TY - THES A1 - Zimmermann, Melanie Andrea T1 - Charakterisierung und Expressionsanalysen von Hämophilie-A-Mutationen T1 - Characterization and expression analysis of Hemophilia A mutations N2 - Bei einem kleinen Prozentsatz (2–3 %) aller molekulargenetisch untersuchten Hä-mophilie-A-Fälle konnte bislang keine kausale Mutation innerhalb der F8-Gen-Region aufgedeckt werden. Die molekularen Ursachen der Hämophilie dieser Patienten sollten im ersten Teil der vorliegenden Doktorarbeit mittels zusätzlicher Methoden aufgeklärt werden. Bei zwei Patienten mit milder Hämophilie A konnte je ein Basenaustausch im Promotorbereich des F8-Gens identifiziert werden. Um die Kausalität dieser Austausche zu überprüfen, wurden für diese und zwei weitere bereits publizierte Promotor-Mutationen Luciferase-Assays durchgeführt. Diese Ergebnisse machten deutlich, dass die nachgewiesenen Promotor-Mutationen die Aktivität des Promotors deutlich herabsetzen und daher als ursächlich einzustufen sind. Weiterhin wurden die übrigen Patienten auf epigenetische Veränderungen in fünf CpG-Inseln im 5’UTR und Intron 1 des F8-Gens untersucht. Hierbei konnten bei drei Patienten auffällige Methylierungsmuster nachgewiesen werden, wobei diese auf ein Klinefelter-Syndrom und genomische Veränderungen im Intron 1 zurückzuführen sind, nicht jedoch auf einen aberranten Methylierungsstatus, der die FVIII-Expression beeinflussen könnte. Mit Hilfe von mRNA-Untersuchungen konnten bei vier Patienten mit mutmaßlichen F8-Spleißmutationen aberrante F8-Transkripte nachgewiesen werden und somit die Kausalität der Mutationen geklärt werden. Des Weiteren wurden aus der Literatur alle bisher als kausal identifizierten stillen Mutationen und Spleißmutationen zusammengestellt, um mit diesen Ergebnissen die Spleißvorhersage-Software Alamut zu validieren. Die große Mehrzahl (78 %) der Spleißvorhersagen stimmte mit den Resultaten der mRNA-Untersuchungen (zumindest im Trend) überein, während es bei 22 % der Vorhersagen und mRNA-Analysen zu unterschiedlichen Resultaten kam. Innerhalb einer vorangegangenen Diplomarbeit konnten zehn Duplikationsbruch-punkte im F8-Gen von nicht verwandten Hämophilie-A-Patienten aufgeklärt werden. Diese wurden nun mit verschiedenen in-silico-Programmen analysiert, um die Sequenzumgebung der Bruchpunkt genauer zu beschreiben. Die Untersuchung ergab, dass verschiedene Mechanismen zur Entstehung von Duplikationen führen können und vermutlich mehrere Sequenzmotive in direkter Nähe der Bruchpunkte hierzu beitragen. Im Rahmen der molekulargenetischen Hämophilie-A-Diagnostik zum Nachweis von Intron-1- bzw. Intron-22-Inversionen sind einige Patienten mit schwerer Hämophilie A aufgefallen, welche ungewöhnliche Bandenmuster in den analytischen PCRs bzw. Southern-Blots aufwiesen. Mittels MLPA-Analysen wurden bei diesen Patienten Deletionen oder Duplikationen (CNVs) aufgedeckt, die meist allein die auffälligen Bandenmuster nicht erklären konnten. Weitere Long-Range-PCR-Untersuchungen belegten dagegen, dass fünf der untersuchten Fälle auf ein kombiniertes Inversions- und Duplikations- bzw. Deletionsereignis zurückzuführen sind. Als zweiter Teil der Arbeit wurden Transkriptions- und Translationsuntersuchungen von Nonsense-Mutationen des F8-Gens in einem zellulären Expressionssystem durchgeführt. Es konnte nachgewiesen werden, dass trotz Nonsense-Mutation eine komplette F8-Tran¬skrip¬tion stattfindet. Antigenanalysen konnten die Expression von trunkierten Proteinen nachweisen, wenn die Nonsense-Mutationen in der leichten Kette, d.h. den distalen Domänen A3, C1 oder C2, lag. Bei Nonsense-Mutationen in der schweren Kette (den proximalen Domänen A1, A2 oder B) war keine Proteinexpression nachweisbar. Diese Daten konnte durch intrazelluläre Immunlokalisation der trunkierten Proteine bestätigt werden. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die B-Domäne eine wichtige Rolle bei der Proteinprozessierung spielt, vermutlich indem sie die Bindung von Chaperonen ermöglicht und das FVIII-Protein vor Degradation schützt. N2 - Molecular F8 gene diagnostic procedures fail to reveal any causal mutation in 2–3 % of haemophilia A patients. In the first part of this thesis, DNA samples from these patients were analyzed to identify ‘non canonical’ F8 gene mutations. Two of these patients showed single base substitutions in the promoter region of the F8 gene. These two and two further previously reported nucleotide substitutions were analyzed by luciferase assays for their promoter activities. F8 promoter activity levels were clearly reduced due to the base substitutions illustrating the causality of these promoter mutations. The remaining patients were investigated for methylation aberrations in five CpG is-lands in the 5’UTR and intron 1 of the F8 gene. Three samples with aberrant meth-ylation status were detected, of which one was caused by the second X chromosome in a haemophilia patient with Klinefelter syndrome and the other two were caused by as yet undefined genomic alteration in intron 1. No aberrant methylation status was detected which could have influenced FVIII expression. In four patients with presumptive splice site mutations, mRNA analysis demonstrated the presence of aberrant F8 transcripts and therefore mutation causality could be confirmed. In addition, all experimentally proven silent and splice site mutations were extracted from the literature and the experimental results were compared to those of splice site prediction tools of the software Alamut. In 78 % of cases, splice prediction was found in good agreement with mRNA analyses. In my previous diploma thesis, the duplication breakpoints of ten unrelated haemo-philia A patients with duplications in F8 gene were characterized by PCR and se-quencing. The sequence data flanking the breakpoints were now analyzed with in silico tools in order to identify sequence motifs which could suggest mechanisms for the generation of duplications. These analyses identified several sequence motives which are assumed to contribute to DNA-repair-related rearrangements and sug¬ge-sted different mechanisms to be involved in the origin of duplications. Upon routine molecular diagnostic analysis of F8 intron 1 and intron 22 inversions by PCR or Southern blotting, a few haemophilia A patients with severe phenotype had revealed inconsistent band patterns. Subsequent MLPA analysis in five of these patients identified additional deletions or duplications (CNVs) which could not fully explain the abnormal band patterns. Further long range PCR experiments provided hints to a combination of CNV and inversion events. In the second part of this thesis, in vitro FVIII expression analyses were performed to investigate the impact of nonsense mutations in the F8 gene on transcription and translation. F8 mRNA analyses of both wild type and mutated constructs showed transcription of full-length mRNA. Polyclonal antigen assays were able to detect truncated proteins in cell lysates transfected with F8 constructs carrying nonsense mutations in the distal light chain, i.e. domains A3, C1 or C2. No protein expression was detectable from F8 constructs harbouring nonsense mutations in the proximal heavy chain, i.e. domains A1, A2 or B. These data were confirmed by intracellular immune localization of the truncated proteins. These results suggest an important role of the B domain during intracellular protein processing: it likely enables chaperone binding and thus protects the FVIII protein from degradation. KW - Hämophilie KW - Hämophilie A KW - Genmutation KW - Gerinnungsfaktor VIII KW - hemophilia KW - factor VIII KW - mutation mechanism KW - Nonsensmutation KW - Punktmutation KW - Mutation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85747 N1 - die vorgelegten Publikationen im Volltext (komplette Artikel) sind nur in der gedruckten Ausgabe enthalten ER - TY - THES A1 - Kandert, Sebastian T1 - Der Einfluss von Mutationen im LMNA-Gen auf die Struktur und Funktion des Zellkerns T1 - The impact of mutations in the LMNA-gen on structure and function of the nucleus N2 - Die Lamina ist ein Netzwerk aus Lamin-Proteinen und befindet sich unterhalb der inneren Kernmembran. Die Lamine A/C, die zu den Typ V Intermediärfilamenten gehören, spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der strukturellen Integrität des Zellkernes sowie der Chromatinorganisation, der Transkription, der DNA-Replikation, der Differenzierung und der Genomstabilität. In den letzten Jahren wurden über 200 verschiedene Mutationen im Lamin A/C kodierenden LMNA Gen gefunden, die mehr als 10 unterschiedliche Krankheiten, die so genannten Laminopathien, auslösen können. Zu diesen Laminopathien zählen unter anderem die Emery-Dreifuss-Muskeldystrophie (EDMD) und das Progerie-Syndrom. Die Mutation LMNA S143F In dieser Arbeit wurde zunächst die Punktmutation LMNA S143F, die in der N-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert ist, näher untersucht. Diese Mutation ist der Auslöser von einzigartigen phänotypischen Merkmalen einer frühen Myopathie sowie einer Progerie. Strukturelle Analysen mit dem Elektronenmikroskop ergaben, dass die primären dermalen Fibroblasten der Laminopathie-Patientin morphologisch veränderte Zellkerne hatten. In Abhängigkeit von S143F Lamin A/C konnte in den Patientenfibroblasten eine abnormale Lokalisation der Kernproteine Nesprin2 Giant und den kürzeren Nesprin2-Isoformen nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten wir beobachten, dass eine reduzierte Expression von Nesprin2 Giant eine Rolle bei der Ausprägung der morphologischen Kerndeformationen spielte. Patientenzellen, die Nesprin2 Giant in hohem Maße exprimierten, zeigten keine Deformationen des Zellkerns und eine normale Verteilung verschiedener Kernproteine. FRAP-Analysen in vivo und biochemische Proteinextraktionsstudien des S143F-Lamin A/Cs in vitro zeigten eine verringerte Mobilität und Dynamik, sowie eine reduzierte Löslichkeit von S143F Lamin A/C gegenüber wildtypischem Lamin A/C. Die Mutation LMNA S143F liegt im Außenbereich der coiled-coil-Struktur des Lamins. Dadurch führt der Austausch der neutralen AS Serin durch die große hydrophobe AS Phenylalanin nicht zu einer Störung in der Dimer-bildung, sondern zu einer Beeinflussung der Formierung zu Protofilamenten bzw. höheren Strukturen. Dies konnte durch in vitro Untersuchungen von rekonstituierten Parakristallen aus S143F Lamin A/C dargestellt werden, die eine Veränderung des transversalen Bänderungs-musters aufwiesen. Zusammengenommen zeigen die Resultate, dass die Mutation LMNA S143F die Lamin-A-Polymerisation beeinflusst und dadurch die Dynamik und Mobilität der Typ A-Lamine beeinträchtigt. Außerdem konnte erstmals nachgewiesen werden, dass das Nesprin2 Giant Protein eine essentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt, indem es die Struktur des Zellkerns verstärkt und als struktureller „Gegenspieler“ zu Lamin A/C fungiert. Die Mutation LMNA R545C Die Punktmutation LMNA R545C, die in der C-terminalen Domäne des Lamin A/C lokalisiert, ist Auslöser eines sehr gravierenden Phänotyps der autosomal dominanten Form der Emery- Dreifuss-Muskeldystrophie (AD-EDMD). Strukturelle Analysen ergaben, dass die primären Myoblasten des EDMD-Patienten morphologisch veränderte Zellkerne haben. Ein Vergleich von deformierten Kernen aus Zellen mit verschiedenen Laminopathie-auslösenden Mutationen wie LMNA R545C, LMNA S143F und LMNA R377H zeigten allerdings, dass die untersuchten Mutationen nicht immer zu gleichen abnormalen Phänotypen der Kernmorphologie, sondern zu divergenten Ausprägungen der morphologischen Kernveränderungen in Patientenzellen führten. Immunfluoreszenzanalysen ergaben, dass auch die Proteine Lamin A/C und Emerin in den Patientenzellen eine fehlerhafte Verteilung aufwiesen und „Honigwabenmuster“ ausbildeten. Interessanterweise konnte auch eine vom Alter der Zellen abhängige Akkumulation der 20S-Untereinheit des Proteasoms in kleine nukleäre Foci beobachtet werden. Diese Foci kolokalisierten weitgehend mit den promyelotischen Leukämie-Körperchen (PML). In den Patientenmyoblasten war der CDK-Inhibitor p21 stark angereichert, was ein Hinweis auf eine Beeinträchtigung der proteasomalen Funktion ist. Nach Kultivierung der Patientenmyoblasten in Minimalmedium zeigten diese eine eingeschränkte Fähigkeit zur ex-vivo Differenzierung zu Myotuben. Dementsprechend war die Expression des Myogenese-spezifischen Transkriptionsfaktors Myogenin, sowie des Proliferationmarkers hypophosphoryliertes Retinoblastoma-Protein in Patientenmyoblasten nicht korrekt induziert. Zusammengenommen weisen diese Daten darauf hin, dass auch die Mutation LMNA R545C Einfluss auf die Kernarchitektur und -Proteinverteilung, die Chromatinorganisation, Gen-expression und Funktion des Proteasoms einnimmt. Darüber hinaus beeinträchtigte die Mutation LMNA R545C die Fähigkeit zur korrekten Proliferation und Differenzierung der Myoblasten, welches eine potentielle Rolle in der Pathogenese von Laminopathien einnimmt. N2 - The nuclear lamina is a network of lamin polymers underlying the inner nuclear membrane. The lamins A/C, which are type V intermediatefilaments, are involved in the organisation of chromatin, gene regulation, DNA-replication, differentiation and the integrity of the genome. In recent years more than 200 mutations in the lamin A/C coding LMNA gene were discovered, which cause more than 10 genetic diseases, collectively termed as laminopathies. These laminopathies include the Emery-Dreifuss-muscular dystrophy (EDMD) and the progeria syndrome. The mutation LMNA S143F First we observed the S143F lamin A/C point mutation, located in the N-terminal domain of the lamin A/C. This mutation causes a phenotype combining features of myopathy and progeria. Structural analyses revealed that patient dermal fibroblast cells had dysmorphic nuclei containing numerous blebs and lobulations. The lamin S143F organization was altered, showing intranuclear and nuclear envelope aggregates and often presenting a honeycomb appearance. Subject to the S143F lamin A/C, there is a reduced expression and an altered distribution of nesprin2 giant and the shorter nesprin2 isoforms in patient fibroblasts. A subpopulation of mutant cells, however, expressing the nesprin2 giant isoform, did not show an overt nuclear phenotype. By contrast, nesprin2 giant deficient cells reveal an aberrant nuclear phenotype and a mislocalization of LAP2α and the transcriptional active form of the RNA-Polymerase II. More detailed analyses of the S143F lamin A/C structure by FRAP-analysis in vivo and biochemical extraction studies in vitro revealed that S143F lamin is less dynamic and dissoluble compared to wildtype lamin A/C. The LMNA S143F mutation occupies the surface of the coiled-coil-structure of the lamin A/C. Thus, the structural topology and particularly the substitution by a bulky, hydrophobic amino acid do not affect the lamin A/C dimer structure but rather perturb intermolecular interactions. This was confirmed by in vitro analysis of reconstituted paracrystals of lamin A/C, which exhibited an altered transversal stratification-pattern. Beyond that, another question was, whether there is a formation of heteropolymers of wildtype and S143F lamin A/C and a formation of homopolymers in vivo. BIFC-analysis confirmed that wildtype and mutated lamins had the capacity to form heteropolymers and homopolymers in vivo. Moreover, the wildtype homopolymers and the lamin A/C-heteropolymers localized correctly in the nuclear envelope. In contrast, the formation of the S143F lamin A/C homopolymers influenced their correct localization in the nuclear envelope and lead to an aberrant nuclear morphology. The mutation LMNA R545C Myoblasts of patients developing a serious form of the autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (AD-EDMD) in response to the R545C lamin A/C point mutation, located in the C-terminal domain, have been analyzed. Structural analyses revealed that subpopulations of these patient myoblast precursor cells had nuclear structural defects as lobulations, whose frequency increased with cell passages in culture. This overt phenotype was compared to other dysmorphic nuclei from laminopathy-causing mutations like LMNA S143F or LMNA R377H. These analyses pointed out, that each mutation leads to a specific nuclear phenotype. Immunofluorescence microscopy showed that the organisation of both lamin A/C and its inner nuclear membrane partner emerin were altered, showing a honeycomb appearance too. Furthermore, our data showed for the first time that in an EDMD context, a progressive accumulation of the 20S proteasomal core subunits into foci that largely colocalized with promyeolocytic leukemia bodies (PML) was obvious, as cells age in culture. Moreover, the impairment of proteasome function, as pointed out by p21 nuclear accumulation, may contribute to the high index of premature cellular senescence we observed in patient cells. Another signal concerning the premature senescence was the accumulation of heterochromatin in late passages and the one- to twofold increase of the nuclear volume of the patient myoblasts. When transferred into low serum medium, patient myoblasts expressing R545C mutated lamin A/C were deficient for ex-vivo differentiation into myotubes. Accordingly, the myogenesis transcription factor myogenin and the hypophosphorylated retinoblastoma-protein were not induced properly in patient myoblasts. These data suggest that the LMNA R545C mutation also affected the nuclear envelope architecture and the distribution of nuclear proteins, chromatin organization, gene expression and the proper function of the proteasome. Furthermore, the LMNA R545C mutation impaired both proliferation and differentiation capacities of myoblasts precursors as part of the pathogenesis of the AD-EDMD. KW - Krankheit KW - Genmutation KW - Kernproteine KW - Laminopathie KW - Lamin KW - LMNA S143F KW - laminopathy KW - lamin KW - LMNA S143F KW - nucleus Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36145 ER - TY - THES A1 - Reiß, Cora T1 - Einfluss von Defekten des Mismatch Reparatur Proteins MLH1 (Mut L Homolog 1) auf Fertilität und Tumorgenese im Mausmodell T1 - Impact of defects of the mismatch repair protein MLH1 (Mut L Homolog 1) on fertility and tumogenesis in mice N2 - Mutationen im humanen DNA Mismatch-Reparatur (MMR) Gens Mlh1 sind mit dem erblichen, nicht-polypösen Kolonkarzinom (Lynch Syndrom, HNPCC) und einem signifikanten Anteil sporadischer kolorektaler Tumore assoziiert. Zudem konnten MMR Defekte in sporadischen und erblichen Lymphom Erkrankungen beschrieben werden. In Zellen resultiert die Inaktivierung des Mlh1 Gens in der Akkumulation von somatischen Mutationen im Genom und einer erhöhten Resistenz gegenüber den genotoxischen Effekten einer Vielzahl von DNA schädigenden Agenzien. Mäuse, die ein Null Allel für das MMR Gen Mlh1 tragen zeigen einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickeln vorrangig B- und T-Zell Lymphome und mit geringerer Haufigkeit gastrointestinale Tumore. Zusätzlich sind Mlh1-/- Mäuse durch einen meiotischen Phänotyp charakterisiert, der zu Sterilitäten in beiden Geschlechtern führt. Um die Effekte von Mlh1 missense Mutationen auf die Tumoranfälligkeit zu untersuchen, erzeugten wir eine Mauslinie, die die häufig in HNPCC Patienten beschriebene MLH1G67R Mutation tragen, die in einer der ATP Bindungs-Domänen von MLH1 lokalisiert ist. Auch wenn die MLH1G67R Mutation in homozygot mutanten Mäusen in einer DNA Reparatur Defizienz resultierte hatte sie keinen Effekt auf die MMR vermittelte zelluläre Antwort auf DNA Schäden. Hierzu gehörte die apoptotische Antwort von Epithelzellen der intestinalen Mucosa auf Cisplatin, die in Mlh1-/- Mäusen defektiv jedoch in Mlh1G67R/G67R Mäusen normal ausfiel. Mlh1G67R/G67R mutante Mäuse zeigten wie Mlh1-/- Tiere einen starken Tumorprädispositions Phänotyp. Sie entwickelten jedoch im Vergleich zu Mlh1-/- Tieren signifikant weniger gastrointestinale Tumore, was darauf hinweist, dass Mlh1 missense Mutationen die Tumor supprimierende MMR Funktion in einer Gewebs-spezifischen Weise beeinflussen können. Darüber hinaus sind Mlh1G67R/G67R Mäuse, aufgrund der fehlenden Bindungsfähigkeit des MLH1G67R Proteins an die meiotischen Chromosomen im Pachytän Stadium, steril. Dies zeigt, dass die ATPase Aktivität von MLH1 für die Fertilität in Säugern essentiell ist. Diese Untersuchungen belegen, dass die Mlh1G67R Mutation die biologischen MLH1 Funktionen differentiell mit einem eindeutigen Phänotyp beeinflusst. Um die Rolle von MLH1 für die Lymphomagenese detaillierter untersuchen zu können, generierten wir ein neues Mausmodell mit einem konditionellen Mlh1 Allel (Mlh1flox/flox). Das Einkreuzen von transgenen EIIa-Cre Mausen in die Mlh1flox/flox Mauslinie führte zur konstitutiven Inaktivierung von MLH1. Die resultierende Mlh1Δex4/Δex4 Mauslinie zeichnete sich durch MMR Defizienz und einen zu Mlh1-/- Tieren vergleichbaren Tumorprädispositions Phänotyp aus. Zur T-Zell spezifischen MMR Inaktivierung kombinierten wir das Mlh1flox/flox Allel mit dem Lck-Cre Transgen. In den resultierenden Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist die MLH1 Inaktivierung auf doppelt positive und einzel positive Thymozyten und naïve periphere TZellen beschränkt. Die Entwicklung von T-Zell Lymphomen in Mlh1TΔex4/TΔex4 Mäusen ist im Vergleich zu Mlh1-/- Mäusen signifikant reduziert, was eine wichtige, Lymphom supprimierende MMR Funktion in frühen Stadien der T-Zell Entwicklung oder in lymphoiden Vorläuferzellen impliziert. N2 - Mutations in the human DNA mismatch repair (MMR) gene Mlh1 are associated with hereditary nonpolyposis colorectal cancer (Lynch syndrome, HNPCC) and a significant proportion of sporadic colorectal cancer. Furthermore, MMR defects have also been observed in sporadic and hereditary lymphoid malignancies. In cells the inactivation of MLH1 results in the accumulation of somatic mutations in the genome and an increased resistance to the genotoxic effects of a variety of DNA damaging agents. Mice carrying a null allele for the MMR gene Mlh1 show a strong tumor predisposition phenotype. They are preferentially prone to the development of lymphomas of B- and T-cell origin and to a lesser extent gastrointestinal tumors. Additionally Mlh1-/- mice are characterized by a meiotic phenotype leading to male and female sterility. To study the effect of Mlh1 missense mutations on cancer susceptibility, we generated a mouse line carrying the recurrent MLH1G67R mutation that is located in one of the ATP-binding domains of MLH1. Although the MLH1G67R mutation resulted in DNA repair deficiency in homozygous mutant mice, it did not affect the MMR-mediated cellular response to DNA damage, including the apoptotic response of epithelial cells in the intestinal mucosa to cisplatin, which was defective in Mlh1-/- mice but remained normal in Mlh1G67R/G67R mice. Similar to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice displayed a strong cancer predisposition phenotype. However, in contrast to Mlh1-/- mice, Mlh1G67R/G67R mutant mice developed significantly fewer intestinal tumors, indicating that Mlh1 missense mutations can affect MMR tumor suppressor functions in a tissue-specific manner. In addition, Mlh1G67R/G67R mice were sterile because of the inability of the mutant Mlh1G67R protein to interact with meiotic chromosomes at pachynema, demonstrating that the ATPase activity of MLH1 is essential for fertility in mammals. These studies demonstrate that the Mlh1G67R mutation differentially affects the biological functions associated with MLH1 with distinct phenotypic effects. To study the role of MLH1 for lymphomagenesis in more detail, we generated a new mouse model carrying a conditional Mlh1 allele (Mlh1flox/flox). Mating of these mice with EIIa-Cre recombinase transgenic mice allowed the constitutive inactivation of MLH1 and the resulting Mlh1Δex4/Δex4 mouse line displays complete MMR deficiency and a cancer predisposition phenotype similar to Mlh1-/- mice. For T-cell specific MMR inactivation we combined the Mlh1flox/flox allele with the Lck-Cre Transgene. In the resulting Mlh1TΔex4/TΔex4 mice, MLH1 inactivation is limited to double positive and single positive thymocytes and naïve peripheral Tcells. The development of T-cell lymphomas in Mlh1TΔex4/TΔex4 mice is significantly reduced compared to Mlh1-/- mice implicating that MMR functions either at very early stages during Tcell development or even earlier in lymphoid precursor cells to suppress lymphomagenesis. KW - Colonkrebs KW - Genmutation KW - DNS-Reparatur KW - MLH1 KW - HNPCC KW - Mutation KW - Mausmodell KW - Tumor KW - MLH1 KW - HNPCC KW - mutation KW - mousemodell Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53626 ER - TY - THES A1 - Beck, Katherina T1 - Einfluss von RSK auf die Aktivität von ERK, den axonalen Transport und die synaptische Funktion in Motoneuronen von \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - RSK2 alters ERK activity, axonal transport and synaptic function in motoneurons of \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - In dieser Arbeit sollte die Funktion von RSK in Motoneuronen von Drosophila untersucht werden. Mutationen im RSK2-Gen verursachen das Coffin-Lowry-Syndrom (CLS), das durch mentale Retardierung charakterisiert ist. RSK2 ist hauptsächlich in Regionen des Gehirns exprimiert, in denen Lernen und Gedächtnisbildung stattfinden. In Mäusen und Drosophila, die als Modellorganismen für CLS dienen, konnten auf makroskopischer Ebene keine Veränderungen in den Hirnstrukturen gefunden werden, dennoch wurden in verschiedenen Verhaltensstudien Defekte im Lernen und der Gedächtnisbildung beobachtet. Die synaptische Plastizität und die einhergehenden Veränderungen in den Eigenschaften der Synapse sind fundamental für adaptives Verhalten. Zur Analyse der synaptischen Plastizität eignet sich das neuromuskuläre System von Drosophila als Modell wegen des stereotypen Innervierungsmusters und der Verwendung ionotroper Glutamatrezeptoren, deren Untereinheiten homolog sind zu den Untereinheiten der Glutamatrezeptoren des AMPA-Typs aus Säugern, die wesentlich für die Bildung von LTP im Hippocampus sind. Zunächst konnte gezeigt werden, dass RSK in den Motoneuronen von Drosophila an der präsynaptischen Seite lokalisiert ist, wodurch RSK eine Synapsen-spezifische Funktion ausüben könnte. Morphologische Untersuchungen der Struktur der neuromuskulären Synapsen konnten aufzeigen, dass durch den Verlust von RSK die Größe der neuromuskulären Synapse, der Boutons sowie der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder reduziert ist. Obwohl mehr Boutons gebildet werden, sind weniger Aktive Zonen und Glutamatrezeptorfelder in der neuromuskulären Synapse enthalten. RSK reguliert die synaptische Transmission, indem es die postsynaptische Sensitivität, nicht aber die Freisetzung der Neurotransmitter an der präsynaptischen Seite beeinflusst, obwohl in immunhistochemischen Analysen eine postsynaptische Lokalisierung von RSK nicht nachgewiesen werden konnte. RSK ist demnach an der Regulation der synaptischen Plastizität glutamaterger Synapsen beteiligt. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte erstmals gezeigt werden, dass aktiviertes ERK an der präsynaptischen Seite lokalisiert ist und diese synaptische Lokalisierung von RSK reguliert wird. Darüber hinaus konnte in dieser Arbeit nachgewiesen werden, dass durch den Verlust von RSK hyperaktiviertes ERK in den Zellkörpern der Motoneurone vorliegt. RSK wird durch den ERK/MAPK-Signalweg aktiviert und übernimmt eine Funktion sowohl als Effektorkinase als auch in der Negativregulation des Signalwegs. Demnach dient RSK in den Zellkörpern der Motoneurone als Negativregulator des ERK/MAPK-Signalwegs. Darüber hinaus könnte RSK die Verteilung von aktivem ERK in den Subkompartimenten der Motoneurone regulieren. Da in vorangegangenen Studien gezeigt werden konnte, dass ERK an der Regulation der synaptischen Plastizität beteiligt ist, indem es die Insertion der AMPA-Rezeptoren zur Bildung der LTP reguliert, sollte in dieser Arbeit aufgeklärt werden, ob der Einfluss von RSK auf die synaptische Plastizität durch seine Funktion als Negativregulator von ERK zustande kommt. Untersuchungen der genetischen Interaktion von rsk und rolled, dem Homolog von ERK in Drosophila, zeigten, dass die durch den Verlust von RSK beobachtete reduzierte Gesamtzahl der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder der neuromuskulären Synapse auf die Funktion von RSK als Negativregulator von ERK zurückzuführen ist. Die Größe der neuromuskulären Synapse sowie die Größe der Aktiven Zonen und Glutamatrezeptorfelder beeinflusst RSK allerdings durch seine Funktion als Effektorkinase des ERK/MAPK-Signalwegs. Studien des axonalen Transports von Mitochondrien zeigten, dass dieser in vielen neuropathologischen Erkrankungen beeinträchtigt ist. Die durchgeführten Untersuchungen des axonalen Transports in Motoneuronen konnten eine neue Funktion von RSK in der Regulation des axonalen Transports aufdecken. In den Axonen der Motoneurone von RSK-Nullmutanten wurden BRP- und CSP-Agglomerate nachgewiesen. RSK könnte an der Regulation des axonalen Transports von präsynaptischem Material beteiligt sein. Durch den Verlust von RSK wurden weniger Mitochondrien in anterograder Richtung entlang dem Axon transportiert, dafür verweilten mehr Mitochondrien in stationären Phasen. Diese Ergebnisse zeigen, dass auch der anterograde Transport von Mitochondrien durch den Verlust von RSK beeinträchtigt ist. N2 - In this thesis the function RSK in motoneurons of Drosophila has been analyzed. Mutations in the RSK2-gene cause the Coffin-Lowry-Syndrome (CLS) which is characterized by mental retardation. RSK2 is predominantly expressed in regions of the brain where learning and formation of the memory take place. Even no obvious changes in brain structures could be observed at macroscopic level in mouse and Drosophila which serve as an animal model for CLS. However deficits in various learning tasks could be observed due to the loss of the RSK function. Synaptic plasticity and the following changes in synaptic properties are fundamental for adaptive behaviors. The neuromuscular system of Drosophila suits as a model for studies of the synaptic plasticity because of the stereotypic innervation pattern and the use of ionotropic glutamate receptors which subunits are homologous to the subunits of the mammalian AMPA-type of glutamate receptors which are essential for the formation of LTP in the hippocampus. This study shows that RSK is located at the presynaptic site of the motoneurons of Drosophila which indicates a synapse-specific function of RSK. The structural analysis of the neuromuscular junction (NMJ) show that the loss of RSK causes a reduction in size of the NMJ, boutons, active zones and glutamate receptor fields. More boutons were found at the NMJ, but less active zones and glutamate receptor fields were established. The localization of RSK at the postsynaptic side could not be detected in this study although RSK regulates the synaptic transmission by affecting the postsynaptic sensitivity but not the presynaptic neurotransmitter release. Hence RSK could take part in the regulation of synaptic plasticity. Immunohistochemical analysis could depict a novel function of RSK in the synapse-specific localization of ERK. Further this study show that due to the loss of RSK more activated ERK is located in den cell bodies of the motoneurons. RSK functions as a negative regulator of the ERK/MAPK signaling in the somata of motoneurons. Additionally, RSK could regulate the distribution of ERK in the different subcompartments of the motoneurons. Previous studies show ERK as a regulator of synaptic plasticity by influencing the insertion of AMPA receptors into the postsynaptic membrane during LTP. RSK is activated by the ERK/MAPK signaling and functions not only as an effector kinase but also as a negative regulator of this pathway. If the effect of RSK on synaptic plasticity is due to its function as a negative regulator of ERK should be clarified in this work. Analysis of the genetic interactions of rsk and rolled, the Drosophila homologue of mammalian ERK, show that the reduced number of active zones and glutamate receptor fields found at the NMJ of RSK null mutants is caused by the function of RSK as a negative regulator of ERK. In turn RSK affects the size of the NMJ, also the size of the active zones and glutamate receptor fields by its function as an effector kinase of the ERK/MAPK signaling. Several studies have shown that the axonal transport of mitochondria is affected in many neuropathological diseases. This work could uncover a novel function of RSK in the regulation of the axonal transport in motoneurons. The loss of RSK causes the formation of agglomerates of the presynaptic proteins BRP and CSP. Therefore RSK takes part in the regulation of the transport of presynaptic material. In absence of RSK less mitochondria are transported in anterograde direction and more mitochondria are pausing. This results implicate a function of RSK in regulating the anterograde transport of mitochondria. KW - Taufliege KW - RSK KW - axonaler Transport KW - synaptische Funktion KW - ERK KW - Motoneuron KW - Motoneuron KW - Genmutation KW - Drosophila Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-130717 ER - TY - THES A1 - Zirn, Birgit T1 - Expressions- und Mutationsanalysen in kindlichen Wilms Tumoren T1 - Expression and mutation analysis in pediatric Wilms Tumors N2 - kumulative Dissertation, vgl. Abstracts der angehängten Publikationen N2 - cumulative dissertation, see abstracts of original papers KW - Nephroblastom KW - Genexpression KW - Genmutation KW - Wilms Tumor KW - Nephroblastom KW - Expressionsanalyse KW - Wilms tumor KW - nephroblastoma KW - expression analysis Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20338 ER - TY - THES A1 - Schubert, Alice T1 - Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D mit Identifizierung von Interaktionspartnern in Drosophila melanogaster T1 - Immunohistochemical and functional characterisation of the serine/arginine protein kinase SRPK79D with identification of interaction partners in Drosophila melanogaster N2 - Auf der Suche nach Mutanten mit einer vom Wildtyp abweichenden Verteilung des Aktive Zone-Proteins Bruchpilot wurde die Serin/Arginin-Proteinkinase SRPK79D identifiziert. Hier zeigte sich, dass die Mutation im Srpk79D-Gen zu einer Agglomeration von Bruchpilot in den larvalen segmentalen und intersegmentalen Nerven führt. In der vorliegenden Arbeit sollte die SRPK79D genauer charakterisiert werden. Nach Präadsorptionen und Affinitätsreinigungen von in einer früheren Arbeit erzeugten Antiseren, gelang es die Lokalisation der überexprimierten SRPK79D-GFP-Isoformen zu bestimmen. Dabei zeigte sich, dass keines der Antiseren die endogene Kinase im Western Blot oder immunhistocheimisch detektieren konnte. Dies legt den Schluss nahe, dass die Expression der SRPK79D in einer geringen Konzentration erfolgt. Es war jedoch möglich die endogene SRPK79D-PC-Isoform mittels einer Immunpräzipitation soweit anzureichern, dass sie im Western Blot nachweisbar war. Für die SRPK79D-PB-Isoform gelang dies allerdings nicht. Anhand von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten konnte gezeigt werden, dass die panneural überexprimierte SRPK79D-PC-GFP-Isoform an die Aktiven Zone transportiert wird und dort mit Bruchpilot, sowie den Interaktionspartnern von Bruchpilot Liprin-α und Rab3 kolokalisiert. Außerdem liegt sie diffus im Zytoplasma von neuronalen Zellkörpern vor. In adulten Gehirnen lokalisiert die transgen überexprimierte SRPK79D-PC-GFP im Fanshaped body, Ringkomplex und in neuronalen Zellkörpern. Die panneural überexprimierte SRPK79D-PB-GFP-Isoform liegt im larvalen und adulten Gehirn lokal im Zytoplasma der Perikaryen akkumuliert vor und wird nicht an die Aktive Zone transportiert. Das PB-Antiserum erkennt im adulten Gehirn neuronale Zellkörper und das Neuropil in der Calyxregion der Pilzkörper. Immunhistochemische Färbungen von larvalen Nerv-Muskel-Präparaten mit verschiedenen Antikörpern gegen neuronale Proteine belegen, dass die Agglomerate in der Srpk79D-Mutante für Bruchpilot spezifisch sind. Es konnten bisher keine weiteren Komponenten der Agglomerate detektiert werden. Auch ein genereller axonaler Defekt konnte durch Färbungen gegen CSP, Synaptotagmin und Experimenten mit dem Mitochondrienfarbstoff MitoTracker® FM Green ausgeschlossen werden. Die quantitative Auswertung der Präparate zeigte, dass die Morphologie der synaptischen Boutons und die Zahl der Aktiven Zonen durch die Mutation im Srpk79D-Gen nicht beeinflusst werden. Um gesicherte Kenntnis darüber zu erlangen, ob die Mutation im Srpk79D-Gen die beobachteten Phänotypen verursacht, wurden Rettungsexperimente durchgeführt. Es konnte sowohl für das hypomorphe Srpk79DP1-Allel, als auch für die Nullmutante Srpk79DVN eine nahezu vollständige Rettung des Agglomerat-Phänotyps mit der panneural exprimierten SRPK79D-PF- oder der SRPK79D-PB-Isoform erreicht werden. Aus diesen Ergebnissen folgt, dass beide Isoformen der SRPK79D in der Lage sind den Bruchpilot-Agglomerat-Phänotyp zu retten, die Rettung der Verhaltensdefizite jedoch alle Isoformgruppen benötigen. Um zu untersuchen, ob der Agglomerations-Phänotyp der Srpk79D-Mutanten auf einer Überexpression des Bruchpilotgens oder auf Fehlspleißen seiner prä-mRNA beruht, wurden Immunpräzipitationen, semiquantitative RT-PCRs und Real Time-PCRs durchgeführt. Ausgehend von den Ergebnissen kann eine mögliche Überexpression bzw. Spleißdefekte von Bruchpilot weitgehend ausgeschlossen werden. Die simultane Überexpression von SRPK79D und Bruchpilot konnte den Phänotyp der Bruchpilot-Überexpression nicht retten. Anhand der stimulated emission depletion-Mikroskopie konnte gezeigt werden, dass die gebildeten Agglomerate das charakteristische Donut-förmige Muster der T-bars zeigen und wahrscheinlich als fusionierte Ketten von T-bars in den larvalen Nerven vorliegen. Beim in vivo Imaging Versuch konnte demonstriert werden, dass das verkürzte Bruchpilot-D3-Strawberry in die Bruchpilot-Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante eingebaut wird und dass größere Agglomerate unbewegt im Nerv verharren. Der anterograde und retrograde Transport kleinerer Agglomerate konnte verzeichnet werden. Bei CytoTrap-Yeast-two-hybrid-Experimenten konnten für die SRPK79D-PB Isoform vier potentielle Interaktionspartner identifiziert werden: das Hitzeschockprotein Hsp70Bbb, die mitochondriale NADH-Dehydrogenase mt:ND5, das large ribosomal RNA Gen in Mitochondrien und das am Spleißen beteiligte Protein 1.3CC/Caper. Die Sequenzierung zeigte, dass nur das letzte Exon von Caper im pMyr-Vektor vorliegt. Der für die PC-Isoform durchgeführte CytoTrap-Versuch ergab nur Temperatur-Revertanten. SR-Proteinkinasen phosphorylieren die RS-Domäne von SR-Proteinen und sind dadurch an der Regulation des konstitutiven und alternativen Spleißens beteiligt. Somit stellen die acht identifizierten SR-Proteine in Drosophila potentielle Interaktionspartner der SRPK79D dar. Die durch RNAi-vermittelte Reduktion von sieben SR-Proteinen führte zu keiner Agglomeration von Bruchpilot. Jedoch führte die RNAi-vermittelte Reduktion des SR-Proteins Spleißfaktor 2 (SF2) zu kleineren Bruchpilot-Agglomeraten in den axonalen Nerven. SF2 ist selbst kein Bestandteil der Agglomerate der Srpk79D-Nullmutante. Die Überexpression von SF2 führt wahrscheinlich zu einem axonalen Transportdefekt, wie die Färbung gegen das Cysteine string protein zeigte. Weiterhin führt die Überexpression zu einer Akkumulation von SF2 in larvalen Axonen und im adulten Gehirn der Fliegen. SF2 ist nicht nur in Zellkernen sämtlicher Zellen nachweisbar, sondern es konnte auch ein spezifisches Signal im subsynaptischen Retikulum der Postsynapse detektiert werden, wie die Färbungen gegen Disc large bestätigten. N2 - In a Screen for mutations which affect the distribution of the active zone protein Bruchpilot, the serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) was identified. A mutation in the Srpk79D gene leads to conspicuous agglomeration of Bruchpilot in the larval segmental and intersegmental nerves. The aim of this thesis was to characterize the function of SRPK79D and to identify its interaction partners. The isoform specific antisera which were generated in an earlier PhD thesis recognized only the pan-neuraly overexpressed GFP-tagged SRPK79D isoforms in Western blots and immunhistochemical stainings. After preabsorption and affinity purification the antisera could uncover the localization of the overexpressed SRPK79D-GFP. Without enrichment of the endogenous SRPK79D concentration seems to be too low to be detected with the antisera. However, the endogenous SRPK79D-PC isoform could be detected in a Western blot after immunoprecipitation, but not the SRPK79D-PB isoform. The panneural overexpressed SRPK79D-PC-GFP isoform co-localizes with Bruchpilot as well as with the Bruchpilot interaction partners Liprin-α and Rab3 at active zones and showed a diffuse pattern in the cytoplasm of neuronal cell bodies. In adult brains the panneural overexpressed SRPK79D-PC isoform is detectable in the fanshaped body, ring complex and neuronal cell bodies. The panneural overexpressed SRPK79D-PB isoform is not present at the active zone but is detectable in larval and adult CNS accumulating in discrete spots in the cytoplasm of neuronal cells. The panneural overexpressed SRPK79D-PB isoform is also present in the neuronal cell bodies and calyces of the mushroom body. Larval dissections followed by stainings with different antibodies against synaptic proteins showed that the agglomerates in the Srpk79D mutants are quite specific for Bruchpilot. No other components of the agglomerates could be revealed until now. General impairments of axonal transport could be excluded by stainings against cysteine string protein (CSP), Synaptotagmin, and experiments with the dye MitoTracker® Green FM. These synaptic proteins are uniformly distributed along the larval nerves. The quantification of boutons revealed that the basic synaptic structure is not altered in Srpk79D-mutants. Stainings on frozen head sections of null mutant Srpk79D revealed a spot like Bruchpilot accumulation in the antennal nerves. The mutation of Srpk79D causes behavioral deficits in adult flies as well as a shortened life span. In order to test if expression of either isoform (SRPK79D-PC/PF or –PB) is able to rescue the obtained phenotypes, rescue experiments were performed. A nearly complete rescue of the agglomerate phenotype was achieved with both SRPK79D isoforms. Rescue experiments for the observed behavioral phenotype in the null mutant background did not significant by improve the defect, neither when using the pannreural driver lines elav-GAL4 nor the newly generated nSyb-GAL4. Alkaline Phosphatase treatment followed by 1D- or 2D-gelelecrophoresis could not detect a possible phosphorylation of SRPK79D. Also the vesicle-associated protein Synapsin showed a normal isoform pattern which indicates that Synapsin is not a substrate for SRPK79D. In experiments to detect overexpression or splicing defects of the active zone protein Bruchpilot as possible cause for the agglomeration phenotype in mutant Srpk79D animals, immunoprecipitations, semiquantitative RT-PCRs and Real Time-PCRs were performed. The results showed that overexpression or splicing deficits could be largely excluded. In stainings with the new Bruchpilot antisera N-Term and D2 the staining pattern did not differ from the nc82 staining showing that the PF isoform of Bruchpilot is not forming separate agglomerates in Srpk79DVN mutants. The overexpression of D2-4 and D1-3, truncated Bruchpilot proteins without either the N- or C-terminus, respectively, showed an agglomeration of the corresponding proteins in larval and adult CNS. However the overexpression of D1-3 is not affecting the endogenous Bruchpilot distribution. The simultaneous overexpression of SRPK79D and Bruchpilot could not rescue the phenotype caused by Bruchpilot overexpression. With the stimulated emission depletion microscope the pattern of the Bruchpilot agglomerates in the Srpk79DVN mutant revealed electron-dense donut-shaped structures in larval nerves, presumably fused T-bars. With in vivo imaging experiments anterograde as well as retrograde movement of D3-labeled agglomerates in the Srpk79DVN mutant was observed whereas large agglomerates are immobile. To identify substrates or interaction partners of SRPK79D the Yeast-two-hybrid screen CytoTrap was performed. The CytoTrap screen for the SRPK79D-PB isoform identified four interaction partners: the heat shock protein Hsp70Bbb, the mitochondrial NADH-Dehydrogenase mt:ND5, the large ribosomal RNA gene in mitochondria and 1.3CC/Caper. Caper is involved in splicing via the spliceosome. Sequencing revealed that the pMyr vector includes only the last exon of Caper. The performed CytoTrap for the RC-Isoform detected only temperature revertants. The RNAi mediated knock down of each of the eight known SR proteins in Drosophila showed that seven of them do not produce a phenotype whereas the reduction of SF2 leads to Bruchpilot agglomerates in larval nerves. The SR-Protein SF2 is not included in the agglomerates of the Srpk79D mutant but showed expression in nuclei of all cell types. The overexpression of SF2 leads to an agglomeration of SF2 in the larval nerves probably due to an impairment of general axonal transport. SF2 is not only a nuclear protein; it is also associated with post synaptic structures. KW - Taufliege KW - Serin KW - Arginin KW - Proteinkinasen KW - RNS-Spleißen KW - Genmutation KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK79D KW - Serin-Arginin Proteinkinase KW - Spleißen KW - Bruchpilot KW - Drosophila melanogaster KW - SRPK79D KW - serine-arginine protein kinase KW - splicing KW - Bruchpilot Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53841 ER - TY - THES A1 - Tiedge, Oliver T1 - Kombinationswirkungen nicht linearer Dosis-Wirkungsbeziehungen T1 - Mixture analysis with nonlinear dose response N2 - Um realistische Risikoabschätzungen von karzinogenen und genotoxischen Expositionen besser bewerten zu können, bedarf es Untersuchungen von Kombinationen welche sich von der Einzellstoffbetrachtung loslöst. Die Zielsetzung der vorliegenden Arbeit bestand darin, herauszufinden, ob die Gentoxizität einer Kombination in ihrer Stärke vom erwarteten Effekt der normalen Additivität abweicht, wenn die Kurven der Dosis – Wirkungsbeziehung der Einzelkomponenten nicht lineare Verläufe zeigen. Dabei muss zwischen Dosisaddition und Wirkaddition der Kombinationen unterschieden werden, das heißt ob die Einzelkomponenten einen untereinander ähnlichen oder unabhängigen Wirkmechanismus verfolgen. Für nicht lineare Dosis – Wirkungsbeziehungen differieren also die Kurvenverläufe zwischen Dosisaddition und Wirkaddition und bilden einen möglichen Bereich der Additivität zwischen ihnen (auch: „Hülle der Additivität“). Nur Reaktionen welche außerhalb dieses Bereiches ablaufen, dürfen als synergistische oder antagonistische Effekte bezeichnet werden. Diese Überlegungen wurden überprüft mit der Analysierung von Mikrokernen, induziert in L5178Y Maus – Lymphom – Zellen durch die methylierenden Substanzen Methylmethansulfonat (MMS) und Methyl-Nitroso-Urea (MNU), sowie dem Topoisomerase II Inhibitor Genistein (GEN). Alle drei Chemikalien erzeugen reproduzierbare sublineare Dosis – Wirkungsbeziehungen. Für die Analyse der Kombinationseffekte wurden diese Substanzen in drei binären Mixturen miteinander gemischt. Für MMS + MNU war der Effekt vereinbar mit Dosisaddition und lag signifikant höher als der vorkalkulierte Effekt der Netto – Wirkung. Für MMS + GEN lag der gemessene Effekt über der Wirkaddition, jedoch unter der Dosisaddition. Für MNU + GEN lag der gemessene Effekt unterhalb der Wirkaddition und deutete damit auf einen echten Antagonismus hin. In Unkenntnis des sublinearen Dosis – Wirkungsverhaltens der Einzelsubstanzen wäre ein synergistischer Effekt von MMS mit beiden Substanzen MNU und GEN fälschlicherweise vorausgesagt worden. Der beobachtete Unterschied zwischen MMS und MNU und deren jeweiligen Kombination mit GEN wäre mit einer stark vereinfachten Interpretation der DNA - Methylierung nicht vorausgesagt worden. Ursachen könnten eine doch zu unterschiedliche Form der DNA – Methylierung und / oder epigentische Faktoren sein. Zusammenfassend kann man sagen, dass Kenntnisse der Nichtlinearität von Dosis – Wirkungskurven der einzelnen Substanzen ausschlaggebend für die Analyse von Synergismus oder Antagonismus in deren Kombinationen ist. Weiterhin ist ein Vorwissen über tiefere mechanistische Vorgänge hilfreich für eine Vorhersage von ähnlichen oder unabhängigen Wirkprozessen. N2 - Distinction between dose addition and response addition for the analysis of the toxicity of mixtures may allow differentiation of the components regarding similar versus independent mode of action. For nonlinear dose responses for the components, curves of dose addition and response addition differ and embrace an "envelope of additivity." Synergistic or antagonistic interaction may then be postulated only if the mixture effect is outside this surface. This situation was analyzed for the induction of micronuclei in L5178Y mouse lymphoma cells by the two methylating agents methyl methanesulfonate (MMS) and N-methyl-N-nitrosourea (MNU) and the topoisomerase-II inhibitor genistein (GEN). All three chemicals reproducibly generated sublinear (upward convex) dose-response relationships. For the analysis of mixture effects, these genotoxic agents were investigated in the three binary combinations. Statistical testing for dose addition along parallel exponential dose responses was performed by linear regression with interaction based on the logarithm of the number of cells that contain micronuclei. For MMS+MNU, the mixture effect was compatible with dose addition (i.e., significantly larger than calculated for the addition of net responses). For MMS+GEN, the measured effect was larger than for response addition but smaller than for dose addition. For MNU+GEN, the measured effect was below response addition, indicative of true antagonism. In the absence of knowledge on the sublinear dose-response relationships for the individual components, a synergistic effect of MMS on both MNU and GEN would have been postulated erroneously. The observed difference between MMS and MNU when combined with GEN would not have been predicted on the basis of a simplistic interpretation of DNA methylation as the mode of action and may be due to differences in the profile of DNA methylations and/or epigenetic effects. We conclude that knowledge of nonlinearities of the dose-response curves of individual components of a mixture can be crucial to analyze for synergism or antagonism and that an in-depth mechanistic knowledge is useful for a prediction of similarity or independence of action. KW - Kleinkern KW - Kombination KW - Dosis-Wirkungs-Beziehung KW - Synergie KW - Addition KW - Gegensatz KW - Risikoanalyse KW - Genanalyse KW - Genmutation KW - Carcinogen KW - Mikrokern KW - sublinear KW - Mauslymphomzellen KW - genotoxisch KW - alkylating agents KW - genotoxicity KW - cell culture KW - dose response KW - mixture models Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28522 ER - TY - THES A1 - Huberth, Andreas T1 - MLC1/KIAA0027 als Kandidatengen für Periodische Katatonie - Eine Mutationsanalyse bei einer betroffenen Großfamilie T1 - MLC1/KIAA0027 - a candidate gene for periodic catatonia (A mutational analysis in a family with multiple affected members) N2 - Die Periodische Katatonie ist eine diagnostisch gut abgrenzbare Untergruppe der Schizophrenie mit besonders großer familiärer Belastung. Durch Kopplungsuntersuchungen konnte eine Kopplung der Erkrankung mit Chromosom 22q13 gezeigt werden. In der Zielregion befindet sich auch das MLC1-Gen (alternative Bezeichnungen WKL1 oder KIAA0027), für welches bereits eine Assoziation mit einer anderen erblichen Hirnerkrankung, der Megalenzephalen Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten (MLC), bekannt ist. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte nun eine Mutationsanalyse von MLC1 als Kandidatengen für die Periodische Katatonie am Material einer mehrfach betroffenen Großfamilie. Durch Verlängerung der bekannten partiellen cDNA-Sequenz von MLC1 mittels 5'-RACE ergab sich unter Annahme des von Nomura et al. (1994) beschriebenen offenen Leserasters ein 377 Aminosäuren großes Protein. Die Strukturanalyse des vorhergesagten MLC1-Proteins zeigt die größte Übereinstimmung für den humanen spannungsgesteuerten Kaliumkanal KCNA1. In der Vergangenheit konnte bereits bei anderen neurologischen Erkrankungen ein Zusammenhang mit veränderten Kaliumkanalproteinen nachgewiesen werden. In der bekannten genomischen DNA-Sequenz konnten 12 Exons annotiert werden. Bei der Sequenzierungsanalyse der codierenden Genabschnitte von MLC1 fand sich bei allen erkrankten Mitgliedern der untersuchten Multiplexfamilie ein heterozygoter Austausch von Cytosin zu Adenin an mRNA-Position 1121 (Gen-Bank Accession-Nummer AF319633). Diese Punktmutation führt zu einem Aminosäureaustausch von Leucin zu Methionin im MLC1-Protein. Bei einigen nicht erkrankten Familienmitgliedern ließ sich die veränderte DNA-Sequenz ebenfalls nachweisen, was jedoch durch eine unvollständige Krankheitspenetranz oder einen späteren Erkrankungszeitpunkt begründet sein könnte. In einem Kontrollkollektiv von 327 Probanden aus der Normalbevölkerung sowie bei je einem erkrankten Mitglied von drei anderen mehrfach von periodischer Katatonie betroffenen Familien konnte die Missense-Mutation nicht gefunden werden. In dieser Arbeit wurde die Assoziation einer sinnverändernden Mutation im MLC1-Gen mit dem Auftreten von periodischer Katatonie in einer mehrfach betroffenen Familie gezeigt. Die Aufklärung der Funktion von MLC1 verspricht somit wichtige Erkenntnisse zur Ätiopathogenese sowohl der Megalenzephalen Leukoenzephalopathie mit subkortikalen Zysten als auch der Periodischen Katatonie. N2 - Periodic catatonia is a well defined subgroup of schizophrenia with marked familial liability. In linkage studies it has been linked to chromosome 22q12. The target region includes the MLC1-gene (alternatively named WKL1 or KIAA0027) for which an association with another hereditary neurological disease, namely Megalencephalic Leukoencephalopathy with subcortical Cysts (MLC), is known. In the scope of this thesis a mutational analysis of MLC1 as a candidate gene for periodic catatonia was performed on the samples of a family with multiple affected members. By extension of the partial cDNA of MLC1 using 5´-RACE technique a protein consisting of 377 amino-acids could be deduced within the previously reported open reading frame. In a structure analysis of the MLC1-protein highest identity scores were obtained for the human voltage-gated potassium channel KCNA1. Previously several neurological diseases have been linked to alterated potassium channels. Twelve exons could be annotated in the known genomic DNA sequence. Consecutive sequencing analysis of the coding regions of MLC1 revealed a heterozygous exchange of cytosine for adenine in mRNA-position 1121 (GenBank accession-number AF319633) in all diseased members of the multiplex family under research. This point mutation effects a replacement of leucine by methionine in the MLC1-protein. Several non-diseased family members were also found to be carriers of the point mutation. This might be accounted for by incomplete penetrance or later manifestations of the disease. The missense mutation could neither be found in diseased members of three other families with multiple affected members nor in an unrelated control group of 327 individuals. Association of a missense mutation in the MLC1-gene and the occurrance of periodic catatonia in a multiply affected family could be demonstrated. Accordingly the elucidation of MLC1 function promises important insights into the etiopathogenesis of both megalencephalic leukoencephalopathy with subcortical cysts and periodic catatonia. KW - Genmutation KW - Punktmutation KW - Schizophrenie KW - MLC1 KW - Periodische Katatonie KW - Mutationsanalyse KW - Kandidatengen KW - schizophrenia KW - periodic catatonia KW - MLC1 KW - candidate gene Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-50903 ER - TY - THES A1 - Möller, Christian T1 - Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase bei Patienten mit familiärer dilatativer Kardiomyopathie T1 - Mutations in the gene of dihydrolipoamide dehydrogenase in patients with familial dilated cardiomyopathy N2 - Die Arbeitsgruppe Zimmer am Institut für Klinische Biochemie und Pathobiochemie der Universität Würzburg detektierte im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase (DLD) eine bisher nicht bekannte Mutation, die für die Entwicklung einer familiären Form der dilatativen Kardiomyopathie (DCM) verantwortlich ist. Die DLD spielt als Teil von mitochondrialen Enzymkomplexen eine wichtige Rolle im Energie- und Aminosäurestoffwechsel der Zelle. Mutationen im DLD-Gen führen dabei meist zu neurologischen Syndromen mit Erscheinungsbildern wie mentaler Entwicklungsverzögerung, Krampfanfällen und spastischen Bewegungsstörungen. Fälle von Herzinsuffizienz und frühkindlicher Hypertropher Kardiomyopathie wurden ebenfalls beschrieben. Von den zahlreichen Gendefekten, die als Auslöser für die dilatative Kardiomyopathie bekannt sind, ist bisher noch keiner im Gen der DLD beschrieben worden. Vielmehr sind DCM-Mutationen in Genen zu finden, die für muskelspezifische Proteine kodieren. Dadurch führen sie oft zu einer Beeinflussung der Kraftübertragung im Sarkomer. Die durch die Arbeitsgruppe Zimmer beschriebene DLD-Mutation wurde in einer portugiesischen Großfamilie entdeckt, in welcher das Auftreten der dilatativen Kardiomyopathie über mehrere Generationen hinweg zu verfolgen ist. Ähnliche Fälle außerhalb dieser Familie sind nicht bekannt. Demnach gibt es keine Daten, die die Häufigkeit DCM-assoziierter Mutationen im Gen der Dihydrolipoamid-Dehydrogenase beschreiben. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich damit weitere Zusammenhänge zwischen genetischen Alterationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer DCM aufzudecken. In diesem Rahmen wurden DCM-Patienten, die erwiesenermaßen an einer familiären Form dieser Erkrankung leiden, gezielt auf Veränderungen in den Exons des DLD-Gens untersucht. Insgesamt wurden die Exons von 88 Patienten auf das Vorhandensein heterozygoter Mutationen überprüft. Hierfür wurden PCR-Produkte, die die jeweiligen Exons enthielten, mit Hilfe der Denaturing High-Performance Liquid Chromatography (DHPLC) untersucht. Diese Methode ermöglicht eine hochsensitive und gleichermaßen äußerst spezifische Detektion heterozygoter Mutationen. Auffällige Ergebnisse wurden anschließend mittels Sequenzierung verifiziert. Insgesamt wurden bei elf Patienten fünf unterschiedliche Mutationen nachgewiesen. Es handelte sich um vier bereits bekannte Einzelnukleotid-Polymorphismen und eine bisher nicht beschriebene Mutation. Dabei lagen vier Mutationen in nicht näher bezeichneten Intron-Bereichen, eine Mutation in einer 3‘ Spleißstelle und eine weitere Mutation in der 3‘ UTR (untranslated region) der mRNA. Somit befanden sich also einige Mutationen an für die Regulation der Genfunktion strategisch wichtigen Positionen. Da es sich dabei um bekannte Polymorphismen handelte, wurde mit Hilfe der Daten des HapMap Projekts überprüft, ob es bereits Hinweise für eine klinische Assoziation gab. Die Daten zeigten, dass bisher keiner der hier detektierten SNPs mit klinischen Erscheinungsbildern in Verbindung gebracht werden konnte. Es gab auch keine Hinweise dafür, dass die erfassten SNPs im Patientenkollektiv häufiger vorkamen als in der Normalbevölkerung. Einer der hier beschriebenen Mutationen war nicht in den verwendeten Datenbanken aufgeführt. Daher kann ein pathologischer Einfluss dieser Mutation zwar nicht ausgeschlossen werden, erscheint aber aufgrund ihrer Lage in einem weit vom Exon entfernten Intron-Bereich nicht offensichtlich. Es ließen sich also für keine der detektierten Mutationen pathogene Eigenschaften nachweisen. In Protein-kodierenden Sequenzbereichen konnten keine Mutationen nachgewiesen werden. Abschließend lässt sich also sagen, dass eine Assoziation zwischen Mutationen im DLD-Gen und dem Auftreten einer familiären DCM im Rahmen dieser Arbeit nicht bestätigt werden konnte. Es ist jedoch möglich, dass DCM-assoziierte Mutationen im DLD-Gen nur äußerst selten auftreten oder aber die durch die Arbeitsgruppe Zimmer detektierte Mutation im DLD-Gen die bisher einzige ist, die mit DCM in Verbindung gebracht werden kann. Um diese Frage zu klären müssen Untersuchungen mit größeren Patientenkollektiven angeschlossen werden. N2 - The working group Zimmer at the Institute of Clinical Biochemistry and Pathobiochemistry at the University of Wuerzburg detected an until now unknown mutation in the gene of dihydrolipoamide dehydrogenase (DLD), which causes a familial dilated cardiomyopathy (DCM). The DLD plays an important role in the metabolism of carbohydrates and amino acids. In most cases mutations in the DLD gene lead to neurological symptoms like mental developmental delay, seizures and spastic movement disorders. Cases of heart failure and an early childhood hypertrophic cardiomyopathy are also known. Among the numerous genetic defects, which are known to be responsible for the development of a dilated cardiomyopathy, there is no one known in the gene of DLD. To a greater degree DCM mutations are found in genes, which encode for muscle-specific proteins. In this way they often lead to an affectation of the force transmission in the sarcomer. The mutation, which was described by the working group Zimmer was found in an portuguese extended familiy. In this family the presence of a dilated cardiomyopathy could be followed up for several generations. Similar cases outside of this family are not known. So there is no data about the frequency of DCM associated mutations in the gene of dihydrolipoamide dehydrogenase. The work in hand dealt with revealing further relationships between genetic variances in the DLD gene and the presence of DCM. In this context the exons of the DLD gene of DCM patients with a familial form of this disease were examined. Overall the DLD exons of 88 patients were investigated looking for heterozygous mutations. For this purpose the Denaturing High-Performance Liquid Chromatography was used. This method allows a highly sensitive and also exceedingly specific detection of heterozygous mutations. Afterwards conspicuous results were verified by sequencing. Altogether five different mutations in eleven patients were found. It was about four already known single nucleotide polymorphisms and one until know not known mutation. Four mutations were located in not further described intronic regions. One was found in a 3' splice site and one in a 3' UTR. In this way some mutations were located in regions which are important for the regulation of gene function. Because it was about known SNPs, it was checked if there is evidence for associations with clinical phenotypes. Therefor the data of the HapMap project was used. The data shows that no one of the detected SNPs is known to be associated with clinical phenotypes. In protein coding sequences no mutation was detected. Conclusively it can be said that within this work an association between mutations in the DLD gene and the presence of a familial DCM could not be confirmed. It is possible that mutations in the DLD gene associated with DCM are very rare or unique in this family. To reason this out, investigations with greater patient populations are necessary. KW - Kongestive Herzmuskelkrankheit KW - Punktmutation KW - Genmutation KW - Genommutation KW - Mutation KW - Dihydrolipoamid-Dehydrogenase KW - Polymorphismus KW - SNP KW - Seque KW - Denaturing high-performance liquid chromatography KW - Sequenzierung KW - Familiäre dilatative Kardiomyopathie KW - Denaturing high-performance liquid chromatography KW - sequencing KW - familial dilated cardiomyopathy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74278 ER - TY - THES A1 - Kohlmann, Bernd T1 - Mutationsanalyse der Gene KIAA0027/MLC1 und KIAA0767/DIP als Kandidatengene für die periodische Katatonie T1 - Mutation analysis of the genes KIAA0027/MLC1 and KIAA0767/DIP as candidate genes for periodic catatonia N2 - In dieser Arbeit wurde die systematische Suche nach krankheitsassoziierten Genen bei periodischer Katatonie fortgeführt. Für diese Erkrankung war die klinische Abgrenzbarkeit und die familiäre Häufung signifikant und ließ aufgrund der vertikalen Transmission und dem Auftreten über mehrere Generationen und hinweg auf einen Hauptgeneffekt schließen. Nach der Durchführung von Kopplungs-Analysen kristallisierten sich zwei koppelnde Regionen auf den Chromosomen 15 und 22 heraus. Mittels Haplotypanalyse konnte der Genort auf Chromosom 22q13 auf einen knapp 5 Mbp großen Bereich eingeschränkt werden. Im kodierenden Bereich des MLC1-Genes segregierte im mit periodischer Katatonie assoziierten Haplotyp eine Variante (p.Leu309Met). Da Mutationen im MLC1-Gen bereits im Zusammenhang mit Megalenzephaler Leukoenzephalopathie beschrieben worden waren, wurden in dieser Arbeit zunächst fünf Patienten mit dieser Erkrankung auf Mutationen in kodierenden Bereichen von MLC1 systematisch untersucht. Daran schloss sich eine Analyse dieses Gens bei 140 Patienten mit periodischer Katatonie an. Ein Zusammenhang zwischen Mutationen in MLC1 und dem Auftreten von Megalenzephaler Leukoenzephalopathie wurde untermauert, wohingegen die Ergebnisse eindeutig gegen eine Assoziation mit periodischer Katatonie sprachen. Ein weiteres im Gehirn exprimiertes Kandidatengen (KIAA0767/DIP) wurde in dieser Arbeit untersucht. Dabei wurden sechs SNPs im exonnahen intronischen Bereich entdeckt sowie eine Variante im Exonbereich (p.Glu156Asn). Dies ist eine seltene Normvariante, eine Assoziation zur periodischen Katatonie wurde in einer Fall-Kontroll-Studie ausgeschlossen. Insgesamt wurde durch die systematische Mutationsanalyse die Kandidatenregion auf Chromosom 22q13.3 weiter eingeengt. Gegen einen Zusammenhang zwischen MLC1 und periodischer Katatonie sprechen die vorgestellten validen Ergebnisse. N2 - The present dissertation has carried on the systematic screening for genes involved in periodic catatonia. The clinical definition and the familial clustering of this disorder were of statistical significance. Its vertical transmission and the occurrence across generations led to the conclusion of it being a major gene effect. Linkage scans discovered two linking regions on chromosome 15 and chromosome 22. Using haplotype analysis it was possible to restrict the candidate region on chromosome 22q13 to region of 5 Mbp. In the coding region of the MLC1 gene a variant (p.Leu309Met) segregated in the haplotype associated with periodic catatonia. As detailed descriptions of mutations in the MLC1 gene in connection with megalencephalic leucoencephalopathy already exist, for the present dissertation five patients with the aforesaid disorder were systematically screened for mutations in the coding regions of MLC1. This was followed by an analysis of the according gene in 140 patients with periodic catatonia, which substantiated a correlation between mutations in MLC1 and the occurrence of megalencephalic leucoencephalopathy, whereas the results definitely did not support an association with periodic catatonia. Additionally, a further brain-expressed candidate gene (KIAA0027/DIP) was screened in this dissertation discovering six single nucleotide polymorphisms in the intronic exon-near region and a variant in the exonic region (p.Glu156Asn). This is a rare normal variant, an association with periodic catatonia was excluded in a case-control study. Altogether the systematic mutation analysis enabled a further reduction of the candidate region on chromosome 22q13.3. The research results, which meet the criterion of validity, do not support a correlation between MLC1 and periodic catatonia. KW - Schizophrenie KW - Katatonie KW - SNP KW - Molekulargenetik KW - Internationale Wernicke-Kleist-Leonhard-Gesellschaft KW - Genmutation KW - Polymorphismus KW - RFLP KW - Leuk KW - schizophrenia KW - periodic catatonia KW - mutation analysis KW - megalencephalic leucoencephalopathy Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34938 ER - TY - THES A1 - Meyer, Johanna T1 - Untersuchungen von Cyrillic 2.13 zur Abschätzung der Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeit bei erblichem Mamma- und Ovarialkarzinom T1 - Examinations of Cyrillic 2.13 for the Estimation of Mutationrate and the likeliness of disease in hereditary breast- and ovarian cancer N2 - In dieser Arbeit wird anhand eines Würzburger Studienkollektivs von erblich an Brust-und Ovarialkrebs Erkrankten, das 150 Ratsuchende umfasst, das Risikokalkulationsprogramm Cyrillic 2.13 zur Abschätzung von Mutations- und Erkrankungswahrscheinlichkeiten bei erblichem Brust- und Ovarialkrebs untersucht. Es werden die vom Programm berechneten Mutationswahrscheinlichkeiten mit dem tatsächlichen Mutationsstatus der Probanden verglichen. Außerdem werden Stammbäume der Probanden auf Angehörige 1. und 2. Generation gekürzt, um zu untersuchen, ob dies die errechneten Ergebnisse beeinflusst. Es zeigt sich hierbei jedoch kein signifikanter Unterschied. N2 - The risk calculating programme Cyrillic 2.13 for the likeliness of developing hereditary breast- and ovarian cancer is being examined in 150 Probands of Würzburg who had already been tested for mutations in brca -genes. It was known whether they had or did not have a mutation. The results are being compared to those calculated by Cyrillic 2.13 depending on their pedegree. The probands' pedigrees then were reduced to only first- and second degree relatives in order to figure out whether there is an influence on the calculated mutation rate or not. The results show, that there is no significant difference between the mutation rates offered by the programme compared to those tested for the probands. KW - Brustkrebs KW - Eierstockkrebs KW - Excelsior Cyrillic KW - Genmutation KW - Mutationswahrscheinlichkeit KW - Rechenprogramme KW - Cyrillic 2.13 KW - Erkrankungswahrscheinlcihkeit KW - Mutationrate KW - Breastcancer KW - Ovariancancer KW - Cyrillic 2.13 Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65757 ER - TY - THES A1 - Wegert, Jenny T1 - WTX-Mutationsscreen und funktionelle Analyse des Retinsäure-Signalwegs in Wilms Tumoren T1 - WTX-mutation screening and functional analysis of the retinoic acid signaling pathway in Wilms tumors N2 - Der Wilms Tumor (WT), auch Nephroblastom genannt, ist einer der häufigsten bösartigen Tumoren im Kindesalter. Er entsteht aus embryonalem undifferenziertem Nierengewebe und tritt meist als unilateraler und sporadischer Tumor auf. In 10-15% der Wilms Tumoren finden sich WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen. Während diese schon länger als genetische Ursachen des Nephroblastoms bekannt sind, wurde erst kürzlich WTX als drittes Gen beschrieben, welches eine Rolle in der Tumorentstehung spielt. Für einen Großteil der WT ist die genetische Ursache jedoch unklar. Da die bisher publizierten WTX-Mutationsraten auf Untersuchungen kleiner Gruppen basieren und sich stark unterscheiden, sollten in dieser Arbeit WTX-, CTNNB1- und WT1-Mutationen in einem großen WT-Set bestimmt werden. Verluste genetischen Materials in der WTX-Region traten in 17% der Fälle auf und waren zwischen den Geschlechtern gleich verteilt. Die Sequenzierung von WT-Proben zeigte, dass nur 2% von WTX-Punktmutationen betroffen sind. In weiteren 11,5% der Proben konnte keine WTX-Expression nachgewiesen werden. Die WTX-Veränderungen traten z. T. gemeinsam mit WT1- und/oder CTNNB1-Mutationen auf. Die unvollständige WTX-Deletion in einigen WT legte die Vermutung nahe, dass innerhalb eines Tumors eine Heterogenität in Bezug auf den WTX-Status möglich ist. Dieser Verdacht konnte durch die detaillierte Untersuchung verschiedener Regionen solcher Tumoren erhärtet werden: Hierzu wurden histologisch unterschiedliche Bereiche auf den Anteil einer WTX-Mutation bzw. eines WTX-LOH hin untersucht. Obwohl alle Regionen des jeweiligen Tumors einen kompletten LOH auf Chromosom 11 aufwiesen, waren die WTX-Veränderungen unterschiedlich stark ausgeprägt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass WTX-Veränderungen keine notwendigen und frühen Ereignisse in der Tumorentstehung sind, sondern erst später auftreten und nur einen Teil der Tumorzellen betreffen können. Die Vermutung, dass WTX-Mutationen keinen direkten Einfluss auf die Tumorentwicklung und prognose haben, wird durch das Fehlen eines signifikanten Zusammenhangs zwischen WTX-Deletion bzw. WTX-Expression und den klinischen Eigenschaften der WT gestützt. Um die Rolle von Genen, die potentiell an der Entstehung und Entwicklung des Nephroblastoms beteiligt sind, zu untersuchen oder mögliche neue Therapiestrategien zu überprüfen, sind in vitro-Modelle nötig. Da ein solches für Wilms Tumoren nicht etabliert ist, wurden Primärkulturen aus verschiedenen WT-Proben angelegt. Kulturen aus Tumorgewebe von 12 Patienten mit unterschiedlichen genetischen Veränderungen konnten als echte Tumorzellen validiert werden. Zwei Zelltypen ließen sich morphologisch und immunhistochemisch unterscheiden: Zum einen runde, langsam wachsende Zellen mit Epithelcharakter und zum anderen fibroblastenähnliche Zellen, welche weniger differenziert waren und häufig für viele Passagen kultiviert werden konnten. Somit wurde ein Set verschiedener WT-Primärkulturen etabliert, welches nun für in vitro-Experimente zur Untersuchung grundlegender Mechanismen der WT-Entstehung oder zum Test neuer Therapieansätze eingesetzt werden kann. Frühere Microarray-Analysen deuteten auf eine Deregulation des Retinsäure (RA)-Signalwegs in fortgeschrittenen Wilms Tumoren hin. Diese Ergebnisse sollten in einem großen unabhängigen Proben-Set mittels Realtime-RT-PCR validiert werden. Eine Deregulation des RA-Signalwegs und die Überexpression von NMYC wurden für Tumoren der Hochrisikogruppe im Vergleich zu Tumoren mit geringem/mittlerem Risiko nachgewiesen. So stellte sich die Frage, ob Patienten mit fortgeschrittenem WT von einem Retinsäure-Einsatz in der Therapie profitieren könnten. Um dies zu beantworten, wurde der Effekt von verschiedenen Retinoiden auf WT-Primärkulturen untersucht. Die WT-Zellen wurden mit all-trans RA (ATRA), 9cisRA, dem synthetischen Retinoid Fenretinid (4HPR) und Kombinationen von ATRA bzw. 4HPR und einem HDAC-Inhibitor (SAHA) behandelt. Gene, welche in Hochrisiko-WT differenziell reguliert waren, wurden untersucht und zeigten nach RA-Behandlung eine entgegengesetzte Expression. In sechs der sieben verwendeten Primärkulturen wurde eine RA-vermittelte Proliferationsreduktion nachgewiesen. Für die Kombinationen von Retinoiden mit SAHA wurden keine synergistischen Effekte beobachtet. Während Fenretinid in den meisten Kulturen Apoptose induzierte, verursachten ATRA und 9cisRA morphologische Veränderungen, welche auf Differenzierungsvorgänge hindeuteten. Eine Microarray-Analyse ATRA-behandelter WT-Zellen zeigte die differenzielle Regulation vieler Gene, welche eine Rolle in der Bildung der extrazellulären Matrix oder bei Differenzierungsvorgängen von Knochen-, Knorpel-, Nerven- oder Muskelgewebe spielen. Diese Befunde bieten einen weiteren Hinweis darauf, dass Retinoide für den Einsatz in der Therapie des Nephroblastoms geeignet sein könnten. N2 - Wilms tumor (WT) – or nephroblastoma – is one of the most common solid tumors in childhood. It arises from embryonal blastema and most frequently presents as a unilateral and sporadic tumor. Mutations in WT1 and CTNNB1 are well established as causal alterations in about 10-15 % of cases. Recently, WTX (Wilms tumor gene on the X-chromosome), a gene implicated in WNT signaling, has been identified as a third WT gene, but for the majority of nephroblastomas the genetic etiology is still unclear. Published WTX mutation rates in Wilms tumors are still based on smaller cohorts and differ significantly. Therefore, the WTX, CTNNB1 and WT1 mutation state was determined in a large set of 429 Wilms tumors. Genomic WTX alterations were identified in 17% of WT, equally distributed between males and females. Analysis of 104 WT samples for WTX point mutations revealed a frequency of only 2%. An additional 11,5% of tumor samples lacked expression of WTX mRNA. These WTX alterations can occur in parallel to WT1 or CTNNB1 mutations. Incomplete deletion of WTX in several cases suggested heterogeneity of WTX alterations in tumors and this was corroborated by analysis of different regions of such tumors. In cases with heterozygous point mutations or LOH, separate tumor fragments or microdissected regions with different histology were analyzed. Despite complete allele losses at chromosome 11 varying ratios of WTX mutation were detected. This suggests that WTX alteration is not an essential and early mutation needed to drive tumorigenesis, but rather a late event that may affect only a fraction of cells with unclear clinical relevance. This hypothesis is supported by the fact that there is no significant correlation between WTX deletion status or expression level and clinical parameters suggesting that WTX mutations apparently have little direct impact on tumor behavior and presentation. As there is no in vitro model for nephroblastoma that could be used to investigate genes playing a role in development and progression of WT or to test new treatment strategies, primary cultures were generated from fresh tumor tissue. Cultures from tumor samples of 12 patients with different genetic alterations could be validated as tumor derived cells. Two different cell types could be distinguished by immunohistochemistry and cell morphology: large round, slowly growing cells with epithelial characteristics and fibroblast-like cells that are less differentiated and some of which could be kept in culture for many passages before getting senescent. In this way a set of primary WT-cells could be established that is suitable for in vitro approaches to study mechanisms of nephroblastoma development or to test new therapy strategies. Prior microarray analyses suggested a deregulation of the retinoic acid (RA) pathway in advanced Wilms tumors. This should be validated in a large independent tumor set of 163 WT by realtime-RT-PCR. Deregulation of RA signaling and overexpression of NMYC was found in high risk tumors as opposed to tumors with low/intermediate risk and suggested a beneficial impact of retinoic acid on advanced nephroblastoma. To investigate whether retinoids could be employed as a novel therapeutic agent in WT primary WT-cells were treated with all-trans-RA (ATRA), 9cisRA, the synthetic retinoid fenretinide and combinations of retinoids and the HDAC inhibitor SAHA. Expression of genes deregulated in high risk tumors were analyzed and showed opposite changes upon treatment suggesting a positive effect of retinoids. For six of seven primary cultures tested cell growth was reduced upon retinoid administration. No additional synergistic effect could be observed for the combination of retinoids with the HDAC inhibitor SAHA. While fenretinide induced apoptosis in several cultures tested, ATRA and 9cisRA caused morphological changes suggesting differentiation upon treatment. Microarray analysis of ATRA treated WT-cells revealed differential expression of many genes involved in the formation of the extracellular matrix and osteogenic, neuronal or muscle differentiation processes. These findings provide further evidence of a potential utility of retinoids in Wilms tumor treatment. KW - Nephroblastom KW - Genmutation KW - Retinoesaeure KW - Signaltransduktion KW - Wilms Tumor KW - WTX KW - Primärkultur KW - Nephroblastoma KW - Wilms tumor KW - WTX KW - primary cell culture KW - retinoic acid Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52822 ER -