TY - THES A1 - Witzinger, Linda T1 - Rolle der Pyridoxal 5´-Phosphat Phosphatase PDXP im Vitamin B6-Metabolismus muriner Erythrozyten und Hippocampi T1 - Role of the pyridoxal 5´-phosphate phosphatase PDXP in the vitamin B6 metabolism of murine red blood cells and hippocampi N2 - Die Phosphatase PDXP (auch bekannt als Chronophin) gehört zur Familie der HAD Phosphatasen, einer ubiquitär exprimierten Enzymklasse mit wichtigen physiologischen Funktionen. PDXP zeigt Phosphatase-Aktivität gegenüber seinem Substrat Pyridoxal 5´-Phosphat (PLP), der aktivierten Form von Vitamin B6. PDXP-defiziente Mäuse (Knockout-Mäuse) weisen im Vergleich zu Wildtypen verdoppelte PLP-Konzentrationen in Erythrozyten sowie im Gesamthirn auf. Vermutlich kommt PDXP daher eine wichtige Funktion in Erythrozyten und im Hirn zu. Ziel dieser Arbeit war es, erste Einblicke in diese Funktion(en) von PDXP zu erlangen. Hierzu wurden HPLC-basierte Analysen der erythrozytären PLP-Konzentrationen in Wildtyp- sowie PDXP-defizienten Mäusen durchgeführt. Dabei ließen sich die rund doppelt so hohen erythrozytären PLP-Level in den KO-Mäusen bestätigen. Zudem ist es gelungen, eine Methode zur Messung der endogenen Phosphatase-Aktivität von PDXP in Erythrozytenlysaten zu etablieren. So konnte im Wildtyp anhand der Verringerung der PLP-Konzentrationen pro Zeiteinheit eine erythrozytäre PDXP-Aktivität nachgewiesen werden. Dazu waren die Inkubation mit Pyridoxin, sowie die Anwendung eines Inhibitors der PDXK notwendig. Eine bis dato vermutete Funktion der PDXP, zur Mobilisation von erythrozytärem PLP während Fastenzeiten, konnte ausgeschlossen werden. So zeigte der Vergleich der erythrozytären PLP-Konzentrationen aus gefasteten mit normal gefütterten Tieren in beiden Genotypen exakt dieselbe prozentuale PLP-Verringerung. Während Nahrungszufuhr ließ sich jedoch eine Funktion der Phosphatase PDXP als „Converter“ von Pyridoxin zu Pyridoxal erkennen. Ausgehend von PN konnte im Wildtyp (über die Zwischenprodukte PNP und PLP) eine PDXP-abhängige Dephosphorylierung von PLP zu PL erfolgen. So wies der Wildtyp eine rund vierfach höhere PL-Produktion auf, verglichen mit der PDXP-defizienten Maus. Die Phosphatase PDXP erwies sich als essenziell für die erythrozytäre Konversion von Pyridoxin zu Pyridoxal. Dadurch erreicht der Organismus eine metabolische Flexibilität, die ihn bis zu einem gewissen Grad unabhängig von der Nahrungsauswahl macht. Zudem können Zellen oder Organe, denen durch das Fehlen der PNPO, die Konversion zu PLP nicht möglich ist, mit PL versorgt werden. Aus der hohen Reaktivität von PLP mit umliegenden Nucleophilen ergibt sich eine gewisse Problematik für die Zelle im Umgang mit freiem PLP. So liegt der Großteil des erythrozytären PLPs gebunden an Proteine (vor allem Hämoglobin) vor. Anhand von Filtern (MWCO, 3000) ließ sich zwischen der hier definiert als „freien“ und der „gebundenen“ Form von PLP differenzieren. So konnten erste Erkenntnisse zur Rolle von PDXP als Determinator freier PLP-Konzentrationen in Erythrozyten und insbesondere im Hippocampus erlangt werden. Im Hippocampus ergaben sich insgesamt deutlich höhere Konzentrationen an freiem PLP als in den Erythrozyten und es bestand zudem ein Unterschied zwischen den Genotypen. So wiesen die KO-Mäuse ~1/3 höhere freie PLP-Konzentrationen im Vergleich zu den Wildtypen auf. Schließlich konnte ein Effekt des Tieralters auf den PLP-Metabolismus festgestellt werden. Sowohl in den Erythrozyten als auch im Hippocampus ergaben sich alterskorrelierte Änderungen ihrer PLP-Konzentrationen. Zudem zeigten Western Blot Analysen altersbedingte Unterschiede ihrer Vitamin B6-Enzymexpressionen. So wiesen ältere Wildtypen im Hippocampus eine fünffach erhöhte PDXP-Expression verglichen mit jüngeren Tieren auf. In den Erythrozytenlysaten hingegen zeigten ältere Tiere beider Genotypen eine rund vierfach geringere PNPO-Expression gegenüber jüngeren Tieren. Die mit dem Alter eintretende physiologische Verringerung der erythrozytären PNPO-Expression würde somit für den Organismus einen Verlust seiner metabolischen Flexibilität bedeuten, die mit der Konversion von PN zu PL einhergeht. N2 - The phosphatase PDXP, also called Chronophin, is a member of the ubiquitously expressed HAD-phosphatases, which have some important physiological functions in the organism. Its substrate pyridoxal 5´-phosphate (PLP) is the active form of vita-min B6, an important cofactor of several reactions. PDXP-deficient mice (KO-mice) have PLP-concentrations in erythrocytes and in the whole brain twice as high as wildtype mice. It is assumed that PDXP therefore has an important function in erythrocytes and in the brain. The aim of the study was to gain initial insights into these functions of PDXP. For this purpose, HPLC-based analyses of the PLP-concentrations in erythrocytes from WT- and KO-mice were carried out. The doubled PLP-levels in the RBCs of KO-mice could be confirmed. In addition, a method for measuring the endogenous phosphatase activity of PDXP in red cell lysates was established. The activity of PDXP could be measured by the reduction of its substrate PLP over time. This required the incubation with pyridoxine and the inhibition of PDXK by ginkgotoxine. An assumed function of PDXP in mobilization of PL(P) from the erythrocytes in fasting conditions could be ruled out. Therefore, a comparison between the PLP-concentrations in RBCs of fasted mice with normal fed ones was done. Surprisingly the fasted KO-mice showed the same percentaged decrease of cellular PLP-level as the fasted WT-mice. During vitamin B6 intake however, a function of PDXP as being a “converter” of pyridoxine to pyridoxal was found. Starting with PN, a PDXP-mediated dephosphorylation from PLP to PL could take place in the wildtype mice (via the intermediate steps PNP and PLP). Consequently, the WT´s production of PL quadrupled compared to the KO´s. PDXP turned out to be essential for the conversion of pyridoxine to pyridoxal in erythrocytes. This conversion confers some metabolic flexibility to the organism and to a certain extent makes it independent of the choice of food. Moreover, cells and organs, that due to the absence of PNPO cannot produce PL(P) themselves, can be provided via erythrocytes. The high reactivity of PLP with surrounding nucleophiles poses a certain problem for the cell in dealing with free PLP. The majority of the PLP in RBCs is bound to proteins (primarily hemoglobin). It was distinguished between the here termed “free” PLP and the bound PLP by using filter devices with a MWCO at 3 kDa. First insights could be gained about PDXP as a determinant of free PLP-levels in erythrocytes and hippocampus. The amount of free PLP in the hippocampus was significantly higher than in the RBCs. Additionally, the hippocampus showed some differences in the con¬centration of free PLP between WT- and KO-mice. The level of free PLP in PDXP deficient mice was one third higher than in wildtype mice. Finally, some correlation between the age of the mice and their PLP-metabolism was found. The results revealed changes of the PLP-concentrations with age in the RBCs and the hippocampus. Moreover, western blot analyses showed some age-related differences in the expression of vitamin B6 enzymes. In the hippocampus older wildtype mice showed a quintupled expression of PDXP compared to younger ones. However, western blot analyses of red blood cell lysates from older animals revealed a lower expression of PNPO by a factor of four. For the organism this physiological reduction of its PNPO expression with age would mean a loss of metabolic flexibility, that is accompanied by the conversion from PN to PL. KW - Vitamin B6 KW - Vitamin-B6-Stoffwechsel KW - Pyridoxalphosphat KW - Erythrozyt KW - Phosphatasen KW - PDXP KW - PLP KW - HAD-Phosphatasen KW - Vitamin B6 Metabolismus KW - pyridoxal phosphate KW - red blood cells Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-216546 ER - TY - THES A1 - Segerer, Gabriela T1 - Characterization of cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase AUM T1 - Charakterisierung zellbiologischer und physiologischer Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase AUM N2 - Mammalian haloacid dehalogenase (HAD)-type phosphatases are a large and ubiquitous family of at least 40 human members. Many of them have important physiological functions, such as the regulation of intermediary metabolism and the modulation of enzyme activities, yet they are also linked to diseases such as cardiovascular or metabolic disorders and cancer. Still, most of the mammalian HAD phosphatases remain functionally uncharacterized. This thesis reveals novel cell biological and physiological functions of the phosphoglycolate phosphatase PGP, also referred to as AUM. To this end, PGP was functionally characterized by performing analyses using purified recombinant proteins to investigate potential protein substrates of PGP, cell biological studies using the spermatogonial cell line GC1, primary mouse lung endothelial cells and lymphocytes, and a range of biochemical techniques to characterize Pgp-deficient mouse embryos. To characterize the cell biological functions of PGP, its role downstream of RTK- and integrin signaling in the regulation of cell migration was investigated. It was shown that PGP inactivation elevates integrin- and RTK-induced circular dorsal ruffle (CDR) formation, cell spreading and cell migration. Furthermore, PGP was identified as a negative regulator of directed lymphocyte migration upon integrin- and GPCR activation. The underlying mechanisms were analyzed further. It was demonstrated that PGP regulates CDR formation and cell migration in a PLC- and PKC-dependent manner, and that Src family kinase activities are required for the observed cellular effects. Upon integrin- and RTK activation, phosphorylation levels of tyrosine residues 1068 and 1173 of the EGF receptor were elevated and PLCγ1 was hyper-activated in PGP-deficient cells. Additionally, PGP-inactivated lymphocytes displayed elevated PKC activity, and PKC-mediated cytoskeletal remodeling was accelerated upon loss of PGP activity. Untargeted lipidomic analyses revealed that the membrane lipid phosphatidylserine (PS) was highly upregulated in PGP-depleted cells. These data are consistent with the hypothesis that the accumulation of PS in the plasma membrane leads to a pre-assembly of signaling molecules such as PLCγ1 or PKCs that couple the activation of integrins, EGF receptors and GPCRs to accelerated cytoskeletal remodeling. Thus, this thesis shows that PGP can affect cell spreading and cell migration by acting as a PG-directed phosphatase. To understand the physiological functions of PGP, conditionally PGP-inactivated mice were analyzed. Whole-body PGP inactivation led to an intrauterine growth defect with developmental delay after E8.5, resulting in a gradual deterioration and death of PgpDN/DN embryos between E9.5 and E11.5. However, embryonic lethality upon whole-body PGP inactivation was not caused by a primary defect of the (cardio-) vascular system. Rather, PGP inactivated embryos died during the intrauterine transition from hypoxic to normoxic conditions. Therefore, the potential impact of oxygen on PGP-dependent cell proliferation was investigated. Analyses of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) generated from E8.5 embryos and GC1 cells cultured under normoxic and hypoxic conditions revealed that normoxia (~20% O2) causes a proliferation defect in PGP-inactivated cells, which can be rescued under hypoxic (~1% O2) conditions. Mechanistically, it was found that the activity of triosephosphate isomerase (TPI), an enzyme previously described to be inhibited by phosphoglycolate (PG) in vitro, was attenuated in PGP-inactivated cells and embryos. TPI constitutes a critical branch point between carbohydrate- and lipid metabolism because it catalyzes the isomerization of the glycolytic intermediates dihydroxyacetone phosphate (DHAP, a precursor of the glycerol backbone required for triglyceride biosynthesis) and glyceraldehyde 3’-phosphate (GADP). Attenuation of TPI activity, likely explains the observed elevation of glycerol 3-phosphate levels and the increased TG biosynthesis (lipogenesis). Analyses of ATP levels and oxygen consumption rates (OCR) showed that mitochondrial respiration rates and ATP production were elevated in PGP-deficient cells in a lipolysis-dependent manner. However under hypoxic conditions (which corrected the impaired proliferation of PGP-inactivated cells), OCR and ATP production was indistinguishable between PGP-deficient and PGP-proficient cells. We therefore propose that the inhibition of TPI activity by PG accumulation due to loss of PGP activity shifts cellular bioenergetics from a pro-proliferative, glycolytic metabolism to a lipogenetic/lipolytic metabolism. Taken together, PGP acts as a metabolic phosphatase involved in the regulation of cell migration, cell proliferation and cellular bioenergetics. This thesis constitutes the basis for further studies of the interfaces between these processes, and also suggests functions of PGP for glucose and lipid metabolism in the adult organism. N2 - Haloazid Dehalogenase (HAD)-Typ Phosphatasen in Säugetieren gehören zu einer großen ubiquitären Proteinfamilie, zu der auch mindestens 40 Phosphatasen, die im menschlichen Organismus vertreten sind, zählen. Eine Vielzahl dieser Phosphatasen hat wichtige physiologische Funktionen beispielsweise als regulatorische Enzyme im Metabolismus. Gleichzeitig werden sie in Verbindung mit Erkrankungen des kardiovaskulären Systems, Stoffwechselstörungen und Krebs gebracht. Dennoch sind die Funktionen vieler Mitglieder dieser Phosphatasen Familie bis heute weitestgehend unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die zellbiologischen und physiologischen Funktionen der Phosphoglykolat-Phosphatase PGP, auch AUM genannt, charakterisiert. Zu diesem Zweck wurde mit gereinigtem Enzym nach potenziellen Protein-Substraten von PGP gesucht. Weiterhin wurden zellbiologische Studien mit der spermatogonialen GC1 Zelllinie sowie mit primären Endothelzellen und Lymphozyten durchgeführt. Mit biochemischen Methoden wurden zudem PGP-defiziente Mausembryonen charakterisiert. Es wurde zunächst die Rolle von PGP für RTK- und integrin- induzierte Zellmigration untersucht. Dabei zeigte sich, dass PGP Inaktivierung die Zelladhäsion und Zellmigration steigerte. Gleichzeitig wurde eine vermehrte Bildung von RTK- und integrinvermittelten ringförmigen Plasmamembranausstülpungen, sogenannten Circular Dorsal Ruffles (CDR) auf der dorsalen Zelloberfläche beobachtet. PGP wurde zudem als negativer Regulator integrinund GPCR-induzierter gerichteter Lymphozytenmigration identifiziert. Der zugrundeliegende molekulare Mechanismus wurde näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass PGP die Bildung von CDRs und die gerichtetete Zellmigration in Abhängigkeit der Phospholipase C- (PLC-), Proteinkinase C- (PKC-) sowie Src Kinase-Aktivität steuert. Nach Integrin- und RTKAktivierung waren die Tyrosinreste 1068 und 1173 des EGF-Rezeptors in PGP-depletierten Zellen vermehrt phosphoryliert und PLCγ1 in diesen Zellen hyperaktiviert. Interessanterweise wurde zudem eine beschleunigte PKC-vermittelte Reorganisation des Zytoskeletts beobachtet. In stimulierten Lymphozyten führte PGP-Inaktivierung zu einer erhöhten PKCAktivität. Durch massenspektrometrische Analysen konnten erhöhte Spiegel des Membranlipids Phosphatidylserin (PS) in PGP-defizienten Zellen nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse sind konsistent mit der Hypothese, dass die Anreicherung von PS in der Plasmamembran PGP-defizienter Zellen zu einer Vor-Rekrutierung von Signalproteinen führt, die die Aktivierung von Integrinen, EGF-Rezeptoren und GPCRs mit einer beschleunigten Zytoskelett-Reorganisation verbindet. Hierdurch konnte gezeigt werden, dass PGP durch die Dephosphorylierung von Phosphoglykolat die Zelladhäsion und Zellmigration reguliert. Um die physiologischen Funktionen von PGP zu verstehen, wurden konditional PGPinaktivierte Mäuse untersucht. Die Inaktivierung von PGP im gesamten Organismus führte zu einem Wachstumsdefekt ab Tag E8.5 und dem Tod der Embryonen im Uterus zwischen Tag E9.5 und E11.5. Die beobachtete embryonale Letalität war nicht durch einen Defekt des (kardio-)vaskulären Systems zu erklären. PGP-inaktivierte Embryonen starben zu einem Zeitpunkt, an dem der intrauterine Übergang von einem hypoxischen zu einem normoxischen Millieu stattfindet. Der Einfluss von Sauerstoff wurde deshalb weiter untersucht. Zellwachstumsanalysen unter normoxischen und hypoxischen Bedingungen mit GC1 Zellen und embryonalen Maus-Fibroblasten, die aus E8.5 Embryonen gewonnen wurden zeigten, dass normoxische Bedingungen (~20% O2) einen Wachstumsdefekt PGP-inaktivierter Zellen verursacht, wohingegen dies unter hypoxischen Bedingungen (~1% O2) nicht der Fall war. Mechanistisch konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI), ein durch PG in vitro gehemmtes Enzym, in PGP inaktivierten Zellen und Embryonen vermindert war. TPI stellt einen entscheidenden Verzweigungspunkt des Glukose- und Lipidstoffwechsels dar. TPI katalysiert die Isomerisierung der aus der Glykolyse stammenden Intermediate Dihydroxyacetonphosphat (DHAP, eine Vorstufe des für die Triglycerid-Biosynthese benötigten Glycerol-Grundgerüsts) und Glyceraldehyd-3’-phosphat (GADP). Eine Verringerung der TPI-Aktivität in PGPinaktivierten Zellen resultierte in erhöhten Glycerol-3-phosphat Spiegeln und einer gesteigerten Triglycerid-Biosynthese. Die Analyse des zellulären ATP Gehalts und des Sauerstoffverbrauchs bei der mitochondrialen Atmung zeigte, dass sowohl die ATP Produktion als auch die mitochondriale Atmung in Abhängikeit der Lipolyse in PGP-defizienten Zellen erhöht waren. Unter hypoxischen Bedingungen, die zu einer Normalisierung der Zellproliferation führten, wiesen PGP-profiziente und -defiziente Zellen keinen Unterschied bezüglich ATP Produktion und mitochondrialer Atmung auf. Wir vermuten deswegen, dass die Inhibierung der TPI-Aktivität durch PG-Anreicherung aufgrund ausbleibender Hydrolyse durch PGP zu einer Verschiebung des zellulären Energiehaushaltes von Seiten eines pro-proliferativ glykolytischen auf die Seite eines lipogenetisch/lipolytischen Metabolismus führt. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass PGP als eine metabolische Phosphatase Zellmigration, Zellproliferation wie auch den zellulären Energiehaushalt reguliert. Die vorliegende Arbeit stellt somit die Grundlage für weitere Untersuchungen an der Schnittschnelle dieser zellulären Prozesse dar und lässt auf eine wichtige Rolle von PGP im Glukose- und Lipidstoffwechsel im adulten Organismus schließen. KW - Phosphoglykolatphosphatase KW - Phosphoglykolat-Phosphatase KW - Maus KW - Cytologie KW - Physiologie KW - Phosphatasen Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-123847 ER - TY - THES A1 - Kestler, Christian T1 - Untersuchungen über die Dimerisierung der HAD-Phosphatase Chronophin T1 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin N2 - Phosphatasen der HAD (haloacid dehalogenase)-Familie sind weit verbreitet in allen Domänen des Lebens und erfüllen die verschiedensten zellulären Aufgaben, beispielsweise in Metabolismus und Zellregulation. Die HAD-Phosphatase Chronophin zeigt Phosphataseaktivität unter anderem gegenüber Pyridoxal-5‘-Phosphat (PLP), einem essentiellen Kofaktor vieler biochemischer Prozesse, und Phosphocofilin, einem Regulator des Aktinzytoskeletts. Chronophin dimerisiert über die Interaktion zweier identischer Untereinheiten zu einem Homodimer. Ziel dieser Arbeit war, die Rolle dieser Dimerisierung, eines bei HAD-Phosphatasen weit verbreiteten Oligomerisierungszustandes, näher zu untersuchen. Hierzu wurde die Dimerisierung erfolgreich durch den Austausch der Aminosäuren Alanin 194 und 195 zu Lysinen (Mutation A194K/A195K) gestört. Der Nachweis einer konstitutiv monomeren Chronophin-Mutante mittels Größenausschlusschromatographie, Rasterkraftmikroskopie, analytischer Ultra¬zentrifugation und Zellexperimenten wurde schließlich über die Struktur¬auflösung mittels Röntgenstrukturanalyse bestätigt. Aktivitätsmessungen der monomeren Mutante gegenüber dem Substrat PLP zeigten eine deutliche Verminderung der Phosphataseaktivität. Die Röntgenstrukturanalyse von Chronophin A194K/A195K im Vergleich mit Wildtyp-Chronophin enthüllte einen Mechanismus, wie die sogenannte Substratspezifitätsschleife, die für die korrekte Positionierung des PLP sorgt, im Homodimer des Wildtyps durch Interaktionen mit dem zweiten Protomer stabilisiert wird. Diese Stabilisierung fehlt bei der monomeren Mutante und äußert sich in einer veränderten Stellung der Substratspezifitätsschliefe. Der Strukturvergleich von Chronophin mit weiteren HAD-Phosphatasen der selben strukturellen Untergruppe vom C2a-Typ lässt eine allgemeine Gültigkeit der hier beschriebenen allosterischen Kontrolle von Substratspezifität über Homodimerisierung bei HAD-Phosphatasen vermuten und könnte so neue Ansatzpunkte für möglicherweise auch therapeutisch nutzbare Aktivitätshemmungen liefern. N2 - Investigations of the dimerization of the HAD-phosphatase Chronophin KW - Dimerisierung KW - Phosphatasen KW - Pyridoxalphosphat KW - Ortspezifische Mutagenese KW - Chronophin KW - Substratspezifitätsschleife Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-149777 ER -