TY - THES A1 - Völler, Thomas T1 - Visualisierung und Manipulation neuronaler Aktivitäten im Gehirn von Drosophila melanogaster T1 - Visualization and manipulation of neuronal activity in the brain of Drosophila melanogaster N2 - In dieser Arbeit wurden zwei Techniken zur Analyse der Funktion diverser Neuronen in Drosophila melanogaster angewendet. Im ersten Teil wurde mittels in-vivo Calcium Imaging Technik unter Verwendung des Calciumsensors Cameleon neuronale Aktivität entlang des olfaktorischen Signalweges registriert. Hierbei wurde die neuronale Repräsentation der Duftidentität und der Duftintensität untersucht. In Bezug auf diese Fragestellung wurde die Datenverarbeitung und Datenanalyse weiterentwickelt und standardisiert. Die Experimente führten zu dem Ergebnis, dass duftspezifische Aktivitätsmuster auf der Ebene des Antennallobus sehr gut unterscheidbar sind. Manche Aktivitätsmuster der präsentierten Düfte zeigten interessanterweise einen hohen Ähnlichkeitsgrad, wohingegen andere unähnlich waren. In höheren Gehirnzentren wie den Orten der terminalen Aborisationen der Projektionsneurone oder den Pilzkörper Kenyonzellen liegt eine starke Variabilität der duftevozierten Aktivitätsmuster vor, was generelle Interpretationen unmöglich macht und höchstens Vergleiche innerhalb eines Individuums zulässt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Calciumsignale in den Rezeptorneuronen sowie prä- und postsynaptisch in den Projektionsneuronen bei Erhöhung der Konzentration der verschiedenen präsentierten Düfte über einen Bereich von mindestens drei Größenordnungen ansteigen. In den Kenyonzellen des Pilzkörper-Calyx und der Pilzkörper-Loben ist diese Konzentrationsabhängigkeit weniger deutlich ausgeprägt und im Falle der Loben nur für bestimmte Düfte detektierbar. Eine Bestätigung des postulierten „sparsed code“ der Duftpräsentation in den Pilzkörpern konnte in dieser Arbeit nicht erbracht werden, was möglicherweise daran liegt, dass eine Einzelzellauflösung mit der verwendeten Technik nicht erreicht werden kann. Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte durch die Nutzung des lichtabhängigen Kationenkanals Channelrhodopsin-2 der Frage nachgegangen werden, ob bestimmte modulatorische Neurone die verstärkenden Eigenschaften eines bestrafenden oder belohnenden Stimulus vermitteln. Die lichtinduzierte Aktivierung von Channelrhodopsin-2 exprimierenden dopaminergen Neuronen als Ersatz für einen aversiven Reiz führte bei einer olfaktorischen Konditionierung bei Larven zur Bildung eines aversiven assoziativen Gedächtnisses. Im Gegensatz dazu induzierte die Aktivierung von Channelrhodopsin-2 in oktopaminergen/tyraminergen Neuronen als Ersatz für einen appetitiven Reiz ein appetitives assoziatives Gedächtnis. Diese Ergebnisse zeigen, dass dopaminerge Neurone bei Larven aversives Duftlernen, oktopaminerge/tyraminerge Neurone dagegen appetitives Duftlernen induzieren. N2 - In this work two different techniques were used to determine the functions of various neurons in the brain of Drosophila melanogaster. First, by using in vivo calcium imaging and the calcium indicator cameleon odor-evoked neuronal activity was monitored along the olfactory pathway. How are odor identity and odor intensity represented in the fruit fly brain? To investigate this question we improved and standardized the data processing and data analysis. The experiments reveal that calcium activity patterns elicited by different odors are distinguishable in the antennal lobe. Interestingly, the patterns evoked by some odors show a high degree of similarity whereas those of other odors show less similarity in this analyzed neuropile. In higher brain centers like the region of the terminal aborizations of the projection neurons and the mushroom body Kenyon cells the odor evoked activity patterns are highly variable allowing no general interpretations but only comparison of patterns within fruit flies. Furthermore this work demonstrates an odor concentration dependent activity in the olfactory receptor neurons as well as pre- and postsynaptically in the projection neurons. In the Kenyon cells of the mushroom body calyx this concentration dependency is less clear and in the mushroom body lobes it seems that there is a concentration dependency only for specific odors. So far we have no evidence for the postulated so called “sparsed code” of odor representation in the mushroom body which might be due to limited resolution of the technique used in this work. In the second part of my work we used the light-dependent cation channel channelrhodopsin-2 and asked the question whether specific modulatory neurons mediate the reinforcing properties of a rewarding or punishing stimulus. Light-induced activation of dopaminergic neurons expressing channelrhodopsin-2 caused aversive associative memory formation in an aversiv olfactory conditioning paradigm for Drosophila larvae. Conversely, the artificial activation of octopaminergic/tyraminergic neurons by channelrhodopsin-2 induced appetitive associative memory. The conclusion is that dopaminergic neurons trigger aversive odor learning whereas octopaminergic/tyraminergic neurons trigger appetitive odor learning. KW - Taufliege KW - Calcium KW - Calciumkonzentration KW - Calcium-bindende Proteine KW - Klassische Konditionierung KW - Drosophila KW - in-vivo Calcium-Imaging KW - Cameleon KW - Channelrhodopsin KW - Light-activation Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35589 ER - TY - THES A1 - Gueta, Ronnie T1 - Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Channelrhodopsinen T1 - Structural and functional analysis of channelrhodopsins N2 - Die zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine gehörenden lichtaktivierbaren Ionenkanäle Channelrhodopsin 1 (ChR1) und Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii sind Bestandteile des visuellen Systems und an der Phototaxis beteiligt. Sie bestehen aus einem zytosolisch gelegenen C Terminus, dessen Funktion noch ungeklärt ist und einem, für die Kanalaktivität verantwortlichen, N terminalen Bereich aus sieben Transmembranhelices. Der lichtsensitive Kofaktor all trans Retinal ist kovalent an einen Lysinrest (K257) der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei einer Belichtung mit Blaulicht isomerisiert das Chromophor zur 13 cis Form, was eine Konformationsänderung und das Öffnen des Kanals zur Folge hat. Im Zuge dessen strömen ein und zweiwertige Kationen in die Zelle und eine Depolarisation findet statt. Um einen tieferen Einblick in Struktur und funktionelle Mechanismen zu bekommen, wurden Wildtyp und Mutanten von Ch1 und ChR2 heterolog in Oozyten von X. laevis exprimiert. In Bakteriorhodopsin bilden die Seitenketten von T90 und D115 eine für Stabilität und Funktion wichtige Wasserstoffbrücke aus. Durch elektrophysiologische, fluoreszenzmikroskopische und biochemische Verfahren wurden Mutanten der entsprechenden Reste in ChR2 (C128, D156) untersucht. Diese zeigten eine deutlich verlangsamte Kinetik und eine 10 bis 100fache Erhöhung der Lichtempfindlichkeit. Die identischen Auswirkungen von Mutationen beider Reste deuten auf eine Bindung mit funktioneller Bedeutung zwischen C128 und D156 hin. Im Falle von ChR2 C128T, C128A und D156A konnte der Kanal nach Anregung mit Blaulicht, durch grünes und violettes Licht vorzeitig geschlossen werden. Diese Lichtqualitäten entsprechen den Absorptionswellenlängen zweier Intermediate des Photozyklus von ChR2 (P390 und P520). Durch Veränderung des externen pH-Wertes konnten Hinweise auf eine protonenabhängige Gleichgewichtsreaktion dieser Intermediate gefunden werden. Auch in dem für Protonen höher leitfähigen ChR1 konnten Hinweise auf eine Interaktion zwischen den Resten C167 und D195 gefunden werden. Elektrische Messungen von Mutanten zeigten eine deutliche Erhöhung des Photostroms bei verhältnismäßig geringem Anstieg der Schließzeit. Der Einfluss dieser Mutationen auf die Kinetik war somit weniger ausgeprägt als bei ChR2. Einen besonderen Stellenwert unter allen Channelrhodopsin Mutanten nehmen ChR2 D156C und ChR1 D195C ein. Mit einem Photostrom von 5 µA bei ChR1 D195C und bis zu 50 µA bei ChR2 D156C konnten für diese die höchsten Photoströme aller bisher charakterisierten ChR1 bzw. ChR2 Varianten nachgewiesen werden. Durch fluoreszenzmikroskopische Quantifizierung konnte für alle im Rahmen dieser Arbeit erstellten ChR1 und ChR2 Mutanten eine erhöhte Proteinmenge sowohl in Anwesenheit als auch Abwesenheit zusätzlichen all trans Retinals während der Inkubation nachgewiesen werden. Die Fluoreszenzintensitäten korrelierten hierbei mit der Höhe der Stromamplituden und erreichten ein Maximum bei ChR2 D156C. Biochemische Experimente mit der Gesamtmembranfraktion von ChR2 exprimierenden Oozyten lieferten Hinweise auf eine dimere Quartärstruktur von Channelrhodopsinen, was durch die Kristallstruktur einer Chimäre aus ChR1 und ChR2 von (Kato et al., 2012) bestätigt wurde. Unter der Annahme, dass die Poren in den Proteomeren gebildet werden, konnte eine gegenseitige Beeinflussung der Regionen in heterodimeren Kanälen aus ChR2 Wildtyp und Mutanten aufgrund kinetischer Unterschiede bei kurzer und langer Belichtung oder der Verwendung von unterschiedlichen Lichtintensitäten nachgewiesen werden. Eine Voraussetzung für diesen Effekt ist eine synchrone Anregung beider Untereinheiten. Die Interaktion von Channelrhodopsin Untereinheiten konnte in vivo mithilfe der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation nachgewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass die Wechselwirkung nicht nur auf identische Untereinheiten in Homodimeren beschränkt ist, sondern auch bei Heterodimeren aus verschiedenen ChR2 Untereinheiten und sogar zwischen ChR2 und ChR1 möglich ist. N2 - The microbial type rhodopsins Channelrhodopsin 1 (ChR1) and Channelrhodopsin 2 (ChR2) are located in the eyespot of the green algae Chlamydomonas rheinhardtii. They are light activated cation channels and play an important role in phototaxis. They are comprised of a cytosolic C terminal part of unknown function and a transmembranal N terminal part responsible for channel activity. The latter consists of seven transmembrane helices and the chromophore all trans Retinal, which is bound covalently as a Schiff base to a lysine residue. When activated with blue light, the chromophore isomerizes to the 13 cis state, followed by a conformational change of the protein and opening of the channel. The resulting influx of mono and divalent cations leads to a depolarization of the cell. To get a deeper insight in structure and function of ChR1 and ChR2, wildtype and mutants have been heterologously expressed in oocytes of Xenopus laevis. In bacteriorhodopsin, a hydrogen bond between the amino acids T90 and D115 is vital for protein stability and proper pump function. Mutants of the corresponding amino acids in ChR2 (C128, D156) were generated and analyzed electrophysiologically. They displayed a significant deceleration of closing time and a 10 100fold increase in light sensitivity. The identical impact of these mutations on kinetics suggests an interaction between these residues, probably also by the formation of a hydrogen bond. In the case of ChR2 C128T, C128A and D156A closing could be accelerated via green and violet light application. These wavelengths correspond to the absorption wavelengths of the photointermediates P390 and P520 in the photocycle of ChR2. Furthermore, a possible proton-dependent equilibrium between these intermediates was identified by varying external proton concentrations. Electrophysiological analyses of C167 and D195 mutants in ChR1 hinted towards an interaction similar to the one between the homologous residues C128 and D156 in ChR2. Both, ChR1 C167 and ChR1 D195 displayed increased current amplitudes, accompanied by only a small increase in closing time. The impact of these mutations on channel kinetics was less pronounced than in ChR2. The mutants ChR2 D156C and ChR1 D195C are of particular importance. Photocurrent amplitudes of 5 µA for ChR1 and 50 µA for ChR2 at 100 mV render these mutants the ones with the highest current amplitudes of all channelrhodopsin variants characterized up till now. In comparison to wildtype channelrhodopsins, quantification by fluorescence microscopy revealed an increased protein amount in oocytes expressing ChR1 and ChR2 mutants, both in absence and presence of additional all trans Retinal during incubation. The fluorescence intensities correlated to the increased photocurrent amplitudes, reaching a maximum in the ChR2 D156C mutant. Immunoblot experiments with total membrane fractions of oocytes expressing ChR2, bacteriorhodopsin and halorhodopsin hinted towards a dimeric quartenary structure of the channel. This has been confirmed by the recently published crystal structure of a chimaeric ChR1/ChR2 protein (Kato et al., 2012). Assuming the pore in a channel dimer is formed by the protomers, interference or crosstalk between the subunits has been identified. Oocytes expressing mixtures of channelrhodopsins demonstrated differences in kinetics when illumination length and light intensity was varied. A prerequisite for this effect is a simultaneous excitation of both subunits. The interaction of channelrhodopsin-subunits in vivo has been demonstrated by bimolecular fluorescence complementation assays. It was shown, that oligomerization is not restricted to identical subunits in a homodimer but also possible between different ChR2 variants in a heterodimer and even between ChR1 and ChR2. KW - Ionenkanal KW - Chlamydomonas reinhardii KW - Glatter Krallenfrosch KW - Rhodopsin KW - Channelrhodopsin KW - Kationenkanal KW - Channelrhodopsin KW - Cation channel Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85693 ER -