TY - JOUR A1 - Rychlik, Michael A1 - Humpf, Hans-Ulrich A1 - Marko, Doris A1 - Dänicke, Sven A1 - Mally, Angela A1 - Berthiller, Franz A1 - Klaffke, Horst A1 - Lorenz, Nicole T1 - Proposal of a comprehensive definition of modified and other forms of mycotoxins including “masked” mycotoxins JF - Mycotoxin Research N2 - As the term "masked mycotoxins" encompasses only conjugated mycotoxins generated by plants and no other possible forms of mycotoxins and their modifications, we hereby propose for all these forms a systematic definition consisting of four hierarchic levels. The highest level differentiates the free and unmodified forms of mycotoxins from those being matrix-associated and from those being modified in their chemical structure. The following lower levels further differentiate, in particular, "modified mycotoxins" into "biologically modified" and "chemically modified" with all variations of metabolites of the former and dividing the latter into "thermally formed" and "non-thermally formed" ones. To harmonize future scientific wording and subsequent legislation, we suggest that the term "modified mycotoxins" should be used in the future and the term "masked mycotoxins" to be kept for the fraction of biologically modified mycotoxins that were conjugated by plants. KW - definition KW - mycotoxins KW - masked mycotoxins KW - modified mycotoxins KW - hidden mycotoxins KW - mycotoxin derivates KW - mycotoxin metabolites KW - conjugated mycotoxins Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-121240 VL - 30 IS - 4 ER - TY - JOUR A1 - Calebiro, Davide A1 - Maiellaro, Isabella T1 - cAMP signaling microdomains and their observation by optical methods JF - Frontiers in Cellular Neuroscience N2 - The second messenger cyclic AMP (cAMP) is a major intracellular mediator of many hormones and neurotransmitters and regulates a myriad of cell functions, including synaptic plasticity in neurons. Whereas cAMP can freely diffuse in the cytosol, a growing body of evidence suggests the formation of cAMP gradients and microdomains near the sites of cAMP production, where cAMP signals remain apparently confined. The mechanisms responsible for the formation of such microdomains are subject of intensive investigation. The development of optical methods based on fluorescence resonance energy transfer (FRET), which allow a direct observation of cAMP signaling with high temporal and spatial resolution, is playing a fundamental role in elucidating the nature of such microdomains. Here, we will review the optical methods used for monitoring cAMP and protein kinase A (PKA) signaling in living cells, providing some examples of their application in neurons, and will discuss the major hypotheses on the formation of cAMP/PKA microdomains. KW - G protein-coupled receptor KW - cyclic AMP KW - signaling microdomain KW - fluorescence resonance energy transfer KW - neurons Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118252 SN - 1662-5102 VL - 8 ER - TY - JOUR A1 - Brand, Susanne A1 - Amann, Kerstin A1 - Mandel, Philipp A1 - Zimnol, Anna A1 - Schupp, Nicole T1 - Oxidative DNA Damage in Kidneys and Heart of Hypertensive Mice Is Prevented by Blocking Angiotensin II and Aldosterone Receptors JF - PLOS ONE N2 - INTRODUCTION: Recently, we could show that angiotensin II, the reactive peptide of the blood pressure-regulating renin-angiotensin-aldosterone-system, causes the formation of reactive oxygen species and DNA damage in kidneys and hearts of hypertensive mice. To further investigate on the one hand the mechanism of DNA damage caused by angiotensin II, and on the other hand possible intervention strategies against end-organ damage, the effects of substances interfering with the renin-angiotensin-aldosterone-system on angiotensin II-induced genomic damage were studied. METHODS: In C57BL/6-mice, hypertension was induced by infusion of 600 ng/kg • min angiotensin II. The animals were additionally treated with the angiotensin II type 1 receptor blocker candesartan, the mineralocorticoid receptor blocker eplerenone and the antioxidant tempol. DNA damage and the activation of transcription factors were studied by immunohistochemistry and protein expression analysis. RESULTS: Administration of angiotensin II led to a significant increase of blood pressure, decreased only by candesartan. In kidneys and hearts of angiotensin II-treated animals, significant oxidative stress could be detected (1.5-fold over control). The redox-sensitive transcription factors Nrf2 and NF-κB were activated in the kidney by angiotensin II-treatment (4- and 3-fold over control, respectively) and reduced by all interventions. In kidneys and hearts an increase of DNA damage (3- and 2-fold over control, respectively) and of DNA repair (3-fold over control) was found. These effects were ameliorated by all interventions in both organs. Consistently, candesartan and tempol were more effective than eplerenone. CONCLUSION: Angiotensin II-induced DNA damage is caused by angiotensin II type 1 receptor-mediated formation of oxidative stress in vivo. The angiotensin II-mediated physiological increase of aldosterone adds to the DNA-damaging effects. Blocking angiotensin II and mineralocorticoid receptors therefore has beneficial effects on end-organ damage independent of blood pressure normalization. KW - aldosterone KW - oxidative stress KW - transcription factors KW - kidneys KW - heart KW - hypertension KW - DNA damage KW - blood pressure Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118011 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 12 ER - TY - JOUR A1 - Agarwal, Shailesh R. A1 - Yang, Pei-Chi A1 - Rice, Monica A1 - Singer, Cherie A. A1 - Nikolaev, Viacheslav O. A1 - Lohse, Martin J. A1 - Clancy, Colleen E. A1 - Harvey, Robert D. T1 - Role of Membrane Microdomains in Compartmentation of cAMP Signaling JF - PLOS ONE N2 - Spatially restricting cAMP production to discrete subcellular locations permits selective regulation of specific functional responses. But exactly where and how cAMP signaling is confined is not fully understood. Different receptors and adenylyl cyclase isoforms responsible for cAMP production are not uniformly distributed between lipid raft and non-lipid raft domains of the plasma membrane. We sought to determine the role that these membrane domains play in organizing cAMP responses in HEK293 cells. The freely diffusible FRET-based biosensor Epac2-camps was used to measure global cAMP responses, while versions of the probe targeted to lipid raft (Epac2-MyrPalm) and non-raft (Epac2-CAAX) domains were used to monitor local cAMP production near the plasma membrane. Disruption of lipid rafts by cholesterol depletion selectively altered cAMP responses produced by raft-associated receptors. The results indicate that receptors associated with lipid raft as well as non-lipid raft domains can contribute to global cAMP responses. In addition, basal cAMP activity was found to be significantly higher in non-raft domains. This was supported by the fact that pharmacologic inhibition of adenylyl cyclase activity reduced basal cAMP activity detected by Epac2-CAAX but not Epac2-MyrPalm or Epac2-camps. Responses detected by Epac2-CAAX were also more sensitive to direct stimulation of adenylyl cyclase activity, but less sensitive to inhibition of phosphodiesterase activity. Quantitative modeling was used to demonstrate that differences in adenylyl cyclase and phosphodiesterase activities are necessary but not sufficient to explain compartmentation of cAMP associated with different microdomains of the plasma membrane. KW - protein-coupled-receptors KW - adenylyl-cyclase isoforms KW - adult cardiac myocytes KW - plasma membrane KW - lipid rafts KW - cholesterol depletion KW - BETA(2)-adrenergic receptor KW - living vells KW - cyclic-AMP KW - domains Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116673 SN - 1932-6203 VL - 9 IS - 4 ER - TY - THES A1 - Riese, Thorsten T1 - Analysen zur potentiellen Gentoxizität von Terahertzstrahlung in vitro T1 - Analyses concerning potential genotoxicity of terahertz radiation in vitro N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden immortalisierte humane Keratinozyten (HaCaT-Zelllinie) über eine Dauer von 24 Stunden mit Terahertzstrahlung der Frequenz 0,106 THz und einer Leistungsflussdichte von 2 mW/cm² behandelt und anschließend mittels „cytokinesis-block micronucleus cytome assay“ ausgewertet. Ferner wurden Proben der gleichen Zelllinie über einen Zeitraum von 24 Stunden Temperaturen zwischen 37 °C und 42 °C ausgesetzt und zum einen auf Hinweise für Gentoxizität mit Hilfe des Mikrokerntests untersucht und zum anderen mittels Western Blot die Expressionsrate von Hitzeschockproteinen der 70 kDa Familie bestimmt. Die der Terahertzstrahlung ausgesetzten Zellen zeigten gegenüber den Kontrollen keine signifikanten Veränderungen der Marker für chromosomale Aberrationen oder der Zellteilung. Die der erhöhten Temperatur ausgesetzten Zellen zeigten einen signifikanten Anstieg der Mikrokernraten und weiterer Marker für Gentoxizität sowie eine damit korrelierende Zunahme der synthetisierten Proteinmenge der Hsp70 Proteine im Rahmen der Hitzeschockreaktion. N2 - In this dissertation HaCaT human keratinocytes were exposed to terahertz radiation (0.106 THz) and to different temperatures from 37 °C to 42 °C for 24 hours. Using the “cytokinesis-block micronucleus cytome assay” the appearance of different markers of genomic damage was analysed and compared to negative controls. Furthermore the heat-induced expression rate of the heat shock protein 70 was determined between 37 °C and 42 °C. The cells exposed to terahertz radiation showed no statistically significant elevation of genomic damage markers or change of proliferation compared to the controls. The hyperthermia-treated cells showed significantly increased micronucleus frequencies and an elevated heat-shock protein expression for temperatures above 37 °C. KW - Terahertzbereich KW - Gentoxizität KW - Nichtionisierende Strahlung KW - Terahertzstrahlung KW - Gentoxizität KW - Nichtionisierende Strahlung KW - terahertz radiation KW - genotoxicity KW - non-ionizing radiation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116469 ER - TY - THES A1 - Rübeling, Karsten T1 - Identifizierung und pharmakologische Charakterisierung von Adenosinrezeptoren in humanen Melanomzelllinien T1 - Identification and pharmacological characterization of adenosine receptors in human melanoma cell lines N2 - Adenosin steuert seine physiologische Funktionen über die vier G-Protein gekoppelten Adenosinrezeptoren A1, A2A, A2B und A3 und kann enormen Einfluss auf die Zellphysiologie und das Immunsystem haben. Hohe Adenosinkonzentrationen in Tumorgeweben haben das Interesse vieler Forschungsgruppen geweckt und den Nachweis von AR und dessen tumorfördernde sowie -hemmende Wirkung auf diverse Krebszellen nach sich gezogen. Melanome sind für 90% der letal ausgehenden Hautkrebsformen verantwortlich, da bereits kleinste Formen metastasieren können und vielmals eine rein chirurgische Therapie keine Heilung verspricht. Bei ungünstiger Prognose schränken adjuvante und systemische Therapieergänzungen die Lebensqualität erheblich ein. Auf der Suche nach gezielteren und schonenderen Therapieansätzen gilt es, die Rolle des Adenosins im Tumorgeschehen weiter aufzuklären, was den Nachweis und die Charakterisierung von AR und deren rezeptorspezifisch-gekoppelte Effekte voraussetzt. Daher sollten in der hier vorliegenden Arbeit die fünf humanen Melanomzelllinien A375, Brown, MV3, SK MEL23 und MEL2A auf die Expression von AR untersucht werden. Zu Beginn wurden die Zellen mit Hilfe von Bindungsexperimenten unter Einsatz radioaktiv markierter Liganden ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA und [3H]ZM 241385) auf das Vorliegen der vier AR-Subtypen untersucht. A1- und A3-AR wurden nach Bindungsstudien mit [3H]CCPA bzw. [3H]HEMADO ausgeschlossen und nicht weiter untersucht. Durch Bindungsstudien mit [3H]ZM 241385 konnten in den Zellen Brown, MV3, SK-MEL23 und MEL2A geringe Mengen von A2B-Rezeptoren detektiert werden. Es folgten funktionelle Untersuchungen zur Stimulation der AC mit den Liganden NECA und CGS 21680 unter besonderem Blick auf die Differenzierung zwischen einer A2A- oder A2B vermittelten Stimulation. Ein NECA vermittelter Anstieg des c[32P]AMP im AC-Versuch bestätigte die Anwesenheit von A2B-Rezeptoren in den Zellen A375, Brown, MV3 und SK-MEL23. Durch CGS 21680 kam es hingegen zu keiner AC-Stimulation, was eine A2A-AR-Beteiligung ausschloss. Zur Bestätigung einer A2B gekoppelten AC-Aktivität wurde zum Abschluss der Versuche die Wirkung von drei selektiven Antagonisten (DPCPX, SCH 58261 und MRE 3008 F20) auf ein NECA induziertes cAMP-Signal überprüft. Mit den drei Antagonisten konnte an den Zelllinien A375, Brown und MV3 die für A2B-AR zu erwartende Wirkung nachgewiesen und damit die Expression von A2B-AR in diesen Zellen bestätigt werden. Die gewonnenen Daten können als Ausgangspunkt weiterführender Untersuchungen genutzt werden, um die Rolle von AR in Krebszellen besser zu verstehen. Sie könnten als Grundlage für die Suche nach potenziellen Angriffspunkten für neue Therapieansätze dienen und so einen Beitrag für Fortschritte in der Behandlung von Tumoren leisten. N2 - Adenosine regulates its physiological function through four G protein-coupled adenosine receptors: A1, A2A, A2B and A3. Adenosine can have a tremendous impact on cell physiology and the immune system. A high concentration of adenosine in tumour tissue has drawn the interest of many research groups which then led to the detection of AR and its tumour-promoting and tumour-inhibiting effect on various cancer cells. Melanomas are responsible for 90% of all fatal skin cancers since already the smallest types can metastasise and, in many cases, surgical treatment alone will prove insufficient. In case of an unfavourable prognosis, adjuvant and systemic additional therapeutic measures will considerably impair the patient’s quality of life. In the search for more targeted and gentle therapeutic approaches it is crucial to further investigate the role of adenosine in tumour development which implies the detection and characterisation of AR and their receptor-specific coupled effects. Hence, in this thesis, the five human melanoma cell lines A375, Brown, MV3, SK-MEL23 and MEL2A will be tested for the expression of AR. In the beginning, the cells were tested for the presence of four AR-subtypes with the help of binding experiments employing radioactively marked ligands ([3H]HEMADO, [3H]CCPA, [3H]NECA and [3H]ZM 241385). A1- and A3-AR were excluded after binding studies with [3H]CCPA and [3H]HEMADO and were not further investigated. Binding studies with [3H]ZM 241385 showed that small amounts of A2B-receptors were detectable in the cell lines Brown, MV3, SK-MEL23 and MEL2A. This was followed by functional analyses regarding the stimulation of the AC with the ligands NECA and CGS 21680. Particular attention was paid to a differentiation between an A2A- or A2B-induced stimulation. A NECA-induced increase of the c[32P]AMP in the AC-test confirmed the presence of A2B-receptors in the cell lines A375, Brown, MV3 and SK-MEL23. CGS 21680, however, did not cause an AC-stimulation, which excluded an A2A-AR-involvement. In order to confirm an A2B-coupled AC-activity, the impact of three selective antagonists (DPCPX, SCH 58261 and MRE 3008-F20) on a NECA-induced cAMP-signal was tested to complete testing. The expected impact for A2B-AR could be proven on the cell lines A375, Brown and MV3 with the three antagonists and thus confirming the expression of A2B-AR in these cells. The data obtained can be used as a basis for further investigating the role of AR in cancer cells. They could be used in the search forpotential points of application for new therapeutic approaches and thus contribute to making progress in the treatment of tumours. KW - Adenosin KW - Adenosinrezeptor KW - Adenosine KW - Adenosine receptor KW - Melanoma KW - Melanomzelllinien KW - Functional analyses KW - Human Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115137 ER - TY - THES A1 - Mandel, Philipp T1 - Entstehung von oxidativen Stressmarkern in DNA und RNA nach der Behandlung mit den Hormonen Angiotensin II und Aldosteron in vitro und in vivo : Vergleich von drei Analysemethoden zum Nachweis von 8-Oxo-2'-desoxyguanosin in LLC-PK1-Zellen T1 - Formation of oxidative stress markers in DNA and RNA after treatment with aldosterone and angiotensin II in vitro and in vivo N2 - The detection of oxidative stress markers has gained increasing importancy in the early investigation of diseases like diabetes, cancer or hypertension. 8 oxo 2' deoxyguanosine (8-oxodG) is the main marker, which is used for the intracellular detection of oxidative stress levels. However, the oxidative stress markers 8 oxoguanine (8-oxoGua), a product of the DNA base excision repair and 8 oxoguanosine (8-oxoGuo), a marker for oxidative damaged RNA have received less attention up to now. The renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) plays an important role in the regulation processes of the blood pressure system. During hypertension angiotensin II (Ang II) and aldosterone (Aldo) are released in high concentrations over a longer period leading to non-physiological effects of the RAAS hormones. Subsequently, an increase of the intracellular oxidative stress level in kidney cells can be measured. The aim of this thesis is the in vitro and in vivo detection of the oxidative damage in DNA and RNA by measuring oxidative stress markers, especially 8-oxodG which is triggered by Ang II and Aldo. In vitro experiments were carried out in LLC-PK1, a cell line originated from porcine kidney cells. It could been shown that Ang II and Aldo led to a dose-dependent increase of DNA damage in the cells. A time-dependent increase was detected for the first 30 minutes of the treatment. For the rest of the experimental set up (4 h) the level of detected DNA damage remained constant. The FPG comet assay and the immunocytochemical staining showed a significant increase of 8-oxodG in the cells, whereas the HPLC-MS/MS measurement only detected a small increase of 8-oxodG in the DNA. The FPG enzyme, which recognises also other oxidized purines besides 8-oxodG, which led to an overestimation of 8-oxodG in the comet assay. Also, the 8 oxodG antibody, which was used in the immunocytochemical analysis, detected higher amounts of 8-oxodG most likely due to its side reactions with other oxidized DNA structures. One of the main advantages of the last mentioned methods is the direct measurement in damaged cells, whereas the HPLC-MS/MS requires an isolation of the DNA. During this isolation process the oxidative stress markers can be oxidized and the detection can become imprecise. The main purpose of the in vivo experiments was the detection of the oxidative stress marker 8-oxoGua, 8-oxodG and 8-oxoGuo in the urine of test animals. The treatment of C57BL/6 mice and Sprague Dawley (SD) rats with the RAAS hormones led to an increase of the blood pressure, higher DNA damage due to oxidative stress as well as an increased excretion rate of oxidative stress markers. The inhibition of the angiotensin II type 1- or mineralocorticoid receptor and a mutation of the AT1a gene could show, that the DNA damage is independent from the hypertension. In addition, it was shown that the NOX4 is not alone responsible for the oxidative stress. Other NADPH oxidases must contribute to the induction of oxidative stress inside the cell. Moreover, the activation of the Nrf2 pathway has an influence on the effect of Aldo in SD rats. The excretion rate of the oxidative stress markers in the 20 h urine of the treated animals showed how the equilibrium between the DNA repair and the oxidative stress level was changing over time. The measurement of 8-oxoGuo became more and more popular, because up to the fact that 80 % of the DNA is translated into RNA. Overall, the detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo is feasible for monitoring the disease or the healing process, because the measurement is non-invasive. The detection of 8-oxodG and 8-oxoGuo in nucleic acids is a first step into the field of basic research methods, because it reveals a snapshot of the nucleic acid damage in the cell at a specific time point. Usually, there will be an overestimation of the oxidative stress marker resulting from the analytical method. Although, it is possible to detect an underestimation of oxidative stress markers in tissue samples if not all cell types are damaged equally. Therefore, a primary goal should be the detection of a stable oxidation product of guanine to insure a reliable detection strategy and for a better understanding of the equilibrium of DNA oxidation and repair. N2 - Der Nachweis von oxidativen Stressmarkern hat bei der Untersuchung von Krankheiten wie Diabetes, Krebs und Hypertonie an großer Bedeutung gewonnen. Vor allem 8-Oxo-2’-desoxyguanosin (8-oxodG) wird gezielt mit verschiedenen Methoden gemessen und als Marker für oxidativen Stress herangezogen. Daneben haben 8 Oxoguanin (8-oxoGua), als Produkt aus der Basenexzisionsreparatur der DNA, sowie 8-Oxoguanosin (8-oxoGuo), als Biomarker für oxidativ geschädigte RNA, bisher weniger Aufmerksamkeit bekommen. Das Renin-Angiotensin Aldosteron System (RAAS) spielt eine wichtige Rolle in der Regulierung des Blutdrucks. Im Falle einer Hypertonie werden Angiotensin II (Ang II) und Aldosteron (Aldo) über einen langen Zeitraum in erhöhter Konzentration ausgeschüttet. Dieser Umstand bewirkt eine nicht physiologische Wirkung der Hormone des RAAS, welche zu einer Induktion von oxidativem Stress führt. Die Zielsetzung dieser Arbeit ist es, die oxidative Schädigung, ausgelöst durch Ang II und Aldo, in der DNA und der RNA in vitro und in vivo nachzuweisen und dabei speziell den Biomarker 8-oxodG zu untersuchen. In-vitro-Experimente wurden mit LLC PK1-Zellen, einer Schweinenierenzelllinie, durchgeführt. Ang II und Aldo lösten einen dosisabhängigen Anstieg der DNA Schäden in LLC PK1 Zellen aus. Eine Zeitabhängigkeit wurde für die ersten 30 Minuten gezeigt. Für die restliche Zeit (4 h) blieb der nachgewiesene DNA Schaden konstant. Der FPG Comet-Assay und die immunzytochemische Färbung zeigten jeweils eine signifikante Zunahme von 8-oxodG in LLC-PK1-Zellen an, während die HPLC MS/MS Messung nur geringe Veränderungen nachwies. Das FPG Enzym erkennt neben 8-oxodG auch andere oxidierte Purine und sorgte so für eine Überbestimmung des DNA-Schadens. Bei der immunzytochemischen Färbung entsteht die Überbestimmung durch Kreuzreaktionen des 8 oxodG Antikörpers mit oxidierten Strukturen in der DNA. Der Vorteil beider Analysemethoden ist die direkte Messung von Schädigungen in der Zelle, während die HPLC-MS/MS eine Isolierung der Nukleinsäuren voraussetzt. Bei diesem Schritt kann es zur Oxidation der Marker für oxidativen Stress kommen, welche einen genauen Nachweis erschwert. In vivo-Versuche hatten zum Ziel, die oxidativen Stressmarker 8-oxoGua, 8-oxodG und 8-oxoGuo im Urin nachzuweisen. Die Behandlung der C57BL/6-Mäuse und Sprague Dawley-Ratten (SD-Ratten) mit den Hormonen des RAAS zeigten einen Anstieg des Blutdrucks, erhöhte DNA Schäden durch oxidativen Stress sowie erhöhte Exkretionsraten der oxidativen Stressmarker. Durch eine Inhibierung des Angiotensin II-Typ1- oder Mineralkortikoidrezeptors sowie die Mutation des Gens AT1a konnte gezeigt werden, dass die Schädigungen unabhängig vom Blutdruck sind. Zudem konnte gezeigt werden, dass neben NOX4 auch andere NADPH Oxidasen für den oxidativen Stress verantwortlich sein müssen. Eine Aktivierung des Nrf2 Signalweges in den SD-Ratten hat Einfluss auf die Wirkung von Aldo. Die Exkretionsrate der oxidativen Biomarker im 20-h-Urin der behandelten Tiere zeigen, wie sich das Gleichgewicht zwischen DNA-Reparatur und oxidativem Stress verändert. Da 80 % der DNA in RNA umgeschrieben werden, ist der Nachweis von 8 oxoGuo in den Fokus gerückt. In der praktischen Anwendung kann mit der Messung von 8 oxodG und 8-oxoGuo ein Krankheits- oder Heilungsprozess auf nicht invasive Weise verfolgt werden. Der Nachweis von 8-oxodG und 8-oxoGuo in den Nukleinsäuren stellt einen Einstieg für die Grundlagenforschung dar, da sie nur eine Momentaufnahme der Nukleinsäureschädigung in der Zelle zeigen. Meist findet eine Überbestimmung, ausgelöst durch die Messmethode, statt. In Gewebeproben kann eine Unterbestimmung vorliegen, falls nicht alle Zelltypen vom oxidativen Stress betroffen sind. Daher sollte es ein vorrangiges Ziel sein, ein stabileres Oxidationsprodukt des Guanins nachzuweisen, um das Gleichgewicht der DNA-Oxidation und Reparatur besser zu verstehen. KW - Oxidativer Stress KW - Aldosteron KW - Renin-Angiotensin-Aldosteron-System KW - Angiotensin II KW - LC-MS KW - oxidative Stressmarker KW - 8-Oxo-2’-desoxyguanosin KW - Hydroxylradikal KW - DNA-Reparatur KW - Mineralokortikoidrezeptor KW - 8-oxo-2'-deoxyguanosine KW - DNA base excision repair KW - hypertension KW - oxidative stress marker KW - RNA degradation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111190 ER - TY - THES A1 - Makiol, Christian T1 - Die Rolle der durch NADPH-Oxidasen produzierten reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in der Pathophysiologie von Hypertonie und Alterung T1 - The role of nadph-oxidase produced reactive oxygen species (ROS) in the pathophysiology of hypertension and aging N2 - Reaktive Sauerstoffradikale spielen eine große Rolle bei der Entstehung von Karzinomen, im Alterungsprozess und bei kardiovaskulären Erkrankungen (Valko et al., 2007). Solche Sauerstoffradikale können unter anderem durch die NADPH-Oxidase gebildet werden (Finkel and Holbrook, 2000). Ziel der Arbeit war es, die Rolle von ROS im Alterungsprozess und bei Bluthochdruck aufzuzeigen. Dafür wurden zwei Tiermodelle, eines mit einer geringen ROS-Konzentration und eines mit einer hohen ROS-Konzentration, verwendet. Zum einen handelt es sich um ein p47-Knockout-Mausmodell für die geringere ROS-Konzentration, im Vergleich zu alten und jungen Wildtyp-Tieren. Für die Rolle von ROS bei der Alterung wurden junge mit alten Wildtyp-Tieren verglichen. Um die Rolle der NOX2 in den ROS-Spiegeln der Organe zu ermitteln wurden gleichaltrige Wildtyp- mit p47-Knockout-Tieren verglichen. Zum anderen nutzten wir ein ren2-Tiermodell für die hohe ROS-Konzentration. Hierbei handelt es sich um ein Bluthochdruckmodell, in dem der Blutdruck mit Medikamenten normalisiert werden kann. Die Tiere wurden daher mit Ramipril (ACE-Inhibitor), Apocynin (NADPH-Oxidase-Inhibitor) und Tempol (Radikalfänger) behandelt. Als Maß für die ROS-Konzentration wurden die Superoxidionenspiegel mithilfe einer Dihydroethidium-Färbung ermittelt. Die DNA-Doppelstrangbrüche wurden mit einer γH2AX-Antikörper-Färbung nachgewiesen und die Expression von Sirtuin1 und Hsp70, welche als Anti-Aging Proteine bekannt sind, mittels Western Blot bestimmt. N2 - Reactive oxygen species play a major role in the etiology of cancer, in the aging process and cardiovascular diseases (Valko et al., 2007). These oxygen radicals may be formed by the NADPH oxidase enzym complex (Finkel and Holbrook, 2000). The aim of the study is to analyse the effect of ROS in the aging process and hypertension. Therefore two models were used. Young and old wild-type animals were used and compared with young p47 knockout mice, which have a reduced ROS level. As a model with increased ROS levels the ren2-rat model was applied. Those animals were treated with different drugs such as ramipril (ACE inhibitor), apocynin (NADPH oxidase inhibitor) and tempol (radical scavenger). The superoxide concentration was determined in kidney and heart by using dihydroethidium-staining. The DNA double strand breaks were detected by staining with an γH2AX antibody and the expression of Sirtuin1 and Hsp70 which are known as anti-aging proteins, were determined by Western Blot. KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Hypertonie KW - Alterung KW - NADPH-Oxidase KW - reaktive Sauerstoffspezies KW - Hypertonie KW - Alterung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109901 ER - TY - THES A1 - Müller, Markus T1 - Effekte kardioprotektiver Zyklopeptide auf Funktion und Morphometrie des Herzens im Rattenmodell der dilatativen Immunkardiomyopathie T1 - Effects of cardioprotective cyclopeptides on cardiac function and morphometry in the rat model of dilated immune cardiomyopathy N2 - Kardiomyopathien sind Erkrankungen des Herzmuskels, die mit einer kardialen Funktionsstörung einhergehen. Formen, die ohne erkennbare Ursache zu einer progredienten Dilatation und Reduktion der Kontraktilität des linken Ventrikels führen, werden als idiopathische dilatative Kardiomyopathie (DCM) bezeichnet. Sie ist der Hauptgrund für schwere Herzinsuffizienz und die damit assoziierten Einschränkungen der Lebensqualität bei jungen Erwachsenen. Neben der beeinträchtigten kardialen Funktion weisen diese Patienten oftmals auch Veränderungen im Bereich der humoralen und zellulären Immunität auf. Ein Teil der Patienten entwickelt Autoantikörper, die sich gegen den kardialen β1-adrenergen Rezeptor richten und ihn ähnlich wie der natürliche Ligand Adrenalin aktivieren. Hieraus resultiert eine chronische Überstimulation des Rezeptors, die über eine initiale Hypertrophie dann zu einer eingeschränkten Pumpfunktion führt. Nachdem sich die Therapie der Antikörper-vermittelten Immunkardiomyopathie bisher auf die Behandlung der Herzinsuffizienz und die Kontrolle der Herz-insuffizienzsymptome beschränkt, könnten β1-ECII-homologe Peptide als Antikörper-Fänger bei Antikörper-positiven Patienten nun einen kausalen Therapieansatz darstellen. In diesem Zusammenhang wurden ein aus 25 Aminosäuren bestehendes zyklisches Peptid, eine aus 18 Aminosäuren bestehende Zyklopeptid-Mutante und ihre jeweiligen linearen Äquivalente im Rattenmodell auf Antikörper-neutralisierende Effekte und potentielle therapeutische Wirksamkeit getestet. Das Rattenmodell ist hierfür besonders geeignet, da die Aminosäuresequenz der funktionell wichtigen zweiten extrazellulären Domäne des β1-adrenergen Rezeptors (β1-ECII) bei Mensch und Ratte absolut identisch ist. Auf immunologischer Ebene konnte der Titer der krankheitsinduzierenden β1-ECII-Antikörper bereits nach der ersten Applikation zyklischer Peptide relevant gesenkt werden und nahm im weiteren Verlauf der Behandlung kontinuierlich ab. Nach Zyklopeptidgabe kam es am Herzen zu einer Reduktion des linksventrikulären Durchmessers und zu einer fast vollständigen Normalisierung der anatomischen Proportionen. Auf die Morphologie der Myozyten selbst und auch den Kollagengehalt des Gewebes hatte die Zyklopeptidtherapie keinen wesentlichen Einfluss. Die funktionellen Eigenschaften des Herzens ließen sich durch die Neutralisation stimulatorischer β1-ECII-Antikörper mittels intravenöser Zyklopeptidapplikation deutlich verbessern: Die Verkürzungsfraktion des linken Ventrikels und der Herzindex als Parameter für die kardiale Leistungsfähigkeit konnten durch die Behandlung wieder weitgehend normalisiert werden. Diese im Tiermodell erzielten Ergebnisse lassen einen therapeutischen Effekt der Zyklopeptide vermuten. Der Ansatz einer spezifisch gegen Antikörper gerichteten Therapie zur Behandlung von Patienten mit β1-Antikörper-positiver Herzinsuffizienz erscheint daher vielversprechend. N2 - Cardiomyopathies are disorders of the heart with particular morphological and physiological characteristics. Cardiomyopathies with unknown origin resulting in progressive left ventricular dilatation and reduced cardiac contractility are named idiopathic dilated cardiomyopathy (DCM). It is the most common cause of heart failure with its associated severe limiting symptoms in young adults. Besides the compromised cardiac function, those patients frequently also exhibit alterations in the humoral and cellular immunity. Some of them develop autoantibodies targeting and activating the cardiac β1-adrenergic receptor similar to its natural ligand epinephrine with a subsequent chronic overstimulation and a decline in left ventricular contractile function. Since the therapy of antibody mediated immune cardiomyopathy has been restricted to the treatment of the heart failure and its concomitant symptoms β1-ECII homologous peptides may constitute a new approach by neutralizing harmful antibodies. Therefore, a 25 amino acid cyclic peptide, a 18 amino acid cyclic peptide mutant, and their linear equivalents were tested for antibody scavenging and potential therapeutic effects in the rat. The rat model was chosen because the amino acid sequence of the functionally important second extracellular loop of the β1-adrenergic receptor (β1-ECII) is completely homologous between human and rat. In contrast to linear peptides, cyclic peptides significantly reduced the β1-ECII antibody titer despite continuous immunization with the disease inducing antigen. Cyclopeptides also achieved a nearly complete restitution of the left ventricular proportions without a significant change in cardiomyocyte morphology or collagen content. In addition, important cardiac parameters such as fractional shortening and cardiac index were clearly improved. The results obtained suggest a therapeutic effect of the applied cyclopeptides. Thus, epitope mimicking cyclic antibody scavengers may open up new perspectives in the treatment of β1-antibody positive heart failure in humans. KW - Dilatative Kardiomyopathie KW - Immunkardiomyopathie KW - Autoimmunerkrankung KW - Peptidtherapie KW - Zyklopeptid Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101935 ER - TY - THES A1 - Sumski, Anna Magdalena T1 - Adenosinrezeptoren auf Zervix-, Uterus- und Mammakarzinomzellen T1 - Adenosine receptors in cervical, uterine and breast cancer cells N2 - Adenosinrezeptoren werden auf nahezu allen Körperzellen exprimiert und übernehmen dort vielfältige und wichtige Funktionen. Auch auf diversen Tumorzelllinien konnten bereits Adenosinrezeptoren nachgewiesen und – je nach Subtyp – mit Pro- oder Anti-tumor-Effekten in Zusammenhang gebracht werden. In dieser Arbeit wurden Gebärmutterhalskrebszellen sowie endometriale und triple-negative Brustkrebszellen auf Expression und mögliche Funktionen von Adenosinrezep-toren untersucht. Da spezifische Antikörper bis heute nicht verfügbar sind, wurde ein pharmakologischer Ansatz mit subtypspezifischen Agonisten und Antagonisten gewählt. In Radioliganden-Bindungsassays, konnte nachgewiesen werden, dass sich auf der Zer-vixkarzinom-Zelllinie SiHa und der Brustkrebs-Zelllinie HCC1806 Adenosinrezeptoren des Subtyps A1 befinden. Die endometrialen Krebszelllinien Ishikawa und HEC-1-A exprimieren Rezeptoren vom Subtyp A1 und A2A. A3-Adenosinrezeptoren wurden auf keiner der untersuchten Zelllinien gefunden. Der Nachweis von A2B-Rezeptoren kann mit dem Radioliganden-Bindungsassay nicht erbracht werden, da bislang kein Radioligand bekannt ist, der eine ausreichende Affini-tät besitzt, um diesen Subtyp zweifelsfrei nachweisen zu können. Obwohl die Mehrheit der untersuchten Zelllinien Adenosinrezeptoren exprimiert, konnte ein signifikanter Effekt auf die Adenylatcyclase bei Stimulation der auf den Zellen vorhandenen Adenosinrezeptoren nur bei den HEC-1-A-Zellen festgestellt werden. Auch auf funktionelle A2B-Rezeptoren fand sich im Adenylatcyclaseassy kein Hinweis. Im durchgeführten Kristallviolettassay zeigte sich ein proapoptotischer Effekt auf Ishi-kawa- und HEC-1-A-Zellen bei hohen Adenosin-Konzentrationen (100 µM). Die im BrdU-Assay gemessene Proliferationsrate hingegen änderte sich nach Vorbehandlung mit Adenosin nicht. Das metabolisch stabilere NECA (in Kombination mit ADA) hatte im Kristallviolettassay einen stärkeren Einfluss auf die Apoptoserate der jeweiligen Zelllinie als Adenosin und auch im BrdU-Assay sank die Menge an inkorporiertem BrdU. Ein Synergismus zwischen Stimulation von Adenosinrezeptoren und diversen Todesliganden bzw. Chemotherapeutika konnte nicht nachgewiesen werden. Freies extrazelluläres Adenosin kann auch aus dem Abbau von ATP generiert werden, wenn Zellen die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 exprimieren. Aufgrund der im-munsuppressiven Wirkung von Adenosin können diese Enzyme T-Zell- und NK-Zellantworten im Mikromilieu von Tumoren hemmen. Die durchflusszytometrische Analyse von HEC-1-A- und Ishikawa-Zellen zeigte zwar, dass die Expression von CD39 und CD73 nach Stimulation der Adenosinrezeptoren unverändert blieb. Die Ex-pression von Enzymen, lässt aber vermuten, dass die Zellen in vivo von Adenosin profi-tieren könnten. Angesichts der in vitro Daten, die allenfalls einen wachstumshemmen-den Effekt von Adenosin zeigten, könnte die vorrangige Wirkung von Adenosin im Tumormikromilieu tatsächlich auf der Inhibition von Immunantworten beruhen. Mög-licherweise würden die Rezeptoren dann in erster Linie als Sensoren dienen. Weitere Forschungsarbeit wird helfen, die Rolle der Adenosinrezeptoren im Tumorge-schehen vollständig zu verstehen und möglicherweise für die Krebstherapie nutzbar zu machen. N2 - In this thesis, cell lines from cervical, endometrial and triple-negative breast cancer were investigated for expression and putative functions of adenosine receptors. Due to the lack of specific antibodies, a pharmacological approach using subtype-specific agonists and antagonists was taken. Radio ligand binding assays showed that adenosine receptors of the A1 subtype are expressed by SiHa cervical cancer and by HCC1806 breast cancer cells. Receptors of the A1 and A2A subtype are expressed by the endometrial cancer cell lines Ishikawa and HEC-1-A. A3 adenosine receptors could not be detected in any of the 5 investigated cell lines and the presence of receptors of the A2B subtype cannot be assessed with the available ligands. However, while the majority of the cell lines expressed adenosine receptors, a significant effect of adenosine receptor stimulation on adenylylcyclase activity was only detected in HEC-1-A cells. In crystal violet assays, high concentrations (100 µM) of adenosine showed a proapoptotic effect in Ishikawa- and HEC-1-A cells. The proliferation rate as measured by BrdU uptake was not affected by adenosine. The metabolically more stable adenosine receptor agonist NECA (in combination with ADA) had, in contrast, a stronger impact on the rate of apoptosis in the respective cell lines. Moreover, NECA also reduced BrdU uptake. Using various chemotherapeutics and death ligands, no synergy was observed between stimulation of adenosine receptors and further death stimuli. Free extracellular adenosine can also be generated from ATP when cells express the ectonucleotidases CD39 and CD73. Due to the immunosuppressive effect of adenosine, these enzymes can inhibit T cell and NK cell responses in the tumor microenvironment. Flow cytometry, however, showed that expression of CD39 and/or CD73 remained unaltered after stimulation of adenosine receptors. Thus, further investigations will be required to reveal the functional role of adenosine receptor expression on the investigated tumor cell lines. KW - Adenosinrezeptor KW - Rezeptor KW - Adenosin KW - Gebärmutterhalskrebs KW - Brustkrebs KW - Liganden KW - Adenylatcyclaseassay KW - FACS KW - Bindungsassay KW - BrdU Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99332 ER -