TY  - THES
A1  - Teichgräber, Jürgen
T1  - Aminosubstituierte Terphenyle als neue Leitstruktur für allostere Modulatoren muscarinischer M2-Acetylcholinrezeptoren
T1  - Aminosubstituted terphenyls as new leadstructures for allosteric modulators of the muscarinic M2-acetylcholine receptors
N2  - Die muscarinischen Rezeptoren sind ein wichtiger Bestandteil des parasympathischen Nervensystems. Sie gehören zur großen Gruppe der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die nach ihrer Verwandtschaft in drei große Klassen eingeteilt werden können. Die muscarinischen Rezeptoren gehören zur Klasse A, den rhodopsinähnlichen Rezeptoren. Durch die im Jahr 2000 vorgenommene Aufklärung der hochauflösenden Röntgenkristallstruktur des Rinderrhodpsins und die hohe Aminosäuresequenzähnlichkeit der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren hat man eine sehr gute Modellvorstellung über den Aufbau der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Die Rezeptoren bestehen aus sieben transmembranalen Helices, die von drei intrazellulären und drei extrazellulären Loops stabilisiert werden. Bis heute konnten fünf Rezeptorsubtypen gentechnisch klassifiziert werden, die sich durch ihre Gewebeverteilung und Funktion unterscheiden. Allen Subtypen ist eine hohe Sequenzhomologie im Bereich der orthosteren Bindungsstelle gemeinsam, so dass die Entwicklung von subtyp-spezifischen orthosteren Liganden sehr schwierig ist. Außer der orthosteren Bindungsstelle konnte noch eine weitere Bindungsstelle am muscarinischen Rezeptor identifiziert werden. Diese befindet sich weiter außerhalb im Rezeptor in einem Bereich, der über die fünf Rezeptorsubtypen nicht sehr stark konserviert ist, so dass die Entwicklung von subtyp-spezifischen Liganden möglich ist. An dieser zweiten Bindungsstelle binden allostere Modulatoren. Hierbei handelt es sich um Substanzen, die ohne den orthosteren Liganden keinen Effekt am Rezeptor auslösen, dafür aber die Gleichgewichtsbindung des orthosteren Liganden beeinflussen können. Der Einfluss auf die Gleichgewichtsbindung geschieht wechselseitig und kann positiv, neutral oder negativ kooperativ sein. Zusätzlich üben allostere Modulatoren einen Effekt auf die Dissoziation des orthosteren Liganden aus. Die meisten bisher gefunden allosteren Modulatoren erniedrigen die Dissoziationsgeschwindikeit des orthosteren Liganden vom Rezeptor. Die Summe dieser Eigenschaften machen die allosteren Modulatoren sehr interessant für die Arzneimitteltherapie. Das Ziel dieser Arbeit war die Synthese strukturell neuer allosterer Modulatoren des muscarinischen Rezeptors unter Anwendung des postulierten Pharmakophormodells. Als Ausgangspunkt sollten geländerhelicale Moleküle dienen, die strukturell abgewandelt dieses Pharmakophormodell sehr gut erfüllen. Die geländerhelicalen Moleküle ähneln in ihrem dreidimensionalen Aufbau dem Geländer einer Wendeltreppe. Sie sind durch die Brücken zwischen den aromatischen Bereichen sehr rigide Moleküle, so dass es nur wenige genau definierte Konformationen gibt. Grundsätzlich können drei Atropisomere unterschieden werden, wobei zwei zueinander enantiomer sind. Geplant war die Synthese eine Reihe von tertiären Aminen oder quartären Ammoniumsalzen. Die Synthese der Ausgangsverbindung konnte nach der Vorschrift von Kiupel erfolgen, war aber nur mit geringer Ausbeute möglich. Deshalb wurde dieser Syntheseweg nicht weiterverfolgt. Als Alternative bot sich an, auf die Brücken zwischen den aromatischen Ringen zu verzichten. Die so entstandenen Verbindungen sind weniger rigide und können sich deshalb gegebenenfalls besser an den Rezeptor anpassen. Grundsätzlich können je nach Substitutionsmuster zwei Synthesewege verfolgt werden. Beide Varianten erfüllen das postulierte Pharmakophormodell. Der Aufbau des Grundgerüstes erfolgt mittels einer nickelkatalysierten Grignard-Kupplung. Danach erfolgen eine Wohl-Ziegler-Seitenkettenbromierung und eine Verlängerung der Seitenkette im Sinne einer Alkylierung mittels Malonsäurediethylester und einer Hilfsbase. Anschließend erfolgen die Decarboxylierung und die Umsetzung zum Amid, das zum Amin reduziert werden kann. Betrachtet man die Lage der Pharmakophorelemente so variiert der Abstand der positiv geladenen Stickstoffe je nach Konformation zwischen 5 Å und 15 Å, so dass ein weiter Bereich abgedeckt werden kann. Der Abstand der aromatischen Bereiche bleibt relativ stabil. Die pharmakologische Testung der Verbindungen auf ihre allostere Potenz und Affinität zum muscarinischen Rezeptor erfolgte in der Arbeitsgruppe von Prof. Mohr in Bonn. Hierzu werden Membranhomogenate vom Herzventrikelgewebe des Hausschweines verwendet. Diese enthalten mit großer Prävalenz muscarinische M2-Rezeptoren. Es wurden Gleichgewichtsbindungs- und Dissoziationsexperimente durchgeführt. Bis jetzt sind noch nicht alle Verbindungen getestet worden. Die bisher getesteten Verbindungen weisen alle eine Affinität zum mit [3H]-N-Methylscopolamin besetzten muscarinischen M2-Rezeptor im mikro-molaren Bereich auf. Sie liegen damit im oberen Bereich der bisher synthetisierten allosteren Modulatoren. Das postulierte Pharmakophormodell konnte also mit Hilfe der synthetisierten Substanzen bestätigt werden.
N2  - The muscarinic receptors are an important part of the parasympathic nervous system. They belong to the group of G protein-coupled receptors. Up to now about 1000 members of this group have been identified and were classified into three families. The muscarinic receptors belong to family A, the rhodopsine-like receptors, which is also the biggest family. Due to the high resolution X-ray crystallography analysis of bovine rhodopsine and the high similarity of the protein sequences of the G protein-coupled receptors, there is a good model describing the structure of the G protein-coupled receptors. The receptor consists of seven transmembranale helices which are stabilised by three extra- and three intracellular loops. Up to now five receptor subtypes are genetically classified which differ in tissue partitioning and function. All subtypes possess a high sequence similarity within the area of the orthosteric binding site. Therefore the development of subtypspecific orthosteric ligands is very difficult. Apart from the orthosteric site a second binding site at the muscarinic receptor could be identified located outside the receptor at a position which is not highly conserved over the five receptor subtypes. Due to this fact the development of subtypspecific ligands could be possible. At this second site allosteric modulators are able to bind. Allosteric modulators are substances which have no effect on the receptor without the binding of the orthosteric ligand, but affect the equilibrium binding of the orthosteric ligand. Influence on the equilibrium binding occurs mutual and is positively, neutral or negatively cooperative. Additionally allosteric modulators have an effect on the dissociation of the orthosteric ligand. Most of the known allosteric modulators reduce the dissociation rate of the orthosteric ligand from the receptor. These properties make allosteric modulators very interesting for medication. Their use could make a smooth and selective modulation of the orthosteric ligand´s effect on one special subtype within a wide therapeutic range possible. A positive cooperative allosteric modulator of the M2-receptor could enhance selectively the affinity of an orthosteric ligand to the receptor. The aim of this dissertation was the synthesis of structurally new allosteric modulators of the muscarinic receptor using the postulated pharmacophore model. Structurally modified “geländerhelicale” molecules served as starting point because they fit perfectly in the postulated pharmacophore model. The 3D structure of a “geländerhelical” molecule is similar to the banisters of a spiral staircase. Due to the bridges between the aromatic rings these molecules are very rigid so that there is a limited set of conformations. In principle three atropisomers can be distinguished, two of them are enantiomers. The synthesis of some tertiary amines or quartäry ammonia salts was intended. The first steps of the synthesis followed Kiupel´s synthesis scheme. Since the last-mentioned ring closure could only be performed with poor yields and a couple of reactions had to follow to obtain the pure product, the strategy was slightly changed. As an alternative the bridges between the aromatic rings were omitted. The compounds are less rigid and have the ability to adopt the receptor’s shape. Two synthesis strategies are possible. Both variations fulfil the postulated pharmacophore model. In case of pathway A the stereochemistry does not change. It could be distinguished between three atropisomers, two of them are enantiomers. In case of pathway B two atropisomers could be distinguished which are diastereomers. Due to higher yields pathway B was preferred. The skeleton was built up by means of a nickel catalysed Grignard coupling. After that the two side chains were brominated by a Wohl-Ziegler-bromination and alkylated by the use of diethyl malonate and a strong base. Afterwards the esters were decarboxylated and converted to the amide which could be reduced to the amine. Looking at the pharmacophoric elements the distance between the positive nitrogens varies due to the conformation between 5 Å and 15 Å, therefore a wide range is covered. The distance between the aromatic ring systems is nearly constant. The pharmacological testing of the compounds due to there allosterical potency and affinity to the muscarinic receptor were performed by the group of Prof. Mohr at Bonn using membrane suspensions of the guinea pig’s heart ventricle tissue. They contain muscarinic M2-receptors with high prevalence. Equilibrium binding and dissociation assays were performed. Up to now not all compounds are tested. The tested compounds show affinity to the [3H]NMS occupied muscarinic M2-receptor in a micro-molar range. The affinity falls into an upper range of the already synthesised compounds. All in all the postulated pharmacophore model could be confirmed by the synthesised compounds.
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Allosterischer Effektor
KW  - Terphenylderivate
KW  - Allosterer Modulator
KW  - Muscarinischer Rezeptor
KW  - Terphenyl Derivate
KW  - allosteric modulation
KW  - muscarinic receptors
KW  - terphenyl derivatives
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8571
ER  - 
TY  - THES
A1  - Bätz, Julia
T1  - FRET-basierte Untersuchungen zur ligandenselektiven Beeinflussung der Rezeptorkonformation durch orthosterische und allosterische Liganden am Beispiel des muskarinischen M2 Acetylcholinrezeptors
T1  - FRET-based analysis of the ligandselective influence of orthosteric and allosteric ligands on the change of receptor conformation of the muscarinic m2 acetylcholine receptor
N2  - Zahlreiche experimentelle Befunde lassen vermuten, dass G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCR) nach ihrer Aktivierung einer ligandenselektiven Änderung der Rezeptorkonformation unterliegen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es dieses Phänomen am Subtyp 2 der muskarinischen Acetylcholinrezeptoren (M2 AChR) zu untersuchen. Muskarinische Acetylcholinrezeptoren (mAChR) können in fünf Subtypen (M1-M5) unterschieden werden. Durch die Beteiligung der mAChR an zahlreichen physiologischen Prozessen stellen sie wichtige Zielstrukturen pharmakologischer Therapien dar. Da die orthosterische Ligandenbindestelle (= Bindestelle des endogenen Liganden) in allen fünf Subtypen hoch konserviert ist, wird ihr pharmakologischer Nutzen derzeit allerdings durch die unselektive Rezeptormodulation und dem damit verbundenen Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen stark limitiert. Ein Ansatz zur Erzielung subtypselektiver Effekte besteht in der Verwendung allosterischer Modulatoren. Da die allosterische Bindestelle der mAChR eine geringere Sequenzhomologie aufweist, können so gezielt einzelne Subtypen der mAChR reguliert werden. Der M2 AChR stellt hinsichtlich allosterischer Modulation ein gut charakterisiertes Modellsystem dar. Für ihn wurde bereits eine Vielzahl allosterischer Liganden entwickelt. Auch bitopische Liganden, die sowohl einen allosterischen als auch einen orthosterischen Anteil enthalten, wurden für den M2 AChR bereits beschrieben. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene FRET-Sensoren des M2 AChR generiert und charakterisiert. Als FRET-Paar wurden das cyan fluoreszierende Protein (CFP) und der niedermolekulare fluorescein-basierte Fluorophor FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) gewählt. CFP wurde in den Sensoren am Ende des C-Terminus angefügt. Die zur Markierung mit FlAsH nötige Tetracysteinsequenz wurde in verschiedenen Bereichen der dritten intrazellulären Rezeptorschleife (IL) eingebracht. Die auf diese Weise erstellten Re-zeptorsensoren trugen das Tetracysteinmotiv in der N terminalen (M2i3-N) bzw. in der C terminalen Region (M2i3-C) von IL 3. Die Charakterisierung der Rezeptorsensoren bezüglich Ligandenbindung, Gi-Protein Aktivierung und β-Arrestin2 Translokation ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen M2i3-N, M2i3 C und M2CFP oder Wildtyp M2 AChR. Zunächst wurden sowohl unterschiedliche orthosterische, als auch allosterische Liganden hinsichtlich ihrer mittleren effektiven Konzentration und ihrer maximalen Wirkstärke an den Rezeptorsensoren untersucht. Mit Hilfe von FRET-Messungen konnte ein superago-nistisches Verhalten des orthosterischen Testliganden Iperoxo gezeigt werden. Die Eigenschaften der allosterischen Substanzen wurden durch Messung der Rezeptordeakti-vierungskinetik und des maximalen Hemmeffekts auf einen vorstimulierten Rezeptor charakterisiert. Alle allosterischen Liganden deaktivierten den vorstimulierten M2 AChR mit einer schnelleren Kinetik als Atropin. Die EC50-Werte der unterschiedlichen Substanzen waren unabhängig von der Markierungsposition im verwendeten Rezeptorsensor vergleich-bar. Ausnahmen bildeten die allosterischen Liganden JK 289, JK 338, ½ W84 und EHW 477, die liganden- und sensorabhängig unterschiedliche mittlere effektive Konzentrationen aufwie-sen. Bei der Untersuchung der Konformationsänderung des M2 AChR konnte kein liganden-selektiver Unterschied zwischen den FRET-Signalen für 19 getestete orthosterische Liganden beobachtet werden. Dies deutet darauf hin, dass alle orthosterischen Testliganden eine dem Acetylcholin (ACh) vergleichbare Änderung der M2 AChR Konformation induzier-ten. Um zu untersuchen, ob für die orthosterischen Testliganden eine Korrelation zwischen ihrer maximalen Wirkstärke hinsichtlich Rezeptoraktivierung in FRET-Experimenten und der Aktivierung nachgeschalteter Signalwege besteht, wurde die orthosterisch-vermittelte Translokation von β-Arrestin2 mit Hilfe der Konfokalmikroskopie bestimmt. Bis auf 5-Methyl-furmethiodid translozierten alle orthosterischen Liganden β-Arrestin2 in einem Ausmaß, das mit der maximalen Rezeptoraktivierung vergleichbar war. Dagegen rief 5 Methylfurmethiodid verglichen mit dem endogenen Liganden ACh zwar eine ca. halbmaximale Rezeptorakti-vierung, aber nur eine äußerst geringe β-Arrestin2 Translokation hervor. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss verschiedener Allostere auf eine ligandenselektive Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Die allosterischen Liganden JK 337 und Seminaph beeinflussten den M2i3-C Sensor signifikant stärker, als das M2i3-N Konstrukt. Dagegen zeigte EHW 477 eine stärkere Beeinflussung der Rezeptorkon-formation des M2i3-N-, als des M2i3-C Sensors. Dies erlaubt die Vermutung, dass JK 337 und Seminaph eine stärkere Bewegung unterhalb von Transmembrandomäne (TM) 6, als unterhalb von TM 5 hervorriefen. Die Ergebnisse für EHW 477 legen nahe, dass TM 5 eine größere Bewegung eingeht, als TM 6. FRET-basierte Untersuchungen der Einflüsse der allosterischen Testliganden auf nachgeschaltete Signalwege ergaben, dass sowohl die Akti-vierung des Gi Proteins, als auch die β-Arrestin2 Translokation selektiv durch einzelne allosterische Liganden beeinflusst werden. Auch ein Zusammenhang zwischen Rezeptor-aktivierung und der Regulation nachgeschalteter Signalwege war erkennbar. Allerdings waren auf Grund der Versuchsbedingungen keine quantitativen Aussagen möglich. Im Folgenden wurden die bitopischen Liganden Hybrid 1 und 2 (H 1, H 2) hinsichtlich ihres Effekts auf die Konformationsänderung des M2 AChR untersucht. Während eine Stimulation mit H 1 vergleichbare FRET-Signale an beiden Sensoren ergab, konnte mit H 2 weder am M2i3-N-, noch an M2i3-C Sensor eine FRET-Änderung detektiert werden. Um den mangeln-den Effekt der Hybridsubstanzen in FRET-mikroskopischen Untersuchungen aufzuklären, wurden verschiedene Ansätze gewählt: Mit kettenverlängerten Derivaten der Hybridsubstanzen konnte in FRET-Messungen eine Änderung des FRET-Signals detektiert werden. Die Entfernung des allosterischen Bausteins führte in FRET-Experimenten zu einer verglichen mit dem endogenen Liganden ACh etwa halbmaximalen Aktivierung beider Sensoren. Dagegen resultierte die Mutation der alloste-rischen Bindestelle in nachfolgenden FRET-Untersuchungen mit H 1 und H 2 in keiner Signaländerung des FRET-Ratio. Diese Beobachtungen führten zu der Annahme, dass die Linkerkette, die orthosterischen und allosterischen Baustein der Hybride miteinander verbindet, zu kurz war um eine gleichzeitige Bindung an die allosterische und orthosterische Bindestelle zu ermöglichen. Ein anderer Erklärungsansatz besteht darin, dass nach Bindung des Orthosters der Kanal zwischen orthosterischer und allosterischer Bindestelle durch die Konformationsänderung des Rezeptors verschlossen wird, weshalb keine dauerhafte, dualsterische Bindung der Hybridsubstanzen an den M2 AChR möglich ist. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen mittels FRET-Experimenten die Existenz einer ligandenselektiven Rezeptorkonformation des M2 AChR mit allosterischen Liganden nachzuweisen. Darüber hinaus konnte auch ein Bezug zum Auftreten einer funktionellen Selektivität mit allosterischen Liganden hergestellt werden. Die Untersuchung von 19 orthosterischen Liganden hinsichtlich ihres Einflusses auf die Rezeptorkonformation des M2 AChR ergab keinen Hinweis auf eine ligandenselektive Konformationsänderung. Die Betrachtung der orthosterisch-vermittelten Translokation von β-Arrestin2 zeigte, dass zwischen der Effizienz der orthosterischen Testliganden, den M2 AChR zu aktivieren und dem Ausmaß, in dem sie eine β Arrestin2 Translokation induzierten eine direkte Korrelation besteht. Lediglich 5-Methylfurmethiodid rief eine ungleich geringere β-Arrestin2 Translokation hervor, verglichen mit dem Ausmaß an Rezeptoraktivierung. Diese Beobachtung deutet auf die Existenz eines signaling-bias für diesen Liganden hin. Die Untersuchung der dualsterischen Liganden H 1 und 2 bezüglich ihrer Fähigkeit zur Rezeptoraktivierung ergab, dass erst durch eine Verlängerung der Linkerkette, durch die orthosterischer und alloste-rischer Baustein miteinander verbunden sind eine Konformationsänderung des M2 AChR hin zu einer aktiven Konformation erreicht werden kann. Es kann somit angenommen werden, dass in den ursprünglichen Hybridsubstanzen H 1 und H 2 eine zu kurze Linkerkette, durch die keine dualsterische Bindung der Hybride an die allosterische und orthosterische Bindestelle möglich ist, ursächlich für die mangelnde Rezeptoraktivierung des M2 AChR war.
N2  - A large body of experimental evidence suggests that upon receptor activation G-protein coupled receptors are subject to ligandspecific changes of receptor conformation. The aim of this study was to investigate this phenomenon using the muscarinic M2 acetylcholine receptor (M2 AChR). Muscarinic acetylcholine receptors (mAChR) can be subdivided into five different subtypes (M1-M5). Their involvement in various physiological processes makes them an important target of pharma-cological therapies. With the orthosteric binding site (= binding site of the endogenous ligand) being highly conserved across all five mAChR subtypes, the unselective receptor modulation can lead to severe side effects. Thus the clinical use of drugs modulating muscarinic receptors is currently limited. Allosteric modulation is one attempt to achieve subtype-selective receptor regulation. Since the allosteric binding site of mAChR is less well conserved, it is possible to selectively target one mAChR subtype. As far as allosteric modulation is concerned, the M2 AChR represents a well characterized model with a large number of allosteric modulators being available. For the M2 AChR bitopic ligands which contain an allosteric as well as an orthosteric binding block have been developed as well. In the first part of this study several FRET-sensors of the M2 AChR were designed and characterized. The cyan fluorescent protein (CFP) was fused to the C-terminus of both sensors while the FlAsH (fluorescein arsenical hairpin binder) binding site was inserted into the N-terminal (M2i3-N) or the C terminal (M2i3-C) region of the third interacellular loop (IL). The receptor sensors were characterized concerning ligand affinity, activation of the Gi protein and -arrestin2 translocation and did not display any significant differences compared to the wildtype M2 or the M2 CFP receptor. Various orthosteric as well as allosteric ligands were investigated regarding their affinity and efficacy at both sensors. Using FRET-measurements iperoxo was proven to behave as a superagonist. The characteristics of the allosteric ligands were investigated by measuring the receptor deactivation kinetics and their maximum inhibitory effect on a pre-stimulated receptor. All allosteric test substances displayed faster deactivation kinetics compared to the antagonist atropine and similar EC50 values at both receptor sensors. When investigating the change of receptor conformation of the M2 AChR upon ligand binding there were no ligand selective differences in the FRET-signal detected for either of the 19 orthosteric ligands at both M2 sensors. This data suggest that all orthosteric ligands induced a change in receptor conformation comparable to acetylcholine (ACh). In order to correlate the efficacy of various orthosteric ligands to activate the M2 AChR in FRET-experiments with their effect on downstream signaling pathways, the translocation of  arrestin2 upon receptor activation with orthosteric ligands was investigated using confocal microscopy. Except for 5 methylfurmethiodide all orthosteric ligands induced -arrestin2 translocation to an extent which was comparable to the maximal receptor activation observed with each other ligand, respectively. In contrast 5-methylfurmethiodide evoked a half maximal receptor activation compared to the endogenous ligand ACh while only a minimal translocation of -arrestin2 was observed. The second aim of this study was to investigate the effects of allosteric ligands on the change of receptor conformation of the M2 AChR. The allosteric ligands JK 337 and seminaph more strongly influenced the M2i3-C than the M2i3-N, whilst EHW 477 behaved just the opposite way. This data suggest that the orthosteric ligands induce a conformation of the M2 AChR comparable to ACh. JK 337 and seminaph seem to evoke a greater movement underneath TM 6 compared to TM 5 whereas EHW 477 probably induces a larger movement beneath TM 5. The allosteric ligands were tested via FRET-measurements concerning their ability to activate the Gi protein and to translocate  arrestin2. The activation of the Gi protein as well as the -arrestin2 translocation were selectively influenced by all allosteric ligands. However, due to the experimental setup, a quantification of the effects was not possible. Furthermore the bitopic ligands hybrid 1 and 2 (H 1, H 2) were tested regarding their effect on the receptor conformation of the M2 AChR. While stimulation with H 1 induced FRET signals that were comparable for both receptor sensors, it wasn’t possible to detect any change in the FRET ratio neither of the M2i3-N nor of the M2i3-C with H 2. The lack of effect of H 1 and H 2 in the FRET-experiments was explored using two different approaches: Derivatives of H 1 and H 2, in which the carbon linker between the allosteric and the orthosteric building block had been elongated, were able to induce changes in the FRET ratio. Upon the removal of the allosteric building block a half-maximal activation of both receptor sensors could be detected. However, the mutation of the allosteric binding site did not result in any change of the FRET-signals upon stimulation of the receptor mutants with H 1 or H 2. These data suggest that the carbon linker, which connects the allosteric and the orthosteric building block, is not long enough to enable a simultaneous binding to the allosteric and the orthosteric binding site. Another explanation would be that upon binding of an orthoster the channel between the orthosteric and the allosteric binding site of the M2 AChR is closed because of the change in receptor conformation, hence a stable, dual-steric binding of the hybrid substances to the M2 AChR would not be possible. In the course of this study it was possible to prove the existence of a ligand selective receptor conformation of the M2 AChR with allosteric ligands using FRET-experiments. In addition a connection was found to the occurrence of a functional selctivity with allosteric ligands. The investigation of 19 orthosteric ligands regarding their influence on the receptor conformation of the M2 AChR did not reveal any evidence of the existence of a ligand selective change of the receptor conformation. Regarding the translocation of β arrestin2 induced by orthosteric ligands there was a direct correlation between the efficency of the orthosteric ligands to activate the receptor and the extend of β-arrestin2 translocation observed. With the only exception being 5-methylfurmethiodide which induced far less β arrestin2 translocation compared to the magnitude of the conformational change of the receptor. This data suggest the existence of a signaling bias for this ligand. The analysis of the dualsteric ligands H 1 and H 2 concerning their ability to activate the M2 AChR revealed that an activation of the M2 AChR could just be observed upon elongation of the linker which connects the orthosteric with the allosteric building block. This suggests that the short linker chain of the original hybrid substances inhibited a dualsteric binding to the orthosteric and the allosteric binding site and thus caused the difficency of H 1 and H 2 to activate the M2 AChR.
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Allosterie
KW  - G-Protein gekoppelte Rezeptoren
KW  - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer
KW  - allosteric modulation
KW  - muscarinic aceylcholine receptor
KW  - GPCR
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72836
ER  - 
TY  - THES
A1  - Muth, Mathias
T1  - Synthese und Charakterisierung allosterer Modulatoren muscarinischer M2-Rezeptoren : Strukturvariationen der Bis(ammonium)alkan-Verbindung W84
T1  - Synthesis and characterisation of allosteric modulators of the muscarinic M2-receptor - structural variations of the bis(ammonio)alkane-compound W84
N2  - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese und Charakterisierung allosterer Modulatoren muscarinischer Rezeptoren. Allostere Modulatoren binden an einer topographisch anderen Stelle am Rezeptor als klassische orthostere Liganden und sind so in der Lage, die Dissoziation und die Assoziation orthosterer Agonisten und Antagonisten zu beeinflussen. Die fünf Subtypen des Muscarinrezeptors M1-M5 unterscheiden sich vor allem in der Aminosäuresequenz der in den äußeren Bereichen des Rezeptorproteins vorhandenen Loops, während sie im Bereich des Rezeptorkanals, wo die orthostere Bindungsstelle lokalisiert ist, eine hohe Sequenzhomologie aufweisen. Die gemeinsame Bindungsstelle allosterer Modulatoren des M2-Rezeptors befindet sich im weniger konservierten extrazellulären Bereich. Somit sind allostere Modulatoren in der Lage, spezifisch an einen der Rezeptorsubtypen zu binden. Als Leitstruktur zum Entwurf der im Rahmen dieser Arbeit synthetisierten Verbindungen diente die Bis(ammonium)alkanverbindung W84. Über Weg A wurden Phthalsäure- bzw. Naphthalsäureanhydridderivate in einer Kondensationsreaktion mit dem entsprechenden N,N-Dimethylpropan-1,3-diaminderivat zum jeweiligen Phthalimidopropylaminderivat umgesetzt. Durch die Reaktion von zwei Äquivalenten des Amins mit einem Äquivalent 1,6-Dibromhexan wurden dann die symmetrischen W84-Derivate erhalten. Um die unsymmetrischen W84-Derivate zu erhalten, musste zunächst das jeweilige Phthalimidopropylamin einseitig durch 1,6-Dibromhexan alkyliert werden. Im letzten Schritt wurden äquimolare Mengen der alkylierten Verbindung und eines Phthalimidopropylamins umgesetzt. Da sich im Laufe der Arbeit die Methylierung an Position 2 der Propylketten als kritische Position zur Beeinflussung der Gleichgewichtsbindung herausstellte, wurden Verbindungen hergestellt, die an den Propylketten Alkylgruppen verschiedener Länge tragen. Aus diesem Grund wurde Syntheseweg B entwickelt. Zunächst wurden in mehreren Stufen, ausgehend von Malonsäurediethylester, einfach und zweifach mit Alkylgruppen substituierte 1,3-Dibrompropanderivate hergestellt. Diese wurden dann mit Kaliumphthalimid zu den jeweiligen 3-Brompropylphthalimidderivaten umgesetzt. Zwei Äquivalente dieser 3-Brompropylphthalimide reagierten mit einem Äquivalent N,N,N’,N’-Tetramethyl-1,6-hexandiamin zu den entsprechenden symmetrischen W84-Derivaten. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, stark fluoreszierende W84-Derivate herzustellen. Die fluoreszierenden Eigenschaften N-substituierter Naphthalimide könnten zur direkten Charakterisierung allosterer Interaktionen oder zur Verfolgung des „Rezeptor-Traffickings“ mittels Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie genutzt werden. Deshalb wurden in Position 3 und 4 des Naphthalimidringes des potentesten allosteren Modulators Aminogruppen eingeführt. Hexamethonio-Derivate beeinflussen in nennenswertem Maße bisher nur die Bindung von Antagonisten am M2-Rezeptor. Da die allostere und die orthostere Bindungsstelle räumlich nahe zusammenliegen, wurde der Versuch unternommen, einen orthosteren Agonisten und einen allosteren Modulator in einem Molekül miteinander zu verknüpfen. Es wurden zwölf Hybridmoleküle aus einem Teil des hochaffinen allosteren Modulators 3a und Derivaten des Muscarinagonisten Oxotremorin-M, verbunden durch aliphatische Spacer verschiedener Länge, hergestellt. In pharmakologischen Testungen soll aufgeklärt werden, ob es möglich ist, mit einem Agonist/Alloster-Hybridmolekül gleichzeitig die orthostere und die allostere Bindungsstelle zu besetzen. Die pharmakologische Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte durch Radioligandbindungsstudien. Der allostere Effekt der Testsubstanzen wurde indirekt über die Verzögerung der Dissoziation des radioaktiv markierten orthosteren Antagonisten [3H]N-Methylscopolamin bestimmt. Alle bisquartären Testverbindungen weisen deutlich höhere Affinitätswerte als die Leitstruktur W84 auf. Die 1,8-Naphthalimid-substituierten Verbindungen mit gleichzeitiger zweifacher Methylierung erwiesen sich als hochaffin und zugleich positiv kooperativ. Die wirksamste Verbindung dieser Serie ist Verbindung 3a (Naphmethonium), deren Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor im einstelligen nanomolaren Bereich liegt (pEC50 = 8.36). Somit stellt Naphmethonium den potentesten in der Literatur bekannten allosteren Modulator des M2 Rezeptors dar. Mittels QSAR-Analysen wurden die ermittelten Affinitäten zum freien und zum NMS-besetzten Rezeptor in Zusammenhang mit verschiedenen physikochemischen Parametern gebracht. Die Affinität zum NMS-besetzten Rezeptor der Verbindungen der Serie 2 lässt sich mit hoher Güte durch das Volumen eines lateralen N-Methylimids in Kombination mit der benachbarten Dimethylierung der Propylkette beschreiben. Somit wird deutlich, dass zur Erzielung von positiver Kooperativität die Kombination aus einem hochaffinen aromatischen Imid in direkter Nachbarschaft zu einer 2,2-Alkylpropylkette essentiell ist.
N2  - The present work deals with the synthesis and characterization of allosteric modulators of muscarinic receptors. Allosteric modulators bind to a topographically different site than classical orthosteric ligands and, thus, are capable of influencing both the dissociation and the association of orthosteric agonists and antagonists. Allosteric modulators are capable of binding selectively to specific subtypes. The bis(ammonio)alkane-type compound W84 served as a lead for the compounds synthesized in this work. Via pathway A, phthalic- and naphthalic anhydride derivatives were converted with N,N-dimethylpropane-1,3-diamines to the phthalimidopropylamine derivatives. The symmetrical W84-derivatives were obtained by the conversion of two equivalents of the amine with one equivalent 1,6 dibromohexane. To obtain the non-symmetrical W84-derivatives the phthalimidopropylamines were unilaterally alkylated by 1,6-dibromohexane. In the last step equimolar amounts of the monoalkylated compound and a phthalimidopropylamine were connected. During our studies the methylation of position 2 of the propylene chains was identified as critical position for the influence on equilibrium binding. Therefore, compounds with varying alkyl substituents were synthesized. First, starting from malonic diethyl ester, 1,3-dibromo-propane derivatives carrying one or two ethyl-, propyl- or iso-butyl groups, respectively, were synthesized first. The latter were converted to the corresponding 3-bromopropylphthalimid derivatives with potassium phthalimide. In the last step two equivalents of the bromopropyl-phthalimides reacted with one equivalent tetramethyl-1,6-hexane-diamine to the symmetrical hexamethonio-derivatives. A further aim of the work was to synthesize highly fluorescent W84-derivatives. The fluorescent properties of N-substituted naphthalimides could be utilized for the direct characterization of allosteric interactions. Therefore, amino groups were introduced in positions 3 and 4 of the naphthalimide moiety. Until now, only the binding of antagonists of the M2 receptor was influenced by hexamethonio derivatives. Because of the spatial proximity of the orthosteric to the allosteric binding site it was tried to combine an agonist and an allosteric modulator in one molecule. Twelve hybride molecules consisting of a part of a highly affin allosteric modulator and of derivatives of the muscarinic agonist oxotremorine-M were synthesized. In the pharmacological evaluation it will be elucidated if it is possible for an agonist/alloster-hybride molecule to bind simultaneously to the orthosteric and the allosteric site. The pharmacological testing of the compounds was accomplished by radioligand binding studies . The allosteric effect of the compounds was determined by measurement of the inhibition of the dissociation of the radioactive marked orthosteric antagonist [3H]N-methylscopolamine. All compounds revealed higher affinitiy values than the lead structure W84. The most potent compound of that series is compound 3a (naphmethonium) that reveals an affinity to the NMS-occupied receptor in the low nanomolar range (pEC50 = 8.36). Taking all results together, the highest affinity values in combination with positive cooperativity were obtained for W84-derivatives carrying at least one naphthalimide moiety directly connected to a 2,2-dimethylpropyl chain. By the introduction of different alkyl groups in the propylene chains it was possible to verify the critical position with respect to the cooperative behaviour of W84-derivatives. QSAR-studies were performed in order to check whether the pharmacologically determined affinities to the free and to the NMS-occupied receptor can be explained by physicochemical properties of the compounds. The affinity to the NMS-occupied receptor of the compounds of series 2 can be described using the volume of one lateral N-methylimide in combination with the dimethylation of the neighbored propylene chain. Summarizing these results it can be concluded that the compounds feature a dominant side with regard to allosteric potency. To achieve positive cooperativity the combination of an affinity generating lateral aromatic imide moiety connected to a 2,2-alkylated propylene chain is essential.
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - allosterischer Effektor
KW  - W84
KW  - Analoga
KW  - Chemische Synthese
KW  - GPCR
KW  - allostere Modulation
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - GPCR
KW  - allosteric modulation
KW  - muscarinic receptor
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8839
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schmitz, Jens
T1  - Synthese von Liganden muscarinerger Rezeptoren - Allostere Modulatoren, bivalente Agonisten und Antagonisten
T1  - Synthesis of ligands of muscarinic receptors - Allosteric modulators, bivalent agonists and antagonists
N2  - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Synthese von Liganden muscarinerger Rezeptoren, die zur Superfamilie der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren gehören. Die fünf Muscarinrezeptor-Subtypen weisen im Bereich der orthosteren Bindungsstelle, an die u. a. der endogene Ligand Acetylcholin bindet, einen hohen Konservierungsgrad der Aminosäuresequenz auf. Alle Muscarinrezeptoren weisen neben der orthosteren Bindungsstelle auch eine oder mehrere allostere Bindungsstellen auf. Da diese sich im weniger konservierten extrazellulären Bereich des Rezeptors befinden, ist es möglich subtypspezifische Liganden zu entwickeln. Allostere Modulatoren binden an diese topographisch andere Stelle des Rezeptors und sind in der Lage, gezielt die Bindung eines orthosteren Agonisten oder Antagonisten zu modulieren. Dies bedeutet, dass sie die Assoziation und die Dissoziation orthosterer Agonisten und Antagonisten beeinflussen können. Die Gleichgewichtsbindung des Orthosters kann erhöht (d. h. positive Kooperativität), erniedrigt (d. h. negative Kooperativität) bzw. nicht beeinflusst (d. h. neutrale Kooperativität) werden. Das Ziel der Arbeit bestand zunächst darin, die Synthese allosterer Modulatoren des M2-Rezeptors vom Bis(ammonium)alkan-Typ, wie W84 und Naphmethonium, zu optimieren. Da die Synthesen dieser bisquartären Verbindungen zeitaufwändig sind, wurden die Synthesen durch Einsatz einer Synthesemikrowelle optimiert, um neue Bis(ammonium)alkan-Verbindungen effizienter synthetisieren zu können. Der Vergleich beider Synthesemethoden (konventionell bzw. Mikrowellen-unterstützt) zeigt sehr deutlich, dass die Reaktionszeiten durch Einsatz einer Synthesemikrowelle drastisch verkürzt werden konnten, insbesondere bei Verbindungen, die sehr lange Reaktionszeiten beanspruchen. Zusätzlich konnten die Ausbeuten aller synthetisierten Verbindungen durch Mikrowellen-unterstützte Synthese z. T. deutlich gesteigert werden. Im Verlauf der Arbeit wurden unsymmetrisch und symmetrisch nitrosubstituierte Bisnaphthalimide hergestellt. Durch Mikrowellen-unterstützte Hydrierung unter Palladium/Kohle-Katalyse wurden anschließend die analogen aminosubstituierten Derivate erhalten. Ein weiteres Ziel der Arbeit bestand darin, ein Naphmethonium-Derivat herzustellen, das über einen Spacer mit einem geeigneten Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt werden kann. Ein Farbstoff-markierter allosterer Modulator könnte als ein wichtiges pharmakologisches Werkzeug zur direkten Charakterisierung allosterer Interaktionen und zur Verfolgung des „Rezeptor-Traffickings“ mittels Fluoreszenzkorrelations-spektroskopie genutzt werden. Als Spacer diente eine Alkylkette mit endständiger primärer Aminofunktion, die mit Alexa-Fluor 532 gekoppelt werden sollte. Zur Einführung des Spacers wurden verschiedene Strategien verfolgt. Schließlich konnte Verbindung 3h über eine Chlorzwischenstufe hergestellt werden, über deren freie primäre Aminogruppe der Fluoreszenzfarbstoff in weiteren Arbeiten gekoppelt werden kann. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Syntheseoptimierung des hochpotenten unselektiven Agonisten Iperoxo, das eine für akademische Zwecke wichtige Substanz in der pharmakologischen Testung und ein wichtiges Zwischenprodukt in der Synthese bivalenter Agonist/Alloster-Hybridverbindungen ist. Die Ausbeuten aller Stufen konnten erhöht und die Gesamtausbeute signifikant von 13% auf 22% gesteigert werden. Außerdem wurden neue Agonisten hergestellt, die sich im Heterozyklus unterscheiden. Ein weiteres Ziel der Arbeit war die Synthese bivalenter Hybridverbindungen nach dem Nachrichten-Adressen-Modell von Schwyzer. Zum einen sollten Agonist/Alloster-Hybridverbindungen synthetisiert werden, wobei die in der Literatur beschriebene Hybridverbindung Hybrid 1 (W84 und Iperoxo) als Leitstruktur diente. So wurde im ersten Schritt eine auf der allosteren Seite verkürzte Substanz ohne Phthalimidopropyl-Rest hergestellt (Hexamethonium und Iperoxo). Danach wurden verschiedene Funktionalitäten an der lateralen quartären Ammoniumfunktion eingeführt. Daneben wurden erstmals Antagonist/Alloster-Hybridverbindungen hergestellt, die aus einem M2-selektiven allosteren Modulator (W84, Naphmethonium bzw. Hexamethonium) und einem subtypunspezifischen Antagonisten (Atropin bzw. Scopolamin) bestehen. Im ersten Schritt wurde der allostere Molekülteil nach der optimierten Mikrowellen-unterstützten Synthese hergestellt. Die erhaltenen Zwischenstufen 2 wurden im Anschluss mit Atropin und Scopolamin in Acetonitril umgesetzt und die Antagonist/Alloster-Hybridverbindungen 34 und 35 erhalten. Die pharmakologische Testung der synthetisierten Verbindungen erfolgte durch Radioligandbindungsstudien an Herzventrikelgewebe des Hausschweins. Der allostere Effekt der Testsubstanzen wurde indirekt über die Verzögerung der Dissoziation des radioaktiv markierten orthosteren Antagonisten [3H]N-Methylscopolamin.
N2  - The present work focussed on the synthesis and characterisation of ligands of muscarinic receptors belonging to the superfamily of G-protein-coupled receptors. The five known subtypes of muscarinic receptors (M1-M5) are located ubiquitary in the mammalian organism and participate in many physiological procedures. The endogenous ligand acetylcholine and classical antagonists bind to the orthosteric binding site, which is located deeply in the receptor channel and exhibit a highly conserved amino acid sequence. Allosteric modulators bind to a topographically different site than classical orthosteric ligands. The allosteric binding sites are located in the external loops of the receptor protein. Since these regions exhibit a less conserved structure it is possible to design allosteric modulators capable of binding selectively to specific subtypes and modulating the efficiency of the orthosteric ligand. An allosteric modulator has the ability to affect equilibrium binding of the orthosteric agonist or antagonist: equilibrium binding can either be increased (= positive cooperativity), decreased (= negative cooperativity) or left unaltered (= neutral cooperativity). One intention of this work was to optimize the synthetic pathway to bis(ammonio)alkane-type allosteric modulators of the M2-receptor, like W84 or naphmethonio. The syntheses to these bisquaternary compounds are time consuming. In order to obtain new potent bis(ammonio)alkane-compounds the syntheses were optimized by using a microwave oven. Comparing the conversion times of conventional and microwave-assisted heating revealed a substantially speed up in the synthetic pathway particularly for the reactions which took the longest under conventional reflux conditions. Additionally, the yields of all synthesized compounds could be increased by means of microwave-assisted synthesis. In this work symmetrical and non-symmetrical nitro-substituted bisnaphthalimides were synthesized and the analogue amino-substituted compounds were obtained by microwave-assisted hydrogenation afterwards. A further aim of this work was to synthesize a naphmethonio-derivative which is suitable for a connection to a fluorescent dye. A fluorescent naphmethonio-derivative may help to characterize allosteric interactions directly and trace receptor trafficking by means of fluorescence correlation spectroscopy. Firstly, a primary amino group should be connected via an alkyl-spacer to the allosteric modulator and secondly, this intermediate should be combined with the fluorescent dye alexa-fluor-532. Several strategies were prosecuted. Finally, the synthesis of compound 3h via a chloride-intermediate was successful. Another intention of this work was to optimize the synthetic pathway to the non-selective muscarinic agonist iperoxo, which is an important reference compound in the pharmacological testing and an intermediate in the synthetic pathway of bivalent agonist/allosteric modulator hybrid compounds. The yields in each reaction step were enhanced and the total yield was increased from 13 % to 22 %. Furthermore, other muscarinic agonists differing in the substitution pattern of the heterocycle were synthesized. A further aim of this work was to synthesize bivalent hybrid compounds combining an orthosteric and an allosteric ligand in one molecule. Following Schwyzer´s concept of hybrid compounds containing an “address” skeleton that binds selectively to a receptor subtype and a non-selective “message” moiety inducing agonism or antagonism, a group of hybrid hexamethonio-type derivatives has been designed as subtype selective agonists and antagonists. Hybrid 1 served as a lead for the agonist/allosteric modulator-hybrid compounds synthesized in this work. Firstly, the goal was to combine the agonist iperoxo with hexamethonio and secondly, to introduce a different substitution pattern at the lateral quaternary ammonio-group in the obtained iperoxo/hexamethonio-hybrid compound 27a. Another aim of this work was to synthesize antagonist/allosteric modulator hybrid compounds. Therefore, the classical antagonists atropine and scopolamine were connected with the allosteric agents W84, naphmethonio and hexamethonio via hexyl-spacer. The pharmacological testing of all compounds was accomplished by radioligand binding studies in homogenates of porcine heart ventricles. The resulting allosteric effect was determined by measuring the inhibition of the dissociation of the radioactive marked orthosteric antagonist [3H]N-methylscopolamine ([3H]NMS). In equilibrium binding studies information about the affinity of the allosteric modulators to the free receptor and about the cooperativity between the allosteric and the orthosteric ligand was obtained.
KW  - Chemische Synthese
KW  - Muscarinrezeptor
KW  - Bivalente Hybridverbindungen
KW  - Allostere Modulation
KW  - GPCR
KW  - bivalent hybrid compounds
KW  - allosteric modulation
KW  - GPCR
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28390
ER  -