opening of calcium channels. The calcium influx could lead to an actin fragmentation via the protein gelsolin and further weaken the cellular adhesion. KW - VE-Cadherin KW - Zelladhäsion KW - Adhärenskontakte KW - Endothel KW - VE-cadherin KW - cell adhesion KW - adherens junction KW - endothelium Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3386 ER - TY - THES A1 - Dziewior, Frank T1 - Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration in Gefäßendothelzellen unter rheologischer Beanspruchung T1 - Measurement of intracellular Ca2+-concentration in vessel endothelial cells subjected to rheological demand N2 - Die den Zellstoffwechsel und das Zytoskelett betreffenden Adaptationsvorgänge in Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung sind von besonderem klinischen Interesse, da Gefäßwandschäden eine entscheidende pathogenetische Relevanz bei der Entstehung vaskulärer Erkrankungen wie z.B. der Arteriosklerose zukommt. Der intrazelluläre Signalweg, über den die Zelle einen rheologischen Reiz in eine entsprechende Zellantwort umsetzt, ist bisher weitgehend ungeklärt geblieben, wobei eine Erhöhung der zytosolischen Calciumkonzentration als Signalgeber diskutiert wurde. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen Messplatz zu etablieren, der es gestattet, Veränderungen in der zytosolischen Calciumkonzentration in kultivierten Endothelzellen nach Applikation von Ca2+-erhöhenden Agonisten, Calciumionophoren sowie während rheologischer Beanspruchung in Echtzeit zu dokumentieren. Die Eignung des verwendeten rheologischen Systems für Scherstressexperimente konnte durch die Beobachtung der für Endothelzellen unter rheologischer Beanspruchung typischen zytoskelettalen Umbauvorgänge im Sinne einer Neuordnung der Aktinfilamente mit der Ausbildung von Stressfasern gezeigt werden. Erstmalig konnte dabei auch die Reaktion mikrovaskulärer Endothelzellen der MyEnd-Zelllinie der Maus auf Scherstressbeanspruchung gesehen werden. Bei diesen Zellen konnte eine Vermehrung des F-Aktin-Gehaltes beobachtet werden, im Gegensatz zu kultivierten Endothelzellen des Truncus pulmonalis des Hausschweins blieb aber eine signifikante Bildung von Stressfasern aus. Diese unterschiedliche Verhalten ist wahrscheinlich der andersartigen Zellmorphologie der MyEnd-Zellen zuzuschreiben. Es konnte in zwei verschiedenen Endothelzellsystemen gezeigt werden, daß Gefäßendothelzellen den Kontakt mit verschiedenen endogenen Stimuli bzw. Calciumionophoren mit einer zytosolischen Calciumerhöhung unterschiedlichen Ausmaßes beantworten. Bei einsetzendem oder sich verstärkenden Flüssigkeitsscherstress konnte von uns hingegen keine Calciumantwort beobachtet werden. An der Induktion zytoskelettaler Umbauvorgänge scheint Calcium als Botenstoff in den hier untersuchten Zellsystemen also nicht primär beteiligt zu sein N2 - The adjustment processes in endothelial cells under rheological demand induced by changes in cell metabolism are of particularly clinical interest, as vessel wall damage has a decisive influence on formation of vascular deseases as e.g. atherosclerosis. The intracellular signal pathway the cell uses to transmit a rheological stimulus into a corresponding cell answer has previously remaind unclarified. In this publication we were able to establish a measuring technique that allows to document changes in cytosolic free calcium in the presence of Ca2+-increasing agonist, calcium ionophores as well as during rheological demand. The suitability of the used rheological system could be proved by observation of the cytoskeleton reorganization processes, that are typical for endothelial cells under rheological demand. A reorientation of actin filaments and formation of shear stress fibers could be observed. For the first time we could see in this context the reaction of microvacular endothelial cells of the mice MyEnd-population on rheological demand. In these cells we could notice an increase of F-actin, but in contrast to cultivated pulmonary endothelial cells of the pig we could not observe a significant formation of shear stress fibers. This different behaviour is probably due to the different cell morphology of MyEnd cells. In two different endothelial cell systems could be shown that vessel endothelial cells answer on stimulation with varying endogeneous agonists and calcium ionophores with an elevation of cytosolic free calcium. No increase in cytosolic free calcium could be shown subsequently to starting or increasing rheological demand. In the investigated cell populations calcium seems not to be involved as a messenger for cytoskeletal reorganization. KW - Endothel KW - Calcium KW - Scherstress KW - Stressfasern KW - Aktin KW - Arteriosklerose KW - endothelium KW - calcium KW - shear stress KW - shear stress fibers KW - actin KW - atherosclerosis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1181128 ER -