TY - THES A1 - Colnot, Thomas T1 - Beurteilung von Phyto- und Xenoöstrogenen am Beispiel ausgewählter Substanzen T1 - Assessment of Phyto- and Xenoestrogens for Selected Substances N2 - Bei Daidzein und Bisphenol A handelt es sich um zwei Vertreter einer Klasse von Stoffen, die als „Umwelthormone“ (engl. endocrine disrupter) bezeichnet werden. Aus der Gruppe der Phytoöstrogene wurde Daidzein als wichtiger Vertreter, der in hohen Konzentrationen in vielen Nutzpflanzen und Nahrungsmitteln vorkommt, ausgewählt. Sojaprodukte, die den größten Beitrag einer menschlichen Exposition gegen Daidzein liefern, werden in zunehmendem Maße auch in westlichen Ländern konsumiert. Bisphenol A wurde als Vertreter der Xenoöstrogene gewählt, da es - was Weltjahresproduktion und Verwendung angeht - die wohl wichtigste Substanz dieser Gruppe darstellt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Biotransformation und Toxikokinetik der beiden Verbindungen nach oraler Gabe in der Ratte aufgeklärt. Dabei konnte gezeigt werden, daß die orale Bioverfügbarkeit beider Substanzen in der Ratte sehr gering war. Maximal zehn Prozent der jeweils applizierten Dosis konnten im Urin der Tiere wiedergefunden werden. Als Hauptmetabolit wurden sowohl von Daidzein als auch von Bisphenol A das jeweilige Glucuronid-Konjugat gebildet. Bei Daidzein überwog in der männlichen Ratte zusätzlich das Sulfat-Konjugat. Der Anteil an freier, d.h. unkonjugierter Verbindung betrug im Urin der Tiere zwischen 1 und 3 Prozent der Dosis. Außer den Phase II-Konjugaten, die aufgrund ihrer mangelnden östrogenen Wirksamkeit zu einer Detoxifizierung der beiden Verbindungen führte, konnten nach Gabe von Bisphenol A in der Ratte keine weiteren Metabolite identifiziert werden. Nach Exposition mit Daidzein konnten in den Faeces der Tiere in geringem Umfang die beiden reduktiven Metabolite Equol und O-DMA gefunden werden. Diese wurden wahrscheinlich im Magen-Darm-Trakt durch die Bakterien der Darmflora gebildet. Sowohl Daidzein als auch Bisphenol A wurden bei der Ratte nur unvollständig aus dem Magen-Darm-Trakt resorbiert; der Großteil der gegebenen Dosis wurde als unveränderte Substanz in den Faeces wiedergefunden. Bei Bisphenol A wurde die Ausscheidung zudem durch einen ausgeprägten enterohepatischen Kreislauf verzögert. Im zweiten Teil der Arbeit wurden zunächst empfindliche GC/MS- und HPLC-Methoden zur Quantifizierung der Verbindungen in humanen Plasma- und Urinproben entwickelt. Danach wurden freiwillige Probanden oral mit jeweils 5 mg Daidzein bzw. d16-Bisphenol A exponiert, um Daten zur Biotransformation und Toxikokinetik der beiden Substanzen im Mensch zu erhalten. Wegen des deutlich meßbaren Hintergrundes an Bisphenol A, das in allen Kontrollproben nachweisbar war, wurde für die Humanstudie die deuterierte Verbindung gegeben, für die kein störender Hintergrund meßbar war. Die Bioverfügbarkeit der Gesamt-Substanz (freie Verbindung + Konjugate) im Menschen war in beiden Fällen deutlich höher als in der Ratte. Von Daidzein wurden 40 Prozent (Ratte 10 Prozent), von Bisphenol A > 95 Prozent (Ratte 13 Prozent) der applizierten Dosis im Urin der Probanden wiedergefunden. Dabei zeigte sich ein sehr effizienter Phase II-Metabolismus; weniger als 1 Prozent der Glucuronid-Konjugatkonzentrationen wurden als unveränderte Substanz gefunden. Das Glucuronid stellte in beiden Fällen den einzigen nachweisbaren Metaboliten dar. Die Elimination von Daidzein und Bisphenol A verlief in den beiden Studien sehr schnell nach einer Kinetik erster Ordnung. Im Gegensatz zu der Ratte konnten auch bei Bisphenol A keine Auffälligkeiten in den Ausscheidungskurven beobachtet werden, Hinweise auf einen enterohepatischen Kreislauf im Menschen wurden nicht gefunden. Im Falle von Bisphenol A wurde fast die komplette applizierte Dosis (> 95 Prozent) in Form des Glucuronides im Urin wiedergefunden. Anhand der erhobenen Daten wurde anschließend eine Beurteilung des Risikos für den Menschen abgegeben. N2 - Daidzein and bisphenol a are two representatives of a class of substances known as endocrine disrupters. A common mark of these compounds is their affinity to at least one of two estrogen receptors in vitro. This leads to speculation on how such compounds may interfere with hormonal regulation in animals and humans. As an important representative of the group of phytoestrogens daidzein has been chosen. Daidzein occurs in high concentrations in plants like soy, thus contributing to a human exposure via food. Bisphenol a has been chosen for this thesis because it probably is the most important industrial chemical suspected of endocrine activity, considering worldwide annual production numbers. Biotransformation and kinetics of the two model substances, daidzein and bisphenol a, have been elucidated. The results showed that oral bioavailability of the two chemicals has been very low. Less than ten percent of the dose given could be recovered from urine of animals. The major metabolite in biotransformation of both daidzein and bisphenol a proved to be the glucuronide of the respective compound. Additionally, after application of daidzein to rats, daidzein sulfate could be identified specifically in male animals only. The percentage of unconjugated parent compound in both studies has been shown to be between one and three percent of the dose given. No further metabolites could be found after oral administration of bpa to rats; after oral administration of daidzein to rats, equol and o-dma could be identified as minor metabolites in feces of animals. In both studies, the major part of the administered dose could be recovered as unchanged parent compound from feces. In the case of BPA, elimination was slowed by the occurence of enterohepatic circulation. This explains why the elimination of BPA and its conjugates was slow and did not follow a first-order kinetics. Furthermore, sensitive analytical methods (HPLC and GC/MS) were developed to allow quantification of low amounts of the two model compounds in human plasma und urine samples. To obtain information on the biotransformation and toxicokinetics in humans, volunteers were given 5 mg of either daidzein or d16-bisphenol a. Because of a rather high background for bisphenol a in control samples, deuterated bisphenol a had been chosen for the human study. Bioavailability of total substance (i.e. unconjugated + conjugated compound) in humans was markedly higher than in rats. After controlled exposure to daidzein 40 per cent (as compared to 10 per cent in rats) could be recovered from urine, in the case of d16-bpa more than 95 per cent (as compared to 13 per cent in rats) could be recovered. Less than 1 per cent of the concentration of the conjugated compound could be found as unchanged parent compound. In both cases, the glucuronide has been identified as sole metabolite in human volunteers. Elimination of both substances was quick and followed a first order kinetics. In the case of d16-bisphenol a, all of the given dose could be recovered from urine. With the data gathered, an assessment of the risk posed by these chemicals to humans was given. KW - Phytoöstrogen KW - Bisphenol A KW - Biotransformation KW - Toxikologie KW - Biotransformation KW - Toxikokinetik KW - Phytoöstrogene KW - Xenoöstrogene KW - Daidzein KW - Bisphenol A KW - Metabolismus KW - biotransformation KW - toxicokinetics KW - phytoestrogens KW - xenoestrogens KW - daidzein KW - bisphenol A KW - metabolism Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180438 ER - TY - THES A1 - Labib, Samira T1 - Ex-vivo-Studien zum intestinalen Metabolismus von Flavonoiden N2 - Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, ein Modell zu etablieren, mit dessen Hilfe Interaktionen zwischen Flavonoiden und Dickdarmbakterien schnell und zuverlaessig erfasst werden koennen, ohne hierzu aufwendige Humanstudien einzusetzen. Zu diesem Zweck wurde Schweine-Caecum eingesetzt; Mensch und Schwein weisen eine grosse Aehnlichkeit hinsichtlich der Anatomie und Physiologie des Gastrointestinaltraktes auf. In einer speziell entwickelten Anaerobenkammer erfolgte unter anoxischen Bedingungen die Inkubation von Modellverbindungen wie Quercetin (3,5,7,3',4'-Pentahydroxyflavon), ein hinsichtlich seiner Metabolisierung schon ausfuehrlich untersuchtes Flavonol, Chrysin (5,7-Dihydroxyflavon), Naringenin (5,7,4'-Trihydroxyflavanon) und Hesperetin (5,7,3'-Trihydroxy-4'-methoxyflavanon) mit dem Caecum-Inhalt. Die Identifizierung und Strukturaufklaerung der im Zeitraum von 24 h gebildeten Metabolite erfolgte mittels Hochleistungs-fluessigchromatographie-Diodenarray-Detektion (HPLC-DAD), HPLC-Elektrospray-Ionisierung-Tandemmassenspekrometrie (ESI-MS/MS) und Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS). Unter den gewaehlten experimentellen Bedingungen wandelte die Schweine-Caecum-Mikroflora Quercetin in Phloroglucin, 3,4-Dihydroxyphenylessigsaeure und 3,4-Dihydroxytoluol um. Das Flavon Chrysin wurde hingegen nicht abgebaut. Naringenin wurde zu 3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsaeure und 3-Phenylpropionsaeure metabolisiert; aus Hesperetin entstanden via Eriodictyol Phloroglucin und 3-(3-Hydroxyphenyl)-propionsaeure. Der mittels HPLC-DAD-Analytik untersuchte zeitliche Verlauf des mikrobiellen Abbaus von Quercetin, Naringenin und Hesperetin zeigte einen langsamen Abbau von Naringenin im Gegensatz zur schnellen Metabolisierung von Quercetin und Hesperetin. Die erhaltenen Resultate stimmten mit Literaturergebnissen sehr gut ueberein und belegten somit die Anwendbarkeit von Schweine-Caecum als geeignetes ex-vivo-Modell zur Untersuchung des intestinalen Metabolismus von Flavonoiden. Mit dem entwickelten Modell wurde in weiteren Studien die Biotransformation ausgewaehlter Flavonoide im Dickdarm simuliert. Neben Ringspaltungen, Hydrolyse, Demethylierungs- und Dehydroxylierungsreaktionen entstanden bevorzugt aromatische Carbonsaeuren. So wurde beispielhaft das erstmals auf seine intestinale Metabolisierung untersuchte Hispidulin (5,7,4'-Trihydroxy-6-methoxyflavon) – ein hoch wirksamer Benzodiazepinrezeptor-Ligand – durch die Schweine-Caecum-Mikroflora rasch zu Scutellarein O-demethyliert, welches dann langsam zu 3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsaeure weiter abgebaut wurde. Anhand der beobachteten Abbaukinetik ergab sich der Hinweis, dass Flavonoide in Abhaengigkeit von ihrem jeweiligen Substitutionsmuster unterschiedlich schnell von den Darmbakterien umgesetzt werden. Da auch Ausmass und Geschwindigkeit des Abbaus von Flavonoiden deren Bioverfuegbarkeit beeinflussen, war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit zu ueberpruefen, inwieweit ein Zusammenhang zwischen Hydroxylierungsgrad des B-Ringes von Flavonoiden und deren mikrobiellen Abbaurate besteht. Hierzu wurden Flavonole, d.h. Galangin (3,5,7-Trihydroxyflavon), Kaempferol (3,5,7,4'-Tetrahydroxyflavon) und erneut Quercetin sowie Flavone, d.h. Chrysin, Apigenin (5,7,4'-Trihydroxyflavon) und Luteolin (5,7,3',4'-Tetrahydroxyflavon), die sich jeweils lediglich im Hydroxylierungsgrad des B-Ringes unterscheiden, ausgewaehlt und als Substrate (in jeweils gleicher Konzentration) fuer die Umsetzung durch Schweine-Caecum-Mikroflora gleicher Donoren eingesetzt. Der mikrobielle Abbau wurde ueber einen Zeitraum von 24 Stunden mittels HPLC-DAD-Analysen verfolgt. Ein Vergleich der mikrobiellen Umsetzungsraten der geprueften Flavonole und Flavone liess den Schluss zu, dass unabhaengig von der Flavonoid-Unterklasse eine Hydroxylierung in Position C-4' des B-Ringes den Abbau von Flavonoiden foerdert (bei den Flavonen sogar erst ermoeglicht) und dass eine zusaetzliche Hydroxylierung des B-Ringes keinerlei Einfluss auf den Abbau hat. Die Ergebnisse dieser Studie lassen weiterhin vermuten, dass die Hydroxylierung in Position C-3 des C-Ringes eine foerdernde Rolle im Abbau von Flavonoiden durch caecale Mikroflora spielt. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten ferner Untersuchungen zur Interaktion von Flavonoiden mit alpha-Glucosidase aus Schweine-Caecum. Als potentielle Hemmstoffe kamen die Flavone Scutellarein, Baicalein und Luteolin zur Verwendung; als Substrate wurden p-Nitrophenyl-alpha-D-glucopyranosid und Saccharose eingesetzt. Fuer keines der eingesetzten Flavonoide war ein Einfluss auf die Aktivitaet der alpha-Glucosidase festzustellen. Diese Ergebnisse weisen auf strukturelle Unterschiede zwischen bakteriellen alpha-Glucosidasen und solchen aus dem Duenndarm der Saeugetiere hin, bei denen fuer u. a. Scutellarein und Baicalein hohe alpha-Glucosidase-Inhibitor-Aktivitaet beschrieben worden ist. N2 - The first objective of the present work was to establish a model that allows us to study the interactions between flavonoids and the large intestine bacteria rapidly and reliably without using complex human study. For this purpose the pig caecum was used; human and pig exihibit a large similarity regarding anatomy and physiology of the gastrointestinal tract. In a special developed anaerobic chamber model compounds such as quercetin (3,5,7,3',4'-pentahydroxyflavone), a flavonol whose metabolism has already been studied thoroughly, chrysin (5,7-dihydroxyflavone), naringenin (5,7,4'-trihydroxyflavanone) and hesperetin (5,7,3'-trihydroxy-4'-methoxyflavanone) were incubated under anoxic conditions with the caecum contents. Identification and structural elucidation of the metabolites formed within 24 h of incubation were performed by high-performance liquid chromatography- diode array detection (HPLC-DAD), HPLC-electrospray ionizationtandem mass spectrometry (ESI-MS/MS) and high-resolution gas chromatography-mass spectrometry (HRGC-MS). The pig caecal microflora converted quercetin, under the experimental conditions used, to phloroglucinol, 3,4-dihydroxyphenylacetic acid und 3,4-dihydroxytoluene. However, the flavon chrysin was not degraded. Naringenin was metabolized to 3-(4-hydroxyphenyl)-propionic acid and 3-phenylpropionic acid. Hesperetin was transformed via eriodictyol to phloroglucinol and 3-(3-hydroxyphenyl)-propionic acid. The time course of microbial conversion of quercetin, naringenin and hesperetin was determined by HPLC-DAD-analysis, revealing slow degradation of naringenin and rapid transformation of quercetin and hesperetin. The obtained results are in full agreement with literature data and demonstrate the use of pig caecum as a suitable ex vivo model for studying the intestinal metabolism of flavonoids. In further studies the developed model was used in order to simulate the biotransformation of selected flavonoids in the large intestine. Among ring fission, hydrolysis, demethylation and dehydroxylation reactions the formation of aromatic acids was preferred. For example, hispidulin (5,7,4'-trihydroxy-6-methoxyflavone) – a potent ligand of the central human benzodiazepine receptor – was rapidly O-demethylated by the caecal microflora to scutellarein. The subsequent degradation of scutellarein to 3-(4-hydroxyphenyl)-propionic acid proceeded slowly. The observed degradation kinetics indicated that the time the gut bacteria need to metabolize the flavonoids depends on the flavonoids substitution pattern. Since extent and kinetics of degradation of flavonoids also affect the bioavailability of flavonoids, a further aim of this work was to examine to what extent a correlation between the hydroxylation grad of the B-ring of flavonoids and their microbial degradation rates exist. Therefore, selected flavonols, i.e. galangin (3,5,7-trihydroxyflavone), kaempferol (3,5,7,4'-tetrahydroxyflavone) and quercetin as well as flavones, i.e. chrysin, apigenin (5,7,4'-trihydroxyflavone) and luteolin (5,7,3',4'-tetrahydroxyflavone), which differ only in their hydroxylation patterns on the B-ring were used (in same concentration, respectively) as substrates for the fermentation by caecal microflora from the same donors, and the microbial degradations were continuously, over 24 h, analyzed by HPLC-DAD. Comparison of the microbial degradation rates of the flavonols and flavones under study led to the conclusion that the presence of a hydroxy group in 4'-position at the B-ring, regardless of the flavonoid subclass, enhances the degradation of flavonoids, and an additional hydroxy group at the B-ring does not affect the degradation degree of flavonoids. In addition, it can be assumed, according to the results of this study, that the presence of a hydroxy group in 3-position at the C-ring enhances the microbial transformation of flavonoids. Furthermore the interactions of flavonoids with alpha-glucosidase from the pig caecum were investigated in the context of this work. The flavones scutellarein, baicalein and luteolin were used as potential alpha-glucosidase inhibitor in these experiments. p-Nitrophenyl-alpha-D-glucoside and sucrose served as substrates. None of the tested flavonoids showed an inhibitory activity against á-glucosidase from the pig caecum. These results indicate structural differences between bacterial alpha-glucosidase and mammalian intestinal alpha-glucosidase, as against rat intestinal alpha-glucosidase some flavonoids, for example scutellarein and baicalein, showed a potent inhibitory activity. KW - Flavonoide KW - Blinddarm KW - Schwein KW - Stoffwechsel KW - Flavonoide KW - Schweine-Caecum-Modell KW - Metabolismus KW - Hispidulin KW - flavonoids KW - pig-caecum-model KW - metabolism KW - hispidulin Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18466 ER - TY - THES A1 - Pfetzer, Nadja T1 - Identifizierung und Testung spezifischer Inhibitoren des Energiestoffwechsels von Tumorzellen T1 - Identification and testing of specific inhibitors of metabolism in tumour cells N2 - Charakteristisch für viele maligne Tumorzellen ist eine erhöhte Aufnahme von Glucose und die Bildung großer Mengen Milchsäure auch in Anwesenheit von Sauerstoff (Warburg Effekt) und eine verminderte Nutzung des Zitratzyklus. Als Grund werden Defekte in der mitochondrialen Atmungskette diskutiert. Aber auch eine durch Onkogene gesteigerte Glykolyserate, könnte ursächlich sein. Ein weiterer für Tumorzellen wichtiger Stoffwechselweg, in dem Glucose abgebaut wird, ist der Pentosephosphatweg, dessen Blockade das Wachstum der Krebszellen hemmen könnte. Zudem stellt die Manipulation derjenigen Signalwege, die in den Tumorstoffwechsel involviert und in Tumorzellen überaktiviert (Ras/PI3K/Akt/mTOR- und Raf/MEK/ERK-Signalweg) oder unterdrückt (oxidative Phosphorylierung) sind, mögliche Ansatzpunkte dar. In dieser Arbeit wurde daher in vitro die Wirkung von 15 Substanzen an drei verschiedenen Tumorzelllinien und vier verschiedenen benignen Zellen untersucht, welche in die oben genannten charakteristischen Stoffwechselwege von Tumorzellen eingreifen und gegenwärtig intensiv als mögliche Tumortherapeutika diskutiert werden. Ziel war es, geeignete Kandidaten für eine zielgerichtete Therapie zu identifizieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Beeinflussung des Glucosestoffwechsels in Tumorzellen. Da Glucose sowohl aerob als auch anaerob verstoffwechselt werden kann, wurden in einem ersten Ansatz zum einen Substanzen gestestet, die die Glykolyse auf verschiedenen Ebenen hemmen, zum anderen wurden Substanzen untersucht, die den mitochondrialen Stoffwechsel beeinflussen. Die Wirkung aller 15 Substanzen wurde zunächst jeweils als Einzelbehandlung getestet. Hierbei führten nur sehr hohe Konzentrationen in Tumorzellen zu einem drastisch verminderten ATP-Gehalt, die für benigne Zellen aber ebenfalls toxisch waren. Daher wurde in einem zweiten Schritt untersucht, ob durch die gleichzeitige Manipulation des Glucosestoffwechsels und des mitochondrialen Stoffwechsels mit jeweils subtoxischen Konzentrationen eine tumorselektive Wirkung erreicht werden kann. Bei der Kombination der Substanzen Oxythiamin/NaDCA bzw. 2-DG/Rotenon ergaben sich zwar synergistische Effekte auf die Verminderung des ATP-Gehaltes in den getesteten Tumorzellen, eine generelle tumorselektive Wirkung konnte jedoch durch die kombinierte Behandlung nicht erreicht werden. In jüngster Zeit mehren sich die Hinweise, dass die Glutaminolyse einen sehr wichtigen Stoffwechselweg für Energiegewinnung und Syntheseprozesse von Tumorzellen darstellt. Deshalb wurde in einem dritten Schritt untersucht, ob durch die Hemmung der Glutaminolyse mit der Substanz 6-Diazo-5-oxo-L-norleuzin (DON) eine tumorspezifische Wirkung erreicht werden kann. In der Tat konnte durch DON eine andeutungsweise tumorselektive Wirkung auf den ATP-Gehalt der Zellen erzielt werden, jedoch war das therapeutische Fenster sehr eng. Durch die Hemmung der oxidativen Phosphorylierung wurde in allen drei untersuchten Tumorzelllinien eine gesteigerte Milchsäureproduktion nachgewiesen. Dies ist ein eindeutiger Hinweis dafür, dass in diesen Tumorzellen die Mitochondrien keine Defekte aufweisen. Die hier untersuchten benignen und malignen Zellen wurden hinsichtlich des Glucosestoffwechsels mit verschiedenen Methoden näher charakterisiert, um zu beurteilen, ob sich die Zellen in ihrem Stoffwechselphänotyp unterscheiden. Bei der Quantifizierung der Glucoseaufnahme wurde deutlich, dass auch manche benigne Zellen deutliche Mengen an Glucose aufnehmen, welche allerdings nur der Tumorzelllinie mit der niedrigsten Aufnahme glich. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden charakteristische Proteine des Zuckerstoffwechsels dargestellt. Zudem wurde die Expression von zentralen Genen des Stoffwechsels auf mRNA- bzw. Proteinebene untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass sowohl Tumorzellen als auch manche benigne Zellen für die Glykolyse typische Proteine bzw. mRNA stark exprimieren. Fazit der Charakterisierung ist, dass es zwischen den hier verwendeten malignen und benignen Zellen keine eindeutige Differenzierung aufgrund des Stoffwechselprofils gibt, sondern sich die getesteten Zellen nur graduell unterscheiden. Dieses Ergebnis erklärt möglicherweise die geringe Tumorspezifität der getesteten Substanzen. Im Vergleich mit den vielversprechenden Ergebnissen aus der Literatur zeigten die hier gewonnenen in vitro-Daten eindeutig, dass die Wirkung von potenziell tumorhemmenden Substanzen je nach Tumorzelltyp extrem verschieden war. Dies beruht darauf, dass der vorherrschende Stoffwechseltyp (oxidativ bzw. glykolytisch) für jede Tumorentität verschieden ist. Daher muss vermutlich für jede Tumorentität bzw. sogar für jeden Patienten individuell die Wirkung und der Nutzen einer Hemmung des Tumorstoffwechsels untersucht werden, bevor künftig an eine zielgerichtete Therapie gedacht werden kann. N2 - A characteristic feature of aggressive tumour cells is a high uptake of glucose and enhanced lactic acid production even in the presence of oxygen (aerobic glycolysis, “Warburg effect”) with a reduced use of the tricarboxylic acid cycle. Defects in mitochondrial function and oncogene activation are supposed to contribute to increased glycolysis, that is not subjected to the Pasteur effect (reduced rate of glycolysis in the presence of oxygen). The pentose phosphate pathway (PPP) is an important metabolic pathway in cancer cells, supplying building blocks for nucleotide synthesis and NADPH for proper redox control. Hence, inhibition of the PPP might block tumour cell growth. Perturbation of signalling pathways that are involved in tumour cell metabolism and are hyperactivated (Ras/PI3K/Akt/mTOR- and Raf/MEK/ERK-pathway) or suppressed (oxidative phosphorylation, p53) in cancer cells are possible targets for anticancer drugs. Thus, in this work the effect of 15 substances highly discussed as potential anticancer agents which influence the aforementioned metabolic and signalling pathways was evaluated in vitro on three different tumour cells lines [two breast cancer cells lines with different metastatic phenotype (MDA-MB 231 and 468) and one gastric cancer cell line (23132/87)] and four normal cell types [endometrial fibroblasts, endothelial cells (HUVEC), peripheral blood leukocytes and skin keratinocytes]. Aim of the study was to identify suitable candidates for targeted therapies. ATP-level was measured as readout to determine the efficacy of the substances, because the ATP content of cells correlates well with cell viability. The main focus of this work was to selectively modulate the glucose metabolism of cancer cells. Because glucose can be metabolized aerobically and anaerobically, we first tested substances that inhibit glycolysis at different steps and substances that interfere with mitochondrial metabolism. All of the 15 substances were tested as single treatment. Here, only very high concentrations of the respective substance significantly decreased ATP-levels in cancer cells - but to a much greater extend in normal cells. Therefore, in the next step we determined if impairing glucose and mitochondrial metabolism simultaneously with less toxic drug concentrations would be more specific in targeting cancer cells. Although synergistic effects were observed by co-treatment with oyxthiamine/NaDCA and 2-DG/rotenone respectively on reducing ATP-levels, this effect was not selective for tumour cells too. Recently, evidence is coming up that glutaminolysis (degradation of glutamine) is an important metabolic pathway for cancer cells providing energy substrates and building blocks. Thus, we examined if a tumour-specific effect could be achieved by inhibition of glutaminolysis with 6-Diazo-5-oxo-L-norleuzin (DON). Actually, other than the substances interfering with glucose metabolism, DON showed a tumour-specific effect to some extent, although the therapeutical range was very small. Inhibition of oxidative mitochondrial metabolism with the substances rotenone, oligomycin, 2,4-dinitrophenol and rhodamine 123 increased lactic acid production in all three cancer cell lines. Thus, it was possible to impede oxidative phosphorylation and to force the cells to increase glycolysis, indicating that mitochondria had no defects. To determine if tumour cells and normal cells differ in regard of their metabolic phenotype, the cells were analyzed for parameters concerning glucose metabolism with different methods. Quantifying glucose uptake of the cells revealed that some normal cells (fibroblasts, T-cells) take up significant amounts of glucose that are similar to those of cancer cells (MDA-MB 231) which showed the lowest glucose uptake among the three tumour cell lines tested. Characteristic proteins of glucose metabolism were analyzed using immunohistochemistry. Furthermore expression patterns of crucial genes involved in glucose metabolism were analyzed on mRNA and protein level. Thereby, it became obvious that both tumour cells as well as normal cells have very similar expression patterns regarding these typical genes. In conclusion, the characterization of tumour and normal cells did not show any substantial but rather gradual differences concerning the metabolic phenotype. These results might explain the marginal tumour specific effect of the drugs tested herein Compared to the promising results from the literature our in vitro data clearly show that the effect of potential anticancer drugs is extremely different for several tumour cell types. This might be due to the predominant metabolic phenotype (oxidative or glycolytic) of different tumour entities. Thus, we suppose that inhibition of tumour cell metabolism has to be evaluated for every single cancer cell type or even every cancer patient on regard of effect and benefit for implementation of selective cancer pharmacotherapy. KW - Tumorzelle KW - Glykolyse KW - Inhibitor KW - Warburgeffekt KW - Stoffwechsel KW - Tumor KW - glycolysis KW - metabolism KW - tumour KW - glucose KW - Warburg effect Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65406 ER - TY - THES A1 - Knaup, Bastian T1 - In vitro- und ex vivo-Studien zum humanen intestinalen Metabolismus und zu Lipoxygenase-hemmenden Eigenschaften ausgewählter sekundärer Pflanzeninhaltsstoffe T1 - In vitro- and ex vivo-studies on human intestinal metabolism and lipoxygenase-inhibiting properties of selected secondary plant constituents N2 - Um eine Verbindung zwischen den bereits bekannten in vitro-Effekten und der bislang weitgehend ungeklärten in vivo-Situation zu knüpfen, wurden der intestinale Metabo-lismus sowie die Lipoxygenase-hemmenden Eigenschaften von ausgewählten sekun-dären Pflanzeninhaltsstoffen mit verschiedenen Modellsystemen untersucht. Folgende kamen zur Anwendung: intestinaler Metabolismus Lipoxygenase-hemmende Eigenschaften - menschlicher Speichel - Soja Lipoxygenase-1 - künstlicher Magensaft - 5-Lipoxygenase aus humanen neu- - Ileostomabeutelinhalt trophilen Granulozyten - Kolostomabeutelinhalt Die ex vivo-Modellsysteme (Ileo- und Kolostomabeutelinhalte, 5-Lipoxygenase aus menschlichen neutrophilen Granulozyten) wurden speziell auf metabolische Kompe-tenz beziehungsweise Zellvitalität überprüft. Die verwendeten Darminhalte wiesen ein breites Spektrum an Enzymaktivitäten und angemessene Zahlen anaerober kolonien-bildender Einheiten auf. Nach Isolierung der neutrophilen Granulozyten aus periphe-rem Humanblut erwiesen sich sowohl Zellvitalität (> 90% lebende Zellen) als auch Zellkonzentration (> 5000 Zellen/ µl) für unsere Studien als geeignet. Mit diesen sorg-fältig geprüften Modellsystemen wurden folgende Anwendungen untersucht: I. Einfluss des Zuckerrests, der Aglyconstruktur und der Mikroflorakonzentration auf die Hydrolyse von Phenolglycosiden im menschlichen Dünndarm II. Inkubation der gegen ileale Hydrolyse/Abbau resistenten Verbindungen mit Kolostomabeutelinhalten III. Einfluss des Zuckerrests und der Aglyconstruktur auf die Hydrolyse von Hei-delbeeranthocyanen im menschlichen Dünn- und Dickdarm IV. Metabolismus von D-Galacturonsäure und amidiertem Pektin V. Flavonoide und deren intestinale Metabolite als Soja Lipoxygenase-1-Inhibi-toren VI. Anthocyane als Lipoxygenase-Inhibitoren: Studien mit Soja Lipoxygenase-1 sowie 5-Lipoxygenase aus menschlichen neutrophilen Granulozyten Hierzu wurden Quercetin- und p-Nitrophenolglycoside (hier: 3-O-β-D-Glucoside, 3-O-β-D-Galactoside, 3-O-α-L-Arabinoside, 3-O-β-D-Xyloside und 3-O-α-L-Rhamno-side), anthocyanreicher Heidelbeerextrakt, D-Galacturonsäure und amidiertes Pektin unter anaeroben edingungen bei 37°C für 24 beziehungsweise 10 h mit Ileostoma-beutelinhalten von gesunden Probanden inkubiert. Zusätzlich wurden Quercetin, Quer-cetin 3-O-α-L-rhamnopyranosid, Chlorogensäure, Procyanidin B2, (-)-Epicatechin, Phloretin, D-Galacturonsäure und amidiertes Pektin unter anaeroben Bedingungen bei 37°C für 24 h mit Kolostomabeutelinhalten von gesunden Probanden inkubiert. Die Substrate und Metabolite wurden mittels Hochdruckflüssigchromatographie-Dioden-array-Detektion (HPLC-DAD) und HPLC-Elektrospray-Ionisierung-Tandemmassen-spektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS) identifiziert. Die Gehalte von D-Galacturonsäure und amidierten Pektin wurden nach Carbazolreaktion photometrisch bestimmt. Metha-nol wurde via Headspace Solid-phase Microextraction Gaschromatographie/Massen-spektrometrie (HS-SPME-GC/MS) gemessen; die Bestimmung kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) erfolgte mittels GC-Flammenionisations-Detektion (GC-FID). Die Enzym-versuche wurden spektrophotometrisch ausgewertet, wobei die Bildung des Hydroper-oxidprodukts bei 234 nm beziehungsweise 236 nm verfolgt wurde. N2 - To develop a link between the already known in vitro effects of various secondary plant constituents and the still unclear in vivo situation, both the intestinal metabolism and the lipoxygenase-inhibitory properties of selected secondary plant constituents were studied with various model systems. The following were applied: intestinal metabolism lipoxygenase-inhibitory properties - human saliva - soybean lipoxygenase-1 - simulated gastric juice - human neutrophil granulocyte - human ileostomy fluid 5-lipoxygenase - human colostomy fluid The ex vivo model systems (i.e. ileostomy and colostomy fluids, human neutrophil granulocyte 5-lipoxygenase) were particularly checked for metabolic competence and cell viability, respectively. The screened intestinal fluids showed a broad range of enzymatic activities and proper counts of anaerobic colony forming units. After isola-tion of neutrophil granulocytes from human peripheral blood, the cell vitality (> 90% viable cells) and cell concentration (> 5000 cells/ µl) were adequate for our studies. With these carefully proved model systems, the following applications were perfor-med: I. Influence of sugar moiety, aglycon structure and microflora concentration on the human ileal hydrolysis of phenol glycosides II. Incubation of compounds resistant to ileal hydrolysis/degradation with human colostomy fluids III. Influence of sugar moiety and aglycon structure on the hydrolysis of bilberry anthocyanins in the small and large intestine of humans IV. The metabolism of D-galacturonic acid and amidated pectin V. Flavonoids and corresponding intestinal metabolites as soybean lipoxygenase-1 inhibitors VI. Anthocyanins as lipoxygenase inhibitors: studies with both soybean lipoxyge-nase-1 and human neutrophil granulocyte 5-lipoxygenase Thus quercetin and p-nitrophenol glycosides (i.e. 3-O-β-D-glucosides, 3-O-β-D-galac-tosides, 3-O-α-L-arabinosides, 3-O-β-D-xylosides and 3-O-α-L-rhamnosides), antho-cyanin-rich bilberry extract, D-galacturonic acid and amidated pectin were incubated under anaerobic conditions at 37°C for 24 and 10 h, respectively, with ileostomy fluids from healthy volunteers. In addition, quercetin, quercetin 3-O-α-L-rhamnoside, chlo-rogenic acid, procyanidin B2, (-)-epicatechin, phloretin, D-galacturonic acid and ami-dated pectin were incubated under anaerobic conditions at 37°C for 24 h with colo-stomy fluids from healthy volunteers. The substrates and metabolites were identified by high performance liquid chromatography-diode array detection (HPLC-DAD) and HPLC-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS). The contents of D-Galacturonic acid and amidated pectin were determined photometrically after carbazole reaction. Methanol was measured via headspace solid-phase microex-traction gas chromatography/mass spectrometry (HS-SPME-GC/MS) and short chain fatty acids (SCFA) were determined by GC-flame ionisation detection (GC-FID). The enzyme assays were analyzed spectrophotometrically, monitoring the appearance of hydroperoxide products at 234 nm and 236 nm, respectively. KW - Metabolismus KW - Lipoxygenase <5-> KW - Polyphenole KW - Anthocyane KW - Pektine KW - metabolism KW - lipoxygenase <5-> KW - polyphenols KW - anthocyanins KW - pectins Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32266 ER - TY - THES A1 - Gräfe, Eva Ulrike T1 - Relative systemische Verfügbarkeit und Pharmakokinetik von Quercetin und Quercetinglykosiden (Quercetin-4'-0-glucosid und Quercetin-3-0-rutinosid) im Menschen T1 - Relative bioavailability and pharmacokinetics of the flavonol quercetin and quercetin glycosides (quercetin-4'-0-glucoside and quercetin-3-0-rutinoside) in humans N2 - Aufgrund seiner potentiell gesundheitsfoerdernden Wirkung wurde das Falvonol Quercetin in den letzten Jahren intensiv untersucht. Daten zur Bioverfuegbarkeit nach oraler Applikation sind jedoch selten und widerspruechlich. Fruehere Untersuchungen deuteten darauf hin, dass die Disposition von Quercetin von der Zuckerkomponente des Glykosids oder der Pflanzenmatrix abhaengen koennte. Um den Einfluss der Zuckerkomponente oder der Matrix auf die Resorption von Quercetin festzustellen, wurden zwei isolierte Quercetinglykoside sowie zwei Pflanzenextrakte in einer vierarmigen, randomisierten cross-over Studie an 12 gesunden Probanden getestet. Jeder Proband erhielt eine Zwiebelzubereitung oder Quercetin-4'-O-glucosid, jeweils entsprechend 100 mg Quercetinaglykon, sowie Quercetin-3-O-rutinosid oder Buchweizenkrauttee entsprechend 200 mg Quercetinaglykon. Die Proben wurden mittels HPLC und Coulometrischer Arraydetektion analysiert. Im Plasma wurden ausschliesslich Quercetinglucuronide detektiert. Freies Quercetin und die Glykoside waren nicht nachweisbar. Die Bioverfuegbarkeit und Pharmakokinetik nach Applikation von Zwiebeln und Quercetin-4'-glucosid zeigte keine signifikanten Unterschiede. Maximale Plasmakonzentrationen von 2.3±1.5 µg·mL-1 and 2.1±1.6 µg·mL-1 (MW±SD) wurden nach 0.7±0.2 h und 0.7±0.3 h erreicht. Nach Einnahme von Buchweizenkraut und Rutin wurden maximale Plasmakonzentrationen (trotz der doppelten Dosis) von nur 0.6±0.7 µg·mL-1 und 0.3±0.3 µg·mL-1 nach 4.3±1.8 h bzw. 7.0±2.9 h erreicht. Die terminale Halbwertszeit lag bei ca. 11 h fuer alle vier Pruefpraeparate. Die Disposition von Quercetin ist daher primaer von der Zuckerkomponente abhaengig. Zu einem geringern Anteil beeinflusst die Pflanzenmatrix im Falle von Buchweizenkrauttee sowohl Geschwindigkeit als auch Ausmass der Resorption. Der Resorptionsort scheint fuer Quercetin-4‘-O-glucoside und Quercetin-3-O-rutinoside unterschiedlich zu sein. Die bedeutung spezifischer carrier fuer die Resorption von Quercetinglykosiden sowie von intestinalen ß-Glucosidasen muss in weiteren Untersuchungen geklaert werden. N2 - Due to its potentially beneficial impact on human health the polyphenol quercetin has come into the focus of medicinal interest. However, data on the bioavailability of quercetin after oral intake are scarce and contradictory. Previous investigations indicate that the disposition of quercetin may depend on the sugar moiety of the glycoside or the plant matrix. In order to determine the influence of the sugar moiety or matrix on the absorption of quercetin, two isolated quercetin glycosides and two plant extracts were administered to 12 healthy volunteers in a four-way cross-over study. Each subject received an onion supplement or quercetin-4‘-O-glucoside both equivalent to 100 mg quercetin, as well as quercetin-3-O-rutinoside and buckwheat tea both equivalent to 200 mg quercetin. Samples were analyzed by HPLC with a 12-channel coulometric array detector. In human plasma only quercetin glucuronides, but no free quercetin, could be detected. There was no significant difference in the bioavailability and pharmacokinetic parameters between the onion supplement and quercetin-4‘-O-glucoside. Peak plasma concentrations were 2.3±1.5 µg·mL-1 and 2.1±1.6 µg·mL-1 (mean±SD) and were reached after 0.7±0.2 h and 0.7±0.3 h, respectively. After administration of buckwheat tea and rutin, however, peak plasma levels were (despite the higher dose) only 0.6±0.7 µg·mL-1 and 0.3±0.3 µg·mL-1, respectively. Peak concentrations were reached 4.3±1.8 h after administration of buckwheat tea and 7.0±2.9 h after ingestion of rutin. The terminal elimination half life was about 11 h for all treatments. Thus, the disposition of quercetin in humans is primarily depending on the sugar moiety. To a minor extent, the plant matrix influences both rate and extent of absorption in the case of buckwheat tea administration compared to the isolated compound. The site of absorption seems to be different for quercetin-4‘-O-glucoside and quercetin-3-O-rutinoside. The significance of specific carriers on the absorption of quercetin glycosides as well as specific intestinal ß-glucosidases needs to be further evaluated. KW - Mensch KW - Stoffwechsel KW - Quercetin KW - Pharmakokinetik KW - Flavonoide KW - Quercetin KW - Zwiebel KW - Buchweizenkraut KW - Bioverfügbarkeit KW - Pharmakokinetik KW - Metabolismus KW - Resorption KW - flavonoids KW - quercetin KW - bioavailibility KW - pharmacokinetics KW - absorption KW - metabolism KW - onion KW - buckwheat Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1333 ER - TY - THES A1 - Ackermann, Matthias T1 - Studien zum Verhalten von Anthocyanen aus Heidelbeeren im Humanstoffwechsel - Stabilisierung und Bindung durch Proteine T1 - Studies on anthocyanins in human metabolism - the stabilization and binding by proteins N2 - Identifizierung und Strukturaufklärung von Anthocyanen und ihrer Metabolite erfolgten mit Hilfe der mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion-Elektro-spray-Tan¬dem¬massen¬spektrometrie (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Quantitative Analysen wurden via HPLC-DAD durchgeführt. Die hierzu erforderlichen Referenzverbindungen wurden mittels präparativer HPLC aus Heidelbeeren isoliert (Reinheit zwischen 85,8% und 99,4%). Der Gehalt an Anthocyanen in den untersuchten Heidelbeerfrüchten lag bei 6 g/kg. Bezüglich der mengen¬mäßigen Verteilung dominierten Delphinidin- und Cyanidin¬glykoside vor den Glykosiden von Malvidin, Petunidin und Peonidin. Als konjugierte Zucker¬reste kamen vor allem Glukose und Galaktose vor, der Gehalt an Arabinosiden war weit geringer. Bei oraler Aufnahme erfolgt ein erster Kontakt der Anthocyane mit Speichel. Daher wurde dessen Wirkung auf die Heidelbeeranthocyane in ex vivo-Studien über einen (unphysio-logisch langen) Zeitraum von bis zu 30 Minuten untersucht. Dabei konnte wurde ins-besondere der Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität der Anthocyane aufgezeigt werden. Zur Simulation des Verhaltens von Anthocyanen im Magen wurden die einzelnen Heidelbeeranthocyane mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Hier erwiesen sich alle untersuchten Verbindungen als stabil. Die anschließend von uns mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführten Studien zeigten, dass die Anthocyane unterschiedlich starken Modifizierungen unterlagen. Unter den schwach alkalischen Bedingungen wurden vor allem die Glykoside des Delphinidins schnell abgebaut, aber auch die übrigen Anthocyane erwiesen sich unter diesen Bedingungen als nicht stabil; nach 24 h war kein Anthocyan mehr nachweisbar. Um die Metabolisierungsvorgänge der Anthocyane im Dünn- und Dickdarm zu untersuchen, wurden ex vivo-Inkubationen jeweils mit frischem Ileo- bzw. Kolo¬stoma-beutel¬inhalt durchgeführt. Während die Abbaugeschwindigkeit in der ilealen Flüssigkeit vor allem von der pH-Stabilität des Aglykons abhänig war, konnten im Dickdarm einzig die Arabinoside nach einer Stunde noch alle in geringen Konzentrationen identifiziert werden. Die meisten Glukoside und Galaktoside waren zu diesem Zeitpunkt schon vollständig abgebaut. Da im Darm von einer hydrolytischen Spaltung der Anthocyane in Anthocyanidin und Zucker ausgegangen wird, wurde die Metabolisierung von Anthocyanidinen unter physio-logischen pH-Bedingungen untersucht. Neben der jeweiligen Spaltung in das Benzoe¬säure-derivat des B-Ringes sowie Phloroglucinessigsäure traten verschiedene Poly¬merisierungs¬-produkte auf, deren Strukturen nicht aufgeklärt werden konnten. In einer weiteren Versuchsreihe wurde die renale Ausscheidung von Anthocyanen bei Ileostomieprobanden nach oraler Applikation von 300 g Heidelbeeren über einen Zeitraum von acht Stunden untersucht. Es zeigte sich, dass ein Stoma des terminalen Ileums keinen Einfluss auf die Absorption und Metabolisierung der Anthocyane hatte. Die Bilanzierung der Anthocyane im Urin erfolgte als Äquvalente von Malvidin-3-O-glukosid, da nicht alle Anthocyanmetabolite zur Verfügung standen. Der Zeitpunkt der maximalen renalen Anthocyanausscheidung sowie die Menge der ausgeschiedenen Anthocyane waren starken interindividuellen Schwankungen unterworfen. Das Aus¬sscheidungs¬maximum (tmax) lag zwischen 0,5 und zwei Stunden. Bei der ausge¬schiedenen Menge wurden Werte zwischen 0,007% und 0.019% der auf¬ge¬nommenen Anthocyane ermittelt. Aufgrund der literaturbekannten Unterschiede zwischen den in Serum und Urin gefunden Anthocyanmengen ist davon auszugehen, dass es nach Anthocyanverzehr zu Inter-aktionen mit Proteinen in Blut oder Geweben kommt. Mittels Blutfraktionierung wurde das humane Serumalbumin (HSA) als wichtigster Bindungspartner der Anthocyane im Blut identifiziert. Anhand spektroskopischer Methoden war es möglich, die Bindungs¬parameter zu berechnen. Als Bindungsort wurde der hydrophile Eingang der lipophilen Warfarin-Bindungstasche in der Subdomäne IIA des HSA-Moleküls mittels "molecular modelling" identifiziert. Nasschemische Untersuchungen ergaben, dass die Bindung der Anthocyane an HSA diese vor ihrem pH-abhängigen Abbau schützt. Eine signifikante Herab¬setzung der chemischen Abbaugeschwindig¬keit konnte auch für bovines Serumalbumin beobachtet werden. Diese Erkenntnis ließ sich auf andere, mit dem HSA-Molekül nicht strukurverwandte lebensmittelrelevante Albumine übertragen. So zeigten Anthocyane große Stabilität in Milch und Eiklar, wobei die Stabilisierung auf eine Wechselwirkung mit den Proteinen Laktalbumin und Ovalbumin zurückgeführt werden konnte. Die in dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse hinsichtlich Absorption, Metabolisierung und systemischer Verfügbarkeit im menschlichen Organismus leisten einen Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkungen von Anthocyanen. Die neuen Erkenntnisse der Protein¬bindung sind vor allem für die Bewertung der Verfügbarkeit der Anthocyane in humanem Gewebe relevant. N2 - Identification and structural analysis of anthocyanins and their metabolites was conducted by High-Performance-Liquid-Chromatography-Diode-Array-Detection-Electrospray-Tan-dem-Mass-Spectrometry (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Quantative analyses were realized via HPLC-DAD. The required reference compounds were isolated by preparative HPLC from blueberries (purity from 85.8% to 99.4%). The content of anthocyanines in the analysed blueberries was approximately 6 g/kg. Regarding the quantative distribution, delphinidin and cyaniding glycosides dominated, followed by malvidin, petunidin and peonidin glycosides. Regarding the conjugated sugar rests, glucose and galactose were most abundant with the content of arabinosides being much lower. When ingested orally the anthocyanins first come into contact with saliva. For this reason the effect of saliva on blueberry anthocyanins was analysed in ex vivo studies over a (unphysiologically long) period of up to 30 minutes. With this study, in particular, the influence of the pH-value on the stability of the anthocyanins was shown. For the simulation of the behaviour of anthocyanins in the stomach, the individual blueberry anthocyanins were incubated for four hours with artificial gastric juice (pH 1.81). Under these conditions all analysed components were found to be stable. The subsequent studies with simulated duodenal fluid (pH 7.2) over a period of 24 hours revealed, that the anthocyanins were modified differently. Under the weak alkaline conditions, especially the delphinidin glycosides were degraded quickly, but the other anthocyanins were also not stable under these conditions; no anthocyan was detectable after 24 hours. To analyse the metabolism processes of anthocyanins in the small and large intestines, ex vivo incubations of fresh ileostoma and colostoma bag contents were conducted. Whilst the degradation rates of the anthocyanins in the ileal liquid were dependent on the pH stability of the aglycons, only the arabinosides were detectable in small concentrations after one hour in the large intestine (colostoma incubations). Most of the glucosides and galactosides were degraded completely at this timepoint. As it is supposed that the anthocyanins are cleaved in the colon, the metabolism of anthocyanidins under physiological pH-values were analysed. Next to the respective cleavage into the benzoic acid derivative of the B-ring and phloroglucin acetic acid, different polymerisation products were found, whose structure could not be determined. In a further trial the renal excretion of anthocyanins in ileostoma patients after oral application of 300 g blueberries over a period of eight hours was determined. It was shown that the ileostoma handicap had no influence on the absorption and metabolism of anthocyanins. The quantification of anthocyanins in the urine samples were calculated as malvidin-3-O-glucoside equivalents, as not all anthocyan metabolites were available. The point of time of the maximum renal anthocyan excretion as well the amount of excreted anthocyanins underwent strong interindividual variations. The highest excretion (tmax) was between 0.5 and two hours. Values of 0.007% and 0.019% of the anthocyan uptake were recovered in the excreted material. Due to the differences known from literature between the amounts of anthocyanins found in serum and urine, it has to be assumed that there are interactions with proteins in the blood or tissue after anthocyan consumption. By fractionating blood, the human serum albumin (HSA) was identified as the most important binding partner for anthocyanins in blood. Using spectroscopic methods it was possible to calculate the binding parameters. With ‘molecular modelling’ the hydrophilic entrance of the lipophilic warfarin binding pocket in the subdomain IIA of the HSA molecule was identified as binding position. Chemical analyses showed that the binding of anthocyanins to HSA protected these from their pH-dependent degradation. A significant lowering of the chemical degradation velocity could also be observed for bovine serum albumin. This knowledge could be related to other, not structurally related food relevant albumins. Anthocyanins showed thus a large stability in milk and egg white, where the stabilising effect could be related to interactions with the proteins lactalbumin and ovalbumin. The novel information provided by this work regarding absorption, metabolism and systematic availability in the human organism leads to a better understanding of the effects of anthocyanins. The data of protein binding is particularly relevant for the assessment of the availability of anthocyanins in human tissues. KW - Heidelbeere KW - Anthocyane KW - Proteinbindung KW - Stoffwechsel KW - Anthocyane KW - Stabilität KW - Humanstoffwechsel KW - anthocyanins KW - binding KW - protein KW - stability KW - metabolism Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53336 ER - TY - THES A1 - Drescher, Daniel Georg T1 - Untersuchungen zum Einfluss von Alter und Geschlecht auf die Konversion von DHEA in humanen peripheren mononukleären Blutzellen T1 - Studies on influence of age and sex concerning the conversion of DHEA in human peripheral blood mononuclear cells N2 - Dehydroepiandrosteron wirkt hauptsächlich indirekt über nachfolgende Umwandlung in Androgene und Östrogene sowie deren Zwischenprodukte in den peripheren Zielzellen, respektive Immunzellen. In vitro Versuche erbrachten den Nachweis von gesteigerter Interleukin-2 Sekretion durch T-Lymphozyten nach Gabe von DHEA, wohingegen es zu einer Inhibierung der Interleukin-6 Sekretion kam. Dementgegen wird im Altersprozess ein Abfall von DHEA und Interleukin-2 beobachtet bei gleichzeitigem Anstieg von Interleukin-6. Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Frage, in wieweit humane periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) über Expression und funktionale Aktivität der im DHEA-Downstream-Metabolismus essentiellen Enzyme verfügen und ob es alters- bzw. geschlechtsspezifische Unterschiede gibt. Die Studie wurde an 8 gesunden jüngeren Frauen sowie 8 gesunden jüngeren und 8 gesunden älteren Männern durchgeführt. Zur Bestimmung der mRNA-Expression der im DHEA-Downstreammetabolismus notwendigen Steroidenzyme in humanen PBMCs wurden qualitative, semiquantitative und quantitative RT-PCR Analysen sowie PBMC-Enzymfunktionsassays durchgeführt. Hierbei wurden PBMCs mit radioaktiv markiertem 4-14C-Testosteron, 4-14C-Androstendion bzw. 4-14C-DHEA inkubiert, extrahiert und mittels Dünnschichtchromatographie separiert. Die anschließende quantitative Auswertung der Konversionsprodukte erfolgte durch Phosphorimager-Analyse. Zusammenfassend lässt sich aussagen, dass humane periphere mononukleäre Blutzellen (PBMCs) ausgehend von DHEA über alle notwendigen Steroidenzyme für einen effizienten Downstreammetabolismus zu aktiven Androgenen verfügen. Dies konnte sowohl durch den qualitativen und quantitativen Nachweis von mRNA der betreffenden Enzyme als auch durch die nachgewiesene Aktivität in PBMC-Enzymfunktionsassays bestätigt werden. Dabei zeigten sich signifikante alters- und geschlechtsspezifische Veränderungen im Androgenmetabolismus. Insbesondere konnte eine erhöhte 17beta-HSD5-Aktivität und -Expression in der älteren männlichen und weiblichen Probandengruppe im Vergleich zur jüngeren männlichen nachgewiesen werden, was sich in signifikant höheren Konversionsraten von DHEA zu Androstenediol und Androstenedion zu Testosteron widerspiegelte. Ebenso konnte eine signifikant erhöhte 5alpha-Reduktase-Aktivität in der älteren männlichen Probandengruppe im Vergleich zur jüngeren männlichen aufgezeigt werden. Dementgegen waren die Konversionsraten von DHEA zu Androstenedion via 3beta-Aktivität unter den einzelnen Probandengruppen ähnlich. Die vermehrte Konversion von DHEA zum immunmodulatorisch wirksamen Metabolit Androstendiol sowie von Androstendion zu Testosteron entspricht einer vermehrten Androgenaktivierung. Dieses Hochregulieren könnte einen kompensatorischen Mechanismus der peripheren Zielzelle darstellen, dem sinkenden DHEA-Serumspiegel während des Alterungsprozesses entgegenzuwirken und kann einen endokrinen Hinweis auf eine „Immunseneszenz“ geben. N2 - CONTEXT: Dehydroepiandrosterone (DHEA) mainly exerts indirect action via downstream conversion toward sex steroids within peripheral target cells including immune cells. In vitro DHEA has been shown to enhance IL-2 release from T lymphocytes, whereas it inhibits IL-6 secretion. Conversely, aging is associated with a decline in both DHEA and IL-2, whereas IL-6 increases. OBJECTIVE: The objective of the study was to investigate age and sex-related differences in expression and functional activity of steroidogenic enzymes involved in downstream conversion of DHEA in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). DESIGN: This study was cross-sectional. PARTICIPANTS/SETTING: Healthy young men (n = 8) and women (n = 8) and healthy middle-aged men (n = 8) were studied in an academic setting. MEASURES: mRNA expression of steroidogenic enzymes in PBMCs was measured by qualitative and quantitative RT-PCR analysis and enzyme activity assays after incubation of PBMCs with radiolabeled DHEA, 4-androstene-3,17-dione (androstenedione), and testosterone. RESULTS: RT-PCR analysis showed expression of all enzymes required for DHEA conversion toward active androgens and to the immune-stimulatory metabolite androstenediol. Steroid conversion patterns indicated a particularly increased activity of 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 5 (17beta-HSD5) in the older men and young women demonstrated by significantly higher conversion rates of DHEA to androstenediol and of androstenedione to testosterone (all P < 0.05). By contrast, conversion of DHEA to androstenedione via 3beta-HSD occurred at a similar rate. Quantitative RT-PCR analysis revealed increased expression of 17beta-HSD 5 mRNA in PBMCs from the older men. CONCLUSIONS: Our results provide evidence for significant changes in sex steroid metabolism by human PBMCs with aging, which may represent an endocrine link to immune senescence. KW - Testosteron KW - Testosteronstoffwechsel KW - Testosteronreductase KW - Dehydroepiandrosteron KW - Metabolismus KW - Steroidstoffwechsel KW - Blutzelle KW - Geschlechtsunterschied KW - Immunseneszenz KW - PBMC KW - DHEA KW - metabolism KW - steroids Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-37359 ER - TY - THES A1 - Kellert, Marco T1 - Untersuchungen zum Metabolismus von Furan in Ratte und Maus, sowie zur Reaktivität und Gentoxizität von cis-2-Buten-1,4-dial in vitro und in Zellkultur T1 - Metabolism of furan in rats and mice and tests for the reactivity and genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial in vitro and in cell culture. N2 - Furan wird in einer Vielzahl von Speisen durch Hitzebehandlung gebildet und ist kanzerogen in der Leber von Ratte und Maus. Durch die hohe Flüchtigkeit von Furan ist eine Expositionsabschätzung auf Basis der Kontamination von Lebensmitteln nur bedingt möglich. Ein alternativer Ansatz dazu ist die Identifizierung von Furanmetaboliten als Expositions­biomarker. Nach der Aufnahme wird Furan zunächst zum Dialdehyd cis-2-Buten-1,4-dial oxidiert. cis-2-Buten-1,4-dial besitzt mehrere elektrophile Strukturelemente, welche eine Reaktion mit Protein und DNS wahrscheinlich machen und damit zur bekannten Toxizität von Furan beitragen können. Es stellt sich in diesem Zusammenhang die Frage, ob eine Reaktion mit Protein die Reaktion mit der DNS verhindern kann und somit keine direkt gentoxischen Effekte auftreten. Für ein kanzerogenes Agens ohne direkte gentoxische Wirkung kann eine Schwellendosis unterhalb derer kein DNS-Schaden auftritt diskutiert werden. Für eine fundierte Risikobewertung bezüglich der Aufnahme von Furan über die Nahrung ist dies unabdingbar. In der vorliegenden Arbeit wurde nach der oralen Gabe von Furan im Urin von Fischer 344 Ratten nach Metaboliten gesucht. Eine Kontrollgruppe erhielt nur die Trägersubstanz Öl. Das vor und nach Exposition über jeweils zwei 24 Stunden Perioden gesammelte Urin wurde mittels einer Tandemmassenspektrometrie-Methode analysiert. Die Methode bestand aus einem Full-Scan und einer darüber gesteuerten Aufzeichnung eines Fragmentionenspektrums. Die Full-Scan-Daten wurden mit Hilfe der Hauptkomponentenanalyse untersucht. In der ersten Sammelperiode nach der Behandlung konnten durch die erste Hauptkomponente die behandelten von den unbehandelten Tieren getrennt werden. Aus den für die Trennung relevanten Verbindungen konnten fünf Biomarker strukturell aufgeklärt werden. In einer weiteren Tierstudie an Ratten und Mäusen wurde die Kinetik und die Dosis-Wirkungs-Beziehung der identifizierten Biomarker untersucht. Die gezielte LC-MS/MS-Analyse der Urine auf die identifizierten Biomarker hin zeigte, dass in der Ratte alle und in der Maus alle bis auf einen dosisabhängig anstiegen. Die Kinetik der Ausscheidung lieferte wertvolle Hinweise auf die Entstehung der Biomarker. Die Ausscheidung der Biomarker mit Lysinstruktur erfolgte über mehr als 72 Stunden. Dies war ein Hinweis auf eine Freisetzung aus Protein. Die Ausscheidung der restlichen Verbindungen erfolgte ausschließlich in den ersten 24 Stunden. Die in der Literatur vorhandenen Daten zur Gentoxizität von Furan und cis-Buten-1,4-dial sind unschlüssig und unvollständig. In der vorliegenden Arbeit wurde cis-2-Buten-1,4-dial im Ames Stamm TA104 und in L5178Y Mauslymphomzellen auf Mutagenität und Gentoxizität untersucht. Durch starke Zytotoxizität war der Konzentrationsbereich auf 4.5 µmol/Platte limitiert. Innerhalb dieses Bereich konnte mit der Vorinkubationsvariante des Ames-Tests keine Mutagenität beobachtet werden. Die L5178Y Mauslymphomzellen wurden mit Standardprotokollen für den Mikrokern-Test, Kometen-Test und den Thymidinkinase-Test untersucht. Der Konzentrationsbereich von cis-2-Buten-1,4-dial erstreckte sich bis 100 µM, konnte aber auf Grund der starken Zytotoxizität nur bis 25 µM ausgewertet werden. Dennoch konnte bereits in diesem Bereich ein 1.7- bzw. 2.2-facher Anstieg im Kometen- bzw. Thymidinkinase-Test beobachtet werden. Verglichen mit der Positivkontrolle Methylmethansulfonat hatte cis-2-Buten-1,4-dial bei einer deutlich höheren Zytotoxizität eine ähnliche Potenz bezüglich der Mutagenität und Gentoxizität. Um das DNS-vernetzende Potential von cis-2-Buten-1,4-dial zu bestimmen wurde eine Variante des Kometen-Tests verwendet. Es wurde dabei untersucht, ob die Vorbehandlung von Zellen mit cis-2-Buten-1,4-dial die durch γ-Strahlung induzierbaren Kometen reduzieren kann. Während die Positivkontrolle Glutaraldehyd die Kometen tatsächlich verringerte, blieb dieser Effekt bei cis-2-Buten-1,4-dial aus. Im Gegenteil, bei einer Konzentration von ≥100 mM konnte durch die Zunahme von Zellen mit beginnender Apoptose ein Anstieg der Kometen beobachtet werden. Obwohl cis-2-Buten-1,4-dial sehr deutliche gentoxische und mutagene Effekte zeigte, beschränkte die hohe Zytotoxizität den auswertbaren Bereich. Möglicherweise kann diese Problematik einen Teil der unschlüssigen Ergebnisse erklären, sicher ist jedoch, dass für die Untersuchung der Mechanismen der Toxizität und Kanzerogenität ein Beitrag von nicht gentoxischen Effekten diskutiert werden muss. N2 - Furan has been found in a number of heated food items and is carcinogenic in the liver of rats and mice. Estimates of human exposure on the basis of concentrations measured in food are not reliable because of the volatility of furan. A biomarker approach was therefore indicated. Metabolism of furan includes the formation of an unsaturated dialdehyde, cis-2-butene-1,4-dial. In view of the multifunctional electrophilic reactivity of cis-2-butene-1,4-dial, adduct formation with protein and DNA may explain some of the toxic effects. DNA-adduction is a direct genotoxic effect. The major question was weather a direct genotoxicity of cis-2-butene-1,4-dial could be prevented by the reaction with protein structures. If so, the genotoxic and mutagenic effects are likely to show a threshold dose, reducing the cancer risk for low exposure levels. We searched for metabolites excreted in the urine of male Fischer 344 rats treated by oral gavage with 40 mg furan per kg body weight. A control group received the vehicle oil only. Urine collected over two 24-hour periods both before and after treatment was analyzed by a column-switching LC-MS/MS method. Data were acquired by a full scan survey scan in combination with information dependent acquisition of fragmentation spectra by the use of a linear ion trap. The full scan data was analyzed by principal component analysis (PCA). The first principal component fully separated the samples of treated rats from the controls in the first post-treatment sampling period. Five of the compounds that are responsible for the separation could be identified as the reaction product of cis-2-butene-1,4-dial with either glutathion or lysine (protein). In a second animal study rats and mice were treated with seven different doses of furan in the range from 125 µg to 8 mg per kg body weight. Dose-response and kinetic over 72 h of the seven identified biomarkers was examined by LC-MS/MS in the urine. In the rats all biomarkers showed a dose-dependent increase. In the mice one biomarker lacked of dose dependency. Different excretion profiles were attributed to the formation of either protein adducts or glutathione conjugates. Whereas the protein-derived biomarkers with a lysin moiety showed a slow excretion over more than 72 h, the glutathion-dervived biomarkers were only excreted within the first 24 h. Short-term tests for genotoxicity of furan in mammalian cells are inconclusive, little is known for cis-2-butene-1,4-dial. We investigated cis-2-butene-1,4-dial generated by hydrolysis of 2,5-diacetoxy-2,5-dihydrofuran for genotoxicity and mutagenicity in Salmonella typhimurium (Strain TA104) and in L5178Y mouse lymphoma cells. The Ames Test was negative in the preincubation assay with and without reduction of cytotoxicity by addition of glutathione after preincubation phase. Remarkable cytotoxicity limited the analysis range up to 4.5 µmol/plate. Mutagenicity and genotoxicicty in L5178Y mouse lymphoma cells was evaluated using standard procedures for the comet assay, the micronucleus test, and the mouse lymphoma thymidine kinase gene mutation assay. cis-2-butene-1,4-dial was tested at 0, 6.25, 12.5, 25, 50, and 100 µM. Cytotoxicity was remarkable; cell viability at 50 µM was reduced to <50%. Up to 25 µM, cell viability was >90%, and measures of comet assay and thymidine kinase mutations were increased over control about 1.7 an 2.2-fold, respectively. Compared to methyl methanesulfonate used as positive control, cis-2-butene-1,4-dial was of similar potency for genotoxicity but much more cytotoxic. A potential cross-linking activity of cis-2-butene-1,4-dial was investigated by checking whether gamma radiation-induced DNA migration in the comet assay could be reduced by pretreatment with cis-2-butene-1,4-dial. As opposed to the effect of the positive control glutaraldehyde, cis-2-butene-1,4-dial treatment did not reduce the comets. On the contrary, an increase was observed at ≥100 µM cis-2-butene-1,4-dial, which was attributable to early apoptotic cells. Although cis-2-butene-1,4-dial was found to be a relatively potent genotoxic agent in terms of the concentration necessary to double the background measures, cytotoxicity strongly limited the concentration range that produced interpretable results. This may explain some of the inconclusive results and indicates that nongenotoxic effects must be taken into account in the discussion of modes of toxic and carcinogenic action of furan. KW - Metabolismus KW - Mutagenität KW - Biomarker KW - Furan KW - LC-MS KW - Harn KW - cis-2-Buten-1 KW - 4-dial KW - Gentoxizität KW - furan KW - metabolism KW - biomarker KW - mutagenicity KW - genotoxicity Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28716 ER -