TY - THES A1 - Kiel, Tilman T1 - Untersuchungen zum Kernproteinimport in Progeriezellen und neue Möglichkeiten der Quantifizierung nukleärer Transportprozesse T1 - Nuclear transport in progeria cells and new possibilities to quantify nuclear transport N2 - Untersuchungen zum Kerntransport in Progeriezellen und neue Möglichkeiten der Quantifizierung nukleärer Transportprozesse N2 - Nuclear transport in progeria cells and new possibilities to quantify nuclear transport KW - Kerntransport KW - Progerie KW - Lamine KW - Kerntransport KW - Progerie KW - Lamine KW - nuclear transport KW - progeria KW - Lamin Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83798 ER - TY - THES A1 - Gößmann, Holger T1 - Untersuchungen zur Expression und Lokalisation des Adaptorproteins Kanadaptin T1 - Expression and localization of the adaptorprotein Kanadaption N2 - Kanadaptin ist ein Multidomänenprotein, das in der Ratte in nahezu allen Geweben vorkommt und über kernimport- und kernexport-aktive Sequenzen verfügt. Die kernimport-aktive Sequenz konnte der NLS1 (189RKRK) zugeordnet werden. Die Kernexportaktivität wird möglicherweise durch eine Leucin-reiche Domäne (414LLQEPELELEAAV) vermittelt. Zusätzlich ist Kanadaptin in Mitochondrien nachweisbar. In humanen Zellen wird eine Isoform gebildet, die über eine zusätzliche aminoterminale FHA-Domäne verfügt. Solche Proteine zeichnen sich u.a durch DNA-bindende Eigenschaften aus (Murakami and Okayama, 1995; Allen et al., 1994; Durocher and Jackson, 2002). Dies erklärt auch die nukleäre Retention von Kanadaptin nach Verlust Zellkernmembranintegrität (Hübner et al, 2002) Für eine nukleäre Funktion spricht auch, dass infolge der Expression eines Kanadaptin-cDNA-Fragments eine unter diesen Umständen (d.h. infolge der Expression DNA-bindender/modifizierender Proteine) spezifische SOS-Antwort in E. coli ausgelöst werden kann (Perkins et al., 1999). Die Ergebnisse deuten somit eindeutig daraufhin, dass Kanadaptin an nukleären und/oder nukleinsäureabhängigen Prozessen beteiligt ist. In der Niere wurde mit Hilfe der in-situ-Hybridisierung Kanadaptin hauptsächlich in proximalen Tubuluszellen detektiert. Insgesamt scheint eine Interaktion zwischen Kanadaptin und kAE1 inzwischen immer unwahrscheinlicher. Schließlich ließ sich eine Interaktion zwischen Kanadaptin und kAE1 im Hefe-2-Hybrid-System nicht mehr reproduzieren (Hübner, persönliche Mitteilung) (Wongthida P. et al., 2006). Auch in embryonalen Nierenzellen (HEK293-Zellen) konnte keine Interaktion zwischen humanem Kanadaptin und kAE1 nachgewiesen werden (Kittanakom et al., 2004). Welche Funktionen Kanadaptin intrazellulär ausübt bleibt weiterhin enigmatisch und muss in zukünftigen Untersuchungen herausgefunden werden. N2 - Kanadaptin is a multidomainprotein, which is expressed in almost all tissue of the rat. It has nuclear import - and export sequences. The import-dependent sequence was identified as NLS1 (189RKRK). The exportsequence might be a leucin-rich domain (414LLQEPELELEAAV). Kanadaptin is also detectable in mitochondrias. In human cells an isoform is produced, which has an aminoterminal insertion containing an FHA. Such proteins show dna-binding features (Murakami and Okayama, 1995; Allen et al., 1994; Durocher and Jackson, 2002). This feature might be the reason for nuclear retention, even after the loss of the integrity of the nuclear core membrane(Hübner et al, 2002). It was also shown, that human kanadaptin cDNA fragment is able to elicite an SOS-Response in an SOS detection E.coli strain(Perkins et al., 1999). These results indicate, that Kanadaptin is involved in DNA and/or DNA-dependent processes. In in-situ-hybridisation Kanadaptin was detetcted mainly in the prox. tubule of the rat kidney. An interaction between Kanadaptin and kAE1 seems less likely, especially since an interaction between the two proteins could not be reproduced in yeast two-hybrid experiments(Wongthida P. et al., 2006). Embryonal kidney cells (HEK293-Cells) also showed no Interaction between the two proteins(Kittanakom et al., 2004). The intracellular function(s) of kanadaptin remain enigmatic and are subject for futher research. KW - Niere KW - Zellkern KW - Kernproteine KW - Sammelrohr KW - Kanadaptin KW - Kerntransport KW - NLS KW - Kidney KW - Nuclear Import KW - nuclear localization sequence Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46218 ER - TY - THES A1 - Filser, Jörg T1 - Mislokalisation von Nup214/CAN auf beiden Seiten des Kernporenkomplexes in akuten myeloischen Leukämien – Eine erstmalige Darstellung des DEK-CAN Fusionsproteins auf der nukleoplasmatischen Seite des Zellkerns T1 - Mislocalization of NUP214/CAN on both sides of the nuclear pore complex in acute myeloid leukaemia – First description of a nucleoplasmic localisation of the DEK-CAN fusion protein N2 - Das elementare Kennzeichen der eukaryontischen Zelle ist der Zellkern, in welchem die Erbinformation in Form der DNA vorliegt. Dieser ist von einer äußeren Kernhülle umgeben, welche kontinuierlich in das endoplasmatische Retikulum übergeht. An der inneren Kernhülle setzt die Kernlamina an. Unterbrochen wird die Kernhülle durch die Kernporen. Diese bestehen aus Untereinheiten, welche als Nukleoporine bezeichnet werden. Eine wesentliche Aufgabe der Kernporen ist der Transport von Makromolekülen, welche durch spezifische Transportsignalsequenzen gekennzeichnet sind. Es mehren sich die Hinweise, dass die Nukleoporine nicht allein für den Kerntransport verantwortlich sind, sondern auch regulatorische Eigenschaften bei Mitose, der Expression von Proteinen und der Stabilisierung des Genoms übernehmen. Nach der Entdeckung der Philadelphia Translokation bei der chronisch myeloischen Leukämie wurden eine Reihe weiterer chromosomaler Translokationen im Rahmen von hämatologischen Neoplasien beschrieben. Hierbei sind auch Nukleoporine involviert. Es entstehen Fusionsproteine, welche ein neues Verteilungsmuster der Proteine erzeugen und möglicherweise auch neue Funktionen innehaben. Nup214/CAN ist ein Onkogen, welches in akuten myeloischen Leukämien mit einer chromosomalen Translokation einhergeht t(6;9). Diese Translokation t(6;9) ist mit einer schlechteren Prognose für den Patienten verbunden. Der genaue onkogene Mechanismus ist noch nicht ausreichend verstanden. Ziel dieser Doktorarbeit war die Frage, welches Verteilungsmuster Nup214 als Fusionsprotein mit einer veränderten NLS in Leukämiezellen der chromosomalen Translokation t(6;9) aufweist, zu beantworten. Zu diesem Zweck wurden die Fusionsproteinfragmente DEK, CAN Mitte und CAN 80/81 in E. coli exprimiert, aufgereinigt und der Herstellung eines spezifischen Antikörpers zugeführt. Hierzu wurden die mit den Proteinfragmenten transfizierten E. coli amplifiziert. Nach Lyse der Zellen wurden die Proteinfragmente elektrophoretisch getrennt und den ermittelten Molekulargewichten zugeordnet. Mit Hilfe einer Affinitätschromatographie und einem Proteintransfer auf Nitrozellulosemembran wurde mit polyvalentem Serum eine Affinitätsreinigung des Antikörpers durchgeführt. Dadurch konnten spezifische Antikörper generiert werden, welche in der Immunfloureszenz die physiologischen Verteilungsmuster zeigten. In einem nachfolgenden Schritt konnte in Kooperation mit dem Biologischen Institut Basel mittels Immuno-Gold-Lokalisation von Nup214/CAN in Leukämiezellen mit einer chromosomalen Translokation t(6;9) erstmalig die Lokalisation des Proteins auf zytoplasmatischer und nukleoplasmatischer Seite einer Kernpore gezeigt werden. Dies legt die Vermutung nahe, dass es durch diese Mislokalisation zu einer Störung des nukleären Transports kommen kann, der wiederum zu einem Wachstumsvorteil oder einer Inhibition der Apoptose der Leukämiezellen führt. N2 - The cell nucleus is the fundamental hallmark in eukaryotic cells. It is surrounded by the outer nuclear membrane, which pass into the endoplasmic reticulum. The inner nuclear membrane is lined with the lamina. Nuclear pore complexes interrupt the nuclear membrane. Subunits are called nucleoporines. One major task is the transport of macromolecules with a determined transport sequence. There is evidence, that nucleoporines are not only responsible for the nucleocytoplasmatic transport. They are also involved in mitosis, stabilisation of the genome or protein expression. After discovery of the Philadelphia translocation in chronic myeloid leukaemia a number of other chromosomal translocation in haematological neoplasm were depicted. New types of fusion proteins Nucleoporines are described, which have a new distribution pattern and also might have new functions. The nuclear pore protein Nup214/CAN is an oncogene in acute myeloid leukaemia characterized by a (6;9)(p23;q34) chromosomal translocation. The detailed oncogenic mechanism is still not well known. The objective of this thesis was the distribution pattern of Nup214 in leukaemoid blasts. For this purpose fragments of the fusion protein DEK, CAN Mitte, and CAN 80/81 were expressed in E.coli in order to generate a specific purified antibody. For this transfected E.coli were multiplied. After lysis protein fragments of the fusion protein were electrophoretically separated and then matched to the calculated molecular weight. After affinity chromatographic purification and protein transfer via Western Blot affinity purification was performed. With this procedure affinity purified antibodies were assembled. In cooperation with the Biological Institute Basel, Switzerland in leukaemia cells with a (6;9)-translocation, but not in controll cells, antibodies labelled both sides of the nuclear pore complex, indicating a localization of the oncogenic DEK-CAN fusion protein on the nucleoplasmic side of the NPC. This can be seen to imply, that mislocalization of Nup214/CAN in the fusion protein to the nucleoplasmic surface of the pore might disturb transport equilibrium and therefore benefit cell growth or lead to inhibition of apoptosis. KW - Kernpore KW - Nucleoporine KW - Nup214 KW - akute myeloische Leukämie KW - Kerntransport KW - Immunfluoreszenz KW - mono spezifischer Antikörper KW - Kernpore KW - Nucleoporine KW - Nup214 KW - akute myeloische Leukämie KW - Kerntransport KW - Immunfluoreszenz KW - mono spezifischer Antikörper KW - nuclear pore complex KW - nucleoporine KW - Nup214 KW - acute myeloid leukaemia KW - nucleocytoplasmatic transport KW - /immunofluorescence KW - mono specific antibody Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75977 ER - TY - THES A1 - Busch, Albert Franz Jakob T1 - Prälamin A und Progerie – verursachende Mutanten im Kontext nukleärer Transportprozesse, der Kernlaminaintegrität und CaaX – Prozessierung T1 - Prelamin A und truncated mutations in nuclear export, lamina integrity and CaaX processing N2 - Zur Charakterisierung nukleärer Proteinexportvorgänge wurde in dieser Arbeit zum ersten Mal ein System heterodimerisierender Fusionsproteine auf Basis des kommerziell verfügbaren ARGENT™ Regulated Heterodimerization Kit 2.0 von ARIAD verwendet. Die Expressionsvektoren wurden so verändert, dass ein CRM1 – vermittelter Proteinexport über die Zellkernhülle mittels Fluoreszenzmikroskopie in HeLa – Zellen und humanen Fibroblasten live oder nach Fixation dargestellt werden konnte. Der Export folgte in HeLa – zellen einer exponentiellen Kinetik, FN/C – Bestimmungen zwischen Wildtyp – und RD (Restriktive Dermopathie) – Fibroblasten ergaben keinen Unterschied im Proteinexport. Eine Inhibition der initialen CaaX - Prozessierung von trunkiertem Prälamin A (head/rod) durch Mevinolin ergab keine signifikante Akkumulationsveränderung des trunkierten Prälamins im Zellkern. Ergänzende subzelluläre Lokalisationsstudien unter Zuhilfenahme ausgewählter CaaX – Mutanten, um die gezeigte Unabhängigkeit der CaaX – Prozessierung zu verifizieren, stehen noch aus. FRAP – Untersuchungen in HeLa – Zellen zeigten für die episomal exprimierten trunkierten Fusionsproteine DsRed – Prälamin A Δ50 und DsRed – Prälamin A Δ90 keinen Unterschied in der lateralen Mobilität. Gegenüber dem Wildtyp – DsRed – Prälamin A ist die Beweglichkeit jedoch signifikant reduziert. Bei der Applikation von thermischem Stress (37°C – 51°C) auf Prälamin A, Prälamin A Δ50 oder Prälamin A Δ90 exprimierende HeLa – Zellen, konnte keine Veränderung hinsichtlich der subzellulären Verteilung des zusätzlich koexprimierten Markerproteins GFP – ß – Galaktosidase im Sinne nukleären Schrankenstörung festgestellt werden. Somit scheint die Kernhülle trotz der zu Zellkerndysmorphien und KPK – Fehllokalisationen führenden Prälamin A – Mutanten hinsichtlich ihrer Schrankenfunktion intakt zu bleiben. N2 - Lamin A and truncated forms were investigated adressing nuclear export, caax processing and laminar integrity. Nuclear export processes were investigated in vivo and in vivo via a modified heterdimerization assay. No difference was seen in human fibroblasts from wildtype and restrictive dermopathy patients concerning crm1-mediated nuclear export truncated prelamin A showed no enhanced nuclear localisation after inhibition of farnesylsynthesis. HGPS- and RD lamin A showed significantly decreased lateral mobility after 30 seconds in FRAP experiments. Applying heat stress to HeLa-cells showed no increased influx of the marker protein gfp-ß-galactosidase after 60 minutes. KW - Progeria infantilum KW - Progerie KW - Restriktive Dermopathie KW - Lamin A KW - Kerntransport KW - nuclear export KW - lamin A KW - progeria KW - restrictive dermopathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71662 ER -