TY - THES A1 - Christenn, Marcus T1 - Charakterisierung von Somatostatinrezeptor-Subtyp 4 interagierenden Proteinen in der Ratte (Rattus norvegicus) T1 - Characterisation of somatostatin receptor subtype 4 interacting proteins in the rat (Rattus norvegicus) N2 - Somatostatin ist ein regulatorisches Peptid, das eine Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb des Körpers beeinflußt. Die Wirkung von Somatostatin wird auf zellulärer Ebene über eine Familie von fünf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelt, die entweder in G Protein-abhängiger Weise oder vermutlich auch über andere interagierende intrazelluläre Proteine auf nachgeschaltete Signaltransduktionswege wirken. Der Somatostatinrezeptor Subtyp 4 (SSTR4) wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und wirkt dort inhibierend auf die exzitatorische Signalweiterleitung. Es sind aber auch stimulierende Effekte des SSTR4 bekannt. Um das subtypspezifische Signalverhalten des SSTR4 weiter zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteine gesucht, die intrazellulär mit dem SSTR4 interagieren und so seine physiologischen Effekte beeinflussen. In einem ersten Ansatz konnten drei mögli-che Interaktionspartner mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems identifiziert werden, die aber in nachfolgenden Untersuchungen als unpezifisch eingestuft wurden. Mit Hilfe einer Affinitätschromatografie wurden dann zwei Proteine identifiziert, die spezifisch mit dem SSTR4 interagieren. Sowohl PSD-95 als auch PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa bzw. 93kDa) wurden mit einem immobilisierten Peptid präzipitiert, das die neun C-terminalen Aminosäuren des SSTR4 enthält. Die Interaktion des SSTR4 mit PSD 95 wurde im Weiteren näher charakterisiert. In einem Bindungsexperiment mit rekombinaten Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch die 1. und 2. PDZ-Domäne von PSD-95 vermittelt wird. In humanen embryonalen Nieren-Zellen (HEK293), die den SSTR4 stabil exprimieren, konnte PSD-95 mit dem Rezeptor koimmunpräzipitiert werden. Nach Koexpression von PSD-95 und SSTR4 findet man eine partielle Kolokalisierung beider Proteine an der Zellmembran, wobei aber der Großteil des PSD-95 weiterhin eine diffuse zytoplasmatische Verteilung zeigt. Die Interaktion wurde in vivo sowohl immunhistochemisch in kultivierten Hippocampus-Neuronen als auch durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Rattengehirn-Lysaten nachgewiesen. Die Interaktion von PSD-95 mit dem SSTR4 beeinflußt weder die Agonisten-induzierte Internalisierung des Rezeptors in HEK293-Zellen, noch die Kopplung des Rezeptors an einen G-Protein-gekoppelten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal in Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Durch die Interaktion mit PSD-95 wird der SSTR4 in physikalische Nähe zu bestimmten Zielproteinen gebracht, über die nachfolgend die Somatostatineffekte weitervermittelt werden. So ermöglicht die Interaktion vermutlich eine Integration des SSTR4 in den postsynaptischen Komplex aus PSD-95 und Glutamatrezeptoren, wo der SSTR4 die bereits beschrieben regulatorischen Effekte auf die Glutamat-vermittelte exzitatorische Signaltransduktion ausüben kann. N2 - Somatostatin is a regulatory peptid, which affects a multiplicity of biological processes within the body. The effects of Somatostatin are mediated by a family of five G-protein-coupled receptors, which act on several downstream signaltransduction pathways either in a G-protein-dependent way or probably in a G-protein-independent manner via intracellular interacting proteins. The somatostatin receptor subtype 4 (SSTR4) is mainly expressed in brain, where it inhibits the excitatory neurotransmission. In addition, excitatory effects of SSTR4 have also been published. In order to examine the subtype specific signalling of SSTR4, I tried to identify intracellular proteins which interact directly with the SSTR4 and affect its physiological effects. Using the yeast two-hybrid system I identified three possible interaction partners for SSTR4, which were however classified as non-specific in subsequent experiments. In a second approach two proteins which interact with SSTR4 could be identified by affinity-chromatography. Both proteins PSD-95 and PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa and 93kDa) were precipitated specifically with an immobilized peptid that contains the nine C-terminal amino acids of SSTR4. The interaction of the SSTR4 with PSD-95 was further characterized. In a binding experiment with recombinant proteins I could show that the interaction is mediated by the 1st and 2nd PDZ-domain of PSD-95. In human embryonic kidney cells (HEK293) which stably express SSTR4, PSD-95 could be coprecipitated with the receptor. After coexpression of PSD-95 and SSTR4 both proteins are partially colocalized at the plasma membrane. The majority of the PSD-95 however shows a diffuse cytoplasmic distribution. The in vivo interaction was proven by immunohistochemistry on cultivated hippocampal neurons and by coimmunoprecipitation of both proteins from rat brain lysates. The interaction of PSD-95 with SSTR4 affected neither the agonist induced internalisation of the receptor in HEK293 cells, nor the coupling of the receptor to a G-protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel in oocytes obtained from the african clawed frog Xenopus laevis. By the interaction with PSD-95, SSTR4 is brought into physical proximity to certain target proteins which mediate the effects of somatostatin. Thus the interaction probably allows an integration of SSTR4 into the postsynaptic complex of PSD-95 and glutamergic receptors, where SSTR4 could regulate the glutamat-mediated excitatory signaltransduction. KW - Ratte KW - Somatostatin KW - G-Proteine KW - Rezeptor KW - G-Protein-gekoppelter Rezeptor KW - Somatostatinrezeptor Subtyp 4 KW - interagierende Proteine KW - PDZ-Domäne KW - PSD-95 KW - G-protein-coupled receptor KW - somatostatin receptor subtype 4 KW - interacting proteins KW - PDZ-domain KW - PSD-95 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14253 ER - TY - THES A1 - Petry, Renate T1 - Spektroskopische Strukturanalytik synthetischer Polypeptide T1 - Structural Analysis of Synthetic Polypeptides by Optical Spectroscopy Methods N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden zwei spektroskopische Methoden (Raman- und Circulardichroismus-Spektroskopie) und die Kernspinresonanz zur Untersuchung der Sekundärstruktur von synthetischen Polypeptiden eingesetzt. Dabei wurden die Struktur-Funktions-Beziehungen der dritten extrazellulären Schleife des Gonadotropin-freisetzenden Rezeptors (GnRH-R) untersucht. Die spektroskopischen Ergebnisse belegten, dass die zuvor getroffene Aussage über eine vorhandene helikale Struktur revidiert werden musste. Die Strukturanalysen mit Hilfe der CD-, Raman- und 2D NMR-Experimente an zwei Serien von Polypeptiden lieferten Aussagen über die Sekundärstruktur. Insbesondere die Raman-Untersuchungen in Verbindung mit einer statistischen Datenanalyse lieferten detaillierte Information über subtile Konformationsänderungen, die einerseits durch die Addition und andererseits durch die Substitution einzelner Aminosäuren in den synthetischen Polypeptiden ausgelöst wurden. Anhand der ausgewählten Raman-Linien konnte nachgewiesen werden, dass sowohl die Änderungen der Polypeptidkettenlänge als auch die Änderung der Polypeptidsequenzen mit den beobachteten Intensitäten der Raman-Linien korreliert sind. KW - Synthetische Polypeptide KW - Strukturaufklärung KW - Raman-Spektroskopie KW - Synthetische Polypeptide KW - Sekundärstruktur KW - Proteindesign KW - Raman-Spektroskopie KW - Prolin KW - G-Protein-gekoppelter Rezeptor KW - synthetic polypeptides KW - secondary structure KW - protein design KW - Raman spectroscopy KW - proline KW - G protein-coupled receptor Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-664 ER -