TY - THES A1 - Bettaga, Noomen T1 - Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus T1 - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in angiogenesis and arteriogenesis in mice N2 - Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gefäßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gefäßsystem wird hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gewährleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkräfte und Zytokine wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird während dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor für NO produziert die NO-GC den sekundären Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und führt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar. Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einer vollständigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zusätzlich zellspezifische Knockout-Mäuse für glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt. Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur äußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine stärkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt. Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-Mäuse eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erhöhte Tuft-Bildung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-Mäuse zeigten eine gegenüber den Kontroll-Tieren unveränderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gefäßkapillaren der Mausretina. Daher könnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich für die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Ischämie-Modells durchgeführt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterläufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell für den Arteriogenese-Prozess ist. Zusammengefasst führt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese. N2 - Nitric oxide (NO) plays an important role in vascular remodelling processes such as angiogenesis and arteriogenesis. The synthesis of NO in the vascular system is ensured mainly by endothelial NO synthase (eNOS). It can be regulated by a number of factors, such as shear stress and cytokines like the vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is an important stimulator of angiogenesis and is upregulated during this process. Most of the physiological effects of NO are mediated by the NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC). As the main receptor for NO, NO-GC produces the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and thereby leads to a variety of physiological effects. However, whether the effects of NO in angiogenesis and arteriogenesis are also mediated by NO-GC is still unclear. NO-GC consists of two subunits (α and ß). The deletion of the ß1 subunit in mice results in a global knockout mouse (GCKO). Using the Cre-LoxP system we also generated smooth muscle cell-specific (SMC GCKO) and endothelial cell-specific knockout mice (EC GCKO). To investigate the role of NO-GC in angiogenesis and arteriogenesis, three well-established methods have been used. In the first part of the project, the expression of the NO-GC in endothelial cells should be investigated. By using the reverse transcription polymerase chain reaction method (RT-PCR), the results show a very weak expression of the NO-GC in endothelial cells of the lung. A role for NO-GC in the VEGF-mediated angiogenesis was ascertained by the aortic ring assay. The results show an increased angiogenesis in the global absence of NO-GC. However, the EC-GCKO shows no difference compared to control mice. This indicates that NO-GC in endothelial cells is unlikely to play a major role in VEGF-mediated angiogenesis. In the second part of the project, the role of NO-GC in angiogenesis was investigated in an in vivo model. In the oxygen induced-retinopathy model (OIR), GCKO mice showed reduced vaso-obliteration, slowed angiogenesis and increased tuft formation. Similar results were observed in the SMC-GCKO animals. In contrast, EC-GCKO mice showed vaso-obliteration as well as angiogenesis rate and tuft formation similar to those seen in control animals. The results of this experiment suggest that NO-GC in endothelial cells is not involved in vaso-obliteration, physiological angiogenesis and tuft formation. Immunhistochemical analyses showed the expression of NO-GC in pericytes of the vascular capillaries of the mouse retina. Therefore, NO-GC in this cell type could be responsible for the effects in GCKO- and SMC-GCKO animals. In the last part of this thesis, hindlimb-ischemia experiments were performed. For this purpose, the paws of all GCKO- and some SMC-GCKO animals showed necrosis after ligation of the femoral artery. The regeneration of legs from EC-GCKO animals after the operation was normal. These results exclude a major role of NO-GC in endothelial cells, but show that NO-GC in smooth muscle cells is essential in the arteriogenesis process. In summary, the deletion of NO-GC in smooth muscle cells and probably also in pericytes leads to a slowed angiogenesis and inhibits arteriogenesis. KW - Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Angiogenese KW - Arteriogenese KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111284 ER - TY - THES A1 - Karlisch, Kaja T1 - Die Rolle der PDE3 im cGMP/cAMP-Crosstalk in NO-GC-defizienten Mäusen T1 - Role of PDE3 on cGMP/cAMP crosstalk in mice deficient in NO-sensitive guanylyl cyclase N2 - Die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) ist der wichtigste Rezeptor für das freigesetzte Signalmolekül NO und katalysiert die Bildung des second Messenger cGMP. Die NO/cGMP Signalkaskade ist im kardiovaskulären System essentiell für die Hemmung der Thrombozytenaggregation und des Tonus der glatten Gefäßmuskulatur und trägt damit zur Regulation des Blutdrucks bei. In der Arbeitsgruppe wurden Mauslinien generiert, bei denen die NO-GC ubiquitär (GCKO) oder spezifisch in glatten Muskelzellen (SM-GCKO) ausgeschaltet ist. Beide Mausstämme zeigen eine arterielle Hypertonie mit einem Anstieg des systolischen Blutdrucks um 30 mmHg im Vergleich zu den jeweiligen Kontrolltieren. Neben cGMP ist auch cAMP als weiterer second messenger in einer Reihe von Regulationsprozessen im kardiovaskulären System involviert. Die Intensität und Dauer eines cAMP-Signals wird zum einen durch seine Synthese durch die Adenylyl-Cyclasen, zum anderen durch seine Hydrolyse durch die Phosphodiesterasen (PDE) bestimmt. Dabei spielt die PDE3 als cGMP-inhibierte, cAMP-abbauende PDE eine wichtige Rolle im sogenannten cGMP/cAMP-Crosstalk. Ein wichtiges Instrument zur Untersuchung PDE3-abhängiger Prozesse ist der spezifische Hemmstoff Milrinon. Innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PDE3-Expression abhängig ist von der Expression des cGMP-produzierenden Enzyms NO-GC: So zeigte sich in Thrombozyten wie auch in glatten Gefäßmuskelzellen nach Deletion der NO-GC im Vergleich zu den Kontrolltieren eine Reduktion der PDE3 um die Hälfte. Diese Reduktion der PDE3-Expression war sowohl in den glatten Muskelzellen von GCKO wie auch von SM-GCKO-Mäusen zu finden. Weiterhin konnte dargestellt werden, dass die Down-Regulation der PDE3 in glatter Gefäßmuskulatur in SM-GCKO-Mäusen parallel zur Reduktion der NO-GC und nicht parallel zum daraus resultierenden Anstieg des Blutdrucks verläuft. Die Reduktion der PDE3-Expression ging mit einer Verminderung der Aktivität in den Thrombozyten und glatten Muskelzellen des GCKOs einher. In Herzmuskelgewebe dagegen änderten sich Expression und Aktivität der PDE3 nicht. Der spezifische PDE3-Hemmstoff Milrinon führte zu einem weiteren Anstieg des systolischen Blutdrucks in den KO-Linien, nicht aber in Kontrolltieren. Zusammenfassend spielt die PDE3 eine wichtige Rolle im cGMP/cAMP-Crosstalk sowohl in Thrombozyten als auch in glatten Gefäßmuskelzellen von Mäusen. N2 - Role of PDE3 on cGMP/cAMP crosstalk in mice deficient in NO-sensitive guanylyl cyclase KW - cGMP KW - Gen-Knockout KW - Guanylylcyclase KW - PDE3 KW - cGMP/cAMP-Crosstalk Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98857 ER - TY - THES A1 - Stangl, Christoph T1 - Lichtgesteuerte Manipulation Zentraler Second Messenger in Pflanzen T1 - Manipulation of Crucial Second Messengers in Plants by light N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unveröffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz über das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einwärts-Ströme gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei annähernd unabhängig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in höheren Pflanzen gezeigt werden. Nach Bestätigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zusätzlich und unter der Kontrolle eines östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der Möglichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums über Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind phänotypische Auffälligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verzögerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verzögerte Keimung normal und uneingeschränkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschläuche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unverändertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ansätzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Über den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsfähiges Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt. N2 - In this study, light-activated nucleotide cyclases based on bPAC (= BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), and the direct light-activated cation channel channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) have been used to non-invasively manipulate the level of the second messengers cAMP, cGMP and calcium as well as the membrane potential in plant cells by means of light. After transient transfection of N. benthamiana, the expression of the two channelrhodopsin variants C128A and C128T (unpublished data from Ronnie Gueta and G. Nagel 2008; Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010) as well as their correct localization in the plasma membrane, was shown by fluorescence microscopy imaging. The general function of channelrhodopsin as a light-activated cation channel was shown for the first time electrophysiologically in higher plants. Using impalement measurements on leaf discs, blue-light-induced depolarizations of the plasma membrane could reproducibly be evoked, which followed the given light pattern in duration and frequency. By Patch-Clamp recordings on N. benthamiana protoplasts, clear blue-light-induced inward currents were demonstrated. The expression of both employed channelrhodopsin variants C128A and C128T was almost independent from supplementation of Retinal during their expression. Furthermore, expression and function of the light activated adenylyl cyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011) and a therefrom derived light activated guanylyl cyclase bPGC::YFP (according to Ryu et al., 2010) was shown for the first time in higher plants. Two stable transgenic plant lines have been generated, which, aside to the constitutively expressed calcium reporter protein Aequorin, express the light-activated nucleotide cyclases bPAC::YFP and bPGC::YFP, respectively, under the control of an estrogen-inducible glucocorticoid promotor (Zuo et al., 2000). Also in these transgenic plants, expression and function of both light-activated nucleotide cyclases was shown. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 192 - For the first time, blue-light-induced calcium signatures in plant cells were evoked by illumination of leafdiscs of the transgenic plant lines as an implication of an elevated cNMP-level. Beside the possibility to manipulate cNMP-levels as well as the free cytoplasmic calcium concentration in those plants by means of light, a direct interrelation between these two second messengers was shown. Also physiological impairments in the generated plant lines were observed. The germination of bPAC::YFP expressing seeds was considerably delayed when grown in light. Further, the pollen tube growth of transiently bPAC::YFP-transfected pollen of Nicotiana SR-1 was fully stopped by illumination with blue light, whereas normal growth was documented under dark conditions. In contrast, bPGC-transfected pollen did not show affected growth of their pollen tubes neither in darkness nor upon blue light illumination. Beside the generated stable transgenic plant lines, two stable transgenic Arabidopsis thaliana Col-0-Aequorin cell-culture lines have been generated in an analogous approach. Also in this case, the expression of bPGC::YFP and bPAC::YFP was estrogen-inducibly expressed under control of the glucocorticoid-promotor (Zuo et al., 2000), and expression as well as function was shown by means of fluorescence microscopy imaging and cNMP-quantification using ELISA. Furthermore, a fused construct of the cAMP-gated cation channel CNGA2 (C460W-E583M, according to Rich et al., 2001) and the light activated adenylyl-cyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) was cloned using a 2A-sequence (Tang et al., 2009) and expressed in oocytes. The function of this construct has been shown electrophysiologically and immunologically. KW - Calciumion KW - Sekundärer Bote KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lichtgesteuerte Manipulation KW - Calcium KW - cAMP KW - cGMP KW - lightinduced manipulation KW - Pflanzen KW - Licht Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85940 ER - TY - THES A1 - Börner, Sebastian T1 - Die endothelialen Effekte des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) sind an der akuten Regulation des arteriellen Blutdrucks und des Blutvolumens beteiligt T1 - The endothelial effects of the atrial natriuretic peptide (ANP) are involved in the acute regulation of blood pressure and blood volume N2 - Mit dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ANP über die Aktivierung der endothelialen Guanylyl Cyklase A (GC-A) akut die Permeabilität für Albumin an postkapillären Venolen stimuliert. Durch diesen Mechanismus ist ANP neben der chronischen auch an der akuten Reduktion des Plasmavolumens und des systolischen arteriellen Blutdrucks beteiligt. Aufgrund der wichtigen extrarenalen endothelialen Effekte stellt ANP das einzige hypovolämische Hormon im Organismus dar und ist somit ein bedeutender physiologischer Regulator der transvaskulären Volumenhomöostase. Jedoch sind diese Effekte deutlich von denen der vasoaktiven Substanzen, wie z. B. Histamin oder Thrombin und anderer diuretisch wirkender Substanzen, wie z. B. Schleifendiuretika, abzugrenzen. Vermutlich wird der permeabilitätssteigernde Effekt von ANP durch die beobachtete gesteigerte PKG- und PKA-abhängige Phosphorylierung von VASP vermittelt, wodurch möglicherweise die parazelluläre Permeabilität selektiv für Albumin gesteigert wird. Den gegenregulatorischen Mechanismus zur endothelialen GC-A stellt der NPR-C dar. Durch diesen erfolgt eine verminderte PKA- und PKG-abhängige Phosphorylierung von VASP, was durch die ANP-Infusion an EC GC-A KO Mäusen beobachtet wurde und zu einer Reduktion der physiologischen Permeabilität für Albumin an den postkapillären Venolen führen könnte. Somit wird wahrscheinlich durch diesen Mechanismus das Plasmavolumen, aber nicht der systolische arterielle Blutdruck in vivo gesteigert und eine übersteigerte Reaktion der GC-A verhindert. Aufgrund der enormen Bedeutung des ANP/GC-A Systems für die Modulation der endothelialen Permeabilität und die akuten sowie chronischen Regulation des Plasmavolumens und arteriellen Blutdrucks besitzt es bei Dysfunktion eine bedeutende klinische Relevanz. Denn durch eine verminderte Sekretion von ANP oder der Dysfunktion des endothelialen GC-A-Rezeptors, durch verschiedene Single Nucleotid Polymorphismen (SNPs) oder Desensitisierung, kann dieses System an der Entstehung der essentiellen Hypertonie oder der Hypervolämie bzw. Hypernatriämie bei herzinsuffizienten Patienten beteiligt sein. N2 - Atrial natriuretic peptide (ANP) regulates arterial blood pressure and volume. Its guanylyl cyclase-A (GC-A) receptor is expressed in vascular endothelium and mediates increases in cGMP, but the functional relevance is controversial. Notably, mice with endothelial-restricted GC-A deletion [EC GC-A knockout (KO) mice] exhibit significant chronic hypervolemic hypertension. The present study aimed to characterize the endothelial effects of ANP and their relevance for the acute regulation of intravascular fluid volume. We studied the effect of ANP on microvascular permeability to fluorescein isothiocyanate-labeled albumin (BSA) using intravital microscopy on mouse dorsal skinfold chambers. Local superfusion of ANP (100 nM) increased microvascular fluorescein isothiocyanate-BSA extravasation in control but notECGC-AKO mice. Intravenous infusion of synthetic ANP (500 ng/kg min) caused immediate increases in hematocrit in control mice, indicating intravascular volume contraction. In EC GC-A KO mice, the hematocrit responses were not only abolished but even reversed. Furthermore, acute vascular volume expansion, which caused release of endogenous cardiac ANP, did not affect resting central venous pressure of control mice but rapidly and significantly increased central venous pressure of EC GC-A KO mice. In cultured lung endothelial cells, ANP provoked cGMP-dependent protein kinase I-mediated phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein. We conclude that ANP, via GC-A, enhances microvascular endothelial macromolecule permeability in vivo. This effect might be mediated by cGMP-dependent protein kinase I-dependent phosphorylation of vasodilator-stimulated phosphoprotein. Modulation of transcapillary protein and fluid transport may represent one of the most important hypovolemic actions of ANP. (Endocrinology 149: 4193–4199, 2008) KW - Atriales natriuretisches Hormon KW - Cyclo-GMP KW - Guanylatcyclase KW - Blutdruck KW - Volumenregulation KW - ANP KW - cGMP KW - GC-A KW - NPR-A KW - NPR-C KW - ANP KW - cGMP KW - GC-A KW - NPR-A KW - NPR-C Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85351 ER - TY - THES A1 - Eder, Elisabeth Christiane T1 - Die Wirkung von Sildenafil auf das kardiovaskuläre System in zwei murinen Modellen der Myokardhypertrophie T1 - Effects of Sildenafil on the cardiovascular system, investigated in two murine models of left ventricular hypertrophy N2 - Myokardhypertrophie stellt einen Adaptationsmechanismus des Herzens an erhöhte Belastungen wie chronische arterielle Hypertonie, Myokardinfarkt, Koronare Herzkrankheit, Myokarditis und Kardiomyopathien dar. Sowohl biomechanische als auch neurohumorale Stimuli führen auf einer Reihe von Signalwegen zur Myokardhypertrophie, die als Größenzunahme postmitotischer Kardiomyozyten definiert ist. Zyklisches 3´5´-Guanosinmonophosphat ist ein ubiquitärer intrazellulärer Signalträger, der im kardiovaskulären System auf mindestens drei bekannten Wegen aus Guanosintriphosphat durch Abspaltung von Pyrophosphat synthetisiert wird. Die Synthese erfolgt unter anderem durch Aktivierung der partikulären, membranständigen Guanylylzyklase A durch Atriales Natriuretisches Peptid oder „B-Typ“ Natriuretisches Peptid und der Guanylyzyklase B, durch „C-Typ“ Natriuretisches Peptid. Des Weiteren wird über neuronale, endotheliale, oder induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase Stickstoffmonoxid synthetisiert, welches die lösliche, vorwiegend zytosolisch lokalisierte Guanylyzyklase aktiviert, die wiederum aus Guanosintriphosphat zyklisches 3´5´-Guanosinmonophosphat synthetisiert. Das intrazelluläre zyklische 3´5´-Guanosinmonophosphat lässt sich durch Behandlung mit Sildenafilcitrat, einem unter dem Markennamen Viagra® zur Therapie der Erektilen Dysfunktion und Revatio® zur Therapie der pulmonalen arteriellen Hypertonie zugelassenem Pharmakon, erhöhen. Sildenafil hemmt die Phosphodiesterase 5A, ein unter anderem in Lunge, Kardiomyozyten, Kleinhirn und glatter Muskulatur vorkommendes Isoenzym. In der vorliegenden Dissertation wurden die kardialen Effekte des Phosphodiesterase 5-Inhibitors Sildenafil an zwei Mausmodellen mit funktionell gut kompensierter Herzhypertrophie getestet. Die mittlere Tagesdosis betrug 150 (Studie 1) bzw. 240 (Studie 2) mg/kg Körpergewicht Sildenafil, in Anlehnung an publizierte Studien mit Nagern (Takimoto et al., 2005b). Diese Dosis wurde oral über vier (Studie 1) bzw. neun Wochen (Studie 2) zugeführt. Die mittlere Plasmakonzentration von Sildenafil lag mit 60 nM weit über dessen IC 50 (3,5 nM) zur Hemmung der PDE 5 in vitro. Studie 1 In der ersten Studie wurde die Nachlast des Herzens mittels operativer transverser Aortenkonstriktion um ca. 25 - 35 mmHg über vier Wochen erhöht. Vergleichbare Anstiege des systolischen Blutdrucks werden in Patienten mit ausgeprägter essenzieller arterieller Hypertonie gemessen. Nekropsie, echokardiographische, histologische und morphometrische Untersuchungen zeigten übereinstimmend die Entwicklung einer konzentrischen Herzhypertrophie ohne interstitielle Fibrose. Echokardiographische Bestimmungen der linksventrikulären Funktion zeigten einen leichten Anstieg der Ejektionsfraktion bei unveränderter fraktioneller Verkürzung der Wand des linken Ventrikels. Proteinchemische Analysen an linksventrikulären Gewebeproben zeigen die Aktivierung von Signalwegen der Herzypertrophie, insbesondere der Mitogen-Aktivierten Protein Kinase ERK 1 / 2. Zusammengenommen belegen diese morphologischen, funktionellen und biochemischen Analysen, dass durch die moderate operative Aortenstenose die Entwicklung einer ausgeprägten, aber funktionell gut kompensierten Linksherzhypertrophie induziert wurde. Die Entwicklung dieser Herzhypertrophie wurde durch Sildenafil nicht verhindert. Im Gegenteil, es zeigte sich unter der Gabe des Pharmakons sogar eine leichte Tendenz zur funktionellen Verschlechterung des linken Ventrikels, mit leicht reduzierter Ejektionsfraktion und gesteigertem Lungenfeuchtgewicht. Auch die kardiale Aktivierung des Hypertrophiesignalweges MAPK / ERK wurde durch Sildenafil nicht beeinflusst. Studie 2 In der zweiten Studie wurden die Effekte von Sildenafil an einem monogenetischen Mausmodell mit globaler Deletion der Guanylylzyklase-A (GC-A -/-), dem Rezeptor für Atriales natriuretisches Peptid, getestet. Wie zuvor in publizierten Studien gezeigt wurde, haben GC-A -/- Mäuse eine chronische arterielle Hypertonie, mit Anstiegen des systolischen Blutdrucks um 20 - 25 mmHg. Nekropsie, Echokardiographie, Histologie und Morphometrie ergaben übereinstimmend, dass diese arterielle Hypertonie von einer ausgeprägten globalen, funktionell gut kompensierten Herzhypertrophie mit leichter interstitieller Fibrose begleitet wurde. Unter der neunwöchigen Behandlung mit Sildenafil kam es zu einem signifikanten aber inkomplettem Rückgang der systemischen arteriellen Hypertonie (um ca 8 - 10 mmHg). Trotz dieser hypotensiven Effekte wurden die Rechts- und Linksherzhypertrophie und die kardiale Fibrose der GC-A -/- Tiere durch Sildenafil nicht beeinflusst. Dagegen zeigte sich auch hier mittels Echokardiographie eine leichte Verschlechterung der linksventrikulären Funktion unter Sildenafil, mit Abnahmen der Ejektionsfraktion und der fraktionellen Verkürzung des linken Ventrikels sowie einer Zunahme des endsystolischen Kammerdurchmessers. Zusammenfassend wurden die in der Literatur beschriebenen protektiven, kardialen antihypertrophen Effekte von Sildenafil in der vorliegenden experimentellen Dissertation nicht bestätigt. N2 - Synthesis of cGMP in cardiomyocytes is stimulated by natriuretic peptides via GC-A signalling as well as nitric oxide (NO) via soluble guanylyl cyclase (sGC). Different studies in vitro / in vivo have demonstrated that cGMP can inhibit myocardial hypertrophic responses. In particular, genetic ablation of the ANP/GC-A or NO/sGC systems in mice led to exacerbated cardiac hypertrophy in response to pressure overload. Conversely, inhibition of cGMP catabolism with the PDE5 inhibitor sildenafil prevented and even reversed pathological cardiac hypertrophy after aortic banding [1]. The present ongoing study was originally designed to elucidate whether the antihypertrophic effects of PDE5 inhibition are linked to the formation of cGMP by either the NP/GC-A or the NO/sGC system. We subjected male C57Bl/6 mice (8 weeks of age, Charles River) to constriction of the transverse aorta (TAC) for 4 weeks. They were concurrently treated with the PDE5 inhibitor sildenafil (100 mg/kg/d) or vehicle mixed in solid food (n=7 per group).Furthermore, mice with genetic ablation of the GC-A receptor were treated with Sildenafil or Placebo. The studies demonstrate that Sildenafil does not exhibit direct antihypertrophic effects, but does exhibit indirect effects on left ventricular myocardium. Furthermore, Sildenafil is supposed to amplify the cGMP that is generated via ANP/GC-A system. KW - Linksherzhypertrophie KW - Sildenafil KW - Guanylatcyclase KW - Blutdruck KW - Cyclo-GMP KW - Transverse Aortenkonstriktion KW - Sildenafil KW - Left Ventricular Hypertrophy KW - Guanylatzklase-A KW - cGMP Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-54515 ER - TY - THES A1 - Telkamp, Myriam T1 - Untersuchung der funktionellen Interaktion zwischen der sarkolemmalen Calcium-ATPase und der neuronalen NO-Synthase T1 - Research on the functionel interaction between the sarcolemmal calcium-ATPase and the neuronal no-synthase N2 - Die Plasmamembrancalcium-ATPase (PMCA) konnte als Interaktionspartner und Inhibitor der neuronalen NO-Synthase (nNOS) in Kardiomyozyten identifiziert werden. PMCA und nNO-Synthase kommen in Caveolae von Kardiomyocyten vor. Humane PMCA4b überexprimierende Rattenherzen zeigen ex vivo eine signifikant höhere cGMP-Konzentration als wildtypische Rattenherzen. Das Ergebnis kann in mit PMCA4b und nNOS transfizierten wildtypischen und PMCA4b-überexprimierenden Kardiomyozyten bestätigt werden. Je höher die PMCA-Konzentration während der Transfektion ist, desto niedriger wird die Induktion von cGMP bei gleichbleibender nNOS-Transfektionskonzentration. Auffällig sind die absolut höheren Werte bei einer deutlich niedrigeren x-fachen Induktion von cGMP in PMCA4b-überexprimierenden Zellen. Dies deutet auf eine Anpassungsreaktion der transgenen Kardiomyozyten auf den inhibitorischen Effekt der PMCA auf die neuronale NO-Synthase. N2 - In cardiomyocytes the plasma membrane calcium/calmodulin-dependent calcium-ATPase (PMCA) interacts with the neuronal NO-synthase (nNOS) as a downregulator. PMCA and nNOS are localized to caveolae in cardiomyocytes. Human PMCA4b overexpressing rathearts show a significant higher concentration of cGMP than wildtyp hearts. The result was proved in cardiomyocytes transfected with PMCA4b and nNOS expression constructs. Increasing PMCA4b expression reduced nNOS-dependent cGMP dramatically in a dose-dependent manner. The results show that PMCA4b overexpressing cardiomyocytes are producing more cGMP than wildtyp cells. On the other hand is the induction of cGMP in PMCA4b overexpressing cardiomyocytes much lower than in wildtyp cells. These results indicate that an adaptation of the PMCA4b overexpressing cardiomyocytes concerning the downregulation of neuronal NO-synthase takes place. KW - PMCA KW - NO-Synthase KW - Kardiomyozyten KW - cGMP KW - Transfektion KW - PMCA KW - NO-Synthase KW - cardiomyocyte KW - cGMP KW - transfection Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5386 ER -