TY - THES A1 - Chan, Gordon T1 - The Role of Vav-1, Vav-2 and Lsc in NK T cell development and NK cell cytotoxicity N2 - The hematopoietic-specific Rho-family GTP exchange factor (GEF) Vav-1 is a regulator of lymphocyte antigen receptor signaling and mediates normal maturation and activation of B and T cells. Recent findings suggest that Vav-1 also forms part of signaling pathways required for natural and antibody dependent cellular cytotoxicity (ADCC) of human NK cells. In this study, I show that Vav-1 is also expressed in murine NK cells. Vav-1-/- mice had normal numbers of splenic NK cells, and these displayed a similar expression profile of NK cell receptors as cells from wild type mice. Unexpectedly, IL-2-activated Vav-1-/- NK cells retained normal ADCC. Fc-receptor mediated activation of ERK, JNK, and p38 was also normal. In contrast, Vav-1-/- NK cells exhibited reduced natural cytotoxicity against EL4, C4.4.25, RMA and RMA/S. Together, these results demonstrate that Vav-1 is dispensable for mainstream NK cell development, but is required for NK cell natural cytotoxicity. Vav-2, a protein homologous to Vav-1 has also been implicated in NK cell functions. However, NK cells from Vav-2-/- mice have normal cytotoxic activities and NK cells that lack both Vav-1 and Vav-2 exhibit similar defect as Vav-1-/- cells. Thus Vav-2 has no apparent function in the development and the activation of NK cells. Although NK cell development is normal in Vav-1-/- mice, their numbers of NKT cells were dramatically diminished. Furthermore, NKT cells from Vav-1 mutant mice failed to produce IL-4 and IFNg following in vivo CD3 stimulation. A similar loss of NKT cells was observed in Vav-1-/-Vav-2-/- mice, but not in Vav-2-/- mice, suggesting that only Vav-1, and not Vav-2, is an essential regulator of NKT cell development and NK cell cytotoxicity. Similar to Vav-1, Lsc is a Rho GEF that is expressed specifically in the hematopoietic system. It contains a regulator of G-protein signaling (RGS) domain which negatively regulates the Ga12 and Ga13 subunits of G-protein coupled receptors (GPCRs). This study shows that NK and NKT cell development are normal in Lsc-/- mice. However, NK cells from mutant mice display enhanced cytotoxic responses towards a panel of tumor cells. These data implicate for the first time a RGS-containing Rho GEF in cytotoxic responses and suggest that Lsc down-modulate NK cell activation. N2 - Vav-1 ist ein spezifisch in hämatopoetischen Zellen exprimierter Guanin-Nukleotid-Exchange-Faktor (GEF) für Rho-GTPasen, der die Antigenrezeptor-vermittelte Signaltransduktion in Lymphocyten reguliert und essentiell für der Reifung und Aktivierung von B- und T-Zellen ist. Untersuchungen an menschlichen Zellen lassen vermuten, dass Vav1 auch für Antikörper-unabhängige, natürliche Zytotoxizität und die Antikörper-abhängige zellvermittelte Zytoxizität (ADCC) von „Natürlichen-Killerzellen“ (NK-Zellen) wichtig ist. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass Vav-1 auch in murinen NK-Zellen exprimiert ist. Analysen von Vav-1-/--Mäuse zeigen eine normale Anzahl von NK-Zellen, die wiederum ein ähnliches Expressionsprofil von typischen NK-Zell-Rezeptoren im Vergleich zu wildtypischen Mäusen aufweisen. Die ADCC von Vav-1-/- NK-Zellen ist unverändert, wie auch die Fc-Rezeptor vermittelte Aktivierung von ERK, JNK und p38. Im Gegensatz dazu zeigen Vav-1-/- NK-Zellen eine reduzierte natürliche Cytotoxizität gegenüber EL4-, C4.4.25-, RMA- und RMA/S-Zielzellen. Vav-1 ist daher nicht für die Entwicklung, sondern für den Aufbau der natürlichen Cytotoxizität von NK-Zellen von Bedeutung. Für Vav-2 wurde ebenfalls eine Rolle in NK-Zellfunktionen wahrscheinlich gemacht. Dennoch zeigen Vav-2-/- Mäuse ein normales zytotoxisches Verhalten. NK-Zellen von Vav-1/Vav-2-doppeldefizienten Tieren weisen ähnliche Defekte wie NK-Zellen von Vav-1-defizienten Tieren. Somit besitzt Vav-2 keine entscheidende Funktion für die Entwicklung und Aktivierung von NK-Zellen. Im Gegensatz zu NK-Zellen ist die Anzahl der NKT-Zellen in Vav-1-/- Mäusen drastisch reduziert. Außerdem sind NKT-Zellen Vav-1-defizienter Mäuse nicht in der Lage IL-4 und INFg nach CD3-Stimulierung in vivo zu produzieren. Ein ähnlicher Verlust der NKT-Zell-Population wurde in Vav-1-/-- Vav-2-/--Mäusen beobachtet, nicht aber in Vav-2-/- Mäusen. Daher scheint nur Vav-1, nicht aber Vav-2, ein essentieller Regulator sowohl der NKT-Zell-Entwicklung als auch der NK-Zell-Cytotoxizität zu sein. Ein weiterer Rho-GEF, Lsc, ist ebenfalls spezifisch im hämatopoetischen System exprimiert. Lsc besitzt auch eine negativ-regulatorische RGS-Domäne (regulator of G-protein signaling) für die Ga12- und Ga13-Untereinheiten von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. NK- und NKT-Zellen von Lsc-defizienten Mäusen entwickeln sich normal, weisen aber eine erhöhte Cytotoxizität gegenüber einer Reihe von Tumor-Zellen auf. Diese Daten zeigen zum ersten mal die Beteiligung eines RGS-Rho-GEF an zytotoxischen Reaktionen und deuten auf eine negative Modulation der NK-Zell-Aktivierung durch Lsc hin. KW - Maus KW - Natürliche Killerzelle KW - Cytotoxizität KW - Vav KW - Lsc/p115 Rho GEF KW - NK cells KW - cytotoxicity KW - T cells Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-3645 ER - TY - THES A1 - Monzón Casanova, Elisa T1 - Rat iNKT Cells: Phenotype and Function T1 - Ratten iNKT Zellen: Phänotyp und Funktion N2 - iNKT cells are a population of T cells with unique characteristics. In contrast to most αβ T cells which recognize peptides presented by highly polymorphic MHC molecules, iNKT cells are reactive to glycolipids presented by CD1d, a non-polymorphic MHC-I like molecule. Moreover, whereas MHC-restricted αβ T cells bear highly variable receptors (TCRs) formed after somatic recombination of the V(D)J gene segments, the TCR of iNKT cells is formed by an invariant α chain, which always contains the same gene segments: AV14 and AJ18; and a β chain of limited BV gene usage: BV8S2, BV7 or BV2, in the mouse. This invariant α chain is the reason for which these cells are named “i” and the NK part of their name refers to the expression of receptors typical of natural killer (NK) cells. iNKT cells recognize glycolipids of endogenous and microbial origin. After activation they secrete large amounts of very different cytokines such as IFN-γ and IL-4 and thus influence immune responses and pathological conditions. One of the most potent iNKT cell agonists, recognized by the semi-invariant TCR, is the synthetic glycolipid α-Galactosylceramide (α-Gal). iNKT cells can be visualized using CD1d-multimeric complexes loaded with α-Gal and flow cytometry, since this reagent has enough avidity to stain these cells. Interestingly, mouse iNKT cells can be stained with human α-Gal-loaded CD1d oligomers and human iNKT cells can also be visualized with mouse α-Gal-loaded CD1d oligomers, indicating a high degree of conservation of the recognition of α-Gal presented by CD1d through evolution. Previous studies showed that rats have the genes necessary to build semi-invariant TCRs: They have a CD1d homologue; one or two BV8S2 homologues and interestingly, up to ten AV14 gene segments, which are highly conserved when compared to the mouse genes. Importantly, it has been shown at least for two of these AV14 gene segments that they can produce invariant TCRα chains which, when coexpressed with BV8-containing β chains, react to α-Gal presented by rat CD1d. Furthermore, ex vivo stimulation of primary splenocytes with α-Gal results in the secretion of IL-4 and IFN-γ. Surprisingly, rat semi-invariant TCRs do not recognize α-Gal presented by mouse CD1d and accordingly, mouse α-Gal-loaded CD1d tetramers failed to stain a discrete population of rat iNKT cells. Taking all together, despite that strong evidence suggested that iNKT cells are present in the rat, the direct identification of such population and the analysis of CD1d-restricted immune responses were still pending for this species. Hence the work presented in this doctoral thesis was aimed to identify iNKT cells, to analyze their phenotype and also to study the distribution and function of CD1d in the rat. For these purposes, we produced essential reagents which were still lacking such as rat specific anti-CD1d monoclonal antibodies and rat CD1d oligomers. Importantly, two of three anti-rat CD1d monoclonal antibodies (all of them generated in our laboratory before this thesis was initiated) also recognized mouse CD1d and therefore allowed a direct comparison of CD1d expression between rat and mouse. Whereas CD1d distribution in the hematopoietic system was found to be extremely similar between these two species; in non-lymphatic tissues important differences were observed. Interestingly, CD1d protein was detected at not yet described sites such as the rat exocrine pancreas and rat and mouse Paneth cells. These monoclonal antibodies did not only allowed the analysis of CD1d expression, but also the first demonstration of the function of rat CD1d as an antigen presenting molecule, since cytokine release in response to α-Gal was blocked when they were added to ex vivo cultures of rat primary cells. Staining of primary rat iNKT cells (possible now with the newly generated rat CD1d oligomers) revealed interesting similarities with human iNKT cells. First, we observed that rat iNKT cells are only a minority among all NKR-P1A/B positive T cells. Human iNKT cells constitute also a very small proportion of NKR-P1A (CD161) expressing T cells, whereas in mice inbred strains which express NKR-P1C (NK1.1), most of NKRP1C expressing T cells are iNKT cells. Second, the majority of rat iNKT cells are either CD4 or DN and only a small proportion expresses CD8β. These findings are similar to humans and different to mice which lack CD8+ iNKT cells. Third, analysis of various inbred rat strains demonstrated different iNKT cell frequencies which correlated with cytokine secretion after α-Gal stimulation of primary cells. In comparison to mice, iNKT cell numbers are markedly reduced in rats. In F344 rats, inbred rat strain which released the highest cytokine amounts after α-Gal stimulation, approximately 0.25% and 0.1% of total liver and spleen lymphocytes, respectively, are iNKT cells. In contrast, in LEW rats iNKT cells were practically absent and neither IL-4 nor IFN-γ were detected after stimulation of primary cells with α-Gal. Once more, these frequencies are very close to those observed in humans. Last, as reported for human peripheral blood cells, rat iNKT cells could be easily expanded in vitro by adding α-Gal to cultures of intrahepatic lymphocytes, whereas the expansion of mouse iNKT cells was not possible using the same protocol. The presence of a multimember AV14 gene segment family in the rat is an intriguing characteristic. These AV14 gene segments are extremely homologous except in the CDR2α region. Based on the amino acid sequence of this region they have been divided into two different types: Type I and II. A specific tissue distribution of the different types was proposed in the first study where the presence of several AV14 gene segments was described. We also analyzed the AV14 gene segment usage in F344 and LEW inbred rat strains. In F344 rats we found no preferential usage of either AV14 gene segment type in the spleen and the liver but type II AV14 gene segments appeared more frequently in the thymus. In contrast, LEW rats show a preferential usage of type I AV14 gene segments in all three compartments analyzed: Thymus, spleen and liver. Taken all together, the usage of newly generated reagents allowed to gain novel insights into CD1d expression in the rat and in the mouse and to directly identify rat iNKT cells for the first time. The phenotypic and functional analysis of rat iNKT cells revealed numerous similarities with human iNKT cells. These are of special interest, since rats serve to investigate several pathological conditions including models for autoimmune diseases. The possibility now to analyze iNKT cells and CD1d-restricted T cell responses in the rat might help to understand the pathogenesis of such diseases. In addition, the uncomplicated in vitro expansion and culture of rat iNKT cells should facilitate the analysis of the immunomoldulatory capacities of these cells. N2 - iNKT Zellen sind eine Population von T Zellen mit einigen Besonderheiten. Anders als die meisten αβ T Zellen, deren T Zell Rezeptoren (TZRs) für von hochpolymorphen MHC Molekülen präsentierte Peptide spezifisch sind, erkennen iNKT Zellen Glycolipide die von CD1d, einem nicht polymorphem MHC-I artigen Moleküle, präsentiert werden. Während MHC-restringierte αβ T Zellen sehr unterschiedliche TZRs haben, die nach somatischer Rekombination der V(D)J Gensegmente generiert werden, besteht der TZR der iNKT Zellen aus einer invarianten α Kette und einer β Kette mit einem limitierten BV Gen Repertoire (BV8S2, BV7 und BV2 in Maus). Die invariante α Kette, auf die das i im Namen der iNKT Zellen verweist, enthält in der Maus immer AV14 und AJ18 kodierte V-Regionen. Das NK in ihrem Namen verweist darauf, dass sie häufig NK-Zell typische Oberflächenmoleküle exprimieren. iNKT Zellen erkennen Glycolipide endogenen und mikrobiellen Ursprungs und sezernieren nach Aktivierung große Mengen verschiedener Zytokine wie zum Beispiel IL-4 und IFN-γ. Auf diese Weise beeinflussen sie Immunantwort und pathologische Zustände. Eine der potentesten iNKT-Zell-TZR Agonisten ist das α-Galactosylceramid (α-Gal) und α-Gal beladene CD1d-Multimere ermöglichen es iNKT Zellen zu färben und mittels Durchflusszytometrie sichtbar zu machen. Die hohe Konservierung der iNKT TZR-CD1d Interaktion ermöglicht es sogar, Maus iNKT Zellen mittels α-Gal beladenen humanen CD1d-Multimere zu färben. Vorhergehende Studien zeigten, dass Ratten die notwendigen Gene für die Generierung der semi-invarianten TZR haben: Sie besitzen ein CD1d Homolog, ein oder zwei BV8S2 Homologe und bis zu zehn AV14 Gensegmente, die im Vergleich zu den Maus-AV14 Genen hoch konserviert sind. Mehrere dieser AV14 Gensegmenten wurden mit AJ18 zusammen rearrangiert gefunden und für mindestens zwei dieser invarianten α Ketten wurde gezeigt, dass sie zusammen mit BV8 enthaltenden β Ketten TZR bilden, die von CD1d präsentiertes α-Gal erkennen. Weiterhin wurde gezeigt, dass primäre Ratten- Milzzellen und intrahepatische Lymphozyten nach Kultur mit α-Gal IL-4 und IFN-γ sezernieren. Auf Grund dieser Befunde und der starken Konservierung der CD1d Gene und der Gene, die die semi-invarianten TZR kodieren, überrascht es, dass keine definierte Zellpopulation von intrahepatischen Rattenlymphozyten mittels α-Gal beladenen Maus CD1d-Tetrameren gefärbt wurde. Zusammengefasst kann gesagt werden, dass die direkte Identifizierung der Zellen und die Analyse der CD1d restringierten Immunantworten in der Ratten noch austand, obwohl es starke Hinweise für die Existenz der iNKT Zellen in dieser Art gab. Infolgedessen sind die Ziele dieser Arbeit: die Identifizierung der Ratten iNKT Zellen, die Analyse ihres Phänotyps und die Untersuchung der CD1d-restringierten Immunantworten. Um diese Ziele zu erreichen, wurden noch fehlende essentielle Reagenzien hergestellt, wie die ersten Ratten-CD1d spezifischen monoklonalen Antikörper und Ratten CD1d Oligomere. Zwei der drei charakterisierten monoklonalen Antikörpern erkennen sowohl Ratten CD1d als auch Maus CD1d. Dies ermöglichte den direkten Vergleich der CD1d Expression zwischen beiden Spezies (diese Antikörper wurden in unserem Labor vor dem Anfang dieser Doktorarbeit hergestellt). Während die CD1d Verteilung im hämatopoetischen System beider Arten äußerst ähnlich ist, wurden in nicht lymphatischen Geweben sehr starke Unterschiede gefunden. Interessanterweise wurde das CD1d Protein auch an noch nicht beschriebenen Stellen wie im exokrinen Pankreas der Ratte und in Paneth Zellen von Maus und Ratte beobachtet. Die monoklonalen Antikörper erlaubten nicht nur die Analyse der CD1d Verteilung, sondern auch den Beweis der Funktion von CD1d als Antigen präsentierendes Molekül, weil die Zugabe der Antikörper zu ex vivo Kulturen von primären Zellen die Sekretion von Zytokinen bei der Stimulation mit α-Gal hemmt. Färbungen von primären Ratten iNKT Zellen, jetzt möglich durch die neu generierte Ratten CD1d-Dimere, zeigten interessante Gemeinsamkeiten mit humanen iNKT Zellen. Es wurde erstens beobachtet, dass Ratten iNKT Zellen nur eine Minderheit unter allen NKR-P1A/B positiven T Zellen sind. Dies ähnelt den humanen iNKT Zellen, die ebenfalls auch nur ein sehr kleinen Teil der NKR-P1A (CD161) exprimierenden T Zellen stellen, während in Mausstämmen, die NKR-P1C (NK1.1) exprimieren, die Mehrheit der NKR-P1C positiven T Zellen iNKT Zellen sind. Zweitens sind die meisten Ratten iNKT Zellen CD4 positiv oder doppelt negativ während nur ein kleiner Anteil CD8β exprimiert. Diese Befunde gleichen denen mit humanen iNKTs und unterscheiden sich von Maus iNKTs, die immer CD8β negativ sind. Drittens zeigt die Analyse von verschiedenen Rattenstämmen, ähnlich wie beim Menschen, 10-100 fach geringere Frequenzen von iNKT Zellen als in der Maus. In F344 Ratten sind etwa 0.25% aller Lymphozyten in der Leber und etwa 0.1% aller Milzzellen iNKT Zellen. Wobei dies der Rattenstamm ist, der die größte Mengen an Zytokinen nach α-Gal Stimulation produziert. In LEW Ratten, die keine Zytokine nach α-Gal Stimulation produzierten, konnten iNKT Zellen praktisch nicht gefärbt werden. Schließlich konnten, wie bei humanen peripherischen Blutzellen beobachtet, Ratten iNKT Zellen durch alleinige Zugabe von α-Gal in vitro expandiert werden, während dies mit Maus iNKT Zellen nicht möglich war. Eine faszinierende bislang nur in der Ratte gemachte Beobachtung ist die Existenz einer AV14 Multigenfamilie, deren Mitglieder bis auf die CDR2 kodierende Region hochhomolog sind. Basiert auf der Aminosäuresequenz dieser Region wurde diese Familie in zwei Gruppen aufgeteilt: Typ I und II. Die erste Studie, in der diese zwei verschiedenen Typen beschrieben wurden, schlug eine spezifische Gewebsverteilung von AV14 positiven TCR vor. Wir haben ebenfalls die Benutzung dieser AV14 Gene in F344 und LEW Inzuchtrattenstämmen analysiert und gefunden, dass es in F344 Leber und Milz keine Präferenz für einen bestimmten AV14 Typ gibt. Jedoch wurde der Typ II häufiger in F344 Thymus gefunden. Im Vergleich zeigen LEW Ratten eine bevorzugte Benutzung des Typ I in allen analysierten Geweben (Thymus, Milz und Leber). Zusammengefasst kann gesagt werden, dass diese Studie mit Hilfe neu generierter Reaganzien neue Erkenntnisse zur CD1d Expression in Ratte und Maus gewonnen wurden und erstmals eine direkte phänotypische und funktionelle Analyse von iNKT Zellen der Ratte durchgeführt wurde. Es wurden eine Reihe von Gemeinsamkeiten zwischen iNKT Zellen von Ratte und Mensch gefunden. Diese sind vor allem deshalb von Interesse, da das Versuchstier Ratte für eine Reihe von Autoimmunkrankheiten und andere pathologische Zustände als Modellorganismus dient. Es ist zu erwarten, dass weitere Untersuchungen von CD1d-restringierten Zellen der Ratte neue Einsichten in die Genese dieser Krankheiten ermöglicht. Darüberhinaus sollte die in der Ratte beobachtete einfach durchzuführende in vitro Kultur und Expansion von iNKT Zellen eine Analyse ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften deutlich erleichtern. KW - Ratte KW - Natürliche Killerzelle KW - Immunologie KW - CD1d KW - rat KW - NKT Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56526 ER - TY - THES A1 - Müller-Leisse, Johanna T1 - Influence of myeloid-derived suppressor cells and neutrophil granulocytes on natural killer cell homeostasis and function T1 - Einfluss myeloider Suppressorzellen und neutrophiler Granulozyten auf die Homöostase und Funktion natürlicher Killerzellen N2 - Polymorphonuclear neutrophils (PMNs) are phagocytic cells of the innate immune system that efficiently kill bacteria. However, they also have regulatory effects on other immune cells and contribute to immunosuppression in cancer, which worsens the outcome. In particular, this has been demonstrated for a subset of granulocytic cells called myeloid- derived suppressor cells (MDSCs), but its distinction from PMNs is controversial. Most authors have explored the suppressive effects of MDSCs on T cells, but recent data suggest that NK cells are also affected. NK cells are crucial for the combat of tumor cells, in particular leukemic cells. There is hardly data available on the interaction between NK cells and suppressive granulocytic cells. Therefore, the aim of this thesis was to explore the effects of MDSCs and PMNs on the NK cell function against the leukemia cell line K562. In co-culture experiments, I demonstrate that granulocytic MDSCs and PMNs had similar effects on NK cell function and homeostasis. On the one hand, they positively influenced the survival and maturation of NK cells. On the other, they inhibited the activation, cytotoxicity and cytokine production of NK cells, both IFNγ and TNFα, in response to K562 target cells. Furthermore, I show a down-regulation of the activating receptor NKp30 on NK cells in the presence of MDSCs or PMNs, which may form part of the underlying suppressive mechanisms. However, there is also evidence for the involvement of other molecules. Further investigations are needed to confirm a relevant suppression of NK cells by granulocytic cells in cancer patients, and to identify therapeutic targets. The recognition that regular PMNs have similar effects on NK cells as MDSCs could simplify future experiments, since MDSCs are heterogeneous and laborious to isolate and identify. NKcells and granulocytes are among the first immune cells to reconstitute after hematopoietic stem cell transplantation, and NK cells may be particularly exposed to suppressive effects of granulocytes this scenario. Modulating these suppressive effects of granulocytes on NK cells therapeutically may yield a better NK cell function and an improved cancer prognosis.  N2 - Neutrophile Granulozyten (polymorphonuclear neutrophils, PMNs) sind Zellen des angeborenen Immunsystems, die insbesondere Bakterien durch Phagozytose unschädlich machen. Zusätzlich haben sie jedoch immunregulatorische und sogar immunsuppressive Eigenschaften. Sie tragen zur Suppression des Immunsystems im Rahmen von Tumorerkrankungen bei, was die Prognose negativ beeinflusst. Dies wurde insbesondere für einen Subtyp von Granulozyten, so genannte myeloide Suppressorzellen (myeloid-derived suppressor cells, MDSCs), gezeigt, wobei deren Unterscheidung von PMNs kontrovers diskutiert wird. Die meisten Autoren untersuchten suppressive Effekte von MDSCs auf T Zellen, doch auch NK Zellen sind betroffen. Eine funktionierende NK Zell Antwort ist entscheidend für die Abwehr von Tumorerkrankungen, insbesondere Leukämie. Über die Interaktion von NK Zellen und MDSCs ist bisher wenig bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss von MDSCs und PMNs auf die NK Zell Antwort auf Leukämiezellen zu untersuchen. In Co-Kultur Experimenten zeige ich, dass granulozytäre MDSCs und PMNs ähnliche Effekte auf die Funktionen und Homöostase von NK Zellen haben. Einerseits wirkten sie sich positiv auf das Überleben und die Reifung der NK Zellen aus, andererseits hemmten sie deren Aktivierung, Zytotoxizität und Zytokinproduktion (sowohl IFNg als auch TNFa) als Antwort auf die Leukämie Zelllinie K562. Ferner war der Aktivierungsrezeptor NKp30 auf NK Zellen unter dem Einfluss der Granulozyten vermindert exprimiert, was mit für die inhibitorische Effekte verantwortlich sein könnte. In weiteren Experimenten sollte die Relevanz der hier gezeigten Effekte in vivo bestätigt werden und die zugrundeliegenden Mechanismen untersucht werden. Der Hinweis, dass PMNs ähnliche hemmende Effekte auf NK Zellen ausüben wie MDSCs kann zukünftige Experimente vereinfachen, da die Isolierung der MDSCs aufwändig und uneinheitlich ist. NK Zellen und neutrophile Granulozyten sind unter den ersten Immunzellen, die sich nach einer hämatopoietischen Stammzelltransplantation erholen. NK Zellen könnten in dieser Situation besonders den hemmenden Einflüssen der Granulozyten unterliegen. Ein therapeutisches Eingreifen in diese Interaktion könnte die NK Zell Antwort stärken und die Prognose von Leukämieerkrankungen verbessern. KW - Natürliche Killerzelle KW - Neutrophiler Granulozyt KW - Neutrophil granulocytes interaction KW - Immunsuppression KW - MDSC KW - NK Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-140734 ER - TY - THES A1 - Pyz, Elwira T1 - Identification of rat NKT cells and molecular analysis of their surface receptor mediated activation N2 - Zusammenfassung NKT Zellen wurden ursprünglich über die gleichzeitige Expresion eines T-Zellantigenrezeptors (TZR) und den NK-Zellmarkern NKRP1A im Menschen bzw. NK1.1. (NKRP1C) in der Maus definiert. In Mensch und Maus exprimieren die meisten NKT Zellen CD1d restringierte TZR mit charakteristischen Genumlagerungen- Va24JaQ/Vb11 im Menschen und Va14Ja18/Vb8.2 in der Maus. Den NKT Zellen werden außerdem wichtige Funktionen in der „first line defence“ und der Immunregulation zugesprochen. Gegenstand der Doktorarbeit war die Charakterisierung eines hypothetischen Gegenstückes in der Ratte. In der Maus wurden rund 30% der intrahepatischen Lymphozyten (IHL) und 3% der Milzlymphozyten als CD1d restringierte NK T Zellen identifiziert und konnten mittels a-GalCer beladenen Maus-CD1d Tetramer visualisiert werden. Wie in der Maus wurden in der Ratte NKRP1A+TZR+ Zellen vorwiegend in der Leber gefunden, waren aber fünfmal weniger häufig. F344 Ratten NKT Zellen waren darüber hinaus im Gegensatz zu den CD4+ oder CD4-CD8- Maus NKT Zellen meistens CD8 positiv und banden kein mCD1d Tetramer. Da in der menschlichen Leber CD1d-restringierte Va24JQ+ T Zellen ebenfalls viel seltener als in der Maus sind, scheint es nun möglich, daß der Phänotyp der Ratten NKT Zellen eher dem des Menschen als dem der Maus entspricht. Ein Test der Fähigkeit von F344 Leber- und Milzlymphozyten nach Kultur mit a-GalCer Cytokine zu produzieren, ergab ähnlich wie in der Maus eine Produktion von IL-4 und IFN-g;. Aus diesem Grund kann eine fehlende Reaktivität von Ratten NKT Zellen für a-GalCer nicht der Grund für eine fehlende mCD1d Tetramerbindung sein. Um die Reaktivität der NKRP1A+TZR+ Rattenzellen auf a-GalCer besser zu verstehen, wurde der Ratten TZR analysiert. RT-PCR von Leberlymphozyten mit Va14-spezifischen Primern und die Analyse der klonierten PCR Produkte ergab ein viel schwächeres Signal für Ratten als für Maus cDNA. Darüber hinaus zeigten Sequenzanalysen, daß das Va14 auch mit anderen J als dem für TCRinv typischem Ja18 rearrangiert war. Die niedrige Anzahl von Va14Ja18 „in frame“ Umlagerungen legt Nahe, daß nur ein kleiner Anteil der Leber-lymphozyten CD1d restringierte NKT Zellen sind. Maus und humane NKT Zellen erkennen durch CD1d-b2m Komplexe präsentiertes a-GalCer und reagieren mit Aktivierung, Proliferation und Cytokinproduktion. Um die Fähigkeit von Maus und Ratten-CD1d a-GalCer zu präsentieren, zu testen, wurde das CD1d Molekül der Ratte kloniert. Sequenzanlyse und funktionelle Tests bestätigten die strukturelle und funktionelle Homologie des CD1d beider Spezies. Gleichzeitig wurde zur Analyse der Reaktivität von NKRP1A+TZR+ Zellen auf a-GalCer ein Ratten Va14+ invarianter TZR kloniert und in einem TZR- T-Zellhybridom (BWr/mCD28) exprimiert. Zellen die transgenen Ratten Va14+TZR und CD28 exprimierten, sezernierten IL-2 nach Stimulation mit aTZR/CD3 Antikörper aber zeigten keine Spezifität für a-GalCer. Die fehlende Reaktivität für a-GalCer und die fehlende Bindung von mCD1-a-GalCer Tetramer waren wahrscheinlich durch Aminosäuresubstitionen insbesondere an Position 71 (51 nach IMGT Nomenklatur) der klonierten TZRa Kette begründet. Eine „Umkehrung“ dieser Änderung wurde mittels molekularbiologischer Techniken durchgeführt aber Expression dieses TZR auf BWr/mCD28 wurde nicht erreicht. Im Gegensatz zum invarianten Va14+ Ratten TZR war der Maus Va14+ TZR voll funktional und spezifisch für mCD1d Tetramer. KT12 Hybridom und Maus TZRinv exprimierende BWr/mCD28 Zellen wurden sowohl durch Ratten als durch Maus CD1d präsentiertes a-GalCer aktiviert. Dasselbe galt für TZR, die eine Maus Va14 TZR Kette und eine Ratten Vb8.4 TZR Kette enthielten. Im Gegensatz hierzu antworteten Linien mit mVa14 und Ratten Vb8.2 nur auf durch Ratten und nicht auf durch Maus CD1d präsentiertes a-GalCer und banden nahezu kein mCD1d Tetramer. Dies legt Nahe, daß Keimbahn kodierte der b-Kettenbereiche (CDR2 oder CDR4) speziesspezifische Bereiche des CD1d erkennen. Weiterhin wurde gefunden, das die Zytokinsekretion der Zellinien durch CD80 spezifische monoklonale Antikörper inhibiert wurde, was eine wichtige Rolle der CD80-CD28 Interaktion bei der Aktivierung dieser Zellen nahelegt. Um zu sehen ob NKT Zellen auch in anderen Rattenstämmen als F344 existieren, wurde Häufigkeit und Funktion von NKRP1A+TZR+ Zellen in F344 und LEW Ratten miteinander verglichen. F344 und LEW, zwei Rattenstämme die unterschiedliche CD1d Allele tragen, zeigten in der Analyse mit einem neu generierten rCD1d spezifischen monoklonalen Antikörper nur geringe Unterschiede in der Expressionsstärke. Hingegen, unterschieden sich beide Stämme in der Reaktivität für a-GalCer. NKRP1A+ Zellen waren in der LEW Ratte weniger häufig als in der F344 Ratte und antworteten in vitro nicht auf a-GalCer oder sein Analogon OCH. Ein Resultat, das insbesodere angesichts der besonderen Empfänglichkeit von LEW Ratten für experimentell induzierte organspezifische Autoimmunerkrankungen von besonderem Interesse ist. Zusammgefasst kann gesagt werden, daß das Maus und Ratten CD1d/TZRinv NKT Zellsystem hohe strukturelle und funktionale Homologie aufweist, aber daß es wie im Menschen weniger invariante NKT Zellen in der Ratte als in der Maus gibt. TZR transgene Zelllinien wiesen ein speziesspezifisches Muster in der a-GalCer Erkennung auf, das für die Analyse von CDd/TZR-Kontaktbereichen von großem Nutzen sein wird. Dasselbe gilt für den Ratten und Maus-CD1d-spezifischen monoklonalen Antikörper, der im Rahmen der Studie generiert wurde. Dieser kann bei der Charakterisierung der CD1d Proteinexpression in verschiedenen Geweben und der besseren funktionellen Charakterisierung von CD1d restringierten T Zellen der Ratte eingesetzt werden. N2 - Summary: Originally, NKT cells have been defined by their expression of T-cell receptor (TCR) and NK cell markers NKRP1A in human and NK1.1 (NKRP1C) in mouse. Most of these cells express CD1d-restricted TCR with a characteristic rearrangement- Va24JaQ/Vb11 in human and Va14Ja18/Vb8.2 in mouse, and have been implicated in playing an important role in first line defence and immunoregulation. The subject of this thesis was the characterisation of the hypothetical rat NKT cell population. In the mouse system, CD1d-restricted NK1.1+ T cells represented around 30% of intrahepatic and around 3% of splenic lymphocytes and could be visualised by staining with a-GalCer-loaded mouse CD1d tetramer. Rat NKRP1A+TCR+ cells, similar to mouse NKT cells, were predominantly expressed in the liver. However, their frequency was around 5 fold lower than the frequency of mouse intrahepatic lymphocytes. F344 rat NKT cells, in contrast to mouse CD4+ or DN NK1.1+ T lymphocytes, were of CD8 rather than CD4 phenotype, and did not bind to mCD1d-a-GalCer-tetramer. Since human hepatic CD1d-restricted Va24JQ+ T cells are not as frequent as their mouse counterparts and may express CD8- a marker not expressed by mouse CD1d-restricted cells, it is possible that the phenotype of F344 rat NKT cells corresponds more to the phenotype of human than mouse NKT cells. Similar to mouse NKT cells, F344 rat liver- and spleen-derived lymphocytes were able to produce IL-4 and IFN-g; when stimulated with the synthetic ligand a-GalCer in vitro. Therefore, the lack of binding of rat lymphocytes to mouse CD1d tetramer could not be due to their inability to respond to a-GalCer. To better characterise the reactivity of rat NKRP1A+TCR+ cells to a-GalCer, the rat invariant TCR was analysed. RT-PCR of liver lymphocytes with Va14-specific primers and subsequent cloning revealed a much weaker PCR signal for rat lymphocyte cDNA than for mouse cDNA. Furthermore the analysis of rat AV14JA18 sequences showed that the rat Va14+TCR invariant could be rearranged not only with AJ18 but also with other AJ segments. The low number of clones with in frame Va14Ja18 rearrangement could suggest that only a small proportion of liver lymphocytes were CD1d restricted NKT cells. Mouse and human NKT cells are able to recognise a-GalCer presented by the CD1d-b2 microglobulin complex, leading to their activation, proliferation and cytokine secretion. In order to compare the capacity of mouse and rat CD1d to present a-GalCer, rat CD1d was cloned. Sequence analysis and functional tests in vitro confirmed the structural and functional homology of rat CD1d with mouse CD1d. In parallel, to characterise the reactivity of rat NKRP1A+TCR+ cells to a-GalCer, rat Va14+TCR invariant was cloned and expressed in the TCR- T cell hybridoma BWr/mCD28. Rat Va14TCR+CD28+ transgenic cells secreted IL-2 upon aTCR/CD3 antibody stimulation, but were not specific for a-GalCer. Such cells were also negative in staining with mCD1d-a-GalCer tetramer. The lack of reactivity to a-GalCer and the lack of binding to mouse tetramer were probably caused by amino acid alterations, particularly at position 72 (51 according to IMTG nomenclature) of cloned rat TCRinv. Reversal of these “alterations” using molecular biology techniques was performed but the expression of this TCR on the surface of BWr/mCD28 cells could not be achieved. In contrast to rat TCRinv, mouse Va14+TCR was fully functional and was specific for mouse CD1d tetramer. KT12 hybridoma and BWr/mCD28 cells expressing mouse TCRinv, when stimulated with a-GalCer presented by primary CD1d+ cells or rCD1d transgenic cell lines, produced IL-2 in an Ag- and CD1d-dependent manner. Transgenic lines expressing TCR comprising mouse Va14 and rat Vb8.4 responded to a-GalCer presented by rat and mouse CD1d, and bound mCD1 tetramer. By contrast, cell lines expressing TCR comprising mouse Va14 and rat Vb8.2 responded only to a-GalCer presented by rCD1d and bound weakly to mCD1d tetramer. This suggests that germ line encoded regions of the b-chain (CDR2 or CDR4) bind to species-specific determinants of CD1d. The cytokine secretion of the cell lines was inhibited by anti-CD80 mAb, indicating the importance of CD80-CD28 costimulation in their activation. To check whether rat NKT cells may exist in other rat strains, the frequency and functions of NKRP1A+TCR+ in F344 and LEW rat were compared. F344 and LEW, two rat strains expressing different allelic CD1d forms, varied slightly in the level of CD1d expression, as assessed by staining with a newly generated CD1d specific monoclonal antibody. By contrast, these rat strains differed in terms of a-GalCer recognition. NKRP1A+TCR+ cells were less frequent in LEW than in F344 rats, and did not respond to a-GalCer or the analogue OCH in vitro, a result which is of special interest considering the susceptibility of LEW but not F344 rats to experimentally induced organ specific autoimmune diseases. In summary, the rat and mouse CD1d-invariant TCR systems show a high degree of structural and functional homology, but it seems that invariant NKT cells in rat, similar to such cells in human, occur at lower frequency than in mice. TCR transgenic cell line species-specific patterns of CD1d a-GalCer reactivity will provide a valuable tool for the mapping of CD1d/TCR contacts. Also monoclonal antibodies specific for rat and mouse CD1d, generated in this study, provide valuable tools to determine CD1d protein expression in various rat tissues and will help to better characterise functions of CD1d-restricted rat T cells. KW - Ratte KW - Natürliche Killerzelle KW - Zellrezeptor KW - NKT Zellen KW - CD1d KW - NKT cells KW - CD1d Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9767 ER - TY - THES A1 - Trinks, Nora Isabel T1 - Super-resolution fluorescence microscopic visualization and analysis of interactions between human immune cells and \(Aspergillus\) \(fumigatus\) T1 - Hochaufgelöste, fluoreszenzmikroskopische Visualisierung und Analyse der Interaktionen zwischen humanen Immunzellen und \(Aspergillus\) \(fumigatus\) N2 - The mold Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) is known as human pathogen and can cause life-threatening infections in humans with a weakened immune system. This is a known complication in patients receiving glucocorticoids, e.g. after hematopoietic stem cell transplantation or solid organ transplantation. Although research in the field of immune cell/fungus interaction has discovered key strategies how immune cells fight against infectious fungi, our knowledge is still incomplete. In order to develop effective treatment options against fungal infections, a detailed understanding of their interactions is crucial. Thus, visualization of immune cell and fungus is an excellent approach to gain further knowledge. For a detailed view of such interaction processes, a high optical resolution on nanometer scale is required. There is a variety of super resolution microscopy techniques, enabling fluorescence imaging beyond the diffraction limit. This work combines the use of three complementary super resolution microscopy techniques, in order to study immune cell/fungus interaction from different points of view. Aim of this work is the introduction of the recently invented imaging technique named expansion microscopy (ExM) for the study of immune cell/fungus interactions. The core aspect of this method is the physical magnification of the specimen, which increases the distance between protein structures that are close to each other and which can therefore be imaged separately. The simultaneous magnification of primary human natural killer (NK) cells and A. fumigatus hyphae was established in this work using ExM. Reorganization of cytoskeletal components of interacting NK cells was demonstrated here, by expansion of the immunological synapse (IS), formed between NK cells and A. fumigatus. In addition, reorganization of the microtubule-organizing center (MTOC) towards fungal hyphae and an accumulation of actin at the IS has been observed. Furthermore, ExM has been used to visualize lytic granules of NK cells after degranulation. After magnification of the specimen, lysosome associated protein 1 (LAMP1) was shown to surround perforin. In absence of the plasma membrane-exposed degranulation marker LAMP1, a “ring-shaped” structure was often observed for fluorescently labeled perforin. Volume calculation of lytic granules demonstrated the benefit of ExM. Compared to pre-expansion images, analyses of post-expansion images showed two volume distributions for degranulated and non-degranulated NK cells. In addition, this work emphasizes the importance of determining the expansion factor for a structure in each species, as variations of expansion factors have been observed. This factor, as well as possible sample distortions should be considered, when ExM is used in order to analyze the interaction between two species. A second focus of this work is the visualization of a chimeric antigen receptor (CAR), targeting an epitope on the cell wall of A. fumigatus. Structured illumination microscopy (SIM) revealed that the CAR is part of the immunological synapse of primary human CAR T cells and CAR-NK-92 cells. At the interaction site, an accumulation of the CAR was observed, as well as the presence of perforin. CAR accumulation at fungal hyphae was further demonstrated by automated live cell imaging of interacting CAR-NK-92 cells, expressing a fluorescent fusion protein. Additionally, the use of direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) gave first insights in CAR expression levels on the basal membrane of CAR-NK-92 cells, with single molecule sensitivity. CAR cluster analyses displayed a heterogeneous CAR density on the basal membrane of transfected NK 92 cells. In summary, this work provides insights into the application of ExM for studying the interaction of primary human NK cells and A. fumigatus for the first time. Furthermore, this thesis presents first insights regarding the characterization of an A. fumigatus-targeting CAR, by applying super-resolution fluorescence microscopy, like SIM and dSTORM. N2 - Der Schimmelpilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) ist bekannt als Humanpathogen und kann lebensbedrohliche Infektionen bei Menschen mit einem geschwächten Immunsystem verursachen. Dies ist eine bekannte Komplikation bei Patienten die Glucocorticoide erhalten, z.B. nach einer hämatopoetischen Stammzelltransplantation oder soliden Organtransplantation. Obwohl die Forschung im Bereich der Immunzelle/Pilz Interaktion Schlüsselstrategien entdeckt hat, wie Immunzellen infektiöse Pilze bekämpfen, ist unser Wissen immer noch unvollständig. Um effektive Therapieoptionen gegen Pilzinfektionen zu entwickeln, ist ein detailliertes Verständnis ihrer Interaktionen äußerst wichtig. Die Visualisierung von Immunzelle und Pilz ist daher ein exzellenter Ansatz um weitere Erkenntnisse zu gewinnen. Für einen detaillierten Einblick in solche Interaktionsprozesse ist eine hohe optische Auflösung im Nanometerbereich erforderlich. Hierzu gibt es eine Vielzahl an hochauflösenden Mikroskopietechniken, die es ermöglichen, Fluoreszenzbildgebung jenseits der Beugungsbegrenzung zu erzielen. Diese Arbeit kombiniert die Nutzung von drei sich ergänzenden hochauflösenden Mikroskopietechniken, um die Interaktion von Immunzelle/Pilz aus verschiedenen Blickwinkeln zu studieren. Ziel dieser Arbeit ist das Einführen der kürzlich entwickelten Bildgebungsmethode, namens Expansions-Mikroskopie (engl. expansion microscopy, kurz: ExM), um Immunzelle/Pilz Interaktionen zu studieren. Kernaspekt dieser Methode ist die physische Vergrößerung der Probe, wodurch der Abstand zwischen nahe beieinanderliegenden Proteinstrukturen vergrößert wird und diese daher separiert aufgenommen werden können. Die simultane Vergrößerung von primären humanen Natürlichen Killerzellen (engl. Natural Killer, kurz: NK) und A. fumigatus Hyphen wurde in dieser Arbeit mittels ExM etabliert. Durch Expansion der Immunologischen Synapse (engl. immunological synapse, kurz: IS), ausgebildet zwischen NK Zellen und A. fumigatus, konnte hier die Reorganisation von Bestandteilen des Zytoskeletts interagierender NK Zellen gezeigt werden. Darüber hinaus konnte eine Reorganisation des Mikrotubuli-organisierenden Zentrums (engl. microtubule-organizing center, kurz: MTOC) in Richtung Pilzhyphen, sowie eine Anreicherung von Aktin an der IS beobachtet werden. Außerdem konnte ExM genutzt werden, um lytische Granula von NK Zellen nach Degranulation zu visualisieren. Für das Lysosom-assoziierte Membranprotein 1 (engl. lysosome-associated protein 1, kurz: LAMP1) konnte nach Vergrößerung der Probe gezeigt werden, dass es Perforin umgibt. Unter Abwesenheit des Plasmamembran-exponierten Degranulations-Markers LAMP1 wurde oft eine „ringförmige“ Struktur für fluoreszenzmarkiertes Perforin beobachtet. Die Volumen Berechnung von lytischen Granula demonstrierte den Nutzen der ExM. Im Vergleich zu Analysen von Bildern vor Expansion, zeigten Analysen von Bildern nach Expansion zwei Verteilungen für die Volumengröße degranulierter und nicht-degranulierter NK Zellen. Zusätzlich unterstreicht diese Arbeit die Wichtigkeit, den Expansionsfaktor für eine Struktur aus jeder Spezies zu bestimmen, da Variationen für Expansionsfaktoren beobachtet wurden. Dieser Faktor sollte ebenso wie mögliche Proben-Deformationen in Betracht gezogen werden, wenn ExM genutzt wird, um die Interaktion zwischen zwei Spezies zu analysieren. Ein zweiter Fokus dieser Arbeit ist die Visualisierung eines chimärischen Antigenrezeptors (engl. chimeric antigen receptor, kurz: CAR), der ein Epitop auf der Zellwand von A. fumigatus erkennt. Strukturierte Beleuchtungs-Mikroskopie (engl. structured illumination microscopy, kurz: SIM) zeigte, dass der CAR Teil der Immunologischen Synapse von primären CAR-T Zellen und CAR-NK-92 Zellen ist. Eine Anreicherung des CARs, an der Interaktionsseite wurde beobachtet, so wie das Vorhandensein von Perforin. Die Anreicherung vom CAR an der Pilz-Hyphe wurde ferner durch automatisierte Lebend-Zell-Bildgebung interagierender CAR-NK-92 Zellen demonstriert, die ein fluoreszierendes Fusionsprotein exprimieren. Zusätzlich lieferte das Nutzen von direkter stochastischer optischer Rekonstruktions-Mikroskopie (engl. direct stochastic optical reconstruction microscopy, kurz: dSTORM) erste Einblicke in CAR Expressionslevel auf der basalen Membran von CAR-NK-92 Zellen, mit Einzelmolekül Empfindlichkeit. CAR Cluster Analysen zeigten eine heterogene CAR Dichte auf der basalen Membran transfizierter NK-92 Zellen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Arbeit erstmals Einblicke in die Anwendung von ExM für die Untersuchung der Interaktion von primären humanen NK Zellen und A. fumigatus liefert. Zudem präsentiert die Thesis erste Einblicke hinsichtlich der Charakterisierung eines A. fumigatus-erkennenden CARs, unter Anwendung von hochauflösender Fluoreszenzmikroskopie, wie SIM oder dSTORM. KW - Mikroskopie KW - Konfokale Mikroskopie KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Aspergillus fumigatus KW - Natürliche Killerzelle KW - Expansion Microscopy KW - Structured Illumination Microscopy Y1 - 2024 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-266407 ER - TY - THES A1 - Weiß, Esther T1 - Host-pathogen interactions of natural killer cells and Aspergillus fumigatus: Relevance of immune cell cross-talk and fungal recognition receptors T1 - Wirt-Pathogen Interaktionen von natürlichen Killerzellen und Aspergillus fumigatus: Relevanz von Immunzellinteraktionen und fungalen Erkennungsrezeptoren N2 - The human pathogen Aspergillus (A.) fumigatus is a fungal mold that can cause severe infections in immunocompromised hosts. Pathogen recognition and immune cell cross-talk are essential for clearing fungal infections efficiently. Immune cell interactions in particular may enhance individual cell activation and cytotoxicity towards invading pathogens. This study analyzed the reciprocal cell activation of natural killer (NK) cells and monocyte-derived dendritic cells (moDCs) after stimulation with A. fumigatus cell wall fractions and whole-cell lysates. Furthermore, the impact of the on moDCs expressed fungal receptors Dectin-1 and TLR-2 on NK cell activation was analyzed. Stimulation of moDCs with ligands for Dectin-1 and TLR-2 and transfer of soluble factors on autologous NK cells showed that moDCs could induce NK cell activation solely by secreting factors. In summary, both cell types could induce reciprocal cell activation if the stimulated cell type recognized fungal morphologies and ligands. However, moDCs displayed a broader set of A. fumigatus receptors and, therefore, could induce NK cell activation when those were not activated by the stimulus directly. Consequently, new fungal receptors should be identified on NK cells. The NK cell characterization marker CD56 was reduced detected in flow cytometry after fungal co-culture. Notably, this decreased detection was not associated with NK cell apoptosis, protein degradation, internalization, or secretion of CD56 molecules. CD56 was shown to tightly attach to hyphal structures, followed by its concentration at the NK-A. fumigatus interaction site. Actin polymerization was necessary for CD56 relocalization, as pre-treatment of NK cells with actin-inhibitory reagents abolished CD56 binding to the fungus. Blocking of CD56 suppressed fungal mediated NK cell activation and secretion of the immune-recruiting chemokines MIP-1α, MIP-1β, and RANTES, concluding that CD56 is functionally involved in fungal recognition by NK cells. CD56 binding to fungal hyphae was inhibited in NK cells obtained from patients during immune-suppressing therapy after allogeneic stem cell transplantation (alloSCT). Additionally, reduced binding of CD56 correlated with decreased actin polymerization of reconstituting NK cells challenged with the fungus. The immune-suppressing therapy with corticosteroids negatively influenced the secretion of MIP-1α, MIP-1β, and RANTES in NK cells after fungal stimulation ex vivo. Similar results were obtained when NK cells from healthy donors were treated with corticosteroids prior to fungal co-culture. Thus, corticosteroids were identified to have detrimental effects on NK cell function during infection with A. fumigatus. N2 - Der humanpathogene Pilz Aspergillus (A.) fumigatus kann lebensbedrohliche Infek-tionen in immunsupprimierten Patienten verursachen. Die Immunerkennung von Patho-genen sowie die Wechselwirkungen zwischen Immunzellen sind essentiell für die erfolg-reiche Bekämpfung von Pilzinfektionen. Zell-Zell-Interaktionen tragen zur gegenseitigen Aktivierung bei und können somit die Zytotoxizität gegenüber eindringenden Pathogenen steigern. In dieser Arbeit wurde die gegenseitige Zellaktivierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) und die aus Monozyten generierten, dendritischen Zellen (DZ) nach Stimula-tion mit Zellwandfraktionen und Zelllysaten des Pilzes A. fumigatus analysiert. Des Weite-ren wurde der Einfluss dendritischer Rezeptoren auf die NK-Zellaktivierung untersucht. Die Stimulation mit Liganden für Dectin-1 und TLR-2 induzierte die Freisetzung löslicher Faktoren, welche ausreichend waren, um autologe NK-Zellen zu stimulieren. Zusammen-fassend ist zu sagen, dass DZ mehr Rezeptoren zur Pilzerkennung exprimieren und so-mit NK-Zellen auch dann aktivieren konnten, wenn diese, aufgrund fehlender Rezepto-ren, nicht stimuliert wurden. Basierend auf diesen Ergebnissen sollten neue Pathogen-Erkennungsrezeptoren auf NK-Zellen identifiziert werden. Der Charakterisierungsmarker CD56 zeigte nach fun-galer Kokultur eine reduzierte Detektion in durchflusszytometrischen Analysen. Die ver-minderte Proteindetektion von CD56 war nicht assoziiert mit Apoptose, Internalisation, Sekretion oder Proteindegradierung. Weitere Analysen bestätigten eine starke CD56-Bindung zu Pilzhyphen, gefolgt von einer Konzentration des Proteins an der NK-A. fumi-gatus Interaktionsstelle. Diese Relokalisation zeigte eine Abhängigkeit zu Aktin, da Zytos-kelett-Inhibitoren die CD56-Bindung am Pilz verhinderten. Eine spezifische Blockade von CD56 Rezeptoren reduzierte die Freisetzung der immun-rekrutierenden Chemokine MIP-1α, MIP-1β und RANTES, was folgern ließ, dass CD56 eine funktionelle Rolle in der Pil-zerkennung der NK-Zellen hat. NK-Zellen, die während einer Immunsuppressionstherapie aus Empfängern einer al-logenen Stammzelltransplantation (alloSZT) gewonnen wurden, zeigten eine inhibierte Bindung von CD56 an Pilzhyphen. Diese korrelierte mit einer reduzierten Aktinpolymeri-sation nach fungaler Stimulation. Weiterhin hemmte eine Immunsuppressionstherapie mit Corticosteroiden die Sekretion von MIP-1α, MIP-1β und RANTES in NK-Zellen, die mit Pilz ex vivo stimuliert wurden. Ähnliches war zu beobachten, wenn NK-Zellen von ge-sunden Spendern vor Pilzstimulation mit Corticosteroiden vorbehandelt wurden. Daraus folgend wurde den Corticosteroiden ein negativer Einfluss auf die NK-Zellfunktion bei Pilzinfektionen zugesprochen. KW - Natürliche Killerzelle KW - Aspergillus fumigatus KW - Dendritische Zelle KW - NK cell KW - host-pathogen interaction KW - allogeneic stem cell transplantation KW - NK-DC cross-talk KW - DC Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-206077 ER -