TY - THES A1 - Popp, Christian T1 - Identifizierung von Aminosäuren als Teile der Substratbindungstasche des Kationentransporters 1 der Ratte (rOCT1) und Interaktion des rOCT2 mit der schwachen Base Chinin T1 - Aminoacids critical for substrate transport of rat organic cation transporter 1 and interaction of rOCT2 with the weak base quinine N2 - Zusammenfassungen 83 5 Zusammenfassungen 5.1 Zusammenfassung Durch Expressionsklonierung wurde 1994 der erste organische Kationentransporter, rOCT1, aus der Ratte isoliert (Gründemann et al., 1994). 1999 wurde eine Aminosäure in der 11. Transmembrandomäne von rOCT1 entdeckt, welche Teil der Substratbindungstasche dieses Transporters war (Gorboulev et al., 1999). Zielsetzung der vorliegenden Arbeit war es weitere funktionell relevante Aminosäuren zu identifizieren. Ein Vergleich der „Helical Wheels“ aller 12 hypothetischen Transmembrandomänen zeigte eine Akkumulation von 5 OCT und OCTN spezifischen Aminosäuren in der vierten Transmembrandomäne auf einer Seite. Bei diesen Aminosäuren handelte es sich um K215, W218, Y222, T226 und V229. Es wurden verschiedene Punktmutationen an diesen Positionen eingeführt. Es zeigte sich mit Hilfe radioaktiv markierter Substrate von rOCT1, dass selbst Substitutionen durch strukturell verwandte Aminosäuren bei den flankieren Aminosäuren zu einem Ausfall des rOCT1 vermittelten Substrattransport führte. Weiterhin schien an Position 218 für den rOCT1- vermittelten Transport von TEA eine aromatische Aminosäure von großer funktioneller Relevanz zu sein. Wir vermuten hier eine Kationen p-Elektronen Interaktion des aromatischen Ringsystems des Tryptophans mit der positiven Ladung des TEA. Versuche mit den Mutanten des Tyrosins 222 zeigten ebenfalls Änderungen bei den Transportraten und Affinitäten verschiedener Substrate. Eine Kationen-p Interaktion konnte ausgeschlossen werden, jedoch war die Affinität der Mutante Y222F zum TPeA um einen Faktor 20 gegenüber dem Wildtyp erhöht. Weiterführende Untersuchungen mit der Zwei- Elektrodenspannungsklemme zeigten unterschiedliche Affinitäten des TPeA zum Wildtyp im Vergleich zum mutierten Protein in seiner nach außen bzw. nach innen gerichteten Konformation. War die Form der Inhibierung des TEA-induzierten Stromes durch TPeA beim Wildtyp kompetitiv, so zeigte sie bei der Mutante einen nicht-kompetitiven Charakter. Die Mutante T226A zeigte ebenfalls Änderungen in Affinität und Selektivität. Bei allen transportierenden Mutanten zeigte sich, dass der Transport von MPP nicht oder kaum verändert war, hingegen wurden sehr starke Änderungen der Transportcharakteristika von TEA gefunden, was auf verschiedene Substratbindungsstellen in rOCT1 hinweist. Diese Versuche zeigen deutlich die funktionelle Relevanz und die Beteiligung der mutierten Aminosäurepositionen an der Substratbindetasche von rOCT1. In Versuchen, in welchen Chinin als Inhibitor des rOCT2 vermittelten Transports genutzt wurde, passierte Chinin mittels Diffusion in seiner ungeladenen Form die Oozytenmembran und hemmte rOCT2 von der Innenseite. Dies könnte der Grund für die nicht-kompetitive Form der Inhibition der TEA-Aufnahme durch Chinin sein. Diese Versuche wurden dadurch bestätigt, dass die protonierte Form des Chinins eine kompetitive Form der Inhibition zeigte und den Transporter von außen hemmte. N2 - The first organic cation transporter was cloned from rat (rOCT1) in 1994 by using the expression cloning technique (Gründemann et al., 1994). In 1999 it was found that one of the aminoacids in the 11th transmembranedomain of rOCT1, is part of it’s substrate binding pocket (Gorboulev et al., 1999). It was the aim of this thesis to identify more aminoacids of functional relevance for this transport protein. A comparison of all 12 helical wheels of the transporter showed, that there is an accumulation of 5 OCT and OCTN specific aminoacids at one side of the a-helix. These aminoacids were K215, W218, Y222, T226 and V229. Different single point mutations have been generated at these positions. Using radiolabeled substrates for rOCT1, the experiments showed, that even a substitution by a structural related aminoacid at the flanking aminoacids resulted in a failure of substrate transport. For TEA transport it has been suggested that the aminoacid at position 218 should have aromatic properties. We therefor suggest a cation-p interaction between the aromatic ringsystem of W218 and the positive charge of TEA. Experiments with mutations in position Y222 also showed differences in transport rates and affinities referring to the wildtype using different substrates. A cation-p interaction could be excluded, but it was shown, that there was a 20fold increased affinity of TPeA for the mutant Y222F. Further experiments utilizing the two electrode voltage clamp technique showed different affinities for wildtype rOCT1 in comparison to the mutated protein in its outward and inward conformation. The wildtype showed a competitive type of inhibition for TPeA inhibited TEA current, the mutant showed a non-competitive type of inhibition. The mutant T226A also showed changes in affinity and selectivity. In all transporting mutants we found no or lowest changes in the transport characteristics of MPP, but very big changes in the transport characteristics of TEA, an indication for different binding sites for these substrates. The experiment clearly showed, that these five aminoacids are of functional relevance for rOCT1 transport. In experiments using quinine as inhibitor of rOCT2 mediated transport quinine in it’s uncharged form passed the oocyte membrane by diffusion and inhibited rOCT2 from the inside. This might be the reason for the non-competitive type of inhibition, using quinine as the inhibitor for TEA uptake. This hypothesis was confirmed when we showed that the type of inhibition changed into the competitive type, when we used the protonated form of quinine. KW - Ratte KW - Kation KW - Carrier-Proteine KW - Chinin KW - Substratspezifität KW - rOCT KW - organischer KW - Kationentransporter KW - Chinin KW - Mutationsanalyse KW - rOCT KW - organic KW - Cationentransporter KW - Quinine KW - Mutationanalysis Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12349 ER - TY - THES A1 - Sturm, Alexander T1 - Identifikation zweier für Regulation, Substratspezifität und Transportgeschwindigkeit bedeutsamer Cysteine des organischen Kationentransporters rOCT1 T1 - Identification of two cysteines in rat organic cation transporter 1 critical for regulation, substrate specifity and turnover. N2 - Zur SLC22-Genfamilie von Karnitin- und organischen Ionentransportern gehören u. a. auch die organischen Kationentransporter der Ratte rOCT1 und rOCT2 sowie deren humane Analoga. Diese funtionell bereits gut charakterisierten Proteine werden in verschiedenen Geweben exprimiert und transportieren endogene und pharmakologisch relevante Substanzen. Die Aufklärung des Transportmechanismus und der Regulation sind Gegenstand intensiver Forschungsbemühungen. In dieser Arbeit wurde durch elekrophysiologische Methoden, die modifiziert auch zur Messung von Membrankapazitäten und des Strom-Teilchen-Aufnahmeverhältnisses (CFR) eingesetzt wurden, der Effekt des ungeladenen, membranpermeablen SH-Gruppenregenz MMTS auf den in Xenopus laevis-Oozyten exprimierten rOCT1 untersucht. Durch MMTS kam es zu einer Aktivierung von substratinduzierten Strömen und Kapazitätsänderungen, einer unterschiedlichen Veränderung von Substrat- und Inhibitoraffinitäten sowie einer Zunahme der absoluten Oozytenmembrankapazität. Die CFR und die Spannungsabhängigkeit änderten sich nicht. An rOCT2 konnten teils gleich-, teils gegensinnige Veränderungen nach MMTS-Exposition gezeigt werden. Diese Phänomene können am ehesten durch eine Konformationsänderung der polyvalenten Substratbindungsregion, einen verstärken Membraneinbau der Transportermoleküle und eine gesteigerte Transportrate des Einzeltransporters erklärt werden. Durch die Untersuchung von Mutanten konnten die Cysteine 322 und 451 als essentiell für den MMTS-Effekt identifiziert werden. Die Daten deuten darauf hin, dass die Modifikation dieser Cysteine für die Effekte zwingend erforderlich ist. Möglicherweise ist aber ein Xenopus-eigenes Regulatorprotein an der Entstehung der Effekte beteiligt, welches in die entsprechenden Proteinregionen des rOCT1 eingreift. Mit der Identifikation von Cystein 451 konnte ein weiterer Beweis für die wichtige Bedeutung der 10. Transmembrandomäne erbracht werden. Mit dem Cystein 322 wurde eine weitere wichtige Aminosäure für die Funktion und möglicherweise auch die Regulation von rOCT1 identifiziert. N2 - rOCT1 and rOCT2 are functionally well characterised members of the SLC22-transporter family. It includes carnitine and organic cation and anion transporters. OCTs are expressed in a variety of tissues and transport a number of drugs and endogenous substrates. Their transport mechanism and regulation are currently intensively being investigated. MMTS is an uncharged and membrane-permeable SH-reactive substance. Using electrophysiological methods the effect of MMTS on rOCT1 expressed in X. laevis-oocytes was investigated. These methods were modified to measure membrane capacitance and current-flux-ratios. MMTS-exposure induced an activation of substrate-induced currents and capacitance changes, a differing alteration of substrate and inhibitor affinities and an increase in the absolute oocyte membrane capacitance. The transport stoechiometry and voltage dependence were not influenced by MMTS exposure. Properties of rOCT2 were partially altered in the same and partially in the opposite way. The effects can most likely be explained by a conformational change of the polyvalent substrate binding region, an increased membrane insertion of OCT molecules and an increased substrate turnover number of the single transporter. Investigating mutants the cysteines 322 and 451 could be identified to be essential for the MMTS-effect. The data suggest that the modification of both cysteines is absolutely necessary to create the seen effects. However the participation of a Xenopus regulatory protein for the induction of the MMTS-effect interfering with the mentioned OCT regions must be taken into account. The identification of cysteine 451 proves once more the importance of the 10th TMD within the OCT family. Cyteins 322 might be another important amino acid for functional properties and the regulation of organic cation transporters. KW - Kationentransporter KW - SH-Gruppen KW - Mutation KW - Substrataffinität KW - Kationentransporter KW - SH-Gruppen KW - Mutation KW - Substrataffinität KW - cation transporter KW - SH group KW - mutagenesis KW - substrate affinity Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25717 ER -