TY - THES A1 - Fehrholz, Markus T1 - APOBEC3G-vermittelte Hemmung der Masernvirus-Replikation T1 - APOBEC3G-mediated Inhibition of Measles Virus Replication N2 - Das Masernvirus (MV) ist ein negativ-strängiges RNA-Virus aus der Familie der Paramyxovi-ridae und zählt immer noch zu den häufigsten Todesursachen bei Kindern in Entwicklungs-ländern. Nach dem Eintritt in den Körper führt eine Infektion von CD150-exprimierenden B- und T-Lymphozyten sowie dendritischen Zellen (DCs) und Monozyten bzw. Makrophagen zu einer systemischen Infektion. Viele Mitglieder der Familie der APOBEC-Proteine („apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like proteins“), u. a. auch APOBEC3G, werden als Teil der angeborenen Immunantwort in diesen Zellen und infizierten Geweben exprimiert. In früheren Studien wurde bereits gezeigt, dass diese Proteine durch ihre RNA-bindenden Eigenschaften und ihre Fähigkeit zur Desaminierung von Cytosin zu Uracil zu einer Inhibition von verschiedenen Retroelementen und Retroviren, wie beispielsweise den „long interspersed nuclear elements 1“ und dem humanen Im-mundefizienz-Virus (HIV) führen. Das Ziel dieser Arbeit war es, mögliche antivirale Mechanismen von humanem APOBEC3G gegen das MV als Vertreter der negativ-strängigen RNA-Viren zu identifizieren. Hierzu wurden rekombinante MV-Wildtyp und -Impfstämme, sowie APOBEC3G-überexprimierende Vero-Zelllinien verwendet. Es zeigte sich, dass die Replikation des verwendeten rekombinanten Masern Wildtyp- und Impfvirus durch humanes APOBEC3G inhibiert wird. Diese Inhibition äußerte sich in einer reduzierten Synzytienbildung, einer mindestens 50 %igen Reduktion viral-exprimierter Proteine, sowie in einer 90-99 %igen Reduktion der auf APOBEC3G-exprimierenden Zellen entstandenen viralen Titer. Durch Sequenzanalysen konnte festgestellt werde, dass es zu einem Anstieg von 0,2 auf 0,95 unspezifischer Mutationen pro 1.000 Basenpaaren in MV-Transkripten kam, deren Muster mit dem in Kontrollzellen vergleichbar war, wohingegen typische C zu U(T) bzw. G zu A Hypermutationen nicht auftraten. Eine Kolokalisation von humanem APOBEC3G mit MV-spezifischen Proteinen konnte ebenfalls nicht eindeutig beobachtet werden. Es zeigte sich allerdings, dass APOBEC3G an virale RNA binden konnte. Außerdem wurde APOBEC3G in aufgereinigten viralen Partikeln um etwa den Faktor 4 angereichert. Versuche mit einem MV-Minireplikon-System ergaben, dass APOBEC3G eine Inhibition der viralen RNA-abhängigen RNA-Polymerase bewirkt, vermutlich aufgrund der Fähigkeit des Proteins an virale RNA zu binden. Immunfluoreszenzfärbungen mit mutierten APOBEC3G-Proteinen haben auch in die-ser Arbeit erneut belegt, dass der RNA-bindenden Desaminase-Domäne bei der zellulären Lokalisation des Proteins eine besondere Rolle zukommt, da einige Mutationen innerhalb dieses Bereiches zu einem hohen Verlust der Proteinexpression sowie zu einer Ansammlung der mutierten Proteine am rauen endoplasmatischen Retikulum führen. Die in dieser Arbeit gezeigte Inhibition der Replikation von MV durch humanes APO-BEC3G lässt eine generelle antivirale Aktivität von Mitgliedern der APOBEC-Familie gegen negativ-strängige RNA-Viren vermuten, welche auf der Fähigkeit des Proteins beruht RNA zu binden. Weitere Untersuchungen bezüglich der Inhibition anderer Vertreter der Mononegavirales durch verschiedene APOBEC-Proteine könnten Aufschluss über die beteiligten Mechanismen geben. N2 - Measles virus (MV) is a negative-strand RNA virus which belongs to the family Para-myxoviridae and remains one of the leading causes of morbidity and mortality in the develop-ing world. Following entry of MV into the body, infection of CD150-positive B- and T-cells as well as dendritic cells and monocytes/macrophages leads to a systemic infection. Members of the APOBEC-protein family (apolipoprotein B mRNA editing enzyme, catalytic polypeptide-like proteins), such as APOBEC3G, are expressed in these cells and infected tissues and form an important component of the innate immune response to viral infections. A number of studies have previously demonstrated that these proteins are able to inhibit various retroelements and retroviruses, such as long interspersed nuclear elements 1 and human immunodeficiency virus (HIV). This inhibition is based on their ability to bind RNA and to deaminate cytosine to uracil. The goal of this thesis was to identify possible antiviral mechanisms of human APOBEC3G against MV as an example for negative-strand RNA viruses. This was achieved through the use of recombinant wild-type and vaccine strains of MV and Vero cell lines overexpressing APOBEC3G. We could show that the replication of recombinant wild-type and vaccine strains of MV was inhibited by APOBEC3G, resulting in a 50 % reduction in the expression of viral proteins and syncytia formation, and a 90 to 99 % reduction in viral titers produced following infection of APOBEC3G expressing cells. Sequence analysis revealed that random mutations in viral transcripts increased from 0.2 to 0.95 mutations per 1000 bp and that the pattern of mutations was similar to that in control cells. Although typical C to U(T) or G to A hypermutations and co-localization of APOBEC3G and MV-specific proteins were not observed, APOBEC3G was able to bind viral RNA and was found to be enriched approximately 4-fold in viral particles. Further studies with a MV-specific minireplicon-system revealed that APOBEC3G led to an impairment of the viral RNA-dependent RNA-polymerase, probably due to the ability of the protein to bind RNA. Immunofluorescence immunostaining of mutated APOBEC3G-proteins showed that the RNA binding deaminase domain plays an important role in determining the cellular localization of the protein. Amino-acid changes in this domain led to a considerable loss of protein expression and to accumulation of the mutated proteins at the rough endoplasmic reticulum. The inhibition of MV replication described here suggests a general antiviral activity of members of the APOBEC family against negative-strand RNA viruses, based on the ability of these proteins to bind RNA. Further examinations including other members of the Mononegavirales may provide novel insights into the underlying mechanisms leading to inhibition of viral replication. KW - RNS-Bindung KW - Masern KW - Desaminierung KW - APOBEC3G KW - Masern KW - Desaminase KW - RNA-Virus KW - APOBEC3G KW - Measles KW - Deaminase KW - RNA-Virus Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56143 ER - TY - THES A1 - Zinke, Michael Benedikt T1 - Hemmung der Masernvirusreplikation durch RNA-Interferenz T1 - Inhibition of Measles Virus replication by RNA interference N2 - Die subakut sklerosierende Panenzephalitis ist eine demyelinisierende Erkrankung des ZNS. Ätiologisch liegt eine persistierende Infektion von Masernviren der Neuronen bzw. Gliazellen zugrunde. Bis heute gibt es keine spezifische Therapie und lediglich symptomatische Therapiemaßnahmen werden in deren Behandlung angewandt. Obwohl sich während des Krankheitsverlaufes eine ausgeprägte Immunantwort des natürlichen als auch adaptiven Immunsystems des Wirtes abspielt führt die Erkrankung unweigerlich zum Tode der Betroffenen. Eine Therapiemöglichkeit diesbezüglich könnten die Effekte der RNAi darstellen. Um geeignete Sequenzen für einen möglichen Genknockdown einzelner MV-Gene herauszufiltern, wurde ein plasmid-basierendes Testsystem entwickelt, das die mRNA des Fluoreszenzproteins DsRed2 zusammen mit mRNA-Sequenzen einzelner MV-Gene exprimiert. Gegen diese MV-Gene wiederum wurden verschiedene shRNAs ausgewählt, welche mithilfe eines lentiviralen Vektorsystems exprimiert werden. Als Expressionsindikator findet in diesem lentiviralen Vektorsystem simultan die Expression von eGFP als statt. Die Auswertung dieses Dual-Color-Systems erfolgte im Folgenden mittels FACS-Analysen. Die wirksamsten siRNA-Sequenzen, ausgewählt durch eine hohe Abnahme der Rotfluoreszenz in den untersuchten Zellen, wurden für weitere Versuche selektiert. Die auf diese Weise ausgewählten shRNA-Sequenzen wurden in einem weiteren Schritt durch die Generierung lentiviraler Partikel in persistierend infizierten NT2-Zellen (piNT2), die das Fluoreszenzprotein HcRed als Infektionsindikator exprimieren, transduziert. Weitere durchflusszytometrische Messungen zeigten eine äußerst hohe Reduktion viraler Replikation innerhalb von 7 Tagen bis unterhalb der Detektionsgrenze sofern die shRNAs gegen die Expression der MV-Proteine N, P und L gerichtet waren. Die Anzahl der virus-negativen Zellen blieb im Folgenden bis zu 3 Wochen nach stattgehabter Transduktion konstant, sofern das fusion-inhibiting-peptide den Zellkulturen hinzugegeben wurde. Die transduzierten piNT2-Zellen, welche keine Expression von HcRed zeigten wurden auf Zellrasen bestehend aus Vero-Zellen aufgetragen und führten im zeitlichen Verlauf zu keiner Fusion bzw. Synzytienbildung. Dieser Zusammenhang legt nahe, dass die transduzierten piNT2-Zellen die Fähigkeit einer Expression viraler Proteine verloren haben und eine „Heilung“ stattfinden kann, wenn die virale Proteinbiosynthese durch eine permanente Expression von siRNAs, wie beispielsweise durch lentivirale Vektorsysteme, gehemmt wird. N2 - Subacute sclerosing panencephalitis is a demyelinating disease of the CNS caused by a persistent infection of Measles Virus (MV) of neurons and glial cells. Up to the present day there is no specific therapy available and in spite of a distinct innate and adaptive immune response, SSPE leads inevitably to death. Options in therapy could be the effects of RNA-Interference (RNAi). In order to select effective sequences for a possible gene knockdown, we established a plasmid-based test system expressing the mRNA of the fluorescence protein DsRed2 fused with mRNA sequences of single viral genes to which certain siRNAs were directed. siRNA sequences were expressed as short hairpin RNA (shRNA) from a lentiviral vector additionally expressing enhanced green fluorescent protein (eGFP) as an indicator. Evaluation by flow cytometry of the dual-color system (DsRed2 and eGFP) allowed us to find optimal shRNA sequences, chosed by a decrease of red fluorescing cells. Using the most effective shRNA constructs, we transduced persistently infected human NT2 cells expressing virus-encoded HcRed (piNT2-HcRed) as an indicator of infection. shRNAs against N, P, and L mRNAs of MV led to a reduction of the infection below detectable levels in a high percentage of transduced piNT2-HcRed cells within 1 week. The fraction of virus-negative cells in these cultures remained constant over at least 3 weeks posttransduction in the presence of a fusion-inhibiting peptide (Z-Phe-Phe-Gly), preventing the cell fusion of potentially cured cells with persistently infected cells. Transduced piNT2 cells that lost HcRed did not fuse or showed syncytial formations with underlying Vero cells, indicating that these cells do not express viral proteins any more and are “cured.” This demonstrates in tissue culture that NT2 cells persistently infected with MV can be cured by the transduction of lentiviral vectors mediating the long-lasting expression of anti-MV shRNA. KW - RNS-Interferenz KW - Masern KW - Masernvirus KW - Masernvirus KW - Masern KW - RNA-Interferenz KW - RNAi KW - SSPE KW - Measlesvirus KW - Measles KW - RNA interference KW - RNAi KW - SSPE Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83933 ER -