TY - THES A1 - Aumüller, Ruth Inge T1 - CD40-restringierte Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren durch bifunktionelle rekombinante Proteine T1 - CD40-restricted activation of TRAIL-death receptors by bifunctional recombinant proteins N2 - Der Ligand TRAIL wurde 1997 aufgrund seiner hohen Sequenzhomolgie ge-genüber dem TNFL CD95L entdeckt (28 %). Allerdings besitzt TRAIL, anders als die Liganden CD95L und TNF, die bemerkenswerte Eigenschaft vor allem in veränderten Zellen Apoptose zu induzieren, während gesunde Zellen davor bewahrt werden. Die TRAIL-induzierte Apoptose wird durch die apoptoseinduzierenden Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2 vermittelt. Allerdings bindet und aktiviert lösliches TRAIL hauptsächlich den Todesrezeptor TRAILR1, während membrangebundes TRAIL sowohl TRAILR1 als auch TRAILR2 gut aktiviert. In den letzten Jahren wurden verschiedene Methoden entwickelt, um die Bioaktivität löslicher TNFL zu steigern. Hierzu zählen z.B.: Stabilisierung der trimeren Molekülanordnung über die TNC-Domäne, Oligomerisierung des Flag-getaggten Liganden mithilfe des monoklonalen Antikörpers M2, sowie Generierung einer artifiziellen, antigenabhängigen Membranständigkeit. In dieser Arbeit wurde der Oberflächenrezeptor CD40 zur Immobilisierung des generierten Fusionsproteins scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL genutzt. In verschieden Experimenten konnten mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL in CD40-exprimierenden Zellen starke Apoptoseinduktion ermittelt werden. Charakteris-tische Kennzeichen und Spaltprodukte der Apoptose konnten ausschließlich in CD40-positiven Tumorzellen detektiert werden. Dabei wurde in allen Versuchen die für die Apoptoseinduktion benötigte Konzentration des Konstrukts mithilfe des Proteinsyntheseinhibitors CHX um das 10- bis 100-fache verringert. Es konnte auch gezeigt werden, dass in CD40-positiven Zellen, nach Stimulation mit scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL, nicht-apoptotische Signalwege verstärkt aktiviert werden. Dies war auf die agonistische Aktivität des monoklonalen Antikörperfragments scFv:CD40 zurückzuführen. Die Antikörperdomäne war folglich nicht nur zur effizienten Aktivierung der TRAIL-Todesrezeptoren mittels Immobilisierung fähig, sondern konnte zusätzlich zur Stimulation des Immunsystems genutzt werden. Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass der lösliche, schwach aktive Ligand TRAIL mittels Oberflächenimmobilisierung über Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen in einen hochaktiven Liganden mit lokal begrenzter Toxizität überführt werden kann. Mithilfe dieses Fusionsproteins ist es somit möglich die selektive Toxizität von TRAIL durch Steigerung seiner Aktivität effizient zu nutzen. Zusätzlich kann durch die Antigenbindung der Wirkungsbereich weiter eingegrenzt werden (CD40-positive Tumoren), wodurch unerwünschte Nebenwirkungen reduziert oder sogar ausgeschaltet werden können. Das in Tumoren oft heruntergefahrene Immunsystem kann CD40-abhängig stimuliert werden, um somit auch Tumorzellen in apoptoseresistenten Stadien zu eliminieren. Basierend auf diesen Ergebnissen können in der Zukunft weitere Studien zur Therapie von TRAIL-resistenten, CD40-exprimierenden Tumoren fortgeführt werden. N2 - TRAIL has been characterized in 1997 based on its high sequence homology towards the TNFL CD95L (28 %). Differing from the ligands CD95L and TNF, TRAIL has the remarkable quality to induce apoptosis in tumor cells, while healthy cells are protected from apoptosis. In this case apoptosis is accomplished by the death receptors TRAILR1 and TRAILR2. However soluble TRAIL binds and activates primarily the death receptor TRAILR1, while membrane-bound TRAIL activates well both TRAILR1 and TRAILR2. In recent years different methods have been generated to raise the bioactivity of soluble TRAIL. To these belong for example: stabilization of the trimeric molecule structure with the TNC-domain, oligomerization of the ligand with the monoclonal antibody M2, generation of an artificial antigen-restricted membrane-bound form. In this work we made use of the surface receptor CD40 for immobilization of the generated fusion protein scFv:CD40-Flag-TNC-TRAIL. With the aid of this fusion protein it is thus possible to use the selective toxicity of TRAIL efficiently by an increase of its activity. Additionally the field of action could be localized further by antigen binding (CD40-positive tumors). As a consequence undesirable side effects can be reduced or even deactivated. The shut down immune system in tumors can be stimulated CD40-dependant, so that tumor cells resistant to apoptosis are also wiped out. Based on these results future studies may be conducted to treat TRAIL-resistant, CD40-expriming tumors. KW - Tumor-Nekrose-Faktor / Rekombinantes Protein KW - Tumorantigen KW - Antigen CD40 KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - CD40 KW - Tumortherapie KW - Todesrezeptoren KW - Antikörper KW - TRAIL KW - CD40 KW - death receptors KW - tumor treatment KW - antibody Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106813 ER - TY - THES A1 - Schaffstein, Stella T1 - Molekulare Mechanismen der nicht-apoptotischen Signaltransduktion des Todesliganden TRAIL (Apo-2 Ligand) T1 - Molecular mechanisms of non-apoptotic signaling of the death-ligand TRAIL (Apo-2 ligand) N2 - TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)/Apo-2 Ligand ist ein Mitglied der TNF (tumor necrosis factor)-Superfamilie, das in den vergangenen Jahren als potentielles Tumortherapeutikum breite Aufmerksamkeit auf sich gezogen hat. Denn über seine korrespondierenden Todesrezeptoren induziert TRAIL vornehmlich in Tumorzellen den apoptotischen Zelltod, während normale Zellen unbeschadet bleiben (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Neuere Studien belegen allerdings, dass die TRAIL-Todesrezeptoren neben ihrer herausragenden Funktion als Auslöser der Apoptose zusätzlich die Fähigkeit zur Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden vornehmlich die nicht-apoptotischen Signalwege wie die MAPK-Kaskaden sowie die NFkappaB-Signalwege in Verbindung mit der Aktivierung von Apoptose sowie der Induktion des Chemokins IL-8 analysiert. Hierfür wurde die humane Pankreasadenokarzinomzellinie Colo 357 verwendet. In den Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass TRAIL die MAP Kinasen JNK, ERK und p38 in Colo 357 Zellen induziert. Die Induktion erfolgte hierbei unabhängig vom apoptotischen Zelltod aber abhängig von der Aktivierung der Caspasen. Desweiteren konnte eine TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkappaB in Colo 357 Zellen demonstriert werden. Anhand von ELISA-Experimenten wurde gezeigt, dass sowohl die Aktivierung der MAP Kinasen als auch die Aktivierung von NFkappaB eine essentielle Rolle bei der TRAIL-vermittelten Induktion von IL-8 spielen. Durch die Induktion von IL-8 wiederum kann TRAIL inflammatorische Effekte induzieren. Im Hinblick auf eine potentielle Tumortherapie mit TRAIL legen die Daten dieser Studie die Notwendigkeit von Kombinationstherapien mit TRAIL nahe. So kann durch die Kombination von TRAIL mit anti-inflammatorisch wirkenden Medikamenten eine Reduktion entzündlicher Nebenwirkungen erzielt werden. Andererseits kann durch Verwendung von TRAIL zusammen mit Proteasom-Inhibitoren die Resistenz gegenüber TRAIL-vermittelter Apoptose vermindert werden und gleichzeitig eine anti-inflammatorische und NFkappaB-hemmende Wirkung erzielt werden. N2 - TRAIL (tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand), also known as Apo-2 ligand, is one of several members of the TNF (tumor necrosis factor) superfamily that induce apoptosis through engagement of death receptors (Wiley et al., 1995). This protein has generated tremendous excitement as a potential tumor-specific cancer therapeutic because it selectively induces apoptosis in many transformed cells but not in normal cells (Ashkenazi et al., 1999; Walczak et al., 1999; Griffith et al., 1998). Since its discovery in 1995, TRAIL has been predominantly described as a potent inducer of apoptosis with functions in tumor surveillance and immune privilege through binding of its corresponding death receptors. More recent studies however point to additional, apoptosis-independent functions of the TRAIL-death-receptors. The experiments described in this study focused mainly on TRAIL-mediated activation of the non-apoptotic signaling pathways as the MAPK (mitogen-activated protein kinase) cascades and the transcriptional factor NFkappaB in connection with the induction of apoptotic cell death as well as the induction of the chemokine IL-8. For the described project the human pancreatic cancer cell line Colo 357 was predominantely used. The experiments demonstrated that TRAIL induces the activation of the MAPK cascades JNK, ERK and p38 in Colo 357 cells. This induction occured independently of the induction of apoptotic cell death but dependently of the activation of caspases. Furthermore a TRAIL-mediated activation of the transcriptional factor NFkappaB was demonstrated in Colo 357 cells. Both the activation of the MAP kinase JNK and the induction of NFkappaB were shown to play a decisive role in the TRAIL-induced expression of the chemokine IL-8. In correspondance to potential tumor-specific cancer therapy with TRAIL the data of this study suggest the use of combintion therapies of TRAIL, on the one hand combination with anti-inflammatory drugs to avoid side effects arising from the proinflammatory potential of TRAIL and on the other hand combintaion with drugs to overcome resistance against TRAIL-mediated apoptosis such as proteasomal inhibitors which were shown to not only reinforce TRAIL-mediated apoptosis but also have anti-inflammatory and NFkappaB inhibitory effects. KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - Apoptose KW - c-Jun N-terminale Kinase KW - NFkappaB KW - Interleukin 8 KW - TRAIL KW - apoptosis KW - c-Jun N-terminal kinase KW - NFkappaB KW - interleukine 8 Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55943 ER - TY - THES A1 - Rumpf, Jost-Julian T1 - Mechanismen der TRAIL-induzierten Signaltransduktion T1 - Mechanisms of TRAIL-induced cell signaling N2 - TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand), ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, wurde bislang hauptsächlich hinsichtlich seiner dominanten Funktion als Auslöser des apoptotischen Programms untersucht. In neueren Untersuchungen konnte allerdings gezeigt werden, dass TRAIL unter bestimmten Bedingungen auch eine starke Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege induzieren kann. Um die Mechanismen der TRAIL-induzierten nicht-apoptotischen Signaltransduktion genauer zu untersuchen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit besonderes Augenmerk auf die TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB und deren Modulation durch Interferon gamma und FLIP gelegt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Interferon gamma, neben einer synergistischen Wirkung hinsichtlich der TRAIL-induzierten Apoptose, unter nicht-apoptotischen Bedingungen, die durch Caspase-Inhibition oder Bcl2-Überexpression geschaffen wurden, auch eine verstärkende Wirkung auf die TRAIL-induzierten NFkB-Aktivierung in KB-Zellen entfaltet. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass FLIP, ein Inhibitor der Caspase-8-Aktivierung, dessen Expression unter anderem durch Interferon gamma reguliert wird, neben einer Apoptose-inhibierenden Wirkung auch die TRAIL-induzierte NFkB-Aktivierung in KB-Zellen inhibiert, was auf eine gemeinsame Regulation beider Mechanismen auf der Ebene des DISC (Death Inducin Signaling Complex) hindeutet. N2 - TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand) is a member of the TNF superfamily and is primarily known for its strong apoptosis inducing capability. However, it could be shown that besides its strong apoptotic potential, TRAIL can also induce non-apoptotic signaling pathways under certain conditions. In this dissertation it is shown that interferon gamma synergistically enhances the TRAIL induced activation of NFkB under non-apoptotic conditions, which were achieved by inhibition of caspases or stable expression of Bcl2 in KB-cells. Furthermore, FLIP, an inhibitor of caspase-8-activation, which is amongst others regulated by interferon gamma, is shown not only to block TRAIL-induced apoptosis but also to inhibit TRAIL-induced NFkB-activation in KB-cells, indicating that both mechanisms are coregulated at the level of the DISC (Death Inducing Signaling Complex). KW - Interferon KW - Apoptosis KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Entzündung KW - TRAIL KW - NFkB KW - cFLIP KW - Todesrezeptor KW - TRAIL KW - NFkB KW - cFLIP KW - Death Receptor Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27112 ER -