TY  - THES
A1  - Stieber, Hanna
T1  - Auswirkungen des Sphingolipidsynthese-Inhibitors Myriocin auf Vitalität und Antimykotikaresistenz von \(Candida\) \(auris\)
T1  - Impact of the sphingolipid synthesis inhibitor myriocin on viability and antifungal susceptibility of \(Candida\) \(auris\)
N2  - Candida Spezies gehören als kommensale Organismen zur normalen menschlichen Mikroflora, können allerdings unter bestimmten Bedingungen Krankheitswert erlangen. Limitationen in der Behandlung durch immer mehr resistente Candida Spezies und die wachsende Zahl immunsupprimierter Patienten gelten als Hauptursachen für die steigende Häufigkeit invasiver Candidosen und systemischer Candidämien. Die 2009 entdeckte Spezies C. auris stellt durch ihre zahlreichen Resistenzen, das Potential zur Auslösung nosokomialer Ausbrüche in Krankenhäusern und die schnelle Verbreitung über mehrere Kontinente eine neue Herausforderung dar. Der Bedarf an neuen Antimykotika mit anderen Wirkmechanismen und neuen Zielstrukturen ist größer denn je. Die fungale Sphingolipid-Biosynthese wurde bereits mehrfach als potenzielles Ziel antimykotischer Therapie diskutiert, allerdings bezieht sich die meiste Forschung hierzu auf C. albicans]. In vorliegender Arbeit wurden die Auswirkungen der Inhibition der Sphingolipid Biosynthese durch Myriocin auf C. auris und sein Resistenzverhalten untersucht und mit denen auf andere Candida Spezies verglichen. 

Sowohl die Mikrodilution als auch die Plattentropftests zeigten, dass C. auris verglichen mit anderen Candida Spezies besonders sensitiv auf die Anwesenheit von Myriocin reagierte und stärker im Wachstum gehemmt wurde. Der Survival Assay ergab für alle drei Spezies ein Absenken der CFU durch Myriocin, die Abweichungen zwischen den Stämmen waren jedoch unwesentlich. Unterschiede konnten in Vitalität und Vermehrung der verschiedenen Spezies unter Myriocineinfluss festgestellt werden.
Aus der Lebend/Tot-Färbung ging hervor, dass Myriocin bei allen Stämmen zum Absterben von Candida Zellen führte, C. albicans und C. glabrata allerdings signifikant niedrigere Überlebensraten im Vergleich zu den C. auris Isolaten aufwiesen. Im Gegensatz dazu konnte mithilfe der FITC-Mikroskopie gezeigt werden, dass Candida Zellen unter Zugabe von Myriocin weniger Tochterzellen ausbildeten, was auf eine erschwerte oder zumindest verlangsamte Zellvermehrung hindeutet. Dabei schien das Wachstum der C. auris Stämme durch Myriocin deutlich eingeschränkter zu sein als das von C. albicans und C. glabrata. Durch weitere Mikroskopie und die Kombination aus Lebend/Tot Färbung mittels PI und FITC Färbung, sollte die Verteilung der toten Zellen auf Mutter- und Tochterzellen evaluiert werden. Hier konnte ein Trend zu einem vermehrten Zellsterben der Tochterzellen, vor allem für C. auris, festgestellt werden. Abschließende E-Tests für Amphotericin B, Anidulafungin und Fluconazol ergaben eine signifikante Herabsetzung der MHK für alle C. auris Isolate durch Myriocin. Die hier vorgestellten Ergebnisse und die durch mehrere Studien festgestellten Differenzen in der Sphingolipidkomposition von C. auris verglichen mit anderen Candida Spezies geben Hinweis darauf, dass Sphingolipide für Vitalität, Zellteilung und vor allem für die Wirkung einiger Antimykotika auf C. auris eine besondere, wenn nicht übergestellte Bedeutung haben könnten. Zwar wurde die Sphingolipidsynthese bereits mehrfach als potenzieller Angriffspunkt für die antifungale Therapie diskutiert, allerdings lediglich am Beispiel anderer Candida Spezies. Der Sphingolipidstoffwechsel könnte somit ein vielversprechender Ansatz für die Behandlung des sonst so therapieresistenten und lebensbedrohlichen Pilzes C. auris sein.
N2  - Candida species are commensal organisms belonging to the normal human microflora, but can become pathogenic under certain conditions. Limitations in treatment due to an increasing number of resistant Candida species and the growing number of immunosuppressed patients are considered to be the main reasons for the increasing frequency of invasive candidiasis and systemic candidemia. C. auris, a species discovered in 2009, shows potential to cause nosocomial outbreaks in hospitals, limited susceptibility to numerous antifungals and a rapid spread across several continents. This leads to a need for new antifungal agents with different mechanisms of action and new targets. Fungal sphingolipid biosynthesis has been discussed several times as a potential target of antifungal therapy, however most research on this relates to C. albicans. In the present work, the effects of inhibition of sphingolipid biosynthesis by myriocin on C. auris and its impact on fungal susceptibility were investigated and compared with those on other Candida species. 

Both microdilution and plate droplet assays showed that C. auris was more sensitive to myriocin compared with other Candida species and showed severe growth defects. The survival assay showed a lowering of CFU by myriocin for all three species, but the differences between the strains were insignificant.
Live/dead staining showed that myriocin led to the death of Candida cells in all strains, but C. albicans and C. glabrata had significantly lower survival rates compared to the C. auris isolates. In contrast, FITC microscopy showed that Candida cells produced fewer daughter cells when myriocin was added, indicating that cell proliferation was impeded or at least slowed. In this regard, the growth of C. auris strains appeared to be significantly more restricted by myriocin than that of C. albicans and C. glabrata. Further microscopy and the combination of live/dead staining using PI and FITC staining, was performed to evaluate the distribution of dead cells between mother and daughter cells. Here, a trend towards increased cell death of daughter cells, especially for C. auris, was observed. Final E-tests for amphotericin B, anidulafungin, and fluconazole revealed a significant reduction in MIC for all C. auris isolates by myriocin. These results and the differences in sphingolipid composition of C. auris compared with other Candida species established by several studies provide evidence that sphingolipids may have a special, if not superimposed, importance for viability, cell division, and especially for the suscteptibility of C. auris to some antifungals. It is true that sphingolipid synthesis has been discussed several times as a potential target for antifungal therapy, but only using other Candida species as examples. Sphingolipid metabolism could thus be a promising approach for the treatment of the therapy-resistant and life-threatening fungus C. auris.
KW  - Candida
KW  - Sphingolipide
KW  - Sphingolipidstoffwechsel
KW  - Multiresistenz
KW  - pathogene Pilze
KW  - Candida auris
KW  - Antimykotikaresistenz
KW  - antifungal susceptibility
KW  - myriocin
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-289121
ER  - 
TY  - THES
A1  - Walter, Tim
T1  - Bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide zur Evaluierung von Lipiddynamiken \(in\) \(vivo\)
T1  - Bioorthogonal functionalized sphingolipids for evaluation of lipid dynamics \(in\) \(vivo\)
N2  - In der Kontrolle von viralen oder bakteriellen Infektionen spielen Sphingolipide eine essentielle Rolle[335-336], weshalb sich inzwischen die Forschung vermehrt an Sphingolipiden und -analoga als Wirkstoffen gegen die verschiedensten Erreger beschäftigt.[9] Dabei finden in der Synthese und Identifikation potentieller Wirkstoffe auch clickchemiebasierte Ansätze Anwendung.[224] Allerdings ist die Wirkweise von sphingolipidbasierten Pharmaka auch in viraler und mikrobieller Pathogenese bisher ungeklärt. 
Mit der Entdeckung der CuAAC[112-113] sowie deren modernen Varianten und Alternativen, die gemeinsam unter dem Begriff Clickchemie zusammengefasst werden, ist es möglich, die strukturellen Änderungen von Biomolekülen klein zu halten und durch spätere Konjugation mit Farbstoffen Fluoreszenspektroskopie zu ermöglichen.[339-340] Während in den letzten Jahren die Clickchemie breite Anwendung zur Modifikation von Proteinen[130], Kohlenhydraten[341] und DNA[340] gefunden hat blieben Lipide lange unbeachtet[342], was vor allem auch für Sphingolipide gilt.
In dieser Arbeit werden bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide und -analoga vorgestellt, um die Vielseitigkeit der Clickchemie auf das Feld der Sphingolipide zu übertragen. Die clickfähigen Lipidanaloga ermöglichen detaillierte Einblicke in die dynamische Organisation von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und ihr Einsatz als therapeutische Wirkstoffe oder zur Generierung von antibakteriellen Oberflächenbeschichtungen wurden untersucht.
Die dargestellten azidmodifizierten Sphingolipide und –analoga konnten in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern, bezüglich ihrer Verwendung in Visualisierungsexperimenten und antibakteriellen Eigenschaften untersucht werden.
Die Ceramidderivate konnten genutzt werden, um den Einfluss von Kettenlänge und Position des Azides der acylierten Säure auf die in vivo-Konjugation mit dem Fluoreszenzfarbstoff DBCO-Sulfo-Cy5 in Jurkatzellen genauer zu untersuchen.[211]
Auch konnten azidfunktionalisierte Ceramide auf ihre Eignung zur Visualisierung von Ceramiddynamiken während T-Stimulation untersucht werden.[205] In diesem Zusammenhang sind visualisierbare Ceramide von besonderer Bedeutung, da die T-Zellstimulation die ASM-Aktivierung zur Folge hat, die wiederum Ceramide freisetzt.
Mit dem azidmodifizierten Phytosphingosinderivat gelang es erstmals ein azidmodifiziertes Sphingolipid nach Inkubation von Arabidopsis thaliana Setzlingen mittels CuAAC mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu konjugieren.[258] 
Des Weiteren konnten die azidfunktionalisierten N-Oleoylserinole in verschiedenen Zelltypten erfolgreich eingebaut und selektiv mit Fluoreszenzfarbstoff visualisiert werden. Kofärbungen mit GFP-PKCζ und Antikörpermarkierungen von Ceramid sowie PKCζ zeigten, dass es sich bei den Enantiomeren um ceramidimitierende Lipidanaloga handelt. Somit eignen sich diese N-Oleoylserinolanaloga, um die Interaktion von Ceramiden mit der Proteinkinase Cζ zu untersuchen.
Da viele natürliche Sphingolipide antibakterielle Eigenschaften aufweisen, konnte in Kooperation mit Jérôme Becam der Einsatz azidmodifizierter Ceramide als Wirkstoff gegen Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus untersucht werden. ωN3-C6-Cer zeigt gute bakterizide Eigenschaften gegen Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, ohne dabei toxisch gegenüber den Wirtszellen zu sein. Die Ceramidanaloga αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer und ωN3-C16-Cer weisen keine antibakteriellen Eigenschaften auf, aber sie wurden effizient in die Membran der Neisseriae eingebaut und konnten ebenfalls erfolgreich bioorthogonal markiert werden. Des Weiteren zeigten hochauflösende dSTORM-Aufnahmen der Bakterien, im Gegensatz zu Humanzellen, eine homologe Verteilung der konjugierten Ceramide. Da Ceramide eine wichtige Rolle in der Infektionsbekämpfung spielen, sind die in dieser Arbeit synthetisierten azidmodifizierten Ceramide wertvolle Werkzeuge, um die Interaktion von Bakterien mit Humanzellen zu untersuchen.
Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich eine innovative Methode entwickelt werden, um alkinpräsentierende Linker auf die Oberfläche von Nunc Covalink 96 Microtiterplatten kovalent zu binden und die Alkine konnten anschließend mittels CuAAC mit den in dieser Arbeit synthetisierten azidfunktionalisierten Lipiden zu konjugiert werden. Ziel der Methode war es potentielle Moleküle für bakterizide Oberflächenmodifikationen zu identifizieren. Mittels solcher Oberflächenmodifikationen soll die Biofilmbildung in Endotrachealtuben verhindert, und damit die Entstehung von beatmungsassozierten Pneumonien unterbunden werden. Die lipidmodifizierten Microtiterplatten sollen zukünftig auch genutzt werden, um sphingolpidaffine Proteine aus Zelllysaten zu identifizieren.
N2  - Sphingolipids play an essential role in the control of viral and bacterial infections[335-336], therefore sphingolipids and analogues shift into the focus of pharmaceutical research as active ingredients against various pathogens.[9] Also click chemistry is used for synthesis and screening of potential drugs.[224] The mode of action of sphingolipid based pharmaceuticals in viral and microbial pathogenesis is not yet fully understood.
By using CuAAC[112-113] and their modern variants and alternatives – summarized in the term click chemistry – it is possible to minimise the structural alterations of biomolecules and still use them in fluorescence spectroscopy after labeling. [339-340] While modification of proteins[130], carbohydrates[341] and DNA[340] via click chemistry has been widely used in recent years, lipids have remained unaffected for a long time, especially sphingolipids.[342]
In this Work biorthogonal functionalised sphingolipids and analogues are presented, that transfer the versatility of the click chemistry to the field of sphingolipids. Furthermore, the clickable lipid analogues allow a detailed view into the dynamic organisation of sphingolipids in infection processes and in addition their use as therapeutic agents or for the generation of antibacterial surface coatings were investigated. 
The synthesized azide modified sphingolipids and analogues were evaluated for the use in visualisation experiments and their antibacterial properties were evaluated within several cooperation projects.
The ceramide derivatives were used to evaluate the influence of acylated chain length and azide position in regard to in vivo labeling with the fluorescence dye DBCO-Sulfo-Cy5 in jurkat cells.[211]
Furthermore, ceramide dynamics during T-cell stimulation were investigated by labeling azide functionalised ceramides.[205] In this context visualisable ceramides are of particular interest due T-cell stimulation results in ASM-activation, which again releases ceramides.
With the azide modified phytosphingosine derivative, an azide modified sphingolipid was labelled via CuAAC after incubation of arabidoopsis thailana seedlings for the first time[258] 
Furthermore, azide functionalised N-Oleoyl serinols were successfully incorporated within different cell types and selectively visualised by labelling. Colocalization studies with GFP-PKCζ and anti body labeling of ceramide as well as PKCζ proved to be ceramide mimicking lipid analogues
Many natural sphingolipids show antibacterial behaviour, therefore the use of azide modified ceramides as active ingredients against Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus were investigated in cooperation with Jérôme Becam ωN3-C6-Cer shows good bactericidal properties against Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae without being toxic against host cells. The ceramide analogues αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer and ωN3-C16-Cer show no antibacterial properties, but they were also efficiently incorporated into the membrane of Neisseriae and can be used biorthogonal labelling. Furthermore, in contrast to human cells high resolution dSTORM-images show an evenly distribution of labelled ceramides in bacteria cells. Since ceramides play an important role in the fight against infections the ceramides synthesised in this work are valuable tools to investigate the interaction of bacteria with human cells. 
Also an innovative method was established within this thesis to modify the surface of Nunc Covalink 96 Wellplates with alkyne presenting linkers followed by the conjugation of the azide modified lipids presented in this work via CuAAC. This method is intended to be used for screening of potential molecules for antibacterial surface modifications. In the future this kind of surface modifications are expected to prevent the biofilm formation in endotracheal tubes and prohibit the formation of ventilator-associated pneumonia. In Addition the lipid modified microtiter plates are also intended to be used to identify sphingolipid affine proteins from cell lysate.
KW  - Click-Chemie
KW  - Sphingolipide
KW  - Lipidmembran
KW  - Sphingolipid
KW  - bioorthogonal
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168091
ER  - 
TY  - THES
A1  - Glenz, René
T1  - Die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion
T1  - The role of sphingobases in plant cell death reaction
N2  - Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod.

In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert.

In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden.

Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei.
N2  - Sphingobases are the building blocks for the biosynthesis of sphingolipids. While complex sphingolipids form a major part of eukaryotic membranes, sphingobases, which are also called long-chain bases (LCBs), are well-known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes. In the animal system, antagonistic effects of nonphosphorylated sphingobases (LCBs) and their phosphorylated counterparts (LCB-Ps) have been reported in many cell functions, with a particular focus on apoptosis, and the underlying signaling pathways have been elucidated in detail. In contrast, few records of an antagonistic effect and the potential signal transduction mechanisms have been established in plants. Several lines of evidence point to a regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Mutations in genes related to sphingobase metabolism may cause spontaneous PCD and altered cell death reactions. (ii) Levels of LCBs are increased under different cell death conditions. (iii) Necrotrophic pathogens produce toxins, like fumonisin B1 (FB1), interfering with sphingolipid metabolism of the host plant and, thus, causing PCD. (iv) Treatment of plants with LCBs, but not LCB-Ps, induces cell death.

In the present study the role of sphingobases in plant cell death reactions, with a focus on the examination of the hypothesis of an antagonistic cell death-inhibitory effect of LCB-Ps, has been investigated. Using conductivity-based measurements of Arabidopsis thaliana leaf discs, cell death induced by treatment with LCBs and separated or combined feeding of LCB-Ps was determined. That kind of quantification allowed the verification of an inhibitory effect of LCB-Ps on LCB-induced cell death, which was published elsewhere. However, by simultaneous measurement of the applied sphingobase levels in the tissue with HPLC-MS/MS, this antagonism could be explained by a reduced uptake of the LCB in the presence of the LCB-P, which was also confirmed by a separated treatment with the sphingobases. In addition to that an impact of exogenous applied LCBs and LCB-Ps on cell death in A. thaliana induced by Pseudomonas syringae has been investigated. For LCB-Ps no cell death inhibitory effect was observed. Similarly, there was no impact for LCB-Ps on the cell death induced by recombinant expression of an avirulence protein in Arabidopsis. For LCBs, a direct antibacterial effect against P. syringae was shown in this work. This puts previous findings of an inhibitory effect of LCBs on pathogen-induced cell death in plants into a new perspective.

In further approaches, Arabidopsis mutants of enzymes of the sphingobase metabolism (LCB kinase, LCB-P phosphatase, LCB-P lyase) were functionally characterized with regard to altered in situ levels of LCBs/LCB-Ps. The phenotype of the mutants in response to fumonisin B1 was determined in a growth assay with seedlings, and by cell death measurements in leaf discs, which were accompanied by quantification of sphingobase levels. The sensitivity of different lines to FB1 was closely correlated with the levels of LCBs, while high contents of LCB-Ps alone were not able to reduce cell death. Some mutants even showed a correlation of highly enhanced LCB-P levels with a pronounced sensitivity to FB1.

The results of the present study challenge the hypothesis of an antagonistic effect of phosphorylated sphingobases on plant cell death. Instead, a detailed analysis of sphingobase levels revealed a positive correlation of LCB contents with cell death. The conducted experiments not only provide further evidence for a cell death-promoting effect of nonphosphorylated sphingobases, but also contribute to the comprehension of sphingobase homeostasis, as well as of the sphingobase-induced PCD in plants.
KW  - Sphingolipide
KW  - Phytosphingosine
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Pseudomonas syringae
KW  - Zelltod
KW  - Sphingobasen (LCB, LCB-P)
KW  - Ackerschmalwand
KW  - programmierter Zelltod
KW  - Sphingobases
KW  - Arabidopsis
KW  - programmed cell death
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187903
ER  - 
TY  - THES
A1  - Dennstädt, Fabio Stefan
T1  - Modulation CD4+ humaner Treg- und Tconv-Zellen durch Inhibition der sauren Sphingomyelinase in vitro
T1  - Modulation of CD4+ human Treg and Tconv cells by inhibition of the acid sphingomyelinase in vitro
N2  - Die saure Sphingomyelinase (ASM) stellt durch die Umwandlung von Sphingomyelin in Ceramid und Phosphorylcholin ein zentrales, fein reguliertes Enzym im Sphingolipidmetabolismus dar. Dadurch nimmt es Einfluss auf verschiedene zelluläre Mechanismen wie Signalvermittlung, Endo- und Exozytose und Zellaktivierung. Dementsprechend weitreichend ist auch die Bedeutung der ASM bei verschiedenen Krankheiten wie Arteriosklerose, Depression oder Neoplasien. Auch auf das Immunsystem, insbesondere auf die Signalvermittlung durch T-Zellen innerhalb des adaptiven Immunsystems, nimmt die saure Sphingomyelinase Einfluss. Aufbauend auf früheren Forschungsarbeiten zur pharmakologischen und genetischen Hemmung der ASM im Mausmodell untersuchten wir, welche Auswirkungen die Hemmung dieses Enzyms in humanen Zellkulturen auf die Population regulatorischer und konventioneller T-Zellen haben. Hierzu verwendeten wir die beiden selektiven Serotonin-Wiederaufnahmehemmer Sertralin und Citalopram; zwei antidepressiv wirksame Medikamente, die durch eine Verdrängung der ASM von der lysosomalen Membran eine hemmende Wirkung ausüben. Wir konnten zeigen, dass diese beiden Substanzen sowohl in Maus-T-Zellen, als auch in humanen T-Zellen, in der Lage sind, die Aktivität der sauren Sphingomyelinase zu inhibieren. Durch Kultivierung von Immunzellen der Maus zusammen mit den Inhibitoren konnte darüber hinaus eine Erhöhung der Treg-Zellfrequenz erreicht werden. Verschiedene Zellkulturexperimente mit humanen PBMCs zeigten weiterhin, dass unter gewissen Umständen so auch eine Vermehrung regulatorischer T-Zellen im Menschen möglich ist, und dass dies mutmaßlich durch Einbindung der ASM im CD3/CD28-Signalweg bedingt ist. In mit AntiCD3-Antikörper stimulierten experimentellen Ansätzen kam es jedoch nur bei einzelnen Individuen, die als Responder identifiziert werden konnten, zu einer Treg-Zellvermehrung. Umgekehrt kam es durch externe Zugabe von C6-Ceramid zu einer Verringerung des Anteils an regulatorischen T-Zellen. Des Weiteren wurden verschiedene Veränderungen im Expressionsverhalten von Treg- und Tconv-Zellen bezüglich CD25, CD69 und CTLA-4 in Anwesenheit der ASMInhibitoren beobachtet. Weiterhin bestätigte sich, dass die pharmakologische Hemmung der sauren Sphingomyelinase auch Auswirkungen auf die Effektorfunktion von T-Zellen hat. Während die Proliferation der Zellen weitgehend unbeeinträchtigt blieb, kam es zu einer verringerten Sekretion der Zytokine IFN-gamma, TNF, IL-5 und IL-10. In ihrer Gesamtheit sprechen diese Ergebnisse dafür, dass Inhibitoren der sauren Sphingomyelinase begünstigend auf Krankheitsgeschehen mit überschießender oder dysregulierter Aktivität des Immunsystems einwirken könnten. Immunmodulatorischen Wirkungen durch Inhibition der ASM erklären möglicherweise auch Einflüsse auf das Immunsystem, die für verschiedene Antidepressiva beschrieben wurden. Insgesamt ist die Bedeutung der sauren Sphingomyelinase innerhalb der Regulation des adaptiven Immunsystems jedoch noch ein weitgehend ungeklärtes Thema mit vielen offenen Fragen. Daher ist auch in Zukunft weitere klinische und experimentelle Forschung erforderlich, um zu klären, welchen Einfluss dieses Enzyms auf Immunzellen hat und wie sich dieser auch klinisch anwenden lässt.
N2  - By catalyzing the transformation of sphingomyeline into ceramide and phosphocholine, the acid sphingomyelinase (ASM) plays a central role in the metabolism of sphingolipids and is tightly regulated. Therefore it takes essential influence upon different cellular mechanisms like signal transduction, endo-/exocytosis and cell activation. Accordingly complex is the importance of the ASM in different diseases like atherosclerosis, depression or neoplastic diseases. The acid sphingomyelinase also greatly influences the signal mediation of T cells within the adaptive immune system. Based on previous research about the pharmacological and genetic inhibition of the ASM in mice we investigated, which impact an inhibition of this enzyme in human cell cultures may have on the populations of regulatory and conventional T cells. Therefore we mostly used the two selective serotonin reuptake inhibitors sertraline and citalopram. These two antidepressive drugs detach the ASM from the lysosomal membrane and thereby inhibit the enzyme. Here we show, that these two substances efficiently inhibit the ASM mice T cells as well as human T cells. Cultivating immune cells of mice together with the inhibitors led to an essential increase in the frequency of regulatory T cells. Various cell culture experiments with human PBMCs showed that under certain circumstances an increase in regulatory T cells is also possible in the human, most likely due to the involvement of the ASM in the CD3/CD28 signal pathway. Experimental approaches using � CD3-antibodies showed an increase in Treg cells in a fraction of the tested individuals. External addition of C6-ceramide led to a decrease in the frequency of regulatory T cells. In addition to that, we were able to observe diverse effects regarding the expression of CD25, CD69 and CTLA-4 in Treg and Tconv cells in the presence of the ASM-inhibitors. We were also able to confirm that the pharmacological inhibition of the acid sphingomyelinase has an impact on the effector functions of T cells. While there was no effect on cell proliferation, we observed a decreased secretion of the cytokines IFN-gamma, TNF, IL-5 and IL-10. Alltogether these results indicate that inhibitors of the acid sphingomyelinase might have positive effects in pathologies of overshooting or dysregulated activity of the immune system. Immunomodulatory effects after inhibition of the ASM might also explain observations of an influence of antidepressants on the immune system that have been described in the literature. Overall the importance of the acid sphingomyelinase within the regulation of the adaptive immune system is a new field of research with many open questions. Therefore further clinical and experimental research is needed to clarify, which impact this enzyme has on immune cells and how this impact might be used therapeutically.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Regulatorischer T-Lymphozyt
KW  - Serotonin-Reuptake-Hemmer
KW  - Sphingolipide
KW  - Sphingomyelinphosphodiesterase
KW  - Saure Sphingomyelinase
KW  - ASM-Inhibition
KW  - Regulatorische T-Zellen
KW  - Serotonin-Wiederaufnahmehemmer
KW  - Sphingolipidstoffwechsel
KW  - Ceramid
KW  - Sphingomyelin
KW  - Sertralin
KW  - Citalopram
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-205420
ER  - 
TY  - THES
A1  - Pilgram, Lisa
T1  - Produktion und pathophysiologische Bedeutung von Sphingosin-1-Phosphat in humanen dendritischen Zellen
T1  - Production and pathophysiological significance of sphingosine-1-phosphate in human dendritic cells
N2  - Dendritische Zellen (DCs) sind als Zielzellen des MV für dessen Pathogenese von zentraler Bedeutung und fördern sowohl Dissemination und Transmission des Virus. Auf zellulärer Ebene findet sich eine Modulation des Sphingolipidmetabolismus in MV-infizierten DC-Kulturen. S1P selbst ist ein bioaktives Sphingolipid, das über auto- und parakrine S1P-Rezeptorstimulation Funktion, Migration und Positionierung von Immunzellen, aber auch als intrazellulärer Botenstoff Calcium-Haushalt, Apoptose und Proliferation reguliert. Über die an der Vermittlung der intrazellulären S1P-Effekte beteiligten Strukturen ist bisher weniger bekannt und der S1P-Metabolismus einzelner Zellen trotz Kompartiment-abhängiger Schwankungen der S1P-Konzentrationen kaum adressiert. Für murine DCs konnte eine kontinuierliche S1P-Produktion und  Sekretion nachgewiesen werden. Ob dies auch auf humane DCs zutrifft und pathophysiologisch im Rahmen einer MV-Infektion moduliert wird, ist bisher nicht bekannt. In dieser Arbeit wurde das Vorkommen S1Ps sowie dessen Metabolismus in humanen DCs quantitativ erfasst, und der Einfluss inflammatorischer, bakterieller und viraler (MV) Stimuli einbezogen. In Anbetracht der bekannten chemoattraktiven Potenz wurde nachfolgend der Beitrag S1Ps für die DC-induzierte T-Zellmigration untersucht. 
Es konnte gezeigt werden, dass beide SphK Isoenzyme und auch die irreversibel degradierende SPL in humanen unreifen DCs (iDCs) auf mRNA-Ebene exprimiert werden. S1P konnte intrazellulär nachgewiesen werden, eine mit Erythroyzten vergleichbare Speicherkapazität ist nicht anzunehmen. Unter bakteriell oder inflammatorisch vermittelter Ausreifung (mDCs) wurde eine Reduktion des S1P Gehalts in DCs beobachtet. Abweichend davon behielten insbesondere stark MV infizierte DC-Kulturen die hohen S1P-Spiegel unreifer DCs bei, was möglicherweise neben der modulierten Chemokinsynthese und Oberflächenexpression ko-stimulatorischer Moleküle einen weiteren Parameter ihrer inkompletten Reifung nach MV Infektion reflektiert. Da die Veränderungen zwischen MV-infizierten DCs und mDCs nur für S1P, nicht aber für andere Sphingolipidmetaboliten messbar waren, liegt ihnen wohl eine Regulation der Sphingosinkinasen oder S1P degradierender Enzyme zugrunde. Bei unveränderter Akkumulation der hierfür spezifischen mRNAs müsste dies auf Ebene der Translation, Stabilität oder Aktivität der Enzyme beruhen. 
Die indirekte Messung des extrazellulären S1Ps anhand der gegenläufigen S1P1-Dichte ließ vermuten, dass in DCs synthetisiertes S1P extrazellulär wirken konnte. Es kann dabei autokrin auf DCs wirken, beispielsweise deren Motilität oder Genexpression regulieren, ist aber auch Voraussetzung zum Aufbau eines S1P-Gradienten und damit parakriner Regulation lymphozytärer Migrationsvorgänge. Einen Beitrag S1Ps zur mDCs-induzierten T Zellchemotaxis konnte durch die erhobenen Daten mit hoher Wahrscheinlichkeit ausgeschlossen werden. Bezüglich der durch iDCs oder MV infizierte DCs induzierten T Zellchemotaxis konnte aufgrund experimenteller Limitationen keine abschließende Aussage zur Beteiligung S1Ps getroffen werden. Die T-Zellmigration auf DCs erwies sich im 2 D-System als gerichtete Bewegung. Weder Ausreifung noch MV-Infektion der DCs hatten Auswirkungen auf die Quantität der T-Zellmigration. Differentielle Expressionsmuster von Chemokinen in iDCs, mDCs und MV infizierten DCs sind jedoch bekannt und legen Variationen der Subset-Komposition innerhalb der migrierenden T Zellen nahe. Diese sollten gezielt in nachfolgenden Arbeiten untersucht werden. 
Zusammenfassend weist die vorliegende Arbeit eine kontinuierliche Synthese S1Ps in DCs mit Stimulus-abhängiger Fluktuation nach. Eine MV Infektion löst dabei einen zu inflammatorischen und bakteriellen Stimuli divergenten Effekt auf den S1P-Gehalt aus mit möglichen pathophysiologischen Konsequenzen. Eine Modulation der T Zellchemotaxis und damit der DC-T-Zell-Interaktion wäre im Rahmen inflammatorischer, bakterieller oder viraler Szenarien denkbar. Unter inflammatorischen und bakteriellen Bedingungen trug S1P jedoch nicht zur T-Zellchemotaxis bei, für MV blieb dies unklar. Dahingegen zeigten weitere Experimente der Arbeitsgruppe einen autokrin vermittelten Beitrag des intrazellulär produzierten S1Ps zur Migration MV-infizierter DCs im respiratorischen Epithel und identifizierten damit einen bisher unbekannten Einflussfaktor einer erfolgreichen MV-Transmission.
N2  - As target for measles virus (MV) infection, dendritic cells (DCs) are central in MV pathogenesis also including viral dissemination and transmission. In this context, changes in sphingolipid metabolism and function of MV-infected DCs are described. Sphingosin-1-Phosphat (S1P) as a potent bioactive sphingolipid has pleiotropic functions in immunological processes. It regulates immune cell trafficking via autocrine or paracrine secretion and calcium homeostasis, apoptosis and proliferation via so far poorly defined intracellular signaling. Though compartment dependent S1P variations have been described, cell specific S1P metabolism remains mostly unclear. Little information is available in this regard for human DCs, especially under inflammatory, bacterial and viral (MV) conditions, while murine DCs were identified to continuously produce and secrete S1P.
In this study, the S1P pool in human DCs, its metabolism as well as its fluctuation in maturation and MV-infection were investigated. Considering its function as a chemoattractant, resulting consequences in T cell chemotaxis induced by DCs were addressed.
Sphingosinkinases (SphK1, SphK2), which generate, and S1P-Lyase (SPL), which irreversibly degrades S1P, were found to be expressed at the mRNA level in human immature DCs. Intracellular S1P was readily detected in immature DCs (iDCs), though they are unlikely to serve as S1P sores as described for erythrocytes. S1P concentrations decreased upon maturation triggered by cytokines (TNF α) or bacterial components (LPS). In contrast, S1P levels corresponding to those measured in iDCs were retained in MV-infected DC culture. In addition to the modulation of chemokine synthesis and surface expression of co-stimulatory molecules, retention of S1P levels may also reflect incomplete DC maturation induced by this virus. As fluctuations of the sphingolipid pool between maturing (mDCs) and infected DCs only affected levels of S1P but not its precursors, differential regulation of sphingosine kinases or degrading enzymes are most likely important in elevated S1P levels. As accumulation of mRNAs specific for SphK1, SphK2 and SPL was unaffected in MV-infected DC-cultures, regulation of the enzymes at translational, stability and/or activity level are likely to be operative. 
Due to its S1P dependent internalization, S1P1 serves as a surrogate marker of extracellular S1P level. The decreased intracellular S1P concentrations in mDCs were paralleled by upregulated S1P1 expression making decreased S1P secretion likely. In MV infected DC culture secretion seems to be maintained at a level comparable to iDCs. Presuming continuous secretion of S1P, the detected S1P in DCs might contribute to S1P gradients among and within tissues, thus regulating lymphocyte migration. Findings obtained within this work do not support a role of S1P in T cell chemotaxis induced by mDCs. Experimental limitations precluded a final statement on a potential role of S1P in T cell chemotaxis induced by iDCs or MV-infected DCs. T cell chemotaxis induced by mDCs was highly directional in a two-dimensional system. At an overall quantitative basis, T cell chemotaxis induced by iDCs, mDCs or MV-infected DCs did not differ. As DCs are known to vary their chemokine expression depending on their differentiation status, it is, however, quite possible that the subset composition of the migrating T cell compartment differs; which has not been directly addressed in this work. 
Altogether, this work revealed continuous production of S1P by human DCs with differentiation-dependent fluctuations. While intracellular S1P pools decreased with maturation induced by inflammatory conditions or LPS, these were fully retained upon MV infection. At a functional level, effects on T cell chemotaxis followed by differential interaction with DCs might be of pathogenetic advantage in inflammatory, bacterial or viral settings. However, S1P did not take part in T cell attraction by mDCs. Its contribution to T cell chemotaxis induced by MV infected DCs remains unsettled. However, further experiments in this research group revealed its importance in promoting migration in MV infected DCs by autocrine signaling, thus enabling efficient virus transmission.
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Sphingolipide
KW  - Chemotaxis
KW  - Entzündung
KW  - Masernvirus
KW  - Sphingosin-1-Phosphat
KW  - T-Zellmigration
KW  - sphingosine-1-phosphate
KW  - T-cell migration
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-210214
ER  - 
TY  - THES
A1  - Peer, Markus
T1  - Sphingolipide – Analytik, Biosynthese und Funktion in der Arabidopsis thaliana Pathogenantwort
T1  - Sphingolipids – Analytics, Biosynthesis and Functions in the Arabidopsis thaliana Pathogen Interaction
N2  - Sphingolipide (SPL) sind wichtige und ubiquitar verbreitete Bestandteile von Biomembranen. Aufgrund der enormen Vielfalt, der komplexen Struktur und diverser physiko-chemischer Eigenschaften der Sphingolipide gestaltet sich die qualitative und quantitative Untersuchung der Sphingolipide allerdings schwierig. In dieser Arbeit konnten, basierend auf publizierten Methoden, analytische Verfahren entwickelt werden, mit deren Hilfe sich die Gehalte spezifischer Sphingolipide in A. thaliana quantitativ nachweisen lassen. Unter Einsatz eines targeted metabolite profiling-Ansatzes wurde die Rolle spezifischer Sphingolipide in der Pflanzen-Pathogen Interaktion charakterisiert. Infiltration von avirulenten P. syringae pv. tomato (Pst) in Blätter von A. thaliana führte zu schnell und transient erhöhten Gehalten der freien Sphingobase Phytosphingosin (t18:0). Im Gegensatz zu avirulenten Pst kam es nach Infiltration von virulenten Pst zu einer schnellen Rückkehr auf Basalniveau und nicht zu einer hypersensitiven Antwort (HR), was auf eine positiv regulatorische Rolle von t18:0 in Abwehrreaktionen von Pflanzen hinwies, z.B. bei der HR. Damit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Spiegel freier Sphingobasen der Pflanze, insbesondere von t18:0, in Antwort auf bakterielle Pathogene reguliert werden. Diese spezifische Regulation korreliert, in Abhängigkeit von der Pathogeninfektion, mit dem Verlauf der HR. Im Unterschied zu avirulenten Stämmen sind virulente Pst in der Lage, Abwehrreaktionen des Wirtsorganismus zu unterdrücken. Daher tritt keine HR auf, welche die Ausbreitung des Pathogens stoppen könnte. Die unterschiedliche Beeinflussung der t18:0 Gehalte virulenter und avirulenter Stämme zeigte sich auch in Experimenten mit einem anderen P. syringae Stamm. Freie Sphingobasen zeigten in dieser Arbeit typische Merkmale von Signalmolekulen: geringe basale Spiegel, schnelle und transiente Gehaltsanderungen, präzise Regulation sowie spezifische Wirkeffekte. Sphingolipide stellen somit, neben den etwa durch PAMPs ausgelösten und durch Phytohormone vermittelten, weitere Signalwege in der Pflanzen Pathogen Interaktion dar. Die Infiltration von Pst in Blätter der A. thaliana Mutante sbh1-1 führte zu transient erhöhten d18:0 Spiegeln. In dieser Mutante ist die Funktion von einer der zwei Sphingobasen-Hydroxylasen gestört. Wie sich nach Totalhydrolyse zeigte, sind die Gesamtgehalte von t18:0 in der Mutante allerdings nicht reduziert. Dies spricht dafür, dass der pathogenabhängige transiente Anstieg von t18:0 durch de novo Synthese aus d18:0 entsteht und nicht durch Freisetzung aus komplexen Sphingolipiden mittels spezifischer Lipasen. Somit ist die Hydroxylase SBH1 für den schnellen signalvermittelten Anstieg von t18:0 verantwortlich. Neben t18:0 lösen auch strukturell ähnliche freie Sphingobasen, z.B. d18:1 und d18:0, Abwehrreaktionen und Zelltod aus, während andere Sphingobasen (d20:0 und d20:1) sowie Ceramide keine Reaktionen auslösten. Dies weist auch direkt auf die Spezifität der beteiligten Mechanismen hin.
N2  - Sphingolipids (SPL) are important and ubiquitously distributed constituents of biological membranes. Due to the tremendous variety, complex structure and diverse physicochemical properties of sphingolipids, qualitative and quantitative analysis has only recently been possible due to newly developed methods in mass spectrometry and chromatography. In this work, analytical methods to quantitatively detect the SPL content in A. thaliana leaves were established based on published literature. Using a targeted metabolic profiling approach, the role of specific SPL in the plant‐pathogen interaction was characterized. In line with the production of reactive oxygen species (ROS), a hallmark of biotic stress, infiltration of the avirulent form of the phytopathogen P. syringae pv. tomato (Pst) led to a fast and transient increase of the free long chain base Phytosphingosine (t18:0). Virulent Pst showed also a fast and transient, but clearly less prolonged elevation of t18:0 levels. Also, no HR was elicited in response to the infiltration, pointing to a positive regulatory role of t18:0 in this plant defense response. This work shows, for the first time, that SPL, namely t18:0, were regulated in response to bacterial pathogens. The t18:0 kinetics showed a strong correlation with the course of the pathogen‐elicited HR. There was also evidence, that virulent Pst influences the plants own biosynthetic and regulatory mechanisms to inhibit the SPL mediated defense response. This was also the case with another tested Pseudomonas syringae strain. In this work, free long chain bases showed characteristics typical for signaling molecules: low basal levels, a fast and transient increase in response to pathogens and a tight regulation. Hence, SPL may represent members of signaling pathways in plant‐pathogen interactions in addition to or besides PAMP‐triggered and hormonal mediated signaling pathways. Infiltration of Pst into leaves of the A. thaliana hydroxylase mutant sbh1-1 led to transiently increased d18:0 levels in leaves. In this mutant, one of the two functional sphingobase hydroxylases of A. thaliana is impaired. As the total pool of t18:0 was not significantly reduced in the mutant after total hydrolysis, we argue that the pathogen‐dependent transient increase of t18:0 was due to de novo synthesis from d18:0 and not to the action of specific lipases. Furthermore SBH1 was responsible for the fast increase of t18:0 levels. In addition to t18:0, also other free long chain bases, e.g. d18:0, elicited plant reactions and cell death, whereas other long chain bases (d20:0 and d20:1) or ceramides elicited no response. Apparently, the specific lipid structure plays a major role for the efficiency in different signaling pathways.
KW  - Sphingolipide
KW  - Ackerschmalwand
KW  - Pseudomonas syringae tomato
KW  - Abwehrreaktion
KW  - Pathogeninteraktion
KW  - Sphingolipidstoffwechsel
KW  - Pseudomonas syringae
KW  - Schmalwand <Arabidopsis>
KW  - Sphingolipids
KW  - Pathogens
KW  - Pseudomonas
KW  - HPLC-MS
KW  - Arabidopsis
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55034
ER  - 
TY  - THES
A1  - Fink, Julian
T1  - Synthese von molekularen Werkzeugen zur Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse
T1  - Synthesis of molecular tools to visualize and study sphingolipid metabolism and other biological processes
N2  - Die Zelle stellt die kleinste Einheit des Lebens dar und zeichnet sich durch die hoch koordinierte Anordnung von mehreren Millionen (Bio-)Molekülen zu einem mikrometergroßen Objekt aus. Als struktureller Bestandteil der Lipiddoppelschicht eukaryotischer Zellen spielt neben Sterolen und Glycerolipiden die Verbindungsklasse der Sphingolipide eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Membranintegrität.[472] Darüber hinaus sind bioaktive Sphingolipide bei vielen grundlegenden zellulären Prozessen wie Apoptose, Wachstum, Differenzierung, Migration und Adhäsion entscheidend beteiligt.[87,120] Ein gestörtes Gleichgewicht des Sphingolipidmetabolismus und Defekte der entsprechenden Stoffwechselwege stehen im Zusammenhang mit vielen Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Adipositas, Arteriosklerose, chronischen Entzündungen und Autoimmunerkrankungen sowie viraler und bakterieller Pathogenese.[22,143,473,474] 
Die Entwicklung und Anwendung von Sphingolipidanaloga als potenzielle Wirkstoffe rückten in den letzten Jahren immer weiter in den Fokus der interdisziplinären Forschung von Biologen, Chemikern und Medizinern. Als bekanntestes Beispiel ist Fingolimod (FTY720) zu nennen, das als Sphingosin-1-phosphat-Mimetikum heute unter dem Markennamen Gilenya® erfolgreich als Arzneistoff zur Behandlung von Multipler Sklerose eingesetzt wird.[475] Es besteht jedoch die Gefahr, dass Fingolimod zur Schädigung anderer Zellfunktionen und zu gravierenden Nebeneffekten wie Bradykardie führen kann.[476] Da Sphingolipide ebenfalls in der Kontrolle von bakteriellen und viralen Infektionen essentiell beteiligt sind, spielen Sphingolipide und deren synthetisch dargestellte Derivate vermehrt eine Rolle in der Wirkstoffentwicklung im Kampf gegen pathogene Krankheitserreger.[175,477-479] Die Wirkweise von antimikrobiellen Sphingolipiden ist bisher nicht vollständig aufgeklärt. Für eine Weiterentwicklung von bekannten Medikamenten gegen verschiedene Krankheiten oder für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen Erreger ist eine umfassende Untersuchung der zugrundeliegenden zellulären Mechanismen auf molekularer Ebene entscheidend. 
Hierfür finden aufgrund der relativ einfachen Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie häufig fluoreszenzmarkierte Sphingolipidderivate breite Anwendung.[480] Die kovalent gebundene Farbstoffeinheit bringt jedoch wesentliche Nachteile mit sich, da sich die Biomoleküle durch die veränderte Struktur und Polarität in ihren biologischen Eigenschaften von den natürlichen Substraten unterscheiden können. Die Verwendung von bioorthogonal funktionalisierten Biomolekülen umgeht dieses Problem, da die strukturellen Änderungen minimal gehalten werden.  
Nach dem zellulären Einbau dieser Derivate ist eine schnelle und spezifische Konjugation mit einem komplementären Fluorophor zu einem gewünschten Zeitpunkt durch sogenannte Click-Reaktionen wie CuAAC oder SPAAC möglich.[12,46] Das Prinzip der Click-Chemie wurde bereits auf eine Vielzahl an Biomolekülen wie Sphingolipide, Fettsäuren, Aminosäuren, Proteine, Kohlenhydrate, Nukleoside oder Nukleinsäuren (DNA und RNA) übertragen.[47,280] Jedoch bedarf es weiterer spezifisch modifizierter Verbindungen, die vielfältige bioorthogonale Reaktionen für die Untersuchung von Zellprozessen zulassen ‒ sowohl in vitro als auch in vivo.
Um neue Therapieansätze gegen verschiedene Krankheiten zu entwickeln und schwerwiegende Nebenwirkungen zu vermeiden, ist die detaillierte Erforschung hochkomplexer Zellvorgänge auf molekularer Ebene von entscheidender Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Synthese und Charakterisierung von molekularen Werkzeugen, die in Kombination mit verschiedenen aktuellen Mikroskopie- und Massenspektrometriemethoden die Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse ermöglichen.
Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine Vielzahl an Sphingolipiden und deren bioorthogonal funktionalisierte Analoga ausgehend von der Aminosäure L-Serin erfolgreich synthetisiert. Die vorgestellten Verbindungen eignen sich in Kombination mit Massenspektrometrie und Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie als molekulare Werkzeuge zur Untersuchung des komplexen Sphingolipidmetabolismus sowie des Einbaus und der Dynamik von Sphingolipiden in Modell- und Zellmembranen. Sowohl in humanen und tierischen Zellen als auch in Bakterien wurden die azidmodifizierten Sphingolipide durch Click-Reaktionen visualisiert, um ein verbessertes Verständnis von bakteriellen und viralen Infektionsprozessen zu erhalten. Der modulare Ansatz der Click-Chemie ermöglicht die Verwendung verschiedener komplementär funktionalisierter Farbstoffe, die unterschiedliche Eigenschaften bezüglich der Membrandurchgängigkeit oder Absorptions- und Emissionswellenlängen besitzen und somit je nach biologischer Fragestellung gezielt eingesetzt werden können.
Alles in allem tragen die in dieser Arbeit synthetisierten Verbindungen dazu bei, die Rolle von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und Krankheitsverläufen auf subzellulärer Ebene aufzuklären. Dadurch wird ein entscheidender Beitrag für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen bakterielle oder virale Erreger sowie innovativer Therapien gegen verschiedene humane Krankheiten geliefert.
N2  - The cell represents the smallest unit of life and is characterized by the highly coordinated arrangement of several million (bio)molecules to form a micrometer-sized object. As a structural component of the lipid bilayer of eukaryotic cells, in addition to sterols and glycerophospholipids, the compound class of sphingolipids plays a central role in maintaining membrane integrity.[472]  In addition, bioactive sphingolipids are critically involved in many basic cellular processes such as apoptosis, growth, differentiation, migration and adhesion.[87,120] A disturbed balance of the sphingolipid metabolism and defects in the corresponding metabolic pathways are associated with many diseases such as cancer, diabetes, obesity, arteriosclerosis, chronic inflammation and autoimmune diseases as well as viral and bacterial pathogenesis.[22,143,473,474]
The development and application of sphingolipid analogues as potential active ingredients have moved more and more into the focus of interdisciplinary research by biologists, chemists and medical professionals in recent years. The best-known example is fingolimod (FTY720), which is now successfully used as a sphingosine-1-phosphate mimetic under the brand name Gilenya® as a drug for the treatment of multiple sclerosis.[475] However, there is a risk that fingolimod can damage other cell functions and lead to serious side effects such as bradycardia.[476] Since sphingolipids are also essential for the control of bacterial and viral infections, sphingolipids and their synthetically produced derivatives are playing an increasing a role in the development of active ingredients in the fight against pathogenic germs.[175,477-479] The mode of action of antimicrobial sphingolipids has not yet been fully elucidated. A comprehensive investigation of the underlying cellular mechanisms at the molecular level is crucial for further development of known drugs against various diseases or for the development of novel active substances against pathogens. 
Due to the relatively easy detection by fluorescence microscopy, fluorescence-labeled sphingolipid derivatives are widely used for this purpose.[480] However, the covalently bonded dye unit has significant disadvantages since the biological properties of the biomolecules can differ from the natural substrates concerning structure and polarity changes. The usage of bioorthogonally functionalized biomolecules avoids this problem because the structural changes are kept to a minimum. After the cellular incorporation of these derivatives, rapid and specific conjugation with a complementary fluorophore at a desired point of time is possible by so-called click reactions such as CuAAC or SPAAC.[12,46] 
The concept of click chemistry has already been applied to a large number of biomolecules such as sphingolipids, fatty acids, amino acids, proteins, carbohydrates, nucleosides or nucleic acids (DNA and RNA).[47,280] However, further specifically modified compounds are required, allowing diverse bioorthogonal reactions for the investigation of cell processes – both in vitro and in vivo.
In order to develop new therapeutic approaches against numerous diseases and to avoid serious side effects, detailed research into highly complex cell processes at the molecular level is of crucial importance. Therefore, the aim of this work was the synthesis and characterization of molecular tools which, in combination with several current microscopy and mass spectrometry methods, enable the visualization and investigation of the sphingolipid metabolism and other biological processes. 
In summary, a variety of sphingolipids and their bioorthogonally functionalized analogues were successfully synthesized in this work starting from the amino acid L-serine. In combination with mass spectrometry and fluorescence or electron microscopy, the presented compounds are suitable as molecular tools for the investigation of the complex sphingolipid metabolism as well as the incorporation and dynamics of sphingolipids in model and cell membranes. The azide-modified sphingolipids were visualized by click reactions in human and animal cells as well as in bacteria to gain a better understanding of bacterial and viral infection processes. The modular approach of click chemistry enables the use of different complementarily functionalized dyes that have different properties in terms of membrane permeability or absorption and emission wavelengths and can therefore be used in a targeted manner depending on the biological issue.
All in all, the compounds synthesized in this work help to elucidate the role of sphingolipids in infection processes and disease progression at subcellular level. This makes a decisive contribution to the development of novel active substances against bacterial or viral pathogens as well as of innovative therapies against various human diseases.
KW  - Chemische Synthese
KW  - Sphingolipide
KW  - Click-Chemie
KW  - Organische Synthese
KW  - Sphingolipidderivate
KW  - bioorthogonale Markierung
KW  - Wirkstoffentwicklung
KW  - Infektionsprozesse
KW  - Sphingolipidanaloga
KW  - Sphingolipidstoffwechsel
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286992
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kaiser, Lena Franziska
T1  - Wirkmechanismus von Sphingolipiden und Sphingosin gegen mikrobielle Erreger
T1  - Mechanism of the bactericidal effect of sphingolipids and sphingosine against microbial pathogens
N2  - Die zunehmende Antibiotikaresistenz vieler Krankheitserreger ist ein weltweites Problem, welches zu einem klinischen Bedarf an neuen antimikrobiellen Substanzen führt. Sphingolipide einschließlich Ceramide stellen eine vielfältige Gruppe strukturverwandter Lipide dar und bestehen aus einem Sphingosin-Grundgerüst, welches mit einer Fettsäure verbunden ist. Sowohl das Sphingosin-Grundgerüst allein als auch Sphingolipide zeigen eine antibakterielle Wirkung gegenüber einer Vielzahl pathogener Mikroorganismen. Die Intensität der Hemmung hängt von der Sphingolipidstruktur und dem Mikroorganismus ab. Neuere Studien konnten zeigen, dass Sphingosin, Ceramide und Ceramid-Analoga in N. meningitidis aufgenommen werden und eine bakteriostatische oder bakterizide Wirkung zeigen. Jedoch ist die antibakterielle Wirkungsweise noch nicht genau bekannt. Um mehr über den Wirkmechanismus zu erfahren haben wir die ultrastrukturellen Veränderungen von N. meningitidis nach Inkubation mit azido-funktionalisierten Sphingolipiden mit elektronenmikroskopischen Verfahren (transmissionselektronenmikroskopische und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen) untersucht. Mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) konnten wir die azido-funktionalisierten Sphingolipide nach Aufnahme in N. meningitidis lokalisieren. Zum Anfärben der funktionalisierten Sphingolipide wurde die kupferfreie Azid-Alkin-Cyccloaddition verwendet.
N2  - The increasing antibiotic resistance of many pathogens is a worldwide problem that leads to a clinical need of new anti-microbial compounds. Sphingolipids, including ceramides, represent a diverse group of structurally related lipids and are composed of a sphingosine backbone coupled to a fatty acid. Solely the sphingosine backbone as well as the sphingolipids show antibacterial activity against a wide range of pathogenic microorganisms. The rate of inhibition depends on the sphingolipid structure and the microbial strain. Recent studies revealed the uptake of sphingosine, ceramides and ceramide analogues by N. meningitidis and a bacteriostatic or bactericidal effect. However, the mechanism of the bactericidal effect is still unknown. To elucidate the antibacterial mechanism, we studied the ultrastructural changes after incubation of N. meningitidis with azido-modified sphingolipids by using electron microscopy techniques (transmission electron microscopy (TEM) and scanning electron microscopy (SEM). Due to correlative light-electron microscopy (CLEM) we were able to localize the azido-modified sphingolipids after incorporation in N. meningitidis. Copper-free azide-alkyne cycloaddition was used to stain the azido-modified sphingolipids.
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - Sphingolipide
KW  - Sphingosin
KW  - Antimikrobieller Wirkstoff
KW  - Mikroskopie
KW  - sphingolipids
Y1  - 2020
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-218970
ER  -