TY  - THES
A1  - Auth, Tanja
T1  - Funktionelle Analyse der Interaktion und Lokalisation von Replikationsfaktoren und replikationsrelevanten Proteinen in Mauszellen
T1  - Functional analysis of the interaction and localization of replicationfactors and replicationrelevant proteins in murine cells
N2  - Zeil dieser Arbeit war die Identifikation von Proteinen, die mit Bestandteilen des für die DNA-Replikation essentiellen präreplikativen Komplexes in der Maus wechselwirken. Hierbei konnten Interkationen des Heterochromatin Proteins 1a mit den Replikationsfaktoren ORC1, ORC2 und CDC6 sowohl in Two Hybrid-Studien als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden. Darüberhinaus konnten signifikante Kolokalisationen dieser Proteine mit HP1a an heterochromatischen Regionen in murinen NIH3T3-Zellen nachgewiesen werden. Ebenfalls konnte hier erstmals eine Lokalisation von HP1a am Centrosom demonstriert werden. Ein siRNA-vermittelter Knock Down von HP1a zeigte jedoch keinen direkten Einfluß auf die Replikation. Es konnte hingegen gezeigt werden, daß ein Knock Down von HP1a in signifikatnen Defekten in der Cytokinese und einer deutlich verlangsamten Zellproliferation resultiert. So konnten häufig multinukleäre Zellen und eine Arretierung in der G1-Phase beobachtet werden. Weiterhin wurde der Einfluß der Phosphorylierung von HP1a durch die Casein Kinase II mithilfe von Phosphorylierungsmutanten untersucht. Im Gegensatz zu Drosophila-Zellen zeigten sich in murinen Zellen jedoch keine Auswirkungen dieser Mutationen auf die Lokalisation von HP1a an Heterochromatin. Wieterhin konnten Interaktionen des Replikationsinhibitors Geminin mit den Replikationsproteinen ORC1, ORC2 und CDC7 sowohl im Two Hybrid-System als auch in Immunpräzipitationen gezeigt werden, die unterschiedliche Zellzyklusabhängigkeiten aufwiesen. In murinen NIH3T3-Zellen zeigte eine Knock Down von Geminin jedoch im Gegensatz zu anderen Zellinien keinen Einfluß auf die Replikation. In weiteren Teilen dieser Arbeit konnten Interaktionen des Retinoblastoma Proteins mit ORC2 und MCM7 sowohl in Two Hybrid- als auch in Immunpräzipitations-Experimenten gezeigt werden. Darüberhinaus wies Pescadillo Interaktionen mit den Replikationsproteinen ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 und CDC45 im Two Hybrid-System und Interaktionen mit MCM2 und MCM3 in Biolumineszenz-Resonanzenergietransfer-Experimenten auf. Eine Kolokalisation von Pescadillo und ORC6 in den Nukleoli läßt auf eine Funktion beider Proteinen bei der Ribosomen Biogenese schließen. Es konnten ebenfalls Interaktionen der Untereinheit E1 des humanen Papillomavirus Subtyp 11 mit den Replikationsfaktoren ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb und Pescadillo im Two Hybrid-System beobachtet werden.
N2  - The identification of proteins, which interact with members of the for the initiation of DNA replication necessary prereplicative complex in murine cells was of greatest interest for this work. Thereby, interactions of the heterochromatin protein 1a with the replication proteins ORC1, ORC2 and CDC6 were demonstrated in the two-hybrid system as well as in immunoprecipitations. Furthermore, significant colocalisation of these proteins with HP1a could be observed at heterochromatic regions in murine NIH3T3 cells. In NIH3T3 cells HP1a is also localisized on the centrosome. Knock down of HP1a by siRNAs showed however no direct influence on DNA- replication. Though, a knock down of HP1a resulted in significant defects in cytokinesis and reduced cell proliferation. Thus, frequntly cells with several nuclei and an arrest of the cells in G1 phase could be observed. Furthermore, the influence od phosphorylation of HP1a by Casein kinase II was analysed with phosphorylationssite In contrast to Drosophila cells there were no differences of the localization of Hp1a on heterochromatin in murine NIH3T3 cells. Also interactions of the replication inhibitor Geminin with the replication factors ORC1, ORC2 und CDC7 were found in two-hybrid analyses as well as in immunoprecipitations, which showed several cell cycle dependence. However, in murine NIH3T3 cells a knock down of Geminin showed in contrast to several other cell lines no influences on DNA replication. In a furthe part of this work interactions of the Retinoblastoma protein with ORC2 and MCM7 were observed in two-hybrid experiments as well as in immunoprecipitations.Furthermore, Pescadillo showed interaction with the replication proteins ORC2, ORC6, MCM2, MCM3, MCM6 and CDC45 in the two-hybrid system as well as interactions with MCM2 and MCM3 in bioluminescence resonance energytransfer experiments. The coloalization of Pescadillo and ORC6 in nucleoli points to a function of these proteins in ribosome biogenesis. In a further part of this work there were also interactions of the protein E1 of the human Papilloma virus 11 with the replication proteins ORC2,3,4,5,6, MCM2, MCM3, MCM6, CDC6, CDC7, CDT1, HP1a, Rb and Pescadillo observed in two-hybrid screenings.
KW  - Maus
KW  - Replikation
KW  - Proteine
KW  - Replikation
KW  - Heterochromatin Protein 1
KW  - Geminin
KW  - Retinoblastoma Protein
KW  - Pescadillo
KW  - replication
KW  - heterochromatin protein 1
KW  - Geminin
KW  - retinobalstoma protein
KW  - Pescadillo
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13082
ER  - 
TY  - THES
A1  - Klein, Jörg
T1  - Verwendung von Gene-Targeting-Techniken zur Etablierung neuer Mauslinien mit Mutationen in B-Zell-Signalwegen
T1  - Usage of Gene Targeting techniques for establishing new mouse lines with mutations in B-cell signaling
N2  - Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberflächenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialinsäure bindende Igähnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazelluläre Immunoglobulin-ähnliche Domänen und kann über die äußerste V-set Domäne seine Liganden: α2,6 verknüpfte Sialinsäuren binden. CD22 hat eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente Mäuse zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdomäne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdomäne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Phänotyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adhäsions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenhängen. Der „Targeting“ Vektor für die „Gene Targeting“ Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Ursprünglich wurde ein „Targeting“ Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir für ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchimäre Mäuse erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie für neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verlängerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5’-Richtung verlängert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erhöhen, durchgeführt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot bestätigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten fünf chimäre Tiere gewonnen werden. Ein 80 %ig chimäres Männchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie für die Gene Targeting Experimente für einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c Mäusen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilität ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Domäne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor führte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der ursprünglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universität Würzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-β Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene näher zu untersuchen. Von Erwin Böttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-β Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-β Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Veränderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erhöhung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der für TGF-β beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- Mäuse hingegen nicht beeinträchtigt.
N2  - The main topic of this thesis dealt with the B cell-specific transmembrane protein CD22, a member of the Siglec (Sialic-acid binding Ig-like lectin) protein family. This transmembrane protein posseses seven extracellular domains and is capable to bind α2,6 sialic acids via its most outer V-set domain. Furthermore there are one transmembrane domain and six potential tyrosine-based phosphorylation motifs, three of which match ITIM (immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) consensus sequences. CD22 deficient mice clearly showed that the Siglec CD22 is a negativ modulator of BCR signalling. BCR engagement causes tyrosine phosphorylation of CD22, now the inhibitory tyrosine phosphatase SHP-1 is able to bind, is then getting activated and is thus inhibiting the BCR Ca2+ signal. To elucidate the function of the CD22 adhesion domain in vivo, especially concerning the connection with CD22 signalling, one main topic of this work was to generate a CD22 knock in mouse (CD22R130E), in order to functionally eliminate the CD22 adhesion domain through a point mutation. The resulting new mouse line should give the opportunity to investigate B-cell development, signal transduction and the immune status ot the CD22R130E mouse. The comparison between the phenotypes of the CD22R130E mouse and the CD22 deficient mouse should resolve the interplay of adhesion and signalling of CD22. The cloning of the targeting vector for the gene targeting experiments was done in the laboratory of Dr. Anton van der Merwe (by Christina Piperi). Basically, the idea was to keep the C57BL/6 genetic background, which was already used to generate the CD22 deficient mouse by Dr. Lars Nitschke (Nitschke et al. 1997). This vector was used by me for the ES cell transfection experiments with the C57Bl/6-III ES cell line. Finally, two ES-cell clones could be identified from gene targeting experiments with the C57BL/6 ES-cell line, which carried a correct homologous integrated target vector. With one Cre-deleted C57BL/6 subclone it was possible to generate six chimaeric animals from one injection experiment, although none of these animals could give rise to germline transmission. Since occurence of crucial problems with the germline transmission of C57BL/6-III ES-cell clones, the BALB/c and E14Tg2a ES-cell lines were used for new gene targeting experiments. With the following gene targeting experiments using the BALB/c ES-cell line no homologous recombinants were obtained. This was probably due to the non-isogenic background. All following experiments performed with the E14Tg2a ES-cell line (genetic background: 129/ola) were carried out with the elongated R130E-targeting vector (targeting vector 2). This vector was created by using a genomic 129/ola template, in order to gain a new isogenetic 2.3 kb 5’- fragment. These experiments gave rise to two ES-cell clones with a correct homologous recombination event confirmed by southern blot. It was now possible to generate five chimaeric animals out of three injection experiments with these two EScell clones. One male animal, with 80 % chimaerism, produced offspring with germline transmission. The analysis of these animals with germline transmission showed that all of them possessed a wildtype like genotype. This thesis dealt with a further member of the Siglec protein family, the murine SiglecG (an ortholog to human Siglec10). In collaboration with the laboratory of Dr. Paul Crocker a SiglecG knock out mouse was to be generated. The strategy to do the gene targeting experiments was based on the usage of the BalbI ES-cell line (from BALB/c mice), since it possesses well known stability concerning pluripotential and germline transmission potential. In the laboratory of Paul Crocker (by Sheena Kerr) a control and target vector was cloned, which should eliminate a large part of the first and second Ig-domain of SiglecG. I performed different ES-cell transfection experiments with this vector. Within the timecourse of my work it was not possible to gain any ES-cell clones with correct homologous integration events. Later on ES-cell clones, germline transmission and generation of the SiglecG deficient mouse was achieved with the original strategy by the following Phd student. Another collaboration was evolved by Dr. Burkhard Kneitz (Department of Physiological Chemistry I, Würzburg). His intention was to investigate the meaning of the TGF-β signalmediator SMAD2 in a B-cell specific manner. From Erwin Böttinger we received a mouse line with a floxed Smad2 gene, which was crossed with a CD19-Cre mouse line (Rickert et al. 1997). Thus a B-cell specific SMAD2 knock out mouse (bSmad2-/-) was generated. I had to analyse the B-cell compartments and the immune responses of the B-cell specific SMAD2 knock out mouse. Taking together all data gained with the newly generated B-cell specific SMAD2 knock out mouse showed that the signalmediator SMAD2 is a crucial downstream component of TGF-β signalling in B-cell biology. The crucial differences of bSmad2-/- animals in comparison to control animals were given in an increase of cells of Payers Patches (PP) and B1 cells of peritoneal lavages. The IgA immune response was strongly reduced in bSmad2-/- animals. The well known effect of TGF-β concerning inhibition of proliferation with activated B-cells (Kehrl et al. 1986; 1989; 1991) was not impaired with activated B-cells of bSmad2-/- animals.
KW  - B-Lymphozyt
KW  - Signaltransduktion
KW  - Antigen CD22
KW  - CD22
KW  - Maus
KW  - B-Zellen
KW  - Homologe Rekombination
KW  - Signaltransduktion
KW  - Zelladhesion
KW  - Gene Targeting
KW  - B-cell signaling
KW  - Siglecs
KW  - CD22
KW  - Adhesion
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13615
ER  - 
TY  - THES
A1  - Brand, Normen
T1  - Lokalisation, Regulation und Interaktionen muriner DNA-Replikationsproteine
T1  - Localization, regulation and interactions of murine DNA replication proteins
N2  - Die DNA-Replikation ist ein entscheidendes Ereignis im eukaryontischen Zellzyklus, das die exakte Duplizierung des Genoms gewährleistet und das geordnete Zusammenspiel einer Vielzahl von Proteinen erfordert. Um diese enorme logistische Herausforderung zu bewerkstelligen ist die DNA-Replikation in mehrere Schritte organisiert, die Initiationsprozesse, Elongation und DNA-Reparatur umfassen. Der Initiationsschritt ist gekennzeichnet durch die Chromatin-Assoziation des hexameren ORC (origin recognition complex), der kontrovers diskutierte DNA-Sequenzen als Origins erkennt und bindet sowie als Landeplattform für weitere Proteinkomponenten dient. Der MCM-Komplex aus den sechs Untereinheiten Mcm2 7 komplettiert in Abhängigkeit von Cdc6 und Cdt1 den prä-replikativen Komplex (pre-RC) und wird vermutlich nach der Initiation vom Origin entfernt, um als DNA-Helikase für die Entwindung der DNA-Doppelhelix zu sorgen. Dies ermöglicht den Proteinen der Elongations-Maschinerie DNA an mikroskopisch sichtbaren Orten, die als Replikationsfoci bezeichnet werden, korrekt zu synthetisieren. PCNA (proliferating cell nuclear antigen) ist eine Hauptkomponente der Replikationsfoci und fungiert als Ringklemme, die die DNA-Polymerasen und weitere Replikationsfaktoren an die DNA bindet. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Verteilung von ORC- MCM- und PCNA-Proteinen in murinen L-Fibroblasten durch Dual-Color-Immunfluoreszenz- (IF-) Studien untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteine des ORC, des MCM-Komplexes und der Elongations-Maschinerie Positionen für drei verschiedene mechanistische Teil-Prozesse markieren, die an der DNA-Replikation beteiligt sind und an distinkten und räumlich getrennten Orten stattfinden: Initiation, Helikase-Aktivität und Elongation. IF-Studien weisen außerdem darauf hin, dass die Acetylierung von Histonen im Zusammenhang mit der Auswahl der Origins steht. Die Assemblierung des pre-RC steht unter der Kontrolle mehrerer Protein-Kinasen. Um zu untersuchen, ob Protein-Komponenten des pre-RC auch vom Hauptregulator von mitotischen Ereignissen, der POLO-like kinase1 (Plk1), phosphoryliert werden, wurden in vitro-Kinase-Assays mit Wildtyp-Plk1 bzw. der Kinase-defizienten Mutante Plk1 (K82M) als Negativ-Kontrolle und potentiellen Targetproteinen durchgeführt. Orc2, Cdc7 und Cdc45 konnten als in vitro-Substrate für die Plk1-Kinase identifiziert werden. Diese Proteine sind außerdem in der Mitose an den Centrosomen, Cdc7 und Cdc45 an den Mikrotubuli und Orc2 und Cdc45 am Midbody lokalisiert. Diese mitotischen Lokalisations-Muster korrelieren mit denen von Plk1. Die Aufklärung von Protein-Protein-Interaktionen ist für das Verständnis der Vorgänge bei der DNA-Replikation essentiell. Mit der BRET (Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer)-Technik konnten direkte Interaktionen zwischen Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 und Plk1 & Dbf4 gezeigt werden. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Histon-Hyperacetylierung und der Depletion von Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKs) auf die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 untersucht. Orc2 und Orc3 sind sowohl endogen als auch überexprimiert im Zellkern und im Cytoplasma lokalisiert. Um herauszufinden, ob die Kernlokalisation von Orc3 Voraussetzung für die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 ist, wurde ein putatives Kernlokalisationssignal (NLS) in der aminoterminalen Region von Orc3 in einem EGFP-ORC3-Fusionsplasmid deletiert. Die Expression dieser Mutante resultierte in L-Fibroblasten und HEK293T-Zellen in ausschließlich cytoplasmatischer Lokalisation. BRET-Assays, bei denen ORC2-Rluc und die NLS-defiziente EGFP-ORC3-Mutante eingesetzt wurden, lieferten ein BRET ratio, das ununterscheidbar von dem mit Wildtyp EGFP-ORC3 erhaltenen Signal war. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 nicht auf den Zellkern beschränkt ist. Mit der erst kürzlich entwickelten BiFC- (bimolecular fluorescence complementation) Technik konnte sowohl die cytoplasmatische als auch die nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 gezeigt werden. FLIP- (fluorescence loss in photobleaching-) Studien mit BiFC-positiven Zellen, die eine ausschließlich nukleäre Lokalisation der Interaktion zwischen Orc2 und Orc3 aufwiesen, zeigten eine verringerte Mobilität des binären Komplexes Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) im Vergleich zu EGFP-Fusionsproteinen von Orc2 (t ½ = 8 s) und Orc3 (t ½ = 6 s) auf. Dies deutet darauf hin, dass die Assoziation mit dem Bindungspartner zu einer erhöhten Chromatin-Bindung von Orc2 und Orc3 führt. Zusätzlich wurden die Auswirkungen von Punktmutationen auf die subzelluläre Lokalisation und die intranukleäre Dynamik des in Replikationsfoci lokalisierten Cdc6-EGFP-Fusionsproteins untersucht und die Mobilität von promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) und der darin enthaltenen Proteinkomponenten analysiert.
N2  - Eukaryotic DNA replication is a crucial event in the cell cycle ensuring precise duplication of the genome by the coordinated action of a multitude of proteins. To cope with this enormous logistical challenge DNA replication is organized in multiple steps comprising initiation processes, elongation and DNA repair. The initiation step is characterized by the chromatin association of the hexameric ORC (origin recognition complex) which selects controversely discussed DNA sequences as replication origins and serves as a landing pad for further protein components. The MCM complex consisting of the six subunits Mcm2-7 accomplishes the pre-RC in a Cdc6- and Cdt1-dependent manner and is supposed to be released from the origin following initiation to act as DNA helicase, triggering the unwinding of the DNA double helix. This allows the proteins of the elongation machinery to accurately synthezise DNA at distinct microscopically visible sites termed replication foci. A major component of replication foci, PCNA (proliferating cell nuclear antigen) acts as a sliding clamp tethering the DNA polymerases and further replication factors to DNA. Within the scope of this thesis, the distribution of ORC, MCM and PCNA proteins was investigated in murine L fibroblasts by dual-color immunofluorescence (IF) studies. It could be shown that the proteins of the ORC, the MCM complex and the elongating machinery constitute locations for three different mechanistical events involved in DNA replication which occur at distinct and spatially separated sites, i. e. initiation, helicase activity and elongation. Additionally, IF studies suggest, that histone acetylation is involved in the selection of origins and the recruitment of the pre-RC to chromatin. The assembly of the pre-RC begins in mitosis and is regulated by the activity of multiple protein kinases. To test whether the key regulator of mitotic events, POLO-like kinase1 (Plk1), is capable of phosphorylating pre-RC components, in vitro kinase assays were carried out using full-length Plk1 and a kinase-deficient mutant Plk1 (K82M) as a negative control together with bacterially expressed target proteins. Orc2, Cdc7 and Cdc45 were found to be in vitro substrates of the Plk1 kinase. Furthermore, IF studies using specific antibodies against Orc2, Cdc7 and Cdc45 revealed conspicuous staining patterns for the Plk1 substrates in mitosis. While Orc2 was accumulated in the midbody region in telophase, Cdc7 was localized at the centrosomes and micotubules in anaphase. Cdc45 was found at the centrosomes and the microtubules from prometaphase to anaphase, and in the midbody region during telophase, strikingly matching the mitotic localization patterns of Plk1. The detection of protein-protein interactions is crucial for the understanding of the course of events in DNA replication. By using the bioluminescence resonance energy transfer (BRET) technique interactions among components of the pre-RC were analyzed in living mammalian cells. The BRET studies revealed direct interactions between Orc2 & Orc3, Orc2 & Orc4, Orc2 & Orc5, Orc4 & Orc6, Plk1 & Orc2 and Plk1 & Dbf4. Furthermore, the influence of histone hyperacetylation, as well as the depletion of cyclin-dependent kinases (CDK) on the interaction between Orc2 and Orc3 was investigated. Orc2 and Orc3 were found to be localized in the nucleus and the cytoplasm. To investigate, whether nuclear import of Orc3 is a prerequisite for the interaction of Orc2 with Orc3 to occur, a putative nuclear localization signal (NLS) in the aminoterminal region of Orc3 was truncated in an EGFP-ORC3 fusion construct. Expression of this mutant in L fibroblasts and HEK293T cells resulted in exclusive cytoplasmatic localization. BRET assays using ORC2-Rluc and the NLS-deficient EGFP-ORC3 mutant were performed. In this experiment, a BRET signal was obtained which was indistinguishable from that obtained with wild-type EGFP-ORC3. Together, these findings strongly suggest that the interaction between Orc2 and Orc3 is not restricted to the nucleus. The nuclear as well as the cytoplasmatic distribution of the localization between Orc2 and Orc3 could furthermore be confirmed with a recently developed BiFC (bimolecular fluorescence complementation) assay. FLIP (fluorescence loss in photobleaching) studies with BiFC-positive cells showing exclusive nuclear distribution revealed decreased mobility of Orc2/Orc3 (t ½ = 10 s) compared with EGFP fusion proteins of Orc2 (t ½ = 8 s) and Orc3 (t ½ = 6 s), suggesting that the association with its binding partner leads to an enhanced capability of Orc2 and Orc3 to bind to chromatin. Additionally, the influence of point mutations on the subcellular localization and intranuclear dynamics of a Cdc6-EGFP fusion protein, previously shown to be localized in replication foci, was analyzed. Further, the mobility of promyelocytic leukaemia nuclear bodies (PML NBs) and PML-associated proteins was investigated.
KW  - Maus
KW  - Replikation
KW  - Proteine
KW  - Interaktion
KW  - Regulation
KW  - DNA-Replikation
KW  - Zellzyklus-Kontrolle
KW  - präreplikativer Komplex
KW  - Biolumineszenz-Resonanzenergie-Transfer
KW  - DNA replication
KW  - cell cycle control
KW  - pre-replicative complex
KW  - bioluminescence resonance energy transfer
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14057
ER  -