TY - THES A1 - Brockmann, Markus T1 - Inhibition von Aurora-A als neue Therapiestrategie gegen MYCN-amplifizierte Neuroblastome T1 - Inhibition of Aurora-A as a novel therapeutic strategy against MYCN-amplified Neuroblastoma N2 - Im Neuroblastom ist die Amplifikation des MYCN-Gens, das für den Transkriptionsfaktor N-Myc kodiert, der klinisch bedeutendste Faktor für eine schlechte Prognose. Als Mitglied der onkogenen Myc-Familie induziert N-Myc die Expression von Genen, die in vielen biologischen Prozessen wie Metabolismus, Zellzyklusprogression, Zellwachstum und Apoptose eine wichtige Rolle spielen. Die Deregulation der MYCN-Expression führt zu einem charakteristischen Genexpressionsprofil und einem aggressiven Phenotyp in den Tumorzellen. In normalen neuronalen Vorläuferzellen wird N-Myc gewöhnlich sehr schnell proteasomal abgebaut. Während der Mitose wird N-Myc an Serin 62 phosphoryliert. Diese Phosphorylierung dient als Erkennungssignal für die Kinase GSK3β, die die Phosphorylierung an Threonin 58 katalysiert. Das Phosphodegron wird von Fbxw7, einer Komponente des E3-Ubiquitinligase-Komplex SCFFbxw7, erkannt. Die anschließende Ubiquitinierung induziert den proteasomalen Abbau des Proteins. Die Reduktion der N-Myc–Proteinlevel ermöglicht den neuronalen Vorläuferzellen den Austritt aus dem Zellzyklus und führt zu einer terminalen Differenzierung. In einem shRNA Screen konnte AURKA als essentielles Gen für die Proliferation MYCN-amplifizierter Neuroblastomzellen identifiziert werden. Eine Aurora-A–Depletion hatte jedoch keinen Einfluss auf das Wachstum nicht-amplifizierter Zellen. Während dieser Doktorarbeit konnte gezeigt werden, dass Aurora-A speziell den Fbxw7-vermittelten Abbau verhindert und dadurch N-Myc stabilisiert. Für die Stabilisierung ist zwar die Interaktion der beiden Proteine von entscheidender Bedeutung, überraschenderweise spielt die Kinaseaktivität von Aurora-A jedoch keine Rolle. Zwei spezifische Aurora-A–Inhibitoren, MLN8054 und MLN8237, sind allerdings in der Lage, nicht nur die Kinaseaktivität zu hemmen, sondern auch die N-Myc-Proteinlevel zu reduzieren. Beide Moleküle induzieren eine Konformationsänderung in der Kinasedomäne von Aurora-A. Diese ungewöhnliche strukturelle Veränderung hat zur Folge, dass der N-Myc/Aurora-A–Komplex dissoziiert und N-Myc mit Hilfe von Fbxw7 proteasomal abgebaut werden kann. In MYCN-amplifizierten Zellen führt diese Reduktion an N-Myc zu einem Zellzyklusarrest in der G1-Phase. Die in vitro Daten konnten in einem transgenen Maus-Modell für das MYCN-amplifizierte Neuroblastom bestätigt werden. Die Behandlung mit MLN8054 und MLN8237 führte in den Tumoren ebenfalls zu einer N-Myc-Reduktion. Darüber hinaus konnte ein prozentualer Anstieg an differenzierten Zellen, die vollständige Tumorregression in der Mehrzahl der Neuroblastome und eine gesteigerte Lebenserwartung beobachtet werden. Insgesamt zeigen die in vitro und in vivo Daten, dass die spezifischen Aurora-A–Inhibitoren ein hohes therapeutisches Potential gegen das MYCN-amplifizierte Neuroblastom besitzen. N2 - Amplification of MYCN, encoding the transcription factor N-Myc, is one of the strongest clinical predictors of poor prognosis in neuroblastoma. As a member of the oncogenic Myc family, N-Myc activates genes that are involved in several biological processes like metabolism, cell cycle progression, cell growth and apoptosis. Deregulation of MYCN expression leads to a distinct gene expression profile and an aggressive phenotype in neuroblastoma cells. In normal neuronal progenitor cells, N-Myc is rapidly degraded by the ubiquitin-proteasome system. N-Myc degradation is controlled by two phospho-sites. During mitosis, Cyclin B/Cdk1 phosphorylates N-Myc at serine 62, which primes the protein for a second phosphorylation at threonine 58 via GSK3β. This phospho-degron provides a recognition site for Fbxw7, an F-box protein of the E3-Ligase complex SCFFbxw7, leading to destabilisation of the N-Myc protein. Mitotic degradation of the N-Myc protein allows progenitor cells to exit the cell cycle and enables terminal differentiation. Our group had previously identified AURKA as a gene that is required for cell growth in MYCN-amplified neuroblastoma cells but not essential for cells lacking MYCN. Here, we show that Aurora-A counteracts the Fbxw7-mediated degradation, and that the interaction between Aurora-A and N-Myc is cruical for N-Myc stabilization. Surprisingly, Aurora-A stabilizes the transcription factor in a kinase-independent manner. Interestingly, two Aurora-A-Inhibitors, MLN8054 and MLN8237, inhibit the kinase activity but also destabilize the N-Myc protein. These inhibitors induce an unusual conformation of the kinase domain and resulting in the dissociation of the N-Myc/Aurora-A complex. We demonstrate that the disruption of the complex promotes Fbxw7-mediated degradation of N-Myc. Inhibitor treatment in neuroblastoma cells leads to a cell cycle arrest in G1-phase. In a transgenic mouse model of MYCN-driven neuroblastoma, treatment causes downregulation of N-Myc protein levels, differentiation of the tumor cells and complete tumor regression in the majority of tumors. Consistent with the tumor reduction, treatment with MLN8054 and MLN8234 results in an extension of survival of the transgenic mice. Collectively, these results demonstrate that the Aurora-A–Inhibitors MLN8054 and MLN8237 are potential therapeutics against MYCN-amplified Neuroblastoma. KW - N-Myc KW - Neuroblastoma KW - Therapie KW - Neuroblastom KW - MYCN-amplified KW - Therapy KW - Aurora-A Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-135951 ER - TY - THES A1 - Maier, Eduard T1 - Molekulare Analyse des IKK-Komplexes als Zielstruktur für potentielle Therapieoptionen im Multiplen Myelom T1 - Molecular analysis of the IKK-complex as a target for potential therapies in multiple myeloma N2 - ZUSAMMENFASSUNG Obwohl diverse Mutationen des NF-κB Systems in Myelomzelllinien und primären Myelomzellen eine pathogenetische Beteiligung andeuten, ist die Relevanz des IKK Komplexes als molekularer Angriffspunkt für die Entwicklung medikamentöser Therapieoptionen noch nicht ausreichend geklärt. Zwar führte die Applikation des IKK-β Inhibitors MLN120b dosisabhängig und längerfristig zu einer Reduktion der Zellviabilität in einer Vielzahl von Myelomzelllinien, doch kann nicht ausgeschlossen werden, dass bei höheren Konzentrationen unspezifische Wirkungen für die beobachteten Effekte (mit-) verantwortlich sind. Aus diesem Grund erfolgte in der vorliegenden Arbeit eine spezifische Suppression von IKK-α, IKK-β oder IKK-γ mittels transienter Transfektion von shRNA Expressionsvektoren oder Stealth-siRNA. Es folgte die Charakterisierung der verminderten Zielproteinspiegel mittels Western-Blot und die Messung der Viabilität der Zellen mittels FACS Analysen. Darüber hinaus wurde in TNF-α Stimulationsexperimenten der Effekt der Suppression von IKK-β mittels Stealth-siRNA auf (Phospho-)IκB-α analysiert. Schließlich erfolgte die Applikation des IKK-β Inhibitors TPCA, dessen Wirkung auf die Zellviabilität und auf die TNF-α-vermittelte Phosphorylierung und Degradation von IκB-α in MM.1S Zellen untersucht wurde. Die Experimente mit Stealth-siRNA zeigten, dass weder die Suppression von IKK-β, noch die Suppression von IKK-α oder IKK-γ in AMO-1, L363 oder MM.1S eine Verminderung der Zellviabilität bewirken konnte. Auch eine kombinierte Suppression von IKK-α zusammen mit IKK-β in L363 und MM.1S Zellen bewirkte keinen vermehrten Zelltod. Dagegen zeigte die Behandlung von MM.1S Zellen mit hohen Konzentrationen von TPCA einen geringen Effekt auf das Überleben dieser Zellen. Die Suppression von IKK-β mittels Stealth-siRNA in MM.1S konnte nicht die TNF-α vermittelte IκB-α Phosphorylierung und Degradation verhindern. Sowohl die hohe TNF-α Konzentration von 100ng/ml, als auch eine unvollständige Suppression von IKK-β könnte dazu beigetragen haben. In analogen Experimenten mit TPCA konnte die TNF-α vermittelte IκB-α Phosphorylierung und Degradation dagegen effektiv unterdrückt werden. In der Zusammenschau der Ergebnisse konnte somit eine potenzielle therapeutische Relevanz des IKK-Komplexes als molekularer Angriffspunkt für eine Myelomtherapie nicht gefunden werden. Eine noch detailliertere Analyse der Funktionalität des Signalwegs (insbesondere eine Messung der Aktivität der NF-κB Transkriptionsfaktoren im Zellkern) und die Etablierung stabiler und induzierbarer Expressionssysteme für längerfristige Untersuchungen der RNAi Wirkungen in Myelomzellen, stellen weiterführende Wege zu einer umfangreicheren Beurteilung der pathobiologischen und therapeutischen Bedeutung des NF-κB Systems dar. Darüber hinaus sind die das NF-κB System betreffenden Mutationen genauer hinsichtlich ihrer potenziellen Wirkung auf NF-κB unabhängige Signalwege zu untersuchen. N2 - ABSTRACT Although the known mutations in NF-kB in imply to view the IKK complex to be involved in promoting survival of Multiple Myeloma cells, and IKK-beta inhibitors have been reported to show anti-Myeloma activity, the actual significance of IKK as a molecular target for treatment of the desease remains unclear. This is due to the fact that the influence on survival by pharmacological inhibitors on many Multiple Myeloma cells has been shown to be dependend on high concentration applications and on long-term incubation times, both inheriting the possibility of unspecific drug effects. Therefor we chose an alternative approach and performed a RNAi mediated knockdown of each of the three components of the IKK Complex (IKK-alpha, IKK-beta and IKK-gamma) and measured the survival rate of the Multiple Myeloma celllines AMO-1, L363 and MM.1s. None of the knockdowns led to a decrease of Multiple Myeloma survival rate, and even a combined knockdown of IKK-alpha and IKK-beta in L363 and MM.1S showed significant effects on the survival. Summarized, IKK is not crucially involved in promoting survival of the mentioned Multiple Myeloma celllines and thus the relevance of the complex as a therapeutic target for the treatment of Multiple Myeloma is not thoroughly clarified yet. Further investiations in different celllines and RNAi mediated knockdowns in longer time intervalls might resolve the true significance of IKK for Myeloma survival. KW - Multiples Myelom KW - NF-Kappa B KW - RNAi KW - Multiples Myelom KW - NF-Kappa B KW - IKK KW - RNAi KW - Therapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-127198 ER - TY - THES A1 - Eberlein, Uta T1 - Zusammenhang zwischen physikalischer Dosimetrie und DNA Doppelstrangbrüchen in Lymphozyten nach Radionuklidtherapie T1 - Relationship between internal dosimetry and DNA double strand breaks in lymphocytes after radionuclide therapy N2 - In der nuklearmedizinischen Therapie werden Radiopharmaka meist systemisch verabreicht. Primär werden dafür, wegen der kurzen Reichweite, beta-Strahler eingesetzt. Als Folge davon verteilt sich das Radiopharmakon im Körper, reichert sich in Organen und Zielstrukturen an und bestrahlt somit den Körper intern, im Gegensatz zur externen Bestrahlung bei der Strahlentherapie. Das Verteilungsmuster der verabreichten Aktivität im Körper wird durch die chemischen und physikalischen Eigenschaften des Radiopharmakons bestimmt. Außerdem sind die Aktivität und die Art der Anreicherung ausschlaggebend für die durch ionisierende Strahlung deponierte Energie im Körper, der Energiedosis. Gemeinsam haben externe und interne Bestrahlungsverfahren, dass der Patient ionisierender Strahlung ausgesetzt ist, die nicht nur die kranken Zellen zerstört, sondern auch gesunde Zellen schädigen kann. Dies geschieht durch direkte oder indirekte Wechselwirkung der Strahlung mit der DNA, die zur Schädigung der DNA-Struktur führt. Am häufigsten sind dabei Einzelstrangbrüche und Basenschäden. Die Doppelstrangbrüche sind im Vergleich zu Einzelstrangbrüchen und Basenschäden sehr selten aber sehr viel schädlicher für die Zelle, da die Reparatur komplizierter ist. Somit sind diese primär für den Zelltod oder für die Folgen nach fehlerhafter Reparatur verantwortlich. Eine sehr schnelle Antwort auf strahleninduzierte oder durch andere Stoffe, wie z.B. zytotoxische Substanzen, induzierte Doppelstrangbrüche ist die Phosphorylierung der Histon H2 Variante H2AX, die gamma-H2AX genannt wird. Zusätzlich reichert sich das Protein 53BP1 nach dem Erkennen eines Doppelstrangbruches durch Sensorproteine sofort am Chromatin, das den Doppelstrang umgibt, an. Damit ist 53BP1 ein weiterer Biomarker, der strahleninduzierte Doppelstrangbrüche sehr effektiv nachweisen kann und der auf sehr verlässliche Weise mit gamma-H2AX kolokalisiert. Mittels Immunfluoreszenzfärbung lassen sich gamma-H2AX und 53BP1 als umschriebene „Foci“, im Zellkern mikroskopisch darstellen und zählen. Unter der Annahme, dass ein Focus einem Doppelstrangbruch entspricht, kann die Anzahl der Foci im Zellkern als quantitativer Biomarker für DNA Doppelstrangbrüche und damit für die Strahlenexposition und Strahlenwirkung verwendet werden. Zudem zeigen Studien der Induktion von gamma-H2AX nach externer Bestrahlung von unterschiedlichen Gewebearten Linearität zwischen der Energiedosis und der Zahl der Foci im Zellkern. Weitere Studien beschäftigen sich mit den Auswirkungen externer Bestrahlung auf Patienten, aber nur wenige mit offenen radioaktiven Substanzen. Ziele dieser Arbeit waren daher: 1. Die Generierung einer bisher noch nicht beschriebenen in-vitro Kalibrierkurve nach interner Bestrahlung von Vollblut mit den in der Therapie eingesetzten beta-Strahlern. 2. Die gleichzeitige Bestimmung der physikalischen Dosis sowie der strahleninduzierten Anzahl der Foci in Lymphozyten, gewonnen aus Blutproben von Patienten nach Radiopeptidtherapie mit Lu-177 und Radioiodtherapie mit I-131. 3. Eine umfassende Beschreibung der Induktion und der Abnahme der Foci in den Lymphozyten aus den Blutproben der Patienten unter Einbeziehung der in-vitro Kalibrierung, um den dosis- und zeitabhängigen Verlauf der Anzahl der strahleninduzierten Foci zu bestimmen. Für die in-vitro Kalibrierung mit I-131 und Lu-177 wurden bei Probanden Blutproben gewonnen und mit unterschiedlichen Aktivitätskonzentrationen ergänzt. Das Ziel war, eine Energiedosis bis 100mGy zu erhalten. Das Ergebnis war, dass sich die Zahl der strahleninduzierten Foci in Abhängigkeit von der Energiedosis gut durch eine lineare Funktion beschreiben lässt, so wie es auch für die externe Bestrahlung bereits gezeigt wurde. Die Patientenstudien befassten sich mit dem Zusammenhang zwischen der im Blut deponierten Energiedosis und der Anzahl und dem zeitlichen Verlauf der induzierten Doppelstrangbrüche im peripheren Blut von Patienten unter Peptidrezeptor-Radionuklidtherapie mit Lu-177 DOTATATE/-TOC und Patienten unter Radioiodtherapie mit I-131 bei Ablationstherapien nach Operation eines differenzierten Schilddrüsenkarzinoms. Die durchschnittliche Anzahl induzierter DSB-Foci zeigte in den frühen Zeitpunkten einen linearen dosisabhängigen Anstieg. In den ersten Stunden nach Therapie stimmten die in-vitro Kalibrierung und die Zahl der strahleninduzierten Foci sowohl für Lu-177 als auch für I-131 für die Patientendaten gut überein. Die späteren Zeitpunkte werden durch eine Abnahme der Dosisrate und der Foci-Anzahl, bedingt durch Reparatur der DNA-Schäden, charakterisiert. Überstiegen die Blutdosiswerte in der ersten Stunde jedoch 20mGy (nur nach I-131-Gabe beobachtet), dann war die Induktion eines schnellen Reparaturprozesses festzustellen. Diese experimentellen Ergebnissen und Modellierungen beschreiben erstmalig die Dosisabhängigkeit und den zeitlichen Verlauf der in-vitro und in-vivo DNA-Schadensantwort nach Inkorporation von beta-emittierenden Radionukliden. N2 - In radionuclide therapy radiopharmaceuticals are administered mostly systemically. Primarily, beta-emitters are used because of their short range in tissue. As a result the radiopharmaceutical distributes within the human body and accumulates in organs and target structures. Thus, the body is irradiated internally, in contrast to external irradiation in radiotherapy. The pattern of the activity distribution within the human body is determined by the physical and chemical properties of the radiopharmaceutical. Furthermore, the amount of activity and its accumulation in organs or tissues is essential for the calculation of the absorbed dose which defines the energy deposited in the body by ionizing radiation. During internal or external irradiation, patients are exposed to ionizing radiation which does not only destroy the malignant cells but also damages healthy tissue and cells. This is mainly caused by direct and indirect interaction of the radiation with the DNA which damages the DNA structure. Most frequently, there are single strand breaks and base damages. DNA double strand breaks (DSBs) are rare; nevertheless, they are the most critical lesions for cells as repairing the damage is difficult. Unrepaired or misrepaired DNA could cause mutations, chromosomal aberrations or lead to cell death. The formation of a DNA DSB in nuclear chromatin results in the rapid phosphorylation of the histone H2 variant H2AX, then called gamma-H2AX. Furthermore, DSBs also recruit the damage sensor 53BP1 to the chromatin surrounding the DSBs, which leads to 53BP1 and gamma-H2AX co-localization in the chromatin surrounding a DSB. By immunofluorescence staining with gamma-H2AX and 53BP1 antibodies those biomarkers can be addressed by microscopically visible DNA damage protein foci, this is also known as the DNA damage focus assay. With progression of DSB repair, gamma-H2AX and 53BP1 foci disappear. It is assumed that one focus corresponds to one DSB. Therefore, the number of foci per cell can be used as a quantitative biomarker for DNA double strand breaks and hence for radiation exposure and radiation effects. Most studies dealing with the DNA damage focus assay performed in the last years were looking only on the effect of external irradiation after external radiation therapy or after diagnostic radiology procedures, but only few with the effects after administration of radiopharmaceuticals. Therefore, the aims of this thesis were: 1. To develop a method to generate an in-vitro calibration curve for the DSB focus assay after internal irradiation with beta-emitting radionuclides by creating a low dose and low dose-rate blood irradiation situation in-vitro, at dose-rates that are similar to the ones that have been observed in nuclear medicine patients. 2. To determine the absorbed dose and the number of radiation-induced foci in lymphocytes by sampling blood from patients after radiopeptide therapy with Lu-177 and radioiodine therapy with I-131. 3. To describe comprehensively the temporal and dose-dependent behavior of the DNA damage focus assay in radiation treatment-naive patients after their first radionuclide therapy using the results of the in-vitro calibration. For the in-vitro calibration with I-131 and Lu-177 blood samples For the in-vitro calibration with I-131 and Lu-177 blood samples were drawn from volunteers. Different activity concentrations were added to the samples for achieving absorbed doses up to 100mGy. As a result it was shown that the number of radiation-induced foci were linearly dependent of the absorbed dose. This is the same result that has been shown after external irradiation. The patient studies addressed the relationship between the absorbed dose to the blood and the number and temporal behavior of radiation-induced DNA double strand breaks in peripheral blood samples under radiopeptide therapy and under radioiodine therapy. The average number of radiation-induced foci showed a linear dose-response relationship within the first hours after administration of the radiopharmaceutical. The slope of the in-vitro calibration curve was in good agreement with the slopes of the linear functions fitted to the in-vivo data for Lu-177 and I-131. Later time points were characterized by a diminishing number of radiation-induced foci which was in accordance with the progression of DNA repair and the declining dose rates. Most patients treated with I-131 exceeded 20mGy in the first hour and in these patients the onset of a fast repair component was observed. With the experimental results and model calculations presented in this work, for the first time a dose-response relationship and a description of the time course of the in-vitro and in-vivo damage response after internal irradiation of beta-emitters could be established. KW - DNS-Doppelstrangbruch KW - gamma-H2AX KW - 53BP1 KW - DNA Doppelstrangbrüche KW - Dosimetrie KW - Medizinphysik KW - Radionuklidtherapie KW - Nuklearmedizin KW - DNA double strand breaks KW - dosimetry KW - medical physics KW - radionuclide therapy KW - nuclear medicine KW - Dosimetrie KW - Radionuklid KW - Therapie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-120440 ER -