TY  - THES
A1  - Chari, Ashwin
T1  - The Reaction Mechanism of Cellular U snRNP Assembly
T1  - Der Reaktionsmechanismus zellulärer U snRNP Zusammenlagerung
N2  - Macromolecular complexes, also termed molecular machines, facilitate a large spectrum of biological reactions and tasks crucial to the survival of cells. These complexes are composed of either protein only, or proteins bound to nucleic acids (DNA or RNA). Prominent examples for each class are the proteosome, the nucleosome and the ribosome. How such units are assembled within the context of a living cell is a central question in molecular biology. Earlier studies had indicated that even very large complexes such as ribosomes could be reconstituted from purified constituents in vitro. The structural information required for the formation of macromolecular complexes, hence, lies within the subunits itself and, thus, allow for self- assembly. However, increasing evidence suggests that in vivo many macromolecular complexes do not form spontaneously but require assisting factors (“assembly chaperones”) for their maturation. In this thesis the assembly of RNA-protein (RNP) complexes has been studied by a combination of biochemical and structural approaches. A resourceful model system to study this process is the biogenesis pathway of the uridine-rich small nuclear ribonucleoproteins (U snRNPs) of the spliceosome. This molecular machine catalyzes pre-mRNA splicing, i.e. the removal of non-coding introns and the joining of coding exons to functional mRNA. The composition and architecture of U snRNPs is well defined, also, the nucleo-cytoplasmic transport events enabling the formation of these particles in vivo have been analyzed in some detail. Furthermore, recent studies suggest that the formation of U snRNPs in vivo is mediated by an elaborate assembly machinery consisting of protein arginine methyltransferase (PRMT5)- and survival motor neuron (SMN)-complexes. The elucidation of the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly would serve as a paradigm for our understanding of how RNA-protein complexes are formed in the cellular environment. The following key findings were obtained as part of this study: 1) Efforts were made to establish a full inventory of the subunits of the SMN-complex. This was achieved by the biochemical definition and characterization of an atypical component of this complex, the unrip protein. This protein is associated with the SMN-complex exclusively in the cytoplasm and influences its subcellular localization. 2) With a full inventory of the components in hand, the architecture of the SMN-complex was defined on the basis of an interaction map of all subunits. This study elucidated that the proteins SMN, Gemin7 and Gemin8 form a backbone, onto which the remaining subunits adhere in a modular manner. 3) The two studies mentioned above formed the basis to elucidate the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly. Initially, an early phase in the SMN-assisted formation of U snRNPs was analyzed. Two subunits of the U7 snRNP (LSm10 and 11) were found to interact with the PRMT5-complex, without being methylated. This report suggests that the stimulatory role of the PRMT5-complex is independent of its methylation activity. 4) Key reaction intermediates in U snRNP assembly were found and characterized by a combination of biochemistry and structural studies. Initially, a precursor to U snRNPs with a sedimentation coefficient of 6S is formed by the pICln subunit of the PRMT5-complex and Sm proteins. This intermediate was shown to constitute a kinetic trap in the U snRNP assembly reaction. Progression towards the assembled U snRNP depends on the activity of the SMN-complex, which acts as a catalyst. The formation of U snRNPs is shown to be structurally similar to the way clamps are deposited onto DNA to tether poorly processive polymerases. 5) The human SMN-complex is composed of several subunits. However, it is unknown whether all subunits of this entity are essential for U snRNP assembly. A combination of bioinformatics and biochemistry was applied to tackle this question. By mining databases containing whole-genome assemblies, the SMN-Gemin2 heterodimer is recognized as the most ancestral form of the SMN-complex. Biochemical purification of the Drosophila melanogaster SMN-complex reveals that this complex is composed of the same two subunits. Furthermore, evidence is provided that the SMN-Gemin2 heterodimer is necessary and sufficient to promote faithful U snRNP assembly. Future studies will adress further details in the reaction mechanism of cellular U snRNP assembly. The results obtained in this thesis suggest that the SMN and Gemin2 subunits are sufficient to promote U snRNP formation. What then is the function of the remaining subunits of the SMN-complex? The reconstitution schemes established in this thesis will be instrumental to address this question. Furthermore, additional mechanistic insights into the U snRNP assembly reaction will require the elucidation of structures of the assembly machinery trapped at various states. The prerequisite for these structural studies, the capability to generate homogenous complexes in sufficient amounts, has been accomplished in this thesis.
N2  - Makromolekulare Komplexe, auch molekulare Maschinen genannt, ermöglichen eine grosse Vielfalt biologischer Reaktionen und Aufgaben, die für das Überleben von Organismen kritisch sind. Diese Komplexe bestehen entweder nur aus Protein, oder setzen sich aus Protein und Nukleinsäure (DNA oder RNA) zusammen. Prominente Beispiele für diese Klassen molekularer Maschinen sind das Proteosom, das Nukleosom oder das Ribosom. Wie sich solche Einheiten innerhalb einer Zelle zusammenlagern ist eine grundlegende Frage der Molekularbiologie. Frühere Studien hatten angeduetet, dass es möglich ist sogar sehr grosse Komplexe wie das Ribosom in vitro aus gereinigten Bestandteilen zu einem aktiven Partikel zu rekonstruieren. Die Strukturinformation, die für die Bildung von makromolekularen Komplexen erforderlich ist, liegt also in den Untereinheiten selbst. Im Gegensatz dazu mehren sich heute die Hinweise dafür, dass sich viele makromolekulare Komplexe nicht spontan zusammenlagern, sondern die Aktivität assistierender Faktoren („Assembly Chaperone“) für ihre Reifung benötigen. In dieser Arbeit wurde der Zusammenbau von RNA-Protein (RNP) Partikeln durch eine Kombination aus Biochemie und Strukturbiologie untersucht. Ein ergiebiges System, um diesen Prozess zu studieren, ist die Biogenese der RNPs (U snRNPs) des Spleissosoms. Aufgabe dieser molekularen Maschine ist das Herausschneiden nicht-kodierender Introns und das Zusammenfügen kodiereneder Exons um so funktionelle mRNA zu bilden. Die Zusammensetzung und Architektur von U snRNPs sind gut definiert. Auch ist der Kern- Zytoplasma Transport, der für die Reifung dieser Partikel notwendig sind, detailliert beschrieben worden. Außerdem weisen neueste Studien darauf hin, dass die Bildung von U snRNPs in vivo durch eine komplexe Maschinerie, die aus den Protein-Arginin- Methyltransferase 5 (PRMT5)- und Survival-Motor-Neuron (SMN)- Komplexen besteht, vermittelt wird. Die Entschlüsselung des Reaktionsmechanismus des zellulärem U snRNP Zusammenbaus würde als Musterbeispiel für unser Verständnis dienen, wie RNPs in einer Zelle gebildet werden. Folgende Erkenntnisse wurden in dieser Arbeit gewonnen: 1) Es wurde zunächst versucht eine komplette Bestandsliste der Untereinheiten des SMN-Komplexes zu erstellen. Dies wurde durch die biochemische Definition und Charakterisierung einer atypischen Komponente dieses Komplexes, des Unrip Proteins, erreicht. Dieses Protein bindet ausschliesslich im Zytoplasma an den SMN-Komplex und beeinflusst dessen subzelluläre Lokalisation. 2) Die komplette Inventarisierung des SMN-Komplexes ermöglichte die Untersuchung der Wechselwirkung aller Untereinheiten und somit die Untersuchung seiner Architektur. Diese Studie zeigte, dass die Proteine SMN, Gemin7 und Gemin8 das Rückgrat des SMN-Komplexes bilden auf dem die restlichen Untereinheiten modular angeordnet werden. 3) Die zwei oben erwähnten Studien bildeten die Grundlage, den Reaktionsmechanismus zellulärer U snRNP Zusammenlagerung zu entschlüsseln. Zunächst wurde eine frühe Phase im SMN-vermittelten U snRNP Zusammenbau analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass zwei Untereinheiten des U7 snRNP (LSm10 und 11) mit dem PRMT5-Komplex wechselwirken, ohne methyliert zu werden. Dies deutet darauf hin, dass die unterstützende Rolle des PRMT5-Komplexes von seiner Methylierungsaktivität unabhängig ist. 4) Schlüsselintermediate im Zusammenschluss von U snRNPs wurden identifiziert und durch eine Kombination von Biochemie und Strukturbiologie charakterisiert. In einer ersten Stufe bildet sich ein Vorgänger von U snRNPs mit einem Sedimentationskoeffizienten von 6S aus. Dieses Intermediat, bestehend aus pICln (einer Untereinheit des PRMT5-Komplexes) und Sm Proteinen, stellt eine kinetische Falle in der U snRNP Zusammenlagerung dar. Das Voranschreiten zum maturen U snRNP hängt von der Aktivität des SMN-Komplexes ab, der als Katalysator wirkt. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Ausbildung von U snRNPs strukturell ähnlich zu der Reaktion verläuft, die Polymerasen mit geringer Prozessivität an der DNA verankert und die als „clamp-loading“ bezeichnet wird. 5) Der menschliche SMN-Komplex setzt sich aus mehreren Untereinheiten zusammen. Es ist jedoch unbekannt, ob alle Teile des Komplexes für die Zusammenlagerung von U snRNPs notwendig sind. Diese Frage wurde durch eine Kombination aus Bioinformatik und Biochemie adressiert. Durch Datenbanksuchen in komplett sequenzierten Genomen wurde festgestellt, dass die evolutionär ursprüngliche Form des SMN-Komplexes aus den zwei Proteinen SMN und Gemin2 besteht. Die biochemische Reinigung des Komplexes der Taufliege Drosophila melanogaster offenbarte, dass er auch in diesem Organismus aus denselben zwei Untereinheiten zusammengebaut ist. Außerdem wurde der Beweis erbracht, dass das SMN-Gemin2 heterodimer notwendig und hinreichend ist, um U snRNPs akkurat zusammenzulagern. Zukünftige Studien werden weitere detaillierte Ansichten des Reaktionsmechanismus in der zellulären Zusammenlagerung von U snRNPs liefern. Die Ergebnisse, die in der vorliegenden Arbeit erhalten wurden, deuten darauf hin, dass die Untereinheiten SMN und Gemin2 des SMN-Komplexes für den Zusammenbau von U snRNPs hinreichend sind. Was also ist die Funktion der weiteren Untereinheiten des SMN-Komplexes? Die Rekonstitutionsschemata, die in dieser Arbeit etabliert wurden, werden essentiell für die Beantwortung dieser Frage sein. Darüberhinaus werden weitere mechanistische Einsichten in die Zusammenlagerung von U snRNPs von der Ermittlung von Strukturen der Assembly-Maschinerie in verschiedenen Zuständen abhängen. Die Voraussetzung für diese strukturbiologische Untersuchungen, die Möglichkeit ausreichende Mengen homogener Komplexe herzustellen, ist ebenfalls in dieser Arbeit geschaffen worden.
KW  - Small nuclear RNP
KW  - Katalysator
KW  - Enzym
KW  - Maschine
KW  - Biopolymere
KW  - Makromolekül
KW  - Biogenese
KW  - Reaktionsmechanismus
KW  - Small nuclear RNP
KW  - Catalyst
KW  - Enzyme
KW  - Molecular Machine
KW  - Chaperone
KW  - Macromolecular Complex
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-40804
ER  - 
TY  - THES
A1  - Spohn, Gunther
T1  - The transcriptional control of virulence gene expression in Helicobacter pylori
T1  - Die transkriptionelle Kontrolle der Virulenzgenexpression in Helicobacter pylori
N2  - The Gram-negative, spiral-shaped, microaerophilic bacterium Helicobacter pylori is the causative agent of various disorders of the upper gastrointestinal tract, such as chronic superficial gastritis, chronic active gastritis, peptic ulceration and adenocarcinoma. Although many of the bacterial factors associated with disease development have been analysed in some detail in the recent years, very few studies have focused so far on the mechanisms that regulate expression of these factors at the molecular level. In an attempt to obtain an overview of the basic mechanisms of virulence gene expression in H. pylori, three important virulence factors of this pathogen, representative of different pathogenic mechanisms and different phases of the infectious process, are investigated in detail in the present thesis regarding their transcriptional regulation. As an essential factor for the early phase of infection, including the colonisation of the gastric mucosa, the flagella are analysed; the chaperones including the putative adhesion factors GroEL and DnaK are investigated as representatives of the phase of adherence to the gastric epithelium and persistence in the mucus layer; and finally the cytotoxin associated antigen CagA is analysed as representative of the cag pathogenicity island, which is supposed to account for the phenomena of chronic inflammation and tissue damage observed in the later phases of infection. RNA analyses and in vitro transcription demonstrate that a single promoter regulates expression of cagA, while two promoters are responsible for expression of the upstream divergently transcribed cagB gene. All three promoters are shown to be recognised by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Promoter deletion analyses establish that full activation of the cagA promoter requires sequences up to -70 and binding of the C-terminal portion of the alpha subunit of RNA polymerase to an UP-like element located between -40 and -60, while full activation of the major cagB promoter requires sequences upstream of -96 which overlap with the cagA promoter. These data suggest that the promoters of the pathogenicity island represent a class of minimum promoters, that ensure a basic level of transcription, while full activation requires regulatory elements or structural DNA binding proteins that provide a suitable DNA context. Regarding flagellar biosynthesis, a master transcriptional factor is identified that regulates expression of a series of flagellar basal body and hook genes in concert with the alternative sigma factor sigma 54. Evidence is provided that this regulator, designated FlgR (for flagellar regulatory protein), is necessary for motility and transcription of five promoters for seven basal body and hook genes. In addition, FlgR is shown to act as a repressor of transcription of the sigma 28-regulated promoter of the flaA gene, while changes in DNA topology are shown to affect transcription of the sigma 54-regulated flaB promoter. These data indicate that the regulatory network that governs flagellar gene expression in H. pylori shows similarities to the systems of both Salmonella spp. and Caulobacter crescentus. In contrast to the flagellar genes which are regulated by three different sigma factors, the three operons encoding the major chaperones of H. pylori are shown to be transcribed by RNA polymerase containing the vegetative sigma factor sigma 80. Expression of these operons is shown to be regulated negatively by the transcriptional repressor HspR, a homologue of a repressor protein of Streptomyces spp., known to be involved in negative regulation of heat shock genes. In vitro studies with purified recombinant HspR establish that the protein represses transcription by binding to large DNA regions centered around the transcription initiation site in the case of one promoter, and around -85 and -120 in the case of the the other two promoters. In contrast to the situation in Streptomyces, where transcription of HspR-regulated genes is induced in response to heat shock, transcription of the HspR-dependent genes in H. pylori is not inducible with thermal stimuli. Transcription of two of the three chaperone encoding operons is induced by osmotic shock, while transcription of the third operon, although HspR-dependent, is not affected by salt treatment. Taken together, the analyses carried out indicate that H. pylori has reduced its repertoire of specific regulatory proteins to a basic level that may ensure coordinate regulation of those factors that are necessary during the initial phase of infection including the passage through the gastric lumen and the colonisation of the gastric mucosa. The importance of DNA topology and/or context for transcription of many virulence gene promoters may on the other hand indicate, that a sophisticated global regulatory network is present in H. pylori, which influences transcription of specific subsets of virulence genes in response to changes in the microenvironment.
N2  - Das Gram-negative, spiralförmige Bakterium Helicobacter pylori verursacht verschiedene Krankheiten des oberen Verauungstraktes, wie z.B. chronische superfizielle Gastritis, chronische aktive Gastritis, Ulzera und Magenkarzinom. Obwohl viele der bakteriellen Faktoren, die zur Entwicklung dieser Krankheitsformen beitragen, in den letzten Jahren untersucht wurden, sind die molekularen Mechanismen, die die Expression dieser Faktoren regulieren, noch weitgehend unbekannt. Als Ansatz zur Untersuchung der grundlegenden Mechanismen der Virulenzgenexpression in H. pylori wurden in der vorliegenden Arbeit drei wichtige Virulenzfaktoren repräsentativ für die verschiedenen Phasen des Infektionsprozesses ausgewählt und in Bezug auf ihre transkriptionelle Regulation analysiert. Als essentielle Faktoren für die frühe Phase der Infektion, gekennzeichnet durch die Erstbesiedelung der Schleimschicht des Magens durch die Bakterien, wurden die Flagellen untersucht. Die Chaperone-Proteine mit den mutmaßlichen Adhärenzfaktoren GroEL und DnaK wurden stellvertretend für die Phase der Adhäsion an die Magenepithelzellen und die anschließende persistente Besiedelung der Magenschleimhaut analysiert. Als Verteter der cag Pathogenitätsinsel, die mit großer Wahrscheinlichkeit für die chronische Entzündung und Schädigung des Magengewebes in den späteren Phasen der Infektion verantwortlich ist, wurde schließlich das sogenannte Cytotoxin-assoziierte Antigen CagA untersucht. RNA-Analysen und in vitro-Transkriptionsstudien konnten zeigen, daß die Transkription des cagA-Gens von einem einzigen Promotor aus gesteuert wird, während die Expression des stromaufwärts gelegenen divergenten cagB-Gens von zwei Promotoren reguliert wird. Alle drei Promotoren werden von der vegetativen, sigma 80-enthaltenden RNA-Polymerase erkannt. Durch die Einführung spezifischer Deletionen zwischen cagA und cagB konnte weiterhin gezeigt werden, daß zur vollständigen Aktivierung des cagA-Promoters Sequenzen bis -70 sowie die Bindung der alpha-Untereinheit der RNA-Polymerase an ein UP-ähnliches Element zwischen -40 und -60 erforderlich sind, während die vollständige Aktivierung des wichtigsten cagB-Promotors Sequenzen oberhalb von -96 erfordert, die mit denjenigen des cagA Promoters überlappen. Diese Daten lassen darauf schließen, daß die Promotoren der Pathogenitätsinsel eine Klasse von Minimalpromotoren darstellen, die ein geringes Niveau an Transkription garantieren, für ihre volle Aktivierung aber regulatorische Elemente oder strukturelle DNA-bindende Proteine benötigen, die ein spezielles topologisches Umfeld produzieren. Bezüglich der Flagellen konnte ein zentraler Transkriptionsfaktor identifiziert werden, der in Kooperation mit dem alternativen Sigma-Faktor sigma 54 die Expression einer Serie von Genen kontrolliert, die für strukturelle Komponenten des Flagellenkörpers kodieren. Es konnte gezeigt werden, daß dieser Faktor (genannt FlgR für Flagellen-Regulator) für die Motilität der Bakterien notwendig ist und die Transkription von fünf Operonen reguliert, die für sieben strukturelle Gene des Flagellen-Basalkörpers und -Hakens kodieren. Darüberhinaus reprimiert FlgR die Transkription des sigma 28-regulierten flaA-Gens, während Änderungen der DNA-Topologie die Transkription des sigma 54-regulierten flaB-Promotors beeinflussen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß das regulatorische Netzwerk, welches die Expression der strukturellen Komponenten der Flagellen in H. pylori kontrolliert, Ähnlichkeiten zu den in Caulobacter crescentus und Salmonella spp. beschriebenen Systemen aufweist. Im Gegensatz zu den Flagellengenen, die von drei verschiedenen Sigma-Faktoren reguliert werden, konnte im Fall der drei Operone, die für die Haupt-Chaperone von H. pylori kodieren, eine sigma 80-abhängige Transkription nachgewiesen werden. Die Expression dieser Operone wird darüberhinaus negativ reguliert durch den transkriptionellen Repressor HspR, ein Homolog des gleichnamigen Hitzeschockrepressors von Streptomyces spp. In vitro-Experimente mit gereinigtem rekombinantem HspR konnten zeigen, daß das Protein die Transkription durch die Bindung an große DNA Regionen reprimiert, die in einem Fall mit dem Transkriptionsstart überlappen, und in den anderen beiden Fällen um -85 bzw. -120 lokalisiert sind. Im Gegensatz zur Situation in Streptomyces, wo die Transkription HspR-abhängiger Gene durch Hitzeschock induziert werden kann, ist die Transkription der HspR-regulierten Gene in H. pylori nicht mit Temperaturerhöhungen induzierbar. Die Expression zweier der drei Chaperone-kodierenden Operone kann dagegen durch osmotischen Schock induziert werden, während die Transkription des dritten Operons, trotz seiner HspR-Abhängigkeit, nicht durch osmotische Reize beeinflußbar ist. In ihrer Gesamtheit lassen die transkriptionellen Analysen der verschiedenen Virulenzfaktoren darauf schließen, daß H. pylori sein Repertoire an spezifischen regulatorischen Genen auf ein minimales Niveau reduziert hat, das die koordinierte Regulation derjenigen Faktoren sicherstellt, die für die Anfangsphase der Infektion, namentlich die Durchquerung des Magenlumens und die Erstbesiedelung des Magenepithels, notwendig sind. Die Bedeutung von DNA-Topologie und -Kontext für die Transkription vieler Virulenzgene könnte andererseits auf die Anwesenheit eines hochentwickelten globalen regulatorischen Netzwerkes hinweisen, welches die Transkription spezifischer Untergruppen von Virulenzgenen in Reaktion auf bestimmte Umweltfaktoren beeinflußt.
KW  - Helicobacter-pylori-Infektion
KW  - Virulenz
KW  - Genexpression
KW  - Helicobacter pylori
KW  - Transkription
KW  - Virulenzfaktoren
KW  - Flagellen
KW  - Pathogenitätsinsel
KW  - Chaperone
KW  - Helicobacter pylori
KW  - transcription
KW  - virulence factors
KW  - flagella
KW  - pathogenicity island
KW  - chaperones
Y1  - 1999
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2334
ER  -