TY  - THES
A1  - Kretzschmar, Martin
T1  - Antigenpräsentation zwischen naiven CD4+ T-Lymphozyten und dendritischen Zellen: Interaktionsdynamik und Kalzium-Signalgebung in 3D Kollagenmatrices und multizellulären Aggregaten
T1  - Antigen Presentation of naive CD4+ T-Lymphocytes and dendritic Cells: Interaction dynamics and Calcium Signalling in 3D Collagen Matrices and  multicellular  Aggregates
N2  - Die Interaktion von CD4+ T-Zellen mit antigenpräsentierenden dendritischen Zellen (DC) verläuft in statischen und dynamischen Phasen, die jeweils zur Ausbildung einer immunologischen Synapse und T-Zell-Aktivierung führen. Um die Signalgebung in den stabilen wie auch dynamischen Phasen näher zu charakterisieren, wurde der Kalziumeinstrom während der T-Zell-Aktivierung zeitaufgelöst untersucht. Dies wurde in 3D Kollagenmatrices und zusätzlich in 3D Zellclustern durchgeführt, um zu klären, ob sich dynamische produktive Kontakte auch in kollagenfreien, räumlich komplexen Mikromileus ausbilden. Kokulturen aus murinen, naiven CD4+ T-Zellen (DO 11.10) und Ova-Peptid beladenen DC (BALB/c) in 3D Kollagenmatrix sowie die T-Zell/DC Cluster in Flüssigkultur wurden mittels Konfokalmikroskopie gefilmt. Die Zelldynamik wurde digital analysiert. Der Ca2+-Einstrom der T-Zellen wurde mittels zeitaufgelöster Fluo 3-Detektion semiquantitativ analysiert. Sowohl im Kollagengel wie auch in Flüssigkulturen erfolgte wenige Sekunden nach der initialen Kontaktaufnahme über die Vorderfront der T-Zelle ein starker Ca2+-Einstrom in die T-Zelle. Das Signal blieb während der gesamten Interaktion und der Ablöse-Phase, solange der Uropod der T-Zelle mit der DC verbunden war, kontinuierlich erhöht. In den sich spontan bildenden multizellulären Clustern erbrachte die morphodynamische Analyse von Kontakten Ca2+-positiver T-Zellen je 50% dynamische bzw. stabil-statische Kontakte, zu deren Dynamik sowohl die T-Zellen als auch die DC beitrugen. Die Geschwindigkeit der dynamischen Kontakte betrug ca. 4 μm/min (1-6 μm/min) und lag damit ca. 50-90% unterhalb der Geschwindigkeit der freien Migration im Kollagen. Analog zu Interaktionen im 3D Kollagengel wurden für Ca2+-positive T-Zellen produktive serielle und teils simultane Kontakte mit mehreren DC nachgewiesen. Der Nachweis dynamischer produktiver Kontakte in kollagenfreien Zellclustern legt einen promigratorischen Effekt der umgebenden räumlichen Komplexität selbst nahe. Das Spektrum von statischen und dynamischen Interaktionsphasen in Abhängigkeit von der räumlichen Komplexität repräsentiert so eine inhärente Eigenschaft der Zelldynamik von T-Zellen und bildet Teilaspekte des in vivo Verhaltens von T-Zellen in Lymphknoten ab. Zukünftige Studien sind notwendig, um zu klären, wie Interaktionscharakteristika auch zur Differenzierung, Effektorfunktion und/oder Anergie von T-Zellen beitragen.
N2  - The interaction of CD4+ T cells with antigen presenting dendritic cells (DC) progresses in static and dynamic phases, each resulting in the formation of a immunologic synapse and subsequent activation of T cells. To characterise the signalling in static and dynamic contacts and to determine the dynamics of productive interactions in a collagen free 3D environment, time resolved calcium measurement was performed in 3D collagen matrices as well as in multicellular clusters. Murine naive CD4+ T cells (DO 11.10) and ova-peptide loaded dendritic cells (BALB/c) were coincubated in 3D collagen matrices or in liquid culture, here spontaniously aggregating to multicellular clusters. Interactions were filmed with confocal microscopy. Dynamics were digitally analysed. Ca2+ influx was semiquantitavely analysed by time resolved detection of Fluo 3. In collagen matrices as well as in liquid culture a strong Ca2+ influx within seconds after contact acquisition via the leading edge of the T cell was detected. This signal of elevated intracellular Ca2+ concentration was maintained during the whole interaction and detachement phase as long as the uropod was connected to the dentritic cell. In multicellular clusters 50% of contacts of T cells with elevated intracellular Ca2+ concentrations showed dynamic interaction characteristics with both, T cells and dendritic cells contributing to the dyamics of the interaction. Velocity of contacts was 4 μm/min (1-6 μm/min)witch is 50-90% less then the velocity of free migrating T cells in collagen. Multiple sequential and simulataneous contacts of Ca2+ T-cells with DC were registrated. The finding of dynamic contacts in collagen free 3D environments, as shown here in multicellular clusters, indicates a promigratory effect of the spatial complexity of environments itself.The spectrum of static and dynamic interactions in dependence to the spatial complexity of the environment indicates an intrinsic quality of the dynamics of T cells and may represent aspects of interaction behaviour of T cells in lymphnodes in vivo. Future studies will show, how this interaction characteristics influence differentiation and effector function of T cells.
KW  - Antigenpräsentation
KW  - Interaktion
KW  - Dynamik
KW  - Kalzium
KW  - Antigenpresentation
KW  - Interaction
KW  - Dynamics
KW  - Calcium
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18915
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schütz, Monika
T1  - Dynamik und Funktion der HMG-Proteine
T1  - Dynamics and Function of HMG-proteins
N2  - HMG-Proteine sind Architekturelemente des Chromatins und regulieren durch ihre Bindung an das Chromatin auf verschiedene Weise DNA-abhängige Prozesse wie Replikation, Transkription und DNA-Reparatur. Um zu verstehen, wie HMG-Proteine ihre vielfältigen Funktionen erfüllen können, wurde mit Hilfe von EGFP- und DsRed2-Fusionsproteinen ihre Funktion in vivo untersucht. Im Wesentlichen wurde dabei mit Hilfe von Bleichtechniken ihr dynamisches Verhalten charakterisiert. Daneben wurde für die HMGN-Proteine ihr bislang unbekanntes Expressionsverhalten in Tumorzellen bestimmt. So konnte für die HMGN-Proteine gezeigt werden, dass bestimmte Tumorzelllinien (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) eine relativ erhöhte Expression von HMGN2 aufweisen, die mit der Tumordifferenzierung korreliert. Eine relativ verringerte Expression von HMGN1 steht dagegen in Mammakarzinomen und Non-Hodgkin-Lymphomen in direktem Zusammenhang mit der Aggressivität der Tumore. Somit kann die HMGN-Expression bei diesen Tumoren als diagnostischer Marker verwendet werden. FRAP-Analysen mit EGFP-Fusionsproteinen führten zu der Erkenntnis, dass HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b und HMGB1 sich sehr schnell durch den Zellkern bewegen und nur transient an das Chromatin gebunden sind. Es konnte gezeigt werden, dass die spezifischen DNA/Chromatin-Bindungsmotive im Wesentlichen entscheiden, wo die Bindung der HMG-Proteine in vivo erfolgt, ihre Verweildauer im Euchromatin, Heterochromatin und zellzyklusabhängig dann aber durch Modifikationen (Phosphorylierungen, Acetylierungen) reguliert wird. Dies wurde beispielhaft durch punktmutierte und deletierte Fusionsproteine, sowie durch Inkubation der Zellen mit spezifischen Drogen für die HMGA1a-Proteine gezeigt. FRAP-Analysen haben außerdem gezeigt, dass die Spleißvarianten hHMGA1a und hHMGA1b unterschiedliche kinetische Parameter besitzen. Dies zeigt, dass beiden Varianten unterschiedliche Funktionen zugesprochen werden können. Die gefundenen spezifischen, transienten Verweildauern der einzelnen HMG-Proteine führen zu einem Modell eines dynamischen Chromatin-Netzwerkes, wobei alle HMG-Proteine in Wechselwirkungen innerhalb eines dynamischen Chromatinprotein-Cocktails DNA-abhängige Prozesse regulieren können. Die jeweiligen, wie hier gezeigt, durch Modifikationen regulierten Verweildauern der HMG-Proteine bestimmen darüber, welche anderen Chromatinproteine wie lange am Chromatin verbleiben und bestimmte Funktionen, wie beispielsweise die Modifikation der Core-Histone, übernehmen können. Die dynamischen Parameter einzelner HMG-Proteine erklären so, wie diese Proteine ihre vielfältigen Funktionen als Architekturelemente und bei der Regulation DNA-abhängiger Prozesse erfüllen können. Einige Vertreter, wie die HMGB1-Proteine, bewegen sich so schnell durch den Zellkern, dass ihre kinetischen Parameter durch das beschränkte zeitliche Auflösungsvermögen konfokaler Mikroskope der älteren Generation nicht erfassbar sind. Die Bestimmung von Dosis-Wirkungs-Beziehungen von Drogen, welche die kinetischen Parameter von HMGB1-Proteinen beeinflussen können, ist inzwischen mit Mikroskopen der neuen Generation möglich. Im Verlaufe der Arbeit zeigte sich, dass andere verwendete Fluorophore wie DsRed2 die kinetischen Eigenschaften von HMG-Fusionsproteinen beeinflussen können. Durch eine erhöhte Verweildauer können auch sehr transiente Interaktionen sichtbar gemacht werden. Wie gezeigt wurde, kann eine erhöhte Verweildauer aber auch zur Verdrängung anderer Proteine führen, die die gleichen Bindungsstellen benutzen und so eine Modulation des Chromatins bewirken. Die Nutzung von DsRed-Fluorophoren ermöglicht interessante neue Erkenntnisse. Diese müssen aber stets vor dem Hintergrund eines veränderten dynamischen Verhaltens der Fusionsproteine interpretiert werden. Zusammengenommen liefern die hier vorgestellten Ergebnisse zur Dynamik der HMG-Proteine grundlegende Informationen, die zur Klärung ihrer Funktion bei Chromatinmodulationen, etwa bei Differenzierungsprozessen oder der Entstehung von Tumorzellen entscheidend beitragen. Die Erkenntnis, dass diese Proteine lediglich transiente Interaktionen mit ihren Bindungspartnern eingehen können, sind im Hinblick auf die Behandlung von Tumoren, bei denen HMG-Proteine im Vergleich zu Normalgewebe häufig überexprimiert sind, von großer Bedeutung.
N2  - HMG proteins are architectural chromatin proteins that regulate different DNA dependent processes such as replication, transcription and DNA repair. To understand how HMG proteins manage to fulfill their multiple functions they were investigated in vivo with the help of EGFP and DsRed2 fusion proteins. Using photobleaching techniques their dynamic properties were characterized in detail. Furthermore, the expression pattern of HMGN proteins in tumor cell lines was investigated for the first time. As presented in this thesis, it was found that HMGN2 proteins exhibited an elevated expression level in some tumor cells (HT-29, FTC-133, MCF-7, RPMI 8226, 697, Ishikawa, LNCap) correlating with the tumor differentiation status. In contrast a reduced expression of HMGN1 found in Mammacarcinoma and Non-Hodgkin-Lymphoma correlated with tumor aggressiveness. Therefore the analyses of HMGN expression may be a suitable diagnostic marker at least in the tumors investigated. FRAP analyses with cells expressing EGFP fusion proteins revealed that HMGN1, HMGN2, HMGA1a, HMGA1b and HMGB1 move very rapidly through the cell nucleus and only bind transiently to chromatin. It was demonstrated that the decision where HMG proteins bind in vivo is essentially mediated by their specific DNA binding motifs. However, the individual residence times in eu- or heterochromatin and chromosomes are regulated by protein modifications (phosphorylation, acetylation). This has been demonstrated using point mutated and truncated HMGA fusion proteins and by the application of specific drugs as well. FRAP analyses also indicated that the splice variants HMGA1a and HMGA1b exhibit different kinetic properties. This supports the view that both variants have different functions. The kinetic parameters characteristic for each HMG protein lead to a model of a dynamic chromatin network in which all HMG proteins are able to regulate DNA dependent processes via multiple interactions with other proteins as components of a cocktail of dynamic chromatin proteins. In this model, individual residence times of all HMG proteins which are regulated by secondary modifications would determine how long other chromatin modulating proteins could reside on chromatin. Therefore the dynamic parameters of the HMG proteins directly affect the capability of other proteins to modulate chromatin structure, e.g. by modifications of core histones. This explains the multiple functions of HMG proteins in chromatin packaging and function. The kinetic parameters of some rapidly moving members of the HMG protein family, such as HMGB1, are beyond the time resolution capacities of most confocal microscopes. However, novel setups of modern confocal microscopes are now capable to determine the dynamic parameters of HMGB proteins and allow investigations of drug induced effects on HMGB dynamics. Control experiments revealed that other fluorophors such as DsRed2 modulate the dynamic parameters of HMG fusion proteins. Due to an increased residence time of HMG DsRed2 fusion proteins it is possible to monitor even very transient interactions. Moreover, it could be observed that this increased residence time may interfere with binding of other proteins (i.e. proteins which occupy the same binding sites) leading to a reorganization of chromatin. Thus, fusion proteins with DsRed fluorophores may be used as helpful tools to investigate protein functions. However, results should always be considered against the background of DsRed modulated kinetics and thus they should be interpreted very carefully. Taken together the results presented in this thesis provide novel information about the dynamic behaviour of HMG proteins which is crucial to understand how chromatin is modulated during differentiation processes or development of neoplasia. Their transient interactions with DNA or other proteins and the fact that overexpression correlates with tumor progression might be relevant for the development of novel strategies for tumor treatment.
KW  - HMG-Proteine
KW  - Chromatin
KW  - Genexpression
KW  - Tumor
KW  - HMG
KW  - Dynamik
KW  - Chromatin
KW  - EGFP
KW  - Tumorinstabilität
KW  - HMG
KW  - Dynamics
KW  - Chromatin
KW  - EGFP
KW  - Tumorinstability
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15627
ER  -