TY - THES A1 - Schreiner, Jochen Josef T1 - Etablierung und Charakterisierung einer humanen adrenokortikalen Zelllinie T1 - Establishment and characterization of a human adrenocortical cel line N2 - Background: The response of advanced adrenocortical carcinoma (ACC) to current chemotherapies is unsatisfactory and a limited rate of response to immunotherapy was observed in clinical trials. High tumour mutational burden (TMB) and the presence of a specific DNA signature are characteristic features of tumours with mutations in the gene MUTYH encoding the mutY DNA glycosylase. Both have been shown to potentially predict the response to immunotherapy. High TMB in an ACC cell line model has not been reported yet. Design and methods: The JIL-2266 cell line was established from a primary ACC tumour, comprehensively characterised and oxidative damage, caused by a dysfunctional mutY DNA glycosylase, confirmed. Results: Here, we characterise the novel patient-derived ACC cell line JIL-2266, which is deficient in mutY-dependent DNA repair. JIL-2266 cells have a consistent STR marker profile that confirmed congruousness with primary ACC tumour. Cells proliferate with a doubling time of 41 ± 13 h. Immunohistochemistry revealed positivity for steroidogenic factor-1. Mass spectrometry did not demonstrate significant steroid hormone synthesis. JIL-2266 have hemizygous mutations in the tumour suppressor gene TP53 (c.859G>T:p.E287X) and MUTYH (c.316C>T:p.R106W). Exome sequencing showed 683 single nucleotide variants and 4 insertions/deletions. We found increased oxidative DNA damage in the cell line and the corresponding primary tumour caused by impaired mutY DNA glycosylase function and accumulation of 8-oxoguanine. Conclusion: This model will be valuable as a pre-clinical ACC cell model with high TMB and a tool to study oxidative DNA damage in the adrenal gland. N2 - Hintergrund: Das Therapieansprechen von fortgeschrittenen Nebennierenrindenkarzinomen (ACC) unter den aktuellen Chemotherapieregimen ist nicht zufriedenstellend.Ebenfalls zeigte sich in klinischen Studien nur ein limitiertes Ansprechen auf Immuntherapien. Eine hohe Mutationslast (TMB) und das Vorhandensein einer spezifischen DNA Signatur sind charakteristisch für Tumore mit Mutationen in dem Gen MUTYH, welches die mutY-DNA-Glykosilase kodiert. Es wurde gezeigt, dass dies potentiell ein Ansprechen auf eine Immontherapie vorhersagen kann. Eine hohe Mutationslast in ein ACC Zellline konnte bis jetzt noch nicht gezeigt werden. Methoden: Die JIL--2266 Zelllinie wurde etabliert aus einem primären ACC-Tumor. Diese wurde umfänglich charakterisiert und oxidativer Schaden, welcher durch eine dysfunktionelle mutY DNA Glykosilase verursacht wird, konnte gezeigt werden. Ergebnis: Wir charakterisierten eine neue ACC Zelllinie JIL-2266, welche eine Defizienz in dem mutY DNA-Reperaturmechanismus aufweist. Die JIL-2266 Zellen weisen ein mit dem Primärtumor kongruentes STR-Profil auf. Die Zellen proliferieren mit einer Verdopplungszeit von 41 bis 13h. Die immunhisochemische Färbung zeigte eine Positivität für SF-1. In der Massenspektrometrie fand sich keine signifikante Steroidproduktion. Die JIL-2266 haben eine hemizygote Mutation in dem Tumorsuppressorgen TP53 und MUTYH. Exomsequenzierung zeigte 683 SNVs. Wir fanden erhöhten oxidativen DNA Schaden in der Zelllinie und im Primärtumor, verursacht durch eine gestörte mutY Glykosilase Funktion und eine Anhäufung von 8-Oxoguanin. Zusammenfassung: Dieses Zellinie ist ein wertvolles ACC Modell mit einer hohen Mutationslast und ein Werkzeug um oxidativen DNA Schaden in der Nebenniere zu untersuchen. KW - Nebennierenrindenkarzinom KW - Zellkultur KW - Zelllinie KW - ACC KW - MUTYH1 Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-312119 ER - TY - THES A1 - Sautter, Kerstin T1 - Gentechnische Verfahren zur Erzeugung und Selektion von hochproduzierenden CHO-Zellen T1 - Genetic strategies for the creation and selection of high producing CHO-cells N2 - Säugerzellen sind die bevorzugten Wirtszellen zur Produktion komplexer biopharmazeutischer Proteine, da die post-translational durchgeführten Modifikationen sowohl in funktionaler als auch in pharmakokinetischer Hinsicht humankompatibel sind. Ein großes Problem bei der Etablierung von Zelllinien mit hoher Expression des gewünschten Proteins ergibt sich aus der willkürlichen und ungerichteten Integration des rekombinanten Vektors in transkriptionsaktive oder -inaktive Loki des Wirtszellgenoms. Dadurch erhält man eine Population von Zellen, die völlig unterschiedliche Expressionsraten des heterologen Gens aufweist, wobei die Produktivität der Zellen in der Regel einer Normalverteilung folgt. Zur Identifizierung von Zellklonen, die eine sehr hohe Expression des heterologen Produktgens aufweisen, muss deshalb eine Vielzahl von Klonen überprüft und getestet werden, resultierend in einem hohen Zeit-, Arbeits- und Kostenaufwand. Optimierungen des zur Transfektion eingesetzten Vektorsystems zielen deshalb darauf ab, durch geeignete Selektionsstrategien den Anteil von Hochproduzenten in der transfizierten Zellpopulation zu erhöhen und somit den Aufwand in der Klonidentifizierung zu reduzieren. Die Entwicklung eines derartigen Expressionssystemes ist Gegenstand der vorliegenden Arbeit. Zwei alternative Strategien, die beide auf der Beeinträchtigung des Selektionsmarkers basieren wurden untersucht. Die Beeinträchtigung des Selektionsmarkers sollte bewirken, dass Klone mit einer Integration in transkriptionsinaktiven Genloki die Selektion nicht überstehen und absterben, während Klone mit einer Integration in transkriptionsaktiven Genloki die Beeinträchtigung des Selektionsmarkers durch eine erhöhte Expression kompensieren können. Diese Klone sollten überleben und gleichzeitig eine hohe Produktexpression aufweisen. Eine der Strategien beruhte auf der Beeinträchtigung der Enzymfunktion des Selektionsmarkers, indem Mutationen in das Leseraster des Enzyms eingeführt wurden. Diese Arbeit zeigt, dass die Verwendung von mutierten Neomycin Phosphotransferase-Varianten als Selektionsmarker in CHO-DG44-Zellen für die Anreicherung von Hochproduzenten geeignet ist. Eine weitere Möglichkeit, die Expressionsrate eines stabil integrierten Produktgens zu erhöhen, ist der Einsatz von cis- und transwirkenden genetischen Elementen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Sequenz aus dem Genom von CHO-Zellen auf mögliche expressionssteigernde Wirkung hin untersucht (Transcription Enhancing TE-Element). Es konnte gezeigt werden, dass dieses TE-Element die Expression eines rekombinanten Antikörpers in stabil transfizierten CHO-DG44-Zellpools verdoppelt. N2 - Mammalian cells are the preferred host fort he production of most complex protein therapeutics, as functionally and pharmacokinetically relevant post-translational modifications are highly human-compatible. A major problem when establishing cell lines with high expression rates of the protein of interest results from the random integration of the recombinant vector in transcription-active and –inactive loci of the host cell genome. As a consequence, a population of cells is obtained, which shows completely diverse expression rates of the heterologous gene, while in general, the productivity of the cells follows a normal distribution. Therefore, a multitude of clones has to be investigated in order to identify cells clones with high expression of the heterologous gene of interest, requiring a lot of time, capacitites and being costly. Thus, optimisations of the vector system used for transfection aim on appropriate selection strategies to elevate the proportion of high producers in the transfected cell population and consequently reduce the effort in clone identification. The development of such an expression system is the subject of this thesis. Two alternative strategies, both based on the impairment of the selection marker, were investigated. The reduced activity of the selection marker should result in the death of clones with a silent site integration. At the same time, clones with an active site integration can compensate the impairment of the selection marker by a higher expression. These clones should survive and simultaneously show a higher product expression. One of the strategies was based on the impairment of the selection marker’s enzyme function by introducing mutations into the enzyme’s open reading frame. This thesis shows that the use of mutated neomycin phosophotransferase-variants as selection marker in CHO-DG44 cells is suitable for the accumulation of high producers. Another possibility to raise the expression rate of a stably integrated product gene is the use of cis- and trans-acting genetic elements. In this thesis, a sequence from the CHO genome was investigated with regard to a possible expression augmenting effect. It has been demonstrated that this element doubled the expression of a recombinant antibody in stably transfected CHO-DG44 cell pools. KW - Säugetiere KW - Heterologe Genexpression KW - Zelllinie KW - Entwicklung KW - CHO-Zellen KW - Expressionssysteme KW - Biopharmazeutika KW - CHO cells KW - expression systems KW - biopharmaceuticals Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8719 ER - TY - THES A1 - Horn, Daniela T1 - Kardiotoxizität von CTRPs und das Vorkommen der CTRP-Rezeptoren in Kardiomyozyten T1 - Cardiotoxicity of CTRPs and the presence of CTRP receptors in cardiomyocytes N2 - Die C1q/tumor necrosis factor-related proteins (CTRPs) sind eine Ligandenfamilie aus sezernierten Plasmaproteinen, welche sich in ihrem Grundbauplan ähneln. Daten aus der Literatur deuten darauf hin, dass sie zum Teil positive Effekte auf den Stoffwechsel und das Herz-Kreislaufsystem besitzen und somit eine mögliche therapeutische Zielstruktur darstellen. Während für manche CTRPs bereits Rezeptoren identifiziert werden konnten, ist für andere immer noch nicht geklärt, an welche Rezeptoren sie binden oder über welche sie diese Wirkungen erzielen. Um die CTRPs zukünftig therapeutisch nutzen zu können, muss die Wirkung der CTRPs auf verschiedene Zellen weiter analysiert werden. Dafür wurden in dieser Arbeit Zellen, auf die Expression bereits bekannter CTRP-Rezeptoren hin, untersucht. Des Weiteren wurden die durch CTRP2, CTRP3, CTRP4, CTRP9A, CTRP10, CTRP11, CTRP13 und CTRP14 induzierten Änderungen in der ATP- und Laktatproduktion als Surrogatparameter für Kardiotoxizität in den Kardiomyozytenzelllinien H9c2 und AC16 getestet, um potenziell kardiotoxische Wirkungen frühzeitig erkennen zu können. Es konnte gezeigt werden, dass die CTRPs sicher für Kardiomyozyten zu sein scheinen, was eine wichtige Grundlage für die therapeutische Nutzbarkeit darstellt. N2 - C1q/tumor necrosis factor-related proteins (CTRPs) are a ligand family of secreted plasma proteins that are similar in their basic structure. Literature on the subject indicate that some of them have positive effects on the metabolism and the cardiovascular system and therefore represent a potential therapeutic target structure. While some receptors have already been identified for some CTRPs, for others it is still not clear which receptors they bind to or through which they achieve these effects. In order to be able to use the CTRPs therapeutically in the future, the effect of the CTRPs on different cells must be further analyzed. For that cells were examined in this study for the expression of already known CTRP receptors. Furthermore, CTRP2, CTRP3, CTRP4, CTRP9A, CTRP10, CTRP11, CTRP13 and CTRP14 were tested in the cardiomyocyte cell lines H9c2 and AC16 with respect to their effect on production of ATP and lactate as surrogate parameters for cardiotoxicity in order to be able to recognize potentially cardiotoxic effects at an early stage. It was shown that the CTRPs appear to be safe for cardiomyocytes, which is an important basis for therapeutic utility. KW - Herzmuskelzelle KW - Zelllinie KW - CTRP KW - C1q/tumor necrosis factor-related proteins KW - Kardiomyozyten Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-349029 ER -