TY - THES A1 - Moriabadi, Neville Fairdoon T1 - Der Einfluß von Virusinfektion und Impfung auf autoreaktive T-Lymphozyten bei der Multiplen Sklerose T1 - Effects of virus infection and immunisation on autoreactive T lymphocytes in multiple sclerosis N2 - In der sogenannten ViMS-Studie, bei der MS-Patienten und gesunde Kontrollpersonen mit einer Influenza-Spaltvakzine geimpft und für einen zum Teil viermonatigen Zeitraum im Verlauf nachbeobachtet wurden, ergab sich weder mit dem sensitiven IFNg-ELISPOT noch mit der quantitativen RT-PCR ein Anhalt für erhöhte Autoimmunreaktivität gegen die zwei untersuchten Myelin-Antigene MBP und MOG. Im Gegensatz dazu konnten mit dem IFNg-ELISPOT-Assay bei einigen gesunden Spendern und MS-Patienten nach natürlichen Atemwegsinfektionen eine erhöhte Frequenz autoreaktiver MBP-spezifischer T-Lymphozyten beobachtet werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit konnten durch Zellkulturinfektionen mit Influenzavirus oder HHV-6 weder an Primärzellkulturen noch in einem etablierten in vitro-Modell für MS-Autoimmunität an MBP-spezifischen T-Zellen eine immunstimulierende Wirkung gezeigt werden. Bei niedrigen Infektionsdosen kam es zur Proliferation einer wahrscheinlich virus-spezifischen Zellpopulation, bei höheren Dosen wurde dieser Effekt durch die bekannte Immunsuppression der in vitro-Infektion mit HHV-6 übertroffen. In einer umfassenden Untersuchung von Serumproben von gesunden Spendern und MS-Patienten in unterschiedlichen Krankheitsphasen wurden trotz sensitiver Nachweismethoden keine erhöhten Antikörper-Titer (IgG/IgM) gegen HHV-6 oder HHV-6-DNA nachgewiesen, woraus geschlossen werden darf, daß die untersuchten Viren keine intrinsische Pathogenität für die Entstehung von Autoimmunität bei der MS aufweisen. Im Vergleich zu der Kontrollgruppe erhöhte Anti-HHV-6-IgG-Titer bei PTX-behandelten MS-Patienten lassen sich als mögliches Epiphänomen durch die immun-modulatorische (Th2-vermittelte) Wirkung des Medikaments deuten. In Zusammenschau aller Ergebnisse dieser Arbeit lassen sich die anfangs angedeuteten Modelle einer virusvermittelten Autoimmunpathogenese der MS nicht eindeutig ein-ordnen. Die Ergebnisse der ViMS-Studie, unterstützt durch zahlreiche Untersuchungen anderer Gruppen, weisen in Bezug auf Schubauslösung oder Verschlechterung auf einen generellen immunaktivierenden Mechanismus im Sinne einer unspezifischen Begleitreaktion durch Infektion aber nicht durch Influenzaschutzimpfung hin. Dabei spielt wohl nicht eine einzelne Virusinfektion die maßgebliche Rolle in einem schon auf immunologischer Ebene recht komplexen Netzwerk, sondern können prinzipiell verschiedene (beliebige) Viren zum Anstoßen einer Autoimmunkaskade beitragen, wenn sie auf einen konstitutionell oder temporär empfänglichen Wirtsorganismus treffen. Dies ist auch vom Infektionsort und –milieu abhängig. Bei der vorliegenden Multifaktorialität und Heterogenität der Subpopulatio-nen sind monolineare Erklärungsansätze bislang zum Scheitern verurteilt gewesen. Aber aus dem Fehlen eines Beweises kann nicht der Beweis für das Fehlen eines Zusammen-hangs zwischen Virusinfektionen und Autoimmunreaktionen geschlossen werden. N2 - We immunised MS patients and healthy volunteers with an influenza split vaccine (ViMS-study) and could not find increased autoimmune reactivity against myelin antigens MBP or MOG over a four months follow up period with sensitive IFNg-ELISPOT or quantitative RT-PCR technology. In contrast we could detect in healthy persons and MS patients an increased number of autoreactive T cells against MBP (IFNg-ELISPOT) after naturally occuring airway infection. In the second part in vitro-infections with neither influenza virus nor human herpesvirus 6 stimulated primary lymphocyte cultures or MBP-specific T cell lines. In a clinical study no differences in HHV-6 antibody titres or HHV-6-DNA could be found between MS patients and healthy donors KW - Multiple Sklerose KW - ViMS KW - Influenza KW - Herpesvirus 6 KW - Virus KW - Impfung KW - MBP KW - MOG KW - T-Lymphozyten KW - Kreuzreaktivität KW - ELISPOT KW - RT-PCR KW - multiple sclerosis KW - ViMS KW - Viral KW - immunisation KW - infection KW - MBP KW - MOG KW - T cell line KW - molecular mimicry KW - bystander activation Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5859 ER - TY - THES A1 - Kind, Sebastian T1 - Etablierung und Evaluierung eines molekularen Nachweises zur Quantifizierung des Chimärismus nach allogener Stammzelltransplantation T1 - Establishment and evaluation of a qPCR- based method to quantify chimerism after allogeneic stem cell transplantation N2 - Jedes Jahr werden am Universitätsklinikum Würzburg etwa 100 PatientInnen allogen stammzelltransplantiert. Für den Erfolg einer allogenen Stammzelltransplantation ist neben einer passenden Spenderauswahl und einer optimalen Vorbereitung auch die regelmäßige Nachkontrolle wichtig. Im Rahmen dieser Nachkontrollen werden unter anderem Chimärismusuntersuchungen durchgeführt. Als Chimäre wird in der Wissenschaft ein Lebewesen bezeichnet, das Zellen in sich trägt, die aus zwei oder mehr Zygoten entstanden ist. Der Begriff kommt aus der griechischen Mythologie, in der die Chimäre als Mischwesen aus Löwe, Ziege und Schlange (oder manchmal Drache) beschrieben wurde. Lange Zeit galt die STR/VNTR Methode als Goldstandard für die Nachkontrolle der Chimärismusuntersuchung. Durch Alizadeh et al. wurde bereits im Jahr 2002 eine neuartige Methode beschrieben, die mittels RT-PCR den genauen Chimärismusgrad messen kann. Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Etablierung und Evaluierung dieser Methode der Chimärismusuntersuchung am Universitätsklinikum Würzburg. Es konnte gezeigt werden, dass sie für den klinischen Alltag geeignet ist und wurde auch im Hinblick auf äußere Störfaktoren untersucht. Darüber hinaus wurde eine Methode zur Bestimmung des CD3+ Chimärismus etabliert. Diese Untersuchung ist wichtig für die Abschätzung eines möglichen Abstoßungs- und GvHD Risikos. Seit 2013 finden auf Basis dieser Arbeit regelmäßige Chimärismusuntersuchungen am Universitätsklinikum Würzburg statt. N2 - Every year, hematopoietic stem cell transplantations are being performed on approximately 100 patients at the university hospital Würzburg. Apart from finding a fitting stem cell donor and a perfect preparation of the recipient, follow-up examinations are essential for the long-term success of this procedure. Monitoring the chimerism after allogeneic stem cell transplantation is an essentialpart of those follow-up examinations. In science, a chimera is defined as a living organism, that contains cells deriving from different zygotes. In greek mythology, the „Chimera“ was described as a creature with the head of a lion, the body of a goat and the tail of a snake. For many years, the STR/VNTR method was the standard for post-transplant chimerism testing. In 2002, Alizadeh et al. developed a new method using RT-PCR to monitor chimerism. This dissertation evaluated and established this new method for engraftment analysis of transplanted patients at the university hospital Würzburg. It could be shown that the method was suitable for routine use in clinical practice. In addition, a method to measure CD3 + chimerism was established to evaluate the risks of GvHD or graft failure. Since 2013, chimerism is being tested at the university hospital Würzburg based on the results of this graduate thesis. KW - Knochenmarktransplantation KW - Real time quantitative PCR KW - Allogene Stammzelltransplantation KW - Chimärismus KW - RT-PCR KW - Allogeneic stem cell transplantation KW - Chimerism Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-208632 ER - TY - THES A1 - Butters, Marlene T1 - Etablierung und Evaluierung von quantitativen RT-PCR- und ELISA-Verfahren zur Bestimmung muriner Zytokinspiegel bei der Immunantwort gegenüber Aspergillus fumigatus T1 - Establishment and evaluation of quantitative RT-PCR- and ELISA-methods for identifycation of murine zytikin levels regarding the immune reaction against Aspergillus fumigatus N2 - In unserer Studie sollte die Genauigkeit der PCR zur Bestimmung von Zytokinspiegeln ermittelt werden. Mittels Blutproben von mit A. Fumigatus infizierten Mäusen, sollte eine Aussage bezüglich der Immunantwort getroffen werden. Wir griffen TNFα, IL-12p40 und IL-10 heraus, um einschätzen zu können, ob die Immunantwort eher humoral oder zellvermittelt abläuft. Zur möglichen Bestimmung der Sensitivität und Genauigkeit, wurden die crossing points der Standardverdünnungsreihen jeweils einmal in einem Lauf dreifach, ausserdem jeweils in drei unabhängigen Läufen von einander einfach eingesetzt, und miteinander verglichen. Unsere Ergebnisse decken sich mit den Ergebnissen aktueller Literatur und Etablierungen anderer Zytokine. Die Etablierung des ELISAs sollte dem Vergleich zwischen mRNA-Ebene und Proteinebene dienen. Zur richtigen Einordnung unserer Arbeiten mit dem Immunoassay müssen die Limitierungen der Ergebnisse beachtet werden. Die Versuche zur Quantifizierung der mRNA murinen TNFαs aus den Versuchsserien misslang. Auch die erzielten Ergebnisse mit Protein-basierten Nachweisverfahren konnten letztendlich nicht suffizient beurteilt werden. Die großen Schwankungen in der Konzentration und die Widersprüchlichkeit im Vergleich der Ergebnisse aktueller Literatur, machen eine Verfälschung durch Kontamination mit Proteinen aus lysierten Zellen sehr wahrscheinlich. Die erzielten Ergebnisse der RT-PCR anhand der Inter- und Intra-Assay- Vergleiche jedoch können nachfolgenden Projekten dazu dienen, hauptsächlich das Instrument LightCycler in seiner Sensitivität und Genauigkeit einschätzen zu können, und so die ermittelten Daten besser verarbeiten zu können. N2 - In this study we analysed the accuracy of PCR for identification of murine cytokine levels. Using blood samples of with A. Fumigatus infected mice, we wanted to reach a conclusion concerning the immune reaction. We picked TNFα, IL-12p40 and IL-10 to decide if the immune reaction is humoral or cell mediated. For determination of sensitivity and accuracy we compared the crossing points of the dilution standard series. We used the standard series once three times in one run and on the other hand in three independent runs. Our results correspond with the results in current literature. The establishment of the ELISA should have served for comparing the mRNA level with the protein level. But the tests failed. We couldn´t find mRNA of murine TNFα, and there was big variability in the concentration of protein. Probably the falsification happend because of the contamination with proteins from lysis of cells. But the conclusions from the RT-PCR inter- and intra-assay comparison could be helpful to assess the LightCycler instrument in its sensitivity and its accuracy and so facilitate the assessment of the results. KW - Aspergillus fumigatus KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Immunreaktion KW - Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion KW - Polymerase-Kettenreaktion KW - Real time quantitative PCR KW - Aspergillose KW - murin KW - IL 10 KW - IL 12 KW - IL 12p40 KW - ELISA KW - Mausmodell KW - invasive Aspergillose KW - aspergillus fumigatus KW - TNF a KW - immune reaction KW - RT-PCR KW - PCR KW - aspergillosis Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38890 ER - TY - THES A1 - Arnholdt, Jörg T1 - Vergleichende Genexpressions-Analyse unterschiedlicher Populationen mesenchymaler Stammzellen T1 - Comparing microarray analysis between different populations of mesenchymal stem cells N2 - Neben den omnipotenten embryonalen Stammzellen existieren im menschlichen Körper adulte mesenchymale Stammzellen (MSZ). Diese Zellen sind in mesenchymalen Geweben über den gesamten Organismus verteilt und sorgen für die Entwicklung und Erneuerung von mesenchymalen Geweben wie Knochen, Knorpel und Bändern. Daher gelten die MSZ im Gegensatz zu den omnipotenten embryonalen Stammzellen als multipotent. Diese verschiedenen MSZ stellen keine homogene Population dar, zeigen aber sowohl in vivo und auch in vitro ein ähnliches Differenzierungsverhalten. In der vorliegenden Arbeit wurde nun eine aus den Knochentrabekeln selbst isolierte MSZ-Population, so genannte bhMSZ, mit MSZ aus dem Knochenmark, mhMSZ genannt, mittels Array-Analyse miteinander verglichen. Die technische Evaluation des Array respektive der zugehörigen SAM-Analyse (significance analysis of microarrays) mittels konventioneller oder Real-Time PCR diente dazu, die Verlässlichkeit der Aussage der Hybridisierungsverfahren zu überprüfen. Dies wurde mit einem Set an ausgewählten Genen durchgeführt, die signifikant differentiell exprimiert waren, und die im Rahmen der Stammzellbiologie relevant erschienen. Die Analyse zeigte, dass die Übereinstimmung der Aussage im Array in über 80 % mit den Ergebnissen der RT-PCR kongruent war. Auf Grund starker interindividueller Schwankungen zeigte sich aber auch, dass die Anzahl der Spender 5 nicht unterschreiten sollte. Im Rahmen der Untersuchungen ergab sich, dass offenbar bei MSZ der Passage 0 eine Kontamination der MSZ mit Plasmazellen vorliegt. Weitere Versuche zeigten, dass erst das Passagieren der MSZ kontaminierende Plasmazellen weitgehend aus der Zellkultur entfernte. Aus diesem Grund wurde in einer weiteren Array Analyse das Transkriptom von MSZ aus Knochentrabekeln mit MSZ aus dem Knochenmark in Passage 1 verglichen. Es zeigten sich in einer stringenten SAM-Analyse keine Unterschiede im Transkriptom. Für klinische Anwendungen scheinen die bhMSZ daher auf Grund der aufwendigeren Isolierung und des dennoch eher geringen Zellgewinns nicht im gleichen Maß für klinische Anwendungen geeignet wie mhMSZ. N2 - The human body contains besides omnipotent embryonal stem cells also adult mesenchymal stem cells (MSC). These cells are spread all over the organism in mesenchymal tissues and are responsible for the development and regeneration of mesenchymal tissues like bone, cartilage and ligaments. Therefore these cells are called multipotent in comparison to the omnipotent embryonal stem cells. The different types of MSC are not a homogeneous population, but show in vivo and in vitro a similar differentiation behavior. The aim of this work was to compare the population of MSC isolated from bone marrow stroma (bhMSC) with MSC isolated from bone fragments (bhMSC) via microarray analysis. The technical evaluation of this array was performed by conventional or real-time PCR to evaluate the reliability of the hybridization procedure. This was done with an assortment of genes, which were differentially expressed, and were estimated to be relevant for the biology of stem cells. The analysis showed 80% accordance between the results of the microarray analysis and the PCR. In addition, the results showed that the number of the analysed individuals shouldn’t be under 5, because of a high interindividual variability. Besides this the experiments showed, that MSC of passage 0 are obviously contaminated with plasma cells. Further tests showed that contaminating plasma cells were widely removed in cell cultures of MSC passage 1. Therefore an additional array analysis was performed comparing MSC isolated from bone marrow stroma in passage 1 with those isolated from bone fragments. No difference could be observed in terms of their transcriptomes obtained by stringent SAM analysis. For clinical purposes bhMSC seem to be less suited because of the more sophisticated isolation procedure and nevertheless the lower cell number yield. KW - Adulte Stammzelle KW - Array KW - Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion KW - mesenchymal stem cell KW - Array KW - RT-PCR Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53512 ER -