TY  - THES
A1  - Schiebel, Johannes
T1  - Structure-Based Drug Design on Enzymes of the Fatty Acid Biosynthesis Pathway
T1  - Strukturbasiertes Wirkstoffdesign an Enzymen der Fettsäurebiosynthese
N2  - Während die Wirkung der meisten gebräuchlichen Antibiotika auf einer Beeinträchtigung wichtiger bakterieller Prozesse beruht, wirken manche Substanzen durch die Störung der Zellmembran-Struktur. Da Fettsäuren ein essentieller Bestandteil von Membran-Phospholipiden sind, stellt die bakterielle Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) einen relativ wenig erforschten, aber dennoch vielversprechenden Angriffspunkt für die Entwicklung neuer Antibiotika dar. Das wichtige Antituberkulotikum Isoniazid blockiert die mykobakterielle Fettsäurebiosynthese und ruft dadurch morphologische Änderungen sowie letztlich die Lyse des Bakteriums hervor. Eine wichtige Erkenntnis war, dass Isoniazid den letzten Schritt des FAS-II Elongationszyklus inhibiert, der durch die Enoyl-ACP Reduktase katalysiert wird. Darauf aufbauend wurden mehrere Programme ins Leben gerufen, die sich zum Ziel gesetzt hatten, neue Moleküle zu entwickeln, welche dieses Protein verschiedener Pathogene hemmen. Die S. aureus Enoyl-ACP Reduktase (saFabI) ist von besonders großem Interesse, da drei vielversprechende Inhibitoren dieses Proteins entwickelt werden konnten, die momentan in klinischen Studien eingehend untersucht werden. Trotz dieser Erfolgsaussichten waren zum Zeitpunkt, als die vorliegenden Arbeiten aufgenommen wurden, keine Kristallstrukturen von saFabI öffentlich verfügbar. Daher war es eines der Hauptziele dieser Doktorarbeit, auf der Basis von kristallographischen Experimenten atomar aufgelöste Modelle für dieses wichtige Protein zu erzeugen. Durch die Entwicklung einer verlässlichen Methode zur Kristallisation von saFabI im Komplex mit NADP+ und Diphenylether-Inhibitoren konnten Kristallstrukturen von 17 verschiedenen ternären Komplexen gelöst werden. Weitere kristallographische Experimente ergaben zwei apo-Strukturen sowie zwei Strukturen von saFabI im Komplex mit NADPH und 2-Pyridon-Inhibitoren. Basierend auf der nun bekannten saFabI-Struktur konnten Molekulardynamik-Simulationen durchgeführt werden, um zusätzliche Erkenntnisse über die Flexibilität dieses Proteins zu erhalten. Die so gewonnenen Informationen über die Struktur und Beweglichkeit des Enzyms dienten in Folge als ideale Grundlage dafür, den Erkennungsprozess von Substrat und Inhibitor zu verstehen. Besonders bemerkenswert dabei ist, dass die verschiedenen saFabI Kristallstrukturen Momentaufnahmen entlang der Reaktionskoordinate der Ligandenbindung und des Hydrid-Transfers repräsentieren. Dabei verschließt der so genannte Substratbindungsloop das aktive Zentrum des Enzyms allmählich. Die außergewöhnlich hohe Mobilität von saFabI konnte durch molekulardynamische Simulationen bestätigt werden. Dies legt nahe, dass die beobachteten Änderungen der Konformation tatsächlich an der Aufnahme und Umsetzung des Substrates beteiligt sind. Eine Kette von Wassermolekülen zwischen dem aktiven Zentrum und einer wassergefüllten Kavität im Inneren des Tetramers scheint für die Beweglichkeit des Substratbindungsloops und somit für die katalysierte Reaktion von entscheidender Bedeutung zu sein. Außerdem wurde die erstaunliche Beobachtung gemacht, dass der adaptive Substratbindungsprozess mit einem Dimer-Tetramer Übergang gekoppelt ist, welcher die beobachtete positive Kooperativität der Ligandenbindung erklären kann. Alles in allem weist saFabI im Vergleich zu FabI Proteinen aus anderen Organismen mehrere außergewöhnliche Eigenschaften auf, die für die Synthese von verzweigten Fettsäuren nötig sein könnten, welche wiederum für die Überlebensfähigkeit von S. aureus im Wirt von Bedeutung sind. Diese Erkenntnis könnte erklären, warum S. aureus selbst bei Anwesenheit von exogenen Fettsäuren von FAS-II Inhibitoren abgetötet werden kann. Somit können die gewonnenen atomaren saFabI Modelle einen entscheidenden Beitrag zur Entwicklung neuer Hemmstoffe dieses validierten Angriffszieles leisten. Tatsächlich konnten die neuen Strukturen genutzt werden, um die Bindungsstärken sowie die Verweilzeiten verschiedener saFabI Inhibitoren molekular zu erklären. Die Struktur von saFabI im Komplex mit dem 2-Pyridon Inhibitor CG400549 hingegen enthüllte spezifische Wechselwirkungen in der geweiteten Bindetasche des S. aureus Enzyms, welche das geringe Aktivitätsspektrum dieses derzeit klinisch erprobten Inhibitors erklären. Diese Studien schaffen somit eine ideale Voraussetzung für die Entwicklung neuer wirksamer saFabI Inhibitoren, was am Beispiel des 4-Pyridons PT166 belegt werden kann. Im Rahmen der vorliegenden Dissertation konnten außerdem die Strukturen des Enzyms KasA im Komplex mit mehreren Derivaten des Naturstoffs Thiolactomycin gelöst werden.
N2  - Whereas most currently used antibiotics act by interfering with essential bacterial processes, a smaller group of antibacterials disturbs the integrity of the cell membrane. Since fatty acids are a vital component of membrane phospholipids, the type-II fatty acid biosynthesis pathway (FAS-II) of bacteria constitutes a promising drug target. The front-line anti-tuberculosis prodrug isoniazid blocks the FAS-II pathway in M. tuberculosis thereby leading to morphological changes and finally to cell lysis. When it became evident that the enoyl-ACP reductase in the FAS-II pathway is the target of the activated isoniazid, several programs were initiated to develop novel inhibitors directed against this protein in different pathogens. The S. aureus enoyl-ACP reductase (saFabI) is of particular interest since three promising drug candidates inhibiting this homologue have reached clinical trials. However, despite these prospects, no crystal structures of saFabI were publicly available at the time the present work was initiated. Thus, one major goal of this thesis was the generation of high-resolution atomic models by means of X-ray crystallography. The development of a highly reproducible approach to co-crystallize saFabI in complex with NADP+ and diphenyl ether-based inhibitors led to crystal structures of 17 different ternary complexes. Additional crystallographic experiments permitted the view into two apo-structures and two atomic models of saFabI in complex with NADPH and 2-pyridone inhibitors. Based on the established saFabI structure, molecular dynamics (MD) simulations were performed to improve our understanding of the conformational mobility of this protein. Taken together, these investigations of the saFabI structure and its flexibility served as an ideal platform to address important questions surrounding substrate and inhibitor recognition by this enzyme. Intriguingly, our saFabI structures provide several vastly different snapshots along the reaction coordinate of ligand binding and hydride transfer, including the closure of the flexible substrate binding loop (SBL). The extraordinary mobility of saFabI was confirmed by MD simulations suggesting that conformational motions indeed play a pivotal role during substrate delivery and turnover. A water chain linking the active site with a water-basin inside the homo-tetrameric enzyme was found likely to be crucial for the closure and opening of the SBL and, thus, for the catalyzed reaction. Notably, the induced-fit ligand binding process involves a dimer-tetramer transition, which could be related to the observed positive cooperativity of cofactor and substrate binding. Overall, saFabI displays several unique characteristics compared to FabI proteins from other organisms that might be necessary for the synthesis of branched-chain fatty acids, which in turn are required for S. aureus fitness in vivo. This finding may explain why S. aureus is sensitive to FAS-II inhibitors even in the presence of exogenous fatty acids. Accordingly, saFabI remains a valid drug target and our structures can be used as a molecular basis for rational drug design efforts. In fact, binding affinity trends of diphenyl ether inhibitors and, more importantly, the correlated residence times could be rationalized at the molecular level. Furthermore, the structure of saFabI in complex with the 2-pyridone inhibitor CG400549 revealed unique interactions in the wider binding crevice of saFabI compared to other FabI homologues explaining the narrow activity spectrum of this clinical candidate with proven human efficacy. In summary, these studies provide an ideal platform for the development of new, effective saFabI inhibitors as exemplified by the promising 4-pyridone PT166. In the context of this dissertation, crystal structures of the condensing enzyme KasA in complex with several analogs of the naturally occurring inhibitor thiolactomycin have been solved.
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Kristallstruktur
KW  - Enoyl-acyl-carrier-protein-Reductase
KW  - Fettsäurebiosynthese
KW  - Enoyl-Reduktase
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - fatty acid biosynthesis
KW  - enoyl reductase
KW  - Staphylococcus aureus
KW  - Fettsäurestoffwechsel
KW  - Inhibition
KW  - Wirkstoff
KW  - Lipide
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69239
ER  - 
TY  - THES
A1  - Luckner, Sylvia
T1  - Towards the development of high affinity InhA and KasA inhibitors with activity against drug-resistant strains of Mycobacterium tuberculosis
T1  - Entwicklung von hoch-affinen InhA und KasA Inhibitoren gegen resistente Stämme von Mycobacterium tuberculosis
N2  - Mycobacterium tuberculosis is the causative agent of tuberculosis and responsible for more than eight million new infections and about two million deaths each year. Novel chemotherapeutics are urgently needed to treat the emerging threat of multi drug resistant and extensively drug resistant strains. Cell wall biosynthesis is a widely used target for chemotherapeutic intervention in bacterial infections. In mycobacteria, the cell wall is comprised of mycolic acids, very long chain fatty acids that provide protection and allow the bacteria to persist in the human macrophage. The type II fatty acid biosynthesis pathway in Mycobacterium tuberculosis synthesizes fatty acids with a length of up to 56 carbon atoms that are the precursors of the critical mycobacterial cell wall components mycolic acids. KasA, the mycobacterial ß-ketoacyl synthase and InhA, the mycobacterial enoyl reductase, are essential enzymes in the fatty acid biosynthesis pathway and validated drug targets. In this work, KasA was expressed in Mycobacterium smegmatis, purified and co-crystallized in complex with the natural thiolactone antibiotic thiolactomycin (TLM). High-resolution crystal structures of KasA and the C171Q KasA variant, which mimics the acyl enzyme intermediate of the enzyme, were solved in absence and presence of bound TLM. The crystal structures reveal how the inhibitor is coordinated by the enzyme and thus specifically pinpoint towards possible modifications to increase the affinity of the compound and develop potent new drugs against tuberculosis. Comparisons between the TLM bound crystal structures explain the preferential binding of TLM to the acylated form of KasA. Furthermore, long polyethylene glycol molecules are bound to KasA that mimic a fatty acid substrate of approximately 40 carbon atoms length. These structures thus provide the first insights into the molecular mechanism of substrate recognition and reveal how a wax-like substance can be accommodated in a cytosolic environment. InhA was purified and co-crystallized in complex with the slow, tight binding inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70). Two crystal structures of the ternary InhA-NAD+-PT70 were solved and reveal how the inhibitor is bound to the substrate binding pocket. Both structures display an ordered substrate binding loop and corroborate the hypothesis that slow onset inhibition is coupled to loop ordering. Upon loop ordering, the active site entrance is more restricted and the inhibitor is kept inside more tightly. These studies provide additional information on the mechanistic imperatives for slow onset inhibition of enoyl ACP reductases.
N2  - Mycobacterium tuberculosis, der Erreger der Tuberkulose ist für mehr als acht Millionen Neu-Infektionen und ungefähr zwei Millionen Todesfälle jedes Jahr verantwortlich. Besonders die Entwicklung von multiresistenten und extrem resistenten Stämmen macht die Entwicklung neuer Medikamente gegen Tuberkulose dringend erforderlich. Die Zellwandbiosynthese ist ein validiertes Ziel für die Chemotherapie bei bakteriellen Infektionen. Bei Mycobakterien besteht die Zellwand zum Großteil aus Mykolsäuren, sehr langkettigen Fettsäuren, die den Bakterien Schutz bieten und ihnen ermöglichen, in Makrophagen zu überleben. Mycobakterien synthetisieren in der Fettsäurebiosynthese II (FAS-II) Fettsäuren bis zu einer Länge von 56 Kohlenstoffatomen, die Bestandteile der Mykolsäuren sind. KasA, die mycobakterielle ß-ketoacyl Synthase und InhA, die mycobakterielle enoyl Reductase, sind essentielle Enzyme der FAS-II und geeignete Ziele für die Entwicklung neuer Antibiotika. In dieser Arbeit wurde KasA in Mycobacterium smegmatis exprimiert und aufgereinigt. Das Protein wurde im Komplex mit dem natürlich vorkommenden Thiolacton-Antibiotikum Thiolactomycin (TLM) co-kristallisiert. Kristallstrukturen von KasA und der C171Q KasA Variante, die das acylierte Enzym-Intermediat darstellt, wurden als apo-Strukturen und im Komplex mit gebundenem TLM aufgeklärt. Die Kristallstrukturen zeigen, wie der Inhibitor an das Enzym gebunden ist und deuten darauf hin, wie das TLM Molekül verändert werden könnte, um seine Affinität für das Protein zu erhöhen und damit ein wirksames Medikament gegen Tuberkulose zu entwickeln. Vergleiche zwischen den TLM gebundenen Kristallstrukturen erklären, warum TLM bevorzugt an die acylierte Form des Enzyms bindet. Des Weiteren sind lange Polyethylenglykol-Moleküle an KasA gebunden, die ein Fettsäuresubstrat einer Länge von etwa 40 Kohlenstoff-Atomen nachahmen. Die Strukturen geben damit zum ersten Mal einen Einblick in den molekularen Mechanismus der Substrat-Erkennung und zeigen, wie eine wachsartige Substanz in einem cytosolischen Umfeld aufgenommen werden kann. InhA wurde aufgereinigt und im Komplex mit dem „slow binding“ Inhibitor 2-(o-tolyloxy)-5-hexylphenol (PT70) co-kristallisiert. Zwei Kristallstrukturen des ternären InhA-NAD+-PT70 Komplexes wurden gelöst und zeigen wie der Inhibitor in der Substratbindetasche gebunden ist. Beide Strukturen, weisen geordnete Substrat-Binde-Loops auf, die den Eingang zur „Active Site“ schließen und damit den gebundenen Inhibitor in der Tasche festhalten. Die Strukturen bestätigen damit die Hypothese, dass „Slow Binding Inhibition“ mit der Ordnung des Loops zusammenhängt. Diese Studien können als Basis für die Entwicklung weiterer „Slow Binding“ Inhibitoren verwendet werden.
KW  - Tuberkelbakterium
KW  - Multidrug-Resistenz
KW  - Arzneimitteldesign
KW  - Fettsäure-Synthase
KW  - Zellwand
KW  - Kristallstruktur
KW  - tuberculosis
KW  - multi-drug-resistance
KW  - drug development
KW  - fatty acid synthesis
KW  - cell wall
KW  - crystal structure
KW  - structure based drug design
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43621
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TY  - THES
A1  - Jung, Lisa Anna
T1  - Targeting MYC Function as a Strategy for Tumor Therapy
T1  - Hemmung der MYC-Funktion als Strategie für die zielgerichtete Tumortherapie
N2  - A large fraction of human tumors exhibits aberrant expression of the oncoprotein MYC. As a transcription factor regulating various cellular processes, MYC is also crucially involved in normal development. Direct targeting of MYC has been a major challenge for molecular cancer drug discovery. The proof of principle that its inhibition is nevertheless feasible came from in vivo studies using a dominant-negative allele of MYC termed OmoMYC. Systemic expression of OmoMYC triggered long-term tumor regression with mild and fully reversible side effects on normal tissues.
In this study, OmoMYC’s mode of action was investigated combining methods of structural biology and functional genomics to elucidate how it is able to preferentially affect oncogenic functions of MYC.
The crystal structure of the OmoMYC homodimer, both in the free and the E-box-bound state, was determined, which revealed that OmoMYC forms a stable homodimer, and as such, recognizes DNA via the same base-specific DNA contacts as the MYC/MAX heterodimer. OmoMYC binds DNA with an equally high affinity as MYC/MAX complexes. RNA-sequencing showed that OmoMYC blunts both MYC-dependent transcriptional activation and repression. Genome-wide DNA-binding studies using chromatin immunoprecipitation followed by high-throughput sequencing revealed that OmoMYC competes with MYC/MAX complexes on chromatin, thereby reducing their occupancy at consensus DNA binding sites. The most prominent decrease in MYC binding was seen at low-affinity promoters, which were invaded by MYC at oncogenic levels. Strikingly, gene set enrichment analyses using OmoMYC-regulated genes enabled the identification of tumor subgroups with high MYC levels in multiple tumor entities. Together with a targeted shRNA screen, this identified novel targets for the eradication of MYC-driven tumors, such as ATAD3A, BOP1, and ADRM1.
In summary, the findings suggest that OmoMYC specifically inhibits tumor cell growth by attenuating the expression of rate-limiting proteins in cellular processes that respond to elevated levels of MYC protein using a DNA-competitive mechanism. This opens up novel strategies to target oncogenic MYC functions for tumor therapy.
N2  - Eine Vielzahl humaner Tumore entsteht durch die aberrante Expression des Onkoproteins MYC. Da MYC als Transkriptionsfaktor viele zelluläre Prozesse reguliert, ist er auch maßgeblich an der Entwicklung von normalem Gewebe beteiligt. Die direkte Hemmung von MYC stellt eine große Herausforderung für die Wirkstoffentwicklung dar. Studien mit dem dominant-negativen MYC-Allel namens OmoMYC belegten, dass MYC ein potenzieller Angriffspunkt für die zielgerichtete Tumortherapie ist. Die systemische Expression dieser MYC-Mutante löste eine dauerhafte Tumorregression aus und zeigte milde sowie vollständig reversible Nebenwirkungen. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Wirkmechanismus von OmoMYC untersucht, wobei sowohl Methoden der Strukturbiologie als auch der funktionalen Genomik angewendet wurden.
Die Kristallstruktur des OmoMYC Proteins wurde im freien und E-Box-gebundenen Zustand bestimmt. Dadurch konnte gezeigt werden, dass OmoMYC ein stabiles Homodimer bildet. Als solches erkennt es DNA mittels derselben basenspezifischen Interaktionen wie der MYC/MAX-Komplex. Dabei bindet OmoMYC DNA mit einer ähnlichen Affinität wie das MYC/MAX-Heterodimer. Die genomweite Expressionsanalyse mittels RNA-Sequenzierung identifiziert eine Reduktion sowohl der MYC-abhängigen Transkriptionsaktiverung als auch der Transkriptionsrepression durch OmoMYC. Mittels Chromatin-Immunpräzipitation gefolgt von einer Hochdurchsatz-Sequenzierung wird gezeigt, dass OmoMYC mit MYC/MAXKomplexen
auf Chromatin konkurriert und so deren Besetzung global an Konsensus-Bindestellen verringert. Die stärkste Reduktion zeigt sich an Promoterregionen mit schwacher Affinität für die MYC-Bindung, welche durch onkogene MYC-Proteinmengen aufgefüllt werden. Gene set enrichment-Analysen unter Berücksichtigung von OmoMYC-regulierten Genen erlaubten die Identifizierung von Tumor-Subgruppen mit hohen MYC-Proteinmengen in zahlreichen Tumorentitäten. Zusammen mit einem fokussierten shRNA-Screen können so neue Zielproteine für die Bekämpfung von MYC-getriebenen Tumoren, wie zum Beispiel ATAD3A, BOP1 und ADRM1, identifiziert werden.
Zusammenfassend weisen die Ergebnisse darauf hin, dass OmoMYC spezifisch das Tumorzellwachstum inhibiert, indem es die Expression von zentralen Proteinen limitiert, welche durch erhöhte MYC-Proteinmengen reguliert werden. Somit können neue Strategien zur Tumortherapie identifiziert werden, die auf onkogene Funktionen von MYC zielen.
KW  - Myc
KW  - Kristallstruktur
KW  - Transkription <Genetik>
KW  - Bauchspeicheldrüsenkrebs
KW  - DNS-Bindung
KW  - OmoMYC
KW  - promoter invasion
Y1  - 2016
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146993
ER  -