TY - THES A1 - Halscheidt, Anja T1 - Das RpoS-Protein aus Vibrio cholerae : Funktionsanalyse und Charakterisierung der Proteolyse-Kaskade T1 - The RpoS protein of Vibrio cholerae : Functional analysis and characterization of the proteolysis cascade N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst die Konservierung bekannter RpoS-assoziierter Funktionen für das V. cholerae Homolog untersucht. Dabei ergab die phänotypische Analyse der rpoS-Deletionsmutante, dass analog zu der Bedeutung als Regulator des Stationärphasen-Wachstums in E. coli, definierte Zelldichte-abhängige Eigenschaften in V. cholerae gleichermaßen der Kontrolle von RpoS unterliegen. In weiterführenden Experimenten konnte daraufhin die Konservierung der entsprechenden Promotorstrukturen über die funktionelle Komplementierung rpoS-abhängiger Gene durch das jeweils speziesfremde Protein aufgedeckt werden. Dahingegen konnte die Bedeutung von RpoS bei der Ausprägung der generellen Stress-Resistenz u. a. in E. coli für das V. cholerae Homolog über den gewählten experimentellen Ansatz nicht belegt werden. So wurden in Survival-Assays für keine der getesteten Stress-Bedingungen signifikante Unterschiede zwischen rpoS-Mutante und Wildtyp ermittelt. Die in E. coli gezeigte intrazelluläre Anreicherung des Sigmafaktors unter diversen Stress-Situationen konnte ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Hinsichtlich der potentiellen Stellung von RpoS als globaler Regulator für Virulenz-assoziierte Gene, unterstützen und ergänzen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit die gegenwärtige Theorie, wonach RpoS das Ablösen der V. cholerae Zellen vom Darm-Epithel fördert. Die postulierte Bedeutung des alternativen Sigmafaktors in der letzten Phase der Pathogenese wurde über die RpoS-abhängige Sekretion der Mukin-degradierenden Protease HapA und die hier unabhängig nachgewiesene Transkriptionskontrolle von Chemotaxis-Genen bestätigt. In E. coli gilt als entscheidender Parameter für die dargelegten RpoS-Funktionen die intrazelluläre Konzentration des Masterregulators. Deshalb war ein weiteres zentrales Thema dieser Arbeit die Regulation des RpoS-Levels in V. cholerae. Neben der Identifizierung von Bedingungen, welche die RpoS-Expression beeinflussen, wurde vorrangig der Mechanismus der Proteolyse analysiert. Dabei wurden als RpoS-degradierende Komponenten in V. cholerae die Homologe des Proteolyse-Targetingfaktors RssB und des Protease-Komplexes ClpXP identifiziert. Die weitere Untersuchung der RpoS-Proteolyse ergab außerdem, dass bestimmte Stress-Signale den Abbau stark verzögern. Interessanterweise resultierten die gleichen Signale jedoch nicht in der Akkumulation von RpoS. Als weiterer Unterschied zu der bekannten Proteolysekaskade in E. coli zeigte sich, dass das V. cholerae Homolog der RssB-aktivierenden Kinase ArcB (FexB) an der RpoS-Proteolyse nicht beteiligt ist. Indessen deuten die Ergebnisse weiterführender Experimente auf den Einfluss der Kinasen CheA-1 und CheA-3 des V. cholerae Chemotaxis-Systems auf die RpoS-Degradation. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit ein zu E. coli abweichendes Modell der RpoS-Proteolyse postuliert, in welchem die aktiven CheA-Kinasen den Targetingfaktor RssB phosphorylieren und somit den Abbau einleiten. Die Beteiligung von MCP-Rezeptoren an der Kontrolle der intrazellulären RpoS-Konzentration und damit an der Transkription der Chemotaxisgene selbst, beschreibt erstmalig ein Regulationssystem, wonach innerhalb der Chemotaxis-Kaskade die Rezeptoraktivität wahrscheinlich über einen positiven „Feedback-Loop“ mit der eigenen Gen-Expression gekoppelt ist. Darüber hinaus deutete sich die Beteiligung der ATP-abhängigen Protease Lon an der RpoS-Proteolyse-Kaskade in V. cholerae an. Die Inaktivierung der in E. coli unter Hitzeschock-Bedingungen induzierten Protease resultierte in einem extrem beschleunigten RpoS-Abbau. Ein letztes Teilprojekt dieser Arbeit adressierte die Regulationsmechanismen der V. cholerae Osmostress-Adaptation. Während in E. coli der alternative Sigmafaktor dabei eine zentrale Rolle spielt, konnte die Beteiligung des V. cholerae RpoS an der Osmostress-Regulation jedoch nicht aufgedeckt werden. Dafür ergab die Funktionsanalyse eines neu definierten Osmostress-Sensors (OsmRK) die Kontrolle von ompU durch dieses Zwei-Komponentensystems unter hypertonen Bedingungen. Dieses Ergebnis überraschte, da bislang nur der Virulenzfaktor ToxR als Regulator für das Außenmembranporin beschrieben wurde. Die nachgewiesene ompU-Transkriptionskontrolle durch zwei Regulatoren führte zu der Hypothese eines unbekannten regulativen Netzwerkes, welchem mindestens 52 weitere Gene zugeordnet werden konnten. Insgesamt ist festzuhalten, dass die in dieser Arbeit durchgeführte molekulare Charakterisierung der RpoS-Proteolyse in V. cholerae Beweise für eine mögliche Verbindung zwischen der Transkriptionskontrolle für Motilitäts- und Chemotaxisgene mit der Chemotaxis-Reizwahrnehmung erbrachte. Eine derartige intermolekulare Verknüpfung wurde bislang für keinen anderen Organismus beschrieben und stellt somit eine neue Variante der Signaltransduktion innerhalb der Virulenz-assoziierten Genregulation dar. N2 - In the present work conserved function of RpoS in E. coli was approached for its homolog in V. cholerae. Comprehensive phenotypical analysis of rpoS-mutant and wildtype revealed the involvement of RpoS in growth-phase-dependent processes, according to RpoS-function as stationary phase regulator in E. coli. In further experiments the conservation of RpoS-promoters in both species could be shown. To the contrary, the well-known function of E. coli RpoS as general stress-regulator could not be demonstrate for V. cholerae: By testing several stress conditions in survival assays, no significant differences were determined between rpoS mutant and wildtype. Additionally, the intracellular mode of RpoS accumulation in E. coli due to different stress conditions was also not observed in V. cholerae. Regarding the putative role of RpoS as a regulator for virulence-associated genes, the inhere described data support and complement the current theory of RpoS being involved in mucosal detachment of V. cholerae cells. In E. coli the intracellular concentration of RpoS is a decisive parameter for its described function. So far the homologs of the proteolysis targeting factor RssB and the ATP-depending terminal protease complex ClpXP were identified to be involved in V. cholerae RpoS-proteolysis. Further characterization also unravelled, that various stress signals slow down that degradation. But such conditions did not yield in the RpoS accumulation. Based on these differences to the E. coli dynamics of RpoS-degradation additional investigations were performed to gain more insights into the regulatory path of RpoS degradation in V. cholerae. In E. coli the ArcB kinase ist the sensor kinase for regulating the activity of RssB. In this study fexB was identified as arcB homolog in V. cholerae. But by monitoring the RpoS stability in the corresponding knock-out mutant no effect could be observed. Therefore the ArcB-system is not influencing RpoS stability in V. cholerae. Knowing, that RpoS is a major regulator for motility and chemotaxis in V. cholerae, it was investigated next whether other signal-kinases are involved in RpoS proteolysis. Thereby, the known chemotaxis kinases were tested. Knockout mutants of cheAs and subsequent analysis of RpoS half-life revealed, that cheA-1 and cheA-3 did alter RpoS proteolysis to slow down the degradation, whereas cheA-2 mutant did not. Therefore, it can be postulated, that a different mode of RpoS-proteolysis is operating in V. cholerae in which active CheA-1 and CheA-3 may be responsible for RssB phosphorylation, hence leading to RpoS degradation. That kind of interaction may also include the output signalling of the MCP-receptors regulating CheA kinase activity. Since the cheA genes are also under transcriptional control by RpoS a new regulation system can be postulated, where MCP signal output links transcriptional regulation of motility and chemotaxis via RpoS stability in a “positive feedback loop”. Additionally, data are presented, where the ATP depending protease Lon is also involved in RpoS proteolysis in an inverted manner. Lon, which in E. coli is a heat shock induced protease, seems to recognize and degrade substrates in V. cholerae operating in RpoS degradation in the RssB-depending branch. That phenotype was observed as an accelerated RpoS degradation in a lon background. Finally, the complex regulatory pathway of osmo-regulation was characterized. In E. coli RpoS plays a central role. However, in V. cholerae RpoS could not be identified to participate in osmo-regulation, instead a new defined osmostress-sensor (OsmRK) was characterized. In first analysis, it was found that osmRK knockout mutants showed a deregulated ompU expression under hyperosmotic conditions. Considering, that so far only the well known virulence regulator ToxR was identified to act on the ompU promoter, a novel regulatory network was suggested, which regulates at least further 52 genes. In summary, the components of RpoS proteolysis in V. cholerae were unravelled and characterized. Additionally, evidence could be gathered, which indicates a linkage between transcriptional control of motility and chemotaxis genes and the chemotaxis-signalling pathway. So far, such an regulatory pathway has not been described before and would represent a novel branch of signal transduction in bacteria. KW - V. cholerae KW - RpoS KW - Chemotaxis KW - Virulenz KW - V. cholerae KW - RpoS KW - chemotaxis KW - virulence Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27325 ER - TY - THES A1 - Schild, Stefan T1 - Bedeutung der Lipopolysaccharidstrukturen bei pathogenen Vibrio cholerae Stämmen für die Ausbildung von Cholera und Abgrenzung zu Umweltisolaten T1 - Importance of LPS structures of virulent Vibrio cholerae strains in correlation with cholera disease and discrimination from environmental strains N2 - Obwohl inzwischen über 200 verschiedene Serogruppen von V. cholerae bekannt sind, wurden Ausbrüche der Cholera hauptsächlich von Stämmen der unbekapselten Serogruppe O1 und der bekapselten Serogruppe O139 verursacht. Die Komponenten des Lipopolysaccharids (LPS) von O1 und O139, sowie die Kapsel von O139 tragen zur Kolonisierung im Gastrointestinaltrakt bei. Um die Funktion des LPS und der Kapsel als Virulenzfaktor näher zu untersuchen, wurden Adhäsionsstudien mit definierten LPS- und/ oder Kapsel-Mutanten beider pathogener Serogruppen durchgeführt. Dazu wurde die Mukus-produzierende humane Darmzelllinie HT-29-Rev MTX verwendet. Im Vergleich zum jeweiligen Wildtyp (Wt) konnte für eine O Antigen-Mutante von O1 eine Reduktion um 85%, für eine O Antigen/ Kapsel-Mutante von O139 eine Reduktion um 70% in der Adhäsionsrate festgestellt werden. Ein Beitrag von ToxR regulierten Genprodukten ist ebenfalls möglich. Weiterhin wurden mit WavJ und WavD zwei Genprodukte der Kernoligosaccharid -Biosynthese charakterisiert, welche bislang nur in dem wa*-Genclustertyp 1 der klinischen Isolate nachgewiesen worden sind. Es konnte gezeigt werden, dass beide Genprodukte an der Biosynthese des Kern OS beteiligt sind, wobei WavJ mit hoher Wahrscheinlichkeit die Heptosyl-IV-Transferase darstellt. Die wavDJ-Doppelmutanten beider Serogruppen wiesen eine erhöhte Sensitivität gegenüber Novobiocin auf. Dagegen konnte eine Attenuation der Mutanten im Mausmodell nur für die Serogruppe O139 demonstriert werden. Ein Schlüsselenzym der LPS-Biosynthese stellt die Oberflächenpolymer:Lipid A-Kern OS-Ligase (WaaL), kurz O Antigen-Ligase genannt, dar. In dieser Arbeit wurden die in der Primärstruktur stark unterschiedlichen Ligasen aus einem pathogenen (P27459) und apathogenen (V194) V. cholerae Isolat strukturell und funktionell analysiert. Es wurde gezeigt, dass die Aktivität beider Ligasen von der Anwesenheit eines N-Acetylglucosamins (GlcNAc) im Kernoligosaccharid abhängig ist. Dieser Zucker wird durch das Genprodukt WavL transferiert, welchem in dieser Arbeit die Aktivität einer N-Acetylglucosaminyltransferase zugeordnet werden konnte. Das Gen wavL wurde in allen zur Verfügung stehenden V. cholerae Isolaten nachgewiesen und stellt wahrscheinlich eine generelle Voraussetzung des Kern OS für eine O Antigen-Anheftung dar. Im Gegensatz dazu, diskriminiert die An- bzw. Abwesenheit einer Galaktose (Gal) im Kern OS die Spezifität der Ligasen von V. cholerae P27459 bzw. V194. Dabei ist die Aktivität der Galaktosyltransferase WavM, essentiell für die Aktivität der Gal-abhängigen Ligase von V194. Die Gal-unabhängige Ligase von P27459 wird hingegen durch die Anwesenheit von Gal im Kern OS inhibiert. Hybridfusionen der beiden Ligasen deuten an, dass die Erkennungsdomäne für Gal in der C-terminalen Hälfte lokalisiert ist. Erstmals wurde die Topologie einer Ligase durch PhoA- und LacZ-Fusionen analysiert. Die Suche nach konservierten Aminosäuren (AS) in verschiedenen Ligasen führte zur Identifizierung der Motive R(X3)L und H(X10)G in zwei periplasmatischen Schleife. Ein Austausch des R oder des H in diesen Motiven führte zum Verlust der Ligase-Aktiviät von WaaL aus V. cholerae und S. enterica. Damit geben diese Motive einen ersten Hinweis auf das aktive Zentrum des Enzyms. Desweiteren wurde nach möglichen O Antigen-Transportern bei V. cholerae gesucht, welche bislang noch nicht identifiziert worden waren. Über die Anpassungen von V. cholerae an aquatische Ökosysteme, insbesondere hinsichtlich der wechselnden Osmolarität, ist nahezu nichts bekannt. Durch ein in dieser Arbeit konstruiertes und etabliertes Transposonsystem konnten 3600 Mutanten erzeugt und auf Wachstumsdefekte unter hypertonischen Bedingungen untersucht werden. Eine dieser osmosensitiven Mutanten wies eine Insertion in dem Locus VCA0565 auf, welcher für eine putative Sensor-Histidinkinase kodiert. Mit dem Regulator, kodiert durch VCA0566, stellt VCA0565 das putative Zwei-Komponentensystem OsmRK dar. Transkriptomanalysen von osmR/ K-Mutanten lieferten keine Erklärung des Wachstumsdefekts unter hypertonischen Bedingungen, zeigten aber eine Vernetzung der durch OsmR/ K regulierten Gene mit dem ToxR-Regulon auf. Analysen der Außenmembran demonstrierten, dass eine Mutation von osmR/ K zu einer Repression von OmpU unter hohen Salzkonzentrationen führt. Vergleichende Experimente mit weiteren Mutanten deuteten an, dass es in osmR/ K- und toxS-Mutanten unter erhöhten Salzkonzentrationen zur Degradation von ToxR kommt. Während die Deregulation von OmpU in osmR/ K-Mutanten nur unter Salzstress zu beobachten war, führte in der toxS-Mutante auch ein Membranstress durch Zugabe von Protamin zu einer Repression von OmpU. Die zu OsmR/ K nah verwandten putativen Zwei-Komponentensysteme EnvZ/ OmpR und VCA0257/ VCA0256 hatten unter keiner der getesteten Bedingungen einen Einfluss auf die Proteine der AM. Weiterhin wurde eine C-terminale Degradation von HutA unter hypertonischen Bedingungen aufgedeckt. N2 - Although, more than 200 serogroups of V. cholerae.were identified, however, only the strains of the non-encapsulated O1 and the encapsulated O139 serogroups were found to be responsible for cholera epidemics. The components of the LPS of O1 and O139 play a crucial role in the colonization of the gastrointestinal tract. To analyze the contribution of the LPS and the capsule in the adhesion to epithelial cells, mucus layer attachment studies using defined O antigen and/ or capsule mutants of both serogroups and the human intestinal cell line HT29-Rev MTX were performed. In case of the O antigen mutant of O1 a 85% and for the O antigen and capsule mutant of O139 a 70% reduction in the adhesion rate was determined compared to wild type. It is likely that ToxR regulated gene products also contribute to the adhesion, since a toxR-mutant of O1 showed a 3-fold reduction in the adhesion rate. In addition the two gene products of the core oligosaccharide biosynthesis, WavJ and WavD, were characterized. So far the corresponding genes could only be found in the wa*-gene cluster type 1 of clinical isolates. It could be demonstrated, that single and double knockout mutants have an effect on core oligosaccharide biosynthesis in both serogroups. Based on bioinformatical data it is likely that WavJ represents the heptosyl-IV-transferase. Double mutants in wavJ and wavD of both serogroups showed an attenuated growth in the presence of novobiocin, whereas only the mutants in O139 demonstrated reduced colonization in the in vivo mouse model. The surface polymer:lipid A-core ligase (WaaL), also called the O antigen ligase, is a key enzyme in the LPS biosynthesis of Gram- bacteria. Part of this work focused on the structural and functional characteristics associated with the recognition of the core oligosaccharide of two distantly related ligases of a virulent (P27459) and an environmental (V194) V. cholerae isolate. It was demonstrated that the activity of both ligases is dependent on the presence of N-acetylglucosamine, which is attached to the core oligosaccharide by the WavL glycosyltransferase. The gene wavL could be found in all V. cholerae isolates so far. In contrast, an additional sugar substitution, i.e. galactose, which is transfered by the WavM galactosyltransferase, discriminates the core oligosaccharide specificity of the ligases of P27459 and V194. The activity of WavM is essential for the activity of the galactose-dependent ligase of V194, whereas it hinders the galactose-independent ligase of P27459 to transfer the O antigen onto the core oligosaccharide. WaaL protein hybrids between galactose dependent and non-dependent ligases indicate that the galactose recognition site is located in the C-terminal half. Using PhoA and LacZ fusions the topology of the ligase of P27459 was determined. Amino acid sequence alignments of WaaL proteins identified the distinct conserved motifs R(X3)L and H(X10)G in two periplasmic loops. By site directed mutagenesis of the histidine and arginine residues within these motifs, an abortism of O antigen transfer reaction for WaaLs of V. cholerae and Salmonella enterica was found. Furthermore the putative O antigen-transport systems of V. cholerae were investigated. In this work a new transposon system was constructed and established, resulting in 3600 mutants, which were screened for growth defects under hypertonic conditions. One of these mutants had an insertion in locus VCA0565, which encodes a putative sensor histidine kinase. In combination with the transcriptional regulator, encoded by VCA0566, they represent the putative two-component system OsmRK. Comparing the transcriptom of osmR/ K-mutants to the wild type revealed no explanation for the osmosensitive phenotype, but showed some interaction between the regulon of OsmR/ K and ToxR. Analysis of the outer membrane demonstrated, that a mutation in osmR/ K results in a repression of OmpU under hypertonic conditions. Comparative experiments, including additional mutants indicated a degradation of ToxR in osmR/ K- and toxS-mutants in presence of high salt concentrations. In contrast to osmR/ K-mutants, in the toxS-mutant the repression of OmpU could be also observed by a different membrane stress caused by protamine. In addition, the analysis of the outer membrane proteins revealed a C-terminal degradation of HutA under hypertonic stress conditions. KW - Vibrio cholerae KW - Lipopolysaccharide KW - Virulenz KW - Osmolarität KW - Vibrio cholerae KW - Lipopolysaccharid KW - O Antigen-Ligase KW - Virulenz KW - Osmolarität KW - Vibrio cholerae KW - lipopolysaccharide KW - O antigen-ligase KW - virulence KW - osmolarity Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12989 ER - TY - THES A1 - Klug, Michael T1 - Phasenvariation bei Legionella pneumophila: Vergleichende Proteomanalyse von virulenten und avirulenten Legionella pneumophila-Stämmen unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese T1 - Phase-variation of Legionella pneumophila: proteom analysis of virulent and avirulent Legionella pneumophila stocks by using two-dimensional gel-electrophoresis N2 - Vergleichende Proteomanalyse eines avirulenten und virulenten Stammes von Legionella pneumophila Sg1 Subgruppe OLDA unter Anwendung der zweidimensionalen Gelelektrophorese. Die Stämme unterliegen einer spontanen LPS-Phasenvariation und unterscheiden sich phänotypisch in multiplen Eigenschaften. Es zeigten sich different exprimierte Proteine der Membranoberfläche, der LPS-Biosynthese und des Bakterienstoffwechsels. N2 - Proteomanalysis of an avirulent and virulent stock of Legionella pneumophila Sg1 subgroup OLDA by using two-dimensional gelelektrophoresis. The stocks show LPS-phase-variation and differ phänotypical in many ways. We show different synthesised proteins of the bakterial membran, of the LPS-Biosynthesis and common bacterial biochemical ways. KW - Legionella pneumophila KW - Phasenvariation KW - Virulenz KW - Zweidimensionale Gelelektrophorese KW - Proteomanalyse KW - Legionella pneumophila KW - phase variation KW - virulence KW - two-dimensional gelelectrophoresis KW - protoemanalysis Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7464 ER -