TY - THES A1 - Flunkert, Julia T1 - Analyse genetischer Stabilität in den Nachkommen bestrahlter Zellen mittels klassischer Chromosomenbänderung und verschiedener Hochdurchsatz-Techniken T1 - Analysis of genetic stability in the clonal descendants of irradiated cells using conventional chromosome banding and various high-throughput methods N2 - Ionisierende Strahlung (IR) ist in der medizinischen Diagnostik und in der Tumortherapie von zentraler Bedeutung, kann aber Genominstabilität und Krebs auslösen. Strahleninduzierte Genominstabilität (RIGI) ist in den klonalen Nachkommen bestrahlter Zellen zu beobachten, die zugrundeliegenden Mechanismen sind jedoch noch unverstanden. Zur Erforschung von verzögerten Strahleneffekten wurden primäre embryonale Fibroblastenkulturen mit 2 Gray bestrahlt und für 20 Populationsverdopplungen klonal expandiert. Zellen, die keiner Strahlung ausgesetzt waren, dienten als Kontrolle für normale Alterungsprozesse. Die Klone wurden durch klassische Chromosomenbänderungstechniken analysiert und in Abhängigkeit der Stabilität ihres Genoms in Gruppen eingeteilt. Ein Klon wurde als stabil gewertet, wenn die analysierten Metaphasen keinerlei Auffälligkeiten zeigten, während instabile Klone ein Mosaik aus normalen und abnormalen Metaphasen waren. Die Zellen von zwei Spendern wurden untersucht, um interindividuelle Strahleneffekte zu beurteilen. Nach Bestrahlung hatten mehr als die Hälfte der Klone Metaphasen mit strukturellen Aberrationen und wurden dementsprechend als instabil eingestuft. Drei Klone zeigten zudem numerische Aberrationen, die ausschließlich das Y Chromosom betrafen. Fluoreszenz in situ Hybridisierungen verifizierten diese Beobachtung in weiteren Klonen und deuteten an, dass der Verlust des Y Chromosoms mit RIGI assoziiert ist. Molekulare Karyotypisierungen mit SNP Arrays ergaben, dass IR in den Klonen Veränderungen der Kopienzahl auslöst. Ein Unterschied zwischen chromosomal stabilen und instabilen Klonen konnte jedoch nicht detektiert werden. Chromosomale Regionen, in denen sich bekanntermaßen fragile Stellen befinden, zeigten eine Anhäufung von CNVs. Ein RIGI Effekt konnte für die fragile Stelle 3B, in der sich das Gen FHIT befindet, identifiziert werden. Exom Sequenzierungen von Klonen und der entsprechenden Massenkultur zeigten eine alterungsassoziierte Entstehung von Varianten. Der Effekt wurde durch die Einwirkung von Strahlung erhöht. Auf Ebene von einzelnen Nukleotiden konnten ebenfalls Anhäufungen von Schäden in bestimmten genomischen Bereichen detektiert werden, dieser Effekt ging ohne die typischen RIGI Endpunkte einher. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass strahlenbedingte Veränderungen auf verschiedenen Ebenen (Chromosomen, Genkopienzahl und einzelnen Nukleotiden) beobachtet werden können, welche, unabhängig von RIGI, die Tumorentstehung begünstigen. Speziell Veränderungen im FRA3B Lokus und der Verlust des Y Chromosoms scheinen jedoch über die Destabilisierung des Genoms zur Krebsentstehung beizutragen. N2 - Ionizing radiation is important in medical diagnosis and cancer treatment but can lead to genomic instability and secondary malignancies as a late effect. Radiation induced genomic instability (RIGI) can be observed in the progeny of irradiated cells but the underlying cellular processes remain to be elucidated. To study delayed genetic radiation effects, single cell fibroblast clones from two different male donors were established after a single X ray dose of 2 Gray. Non irradiated cells were used as controls to account for aging related effects. Clones were characterized using chromosome banding analysis. Stable clones were endowed with no karyotype abnormalities in all analysed metaphases after 20 Population doublings, whereas unstable clones showed both normal and abnormal metaphases. Two fibroblast strains were used to detect differences in radiation sensitivity. More than half of the irradiated clones were chromosomally abnormal and thus classified as unstable. Both banding analysis and fluorescence in situ hybridization revealed an increased rate of Y chromosome loss in irradiated clones which might be associated with RIGI. Using SNP Arrays, an increased rate of de novo copy number variations (CNVs) was detected in the progeny of irradiated cells when compared to non irradiated controls. However, a significant difference between chromosomally stable and unstable clones was not found. CNVs clustered in chromosomal regions that are associated with known fragile sites. The fragile site 3B, which encompasses the gene FHIT, was found to be affected by CNVs in unstable clones suggesting a RIGI related effect. Exome sequencing of clones and the respective primary cultures revealed an increased rate of variants during in vitro aging. This effect was further increased by radiation exposure. Analysis of single nucleotides showed a RIGI independent accumulation of damage in specific regions. The results of the present study show that radiation induced changes can manifest as chromosomal abnormalities, copy number variations and DNA sequence mutations promoting tumorigenesis independent from RIGI. However, changes in FRA3B and loss of Y chromosome might trigger cancer through destabilizing the genome. KW - Ionisierende Strahlung KW - High throughput screening KW - Instabilität KW - Strahleninduzierte Genominstabilität KW - Genom KW - Genetik Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-173670 ER - TY - THES A1 - Guckenberger, Matthias T1 - Analyse des Hitzeschocks bei Neisseria meningitidis mit DNA-Microarrays T1 - Analysis of the heat shock response of Neisseria meningitidis with DNA microarrays N2 - Das Gram negative Bakterium Neisseria meningitidis ist weltweit ein bedeutender Erreger der bakteriellen Meningitis. Obwohl das ausschließlich humanpathogene Bakterium in bis zu 25% der Europäischen Bevölkerung die oberen Atemwege als harmloser Kommensale besiedelt, kommt es unter bestimmten, noch nicht ganz verstandenen Bedingungen zu einer klinisch manifesten Infektion. In dieser Arbeit wurde die neue Technologie der DNA Mikroarray Technologie für die Untersuchung des Transkriptoms bei Neisseria meningitidis etabliert. Untersucht wurde die Reaktion von N. meningitidis auf einen Hitzeschock, eine plötzliche Steigerung der Temperatur. Während einer Infektion wird das Bakterium durch induziertes Fieber sehr ähnlichen Bedingungen ausgesetzt. Im Ergebnis erlaubten die RNA Expressionsanalysen nicht nur eine sichere Unterscheidung deregulierter Gene von Genen mit konstanter Expression, sondern es konnte auch das Ausmaß der Deregulation exakt bestimmt werden. Die Daten der DNA Mikroarray Experimente wurden mit der etablierten Technik der RT-PCR exakt bestätigt. Bei den Hitzeschock-Versuchen mit Neisseria meningitidis konnten zahlreiche ORFs als Hitzeschock-Gene identifiziert werden. Die Funktion dieser Gene, darunter groEL/groES und dnaJ/dnaK, war bereits bei anderen Organismen beschrieben worden, was die Qualität und Reproduzierbarkeit der Ergebnisse unterstreicht. Es konnte gezeigt werden, dass die Intensität des Hitzeschocks und damit die Deregulation der Hitzeschock-Gene mit steigender Temperatur zunimmt. Eine Erklärung für dieses interessante Ergebnis wäre, dass mit Steigerung der Temperatur der Schaden im Bakterium zunimmt und dadurch auch mehr Hitzeschock Proteine zur Reparatur benötigt werden. Daneben wurde erstmals die transkriptionelle Beeinflussung von Genen aus dem Bereich der Transformation durch einen Hitzeschock gefunden. Diese Daten konnten durch einen phänotypischen Nachweis der Verminderung der Transformationsaktivität von Meningokokken nach einem Hitzeschock bestätigt werden. Diese neue Technik wird eine der Schlüsseltechnologien für die Forschung in der postgenomischen Ära sein. Viele Fragen in dem noch lückenhaften Wissen über die Pathologie von Neisseria meningitidis sollen sich in Zukunft mit Hilfe der DNA Mikroarrays beantworten lassen. N2 - The Gram negative bacteria Neisseria meningitidis is a major pathogen of meningitis throughout the world. Although N. meningitidis can be found in the upper airway of up to 30% of European population, it is unclear what exactly causes a clinical infection. Here we established the new technique of DNS microarrays to examine the transcriptional response of N. meningitidis to a rapid increase of temperature, a heat shock. During an infection, the bacteria could encounter similar stress situations when causing high fever. Using rising temperatures from 37oC up to 45oC an increasing number of the 59 selected N. meningitidis ORFs showed dereglulation. Deregulated and not deregulated ORFs were successfully confirmed using semi quantitative RT-PCR. Among these upregulated ORFs there were already known heat shock genes like groEL / groES and dnaJ / dnaK and the alternative sigma factors rpoD and rpoH. These ORFs showed an increasing upregualtion with rising temperatures. An explanation for this interesting result could be that higher temperatures cause more damage to the bacteria and therefore more heat shock proteins are needed for repair. The heat shock response of E. coli has been analysed using whole genome DNS microarrays and these data were in very good concordance with our results. This proofs the excellent quality of the data produced with N. meningitidis DNS microarrays. Besides we found a number of ORFs to be downregulated confronted with high temperatures during heat shock: Mainly ORFs of aerobic and anaerobic metabolism but also ORFs pilM – pilQ. A deregulation after heat shock of these 5 ORFs has not been reported before. These pil ORFs are essential for assembly of type IV pili. Type IV pili are responsible for binding of free DNS, the first step in the process of transformation. A downregulation of these ORFs should be followed be lowered synthesis of type IV pili and therefore decreased transformation activity. As expected, after exposure to a heat shock the transformation activity of Neisseria meningitidis was lowered up to 10% of normal activity. Summarizing, we successfully established the promising technique of DNS microarrays for Neisseria meningitidis, a technique that hopefully will proof as a beneficial tool for examining bacterial pathogenesis and finding new ways of treatment or prevention. KW - Neisseria KW - meningitidis KW - Hitzeschock KW - Microarray KW - Genom KW - Neisseria KW - meningitidis KW - heat KW - shock KW - Microarray Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8952 ER - TY - THES A1 - Paunescu, Karina T1 - DNA-Stabilität und Thioredoxin/Thioredoxin Reduktase im Zellkern T1 - DNA-Stability and thioredoxin/thioredoxin reductase in nucleus N2 - Das System Thioredoxin /Thioredoxin Reduktase(Trx/TrxR) ist ein sehr versatiles System zur neutralisation reaktiver Sauerstoffspezies, zur Regulation redox-sensitiver Vorgänge und zur Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie Steroidhormonrezeptoren, AP-1 und NFkB. Das Enzym Thioredoxin Reduktase war zunächst nur als zytosolisches Enzym beschrieben, es ist mittlerweile bekannt, dass es z. B. nach Phorbolester-Stimulation auch sezeniert werden kann. Adäquate Stimuli für die nucläere Translokation von Trx sind z. B. UV-Licht und TNF-Signalling. Zudem wurde in der vorhandenen Arbeit anhand transienter Transfektion und immunhistochemischer Untersuchungen nachgewiesen, dass beide Komponenten des Systems auch im Zellkern präsent sind. Ein Teil er Arbeit stellt die Charakteriesierung der subzellulären Lokalisation zweier Isoformen von Thioredoxin Reduktase 1 mit unterschiedlichem N-Terminus dar. Es konnte gezeigt werden, dass die beiden Isoformen als mRNA und Protein vorhanden sind. Es wurde dann die Interaktion des Enzyms Thioredoxin Reduktase mit anderen Komponenten des Zellkerns, hier speziell mit Enzymen der DNA-Prozessierung untersucht. Zudem wurde in einem Immunpräzipitationsansatz ("Pull-Down-Assay") nucläere Interaktionspartner des Enzyms charakterisiert. Diese Partner sollen nach Gelelektrophorese und MALDI-TOF-Analyse identifiziert werden. Zu den DNA-Prozessierungsenzyme zählt auch Topisomerase I. Durch Antikörpervermittelte Assays gelang es nachzuweisen, dass Topoisomerase I mit TrxR eine Protein-Protein-Wechsekwirkung eingeht. In einem Rekonstruktionssystem mit rekombinanter Topoisomerase I und gerenigter TrxR ergab sich jedoch keiner Hinweis für eine funktionelle Interaktion in DNA-Relaxations-Assay. Die Aufschlüsselung der Protein-Protein-Interaktion, der detaillierten molekularen Mechanismen und ihrer physiologischen relevanz bleibt weiteren Unterschungen vorbehalten. N2 - The mammalian thioredoxin system consists of thioredoxin (Trx), thioredoxin reductase (TrxR), and NADPH. Human Trx was originally cloned as a soluble factor named adult T-cell leukemia-derived factor, which was purified from the conditioned medium of human T-cell lymphotrophic virus-I-transformed CD4+ T-cell line, ATL-2 (Yodoi, J., et al.1992, Nakamura, et al. 1992, 1997, Tagaya, Y., et al. 1989). It participates in many different types of reactions including synthesis of deoxyribonucleotides , redox control of transcription factors, reduction of peroxides, and regulation of apoptosis. The thioredoxin reductases (TrxRs) belong to the flavoprotein family of pyridine nucleotide-disulphide oxidoreductases that includes lipoamide dehydrogenase, glutathione reductase and mercuric ion reductase. Members of this family are homodimeric proteins. Each monomer includes an FAD prosthetic group, an NADPH binding site and an active site containing a redox-active disulphide. Recently it has been reported that the human TrxR1 gene exhibits possible alternative splicing around its first exon (Rundlof AK, et al. 2001). The Arner group reported three isoforms of TrxR mRNA (I, II, V) and Tonissen group identified two further isoforms (isoforms IV and VI) and proposed another (isoform III), that would align with the mouse isoform III.In this work it could be demonstrated, that PCR using isoform specific oligonucleotide primers yielded products for both ATGs, indicating the existence of both mRNA species. Transient transfection of GFP fusion proteins (Trx-N1-EGFP, TrxR-N1-EGFP, TrxR-pDsRed2N1) into osteoblast cells (hFOB) revealed cytosolic localisation of both isoforms. While the isoform ATG1 was also nuclear, ATG2 was very rarely found in the nucleus. Transfection of the ATG1 to ATG2 fragment alone showed cytosolic and nuclear localisation accordingly. Staining of HFOBs and mesenchymal stem cells with Trx antibody revealed that Trx was preferentially localised in the nucleus; using an antibody to TrxR it was shown that the enzyme was always colocalized with Trx in mesenchymal stem cells, osteoblast-like cells and chondrocyte like cells. In summary we could characterise the subcellular localisation of the Trx/TrxR system in osteoblasts and mesenchymal stem cells with respect to the expression of TrxR isoforms. The role of the ribonucleotide reductase TrxR in the nucleus remains to be elucidated. Besides its well characterized function in modulation of transcription factor DNA binding, the role in nuclear antioxidative defense and/or DNA processing and repair might be hypothesized. KW - Genom KW - Thioredoxin KW - Thioredoxin Reduktase KW - Topoisomerase I KW - Tumorinstabilität KW - genom KW - Thioredoxin KW - Thioredoxin reductase KW - Topoisomerase I KW - Tumorinstability Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6999 ER -