TY  - THES
A1  - Mühlemann, Markus
T1  - Intestinal stem cells and the Na\(^+\)-D-Glucose Transporter SGLT1: potential targets regarding future therapeutic strategies for diabetes
T1  - Intestinale Stammzellen und der Na\(^+\)-D-Glukose Transporter SGLT1: potentielle Ansatzpunkte neuartiger Therapien für Diabetes Patienten
N2  - The pancreas and the small intestine are pivotal organs acting in close synergism to regulate glucose metabolism. After absorption and processing of dietary glucose within the small intestine, insulin and glucagon are released from pancreatic islet cells to maintain blood glucose homeostasis. Malfunctions affecting either individual, organ-specific functions or the sophisticated interplay of both organs can result in massive complications and pathologic conditions. One of the most serious metabolic diseases of our society is diabetes mellitus (DM) that is hallmarked by a disturbance of blood glucose homeostasis. Type 1 (T1DM) and type 2 (T2DM) are the main forms of the disease and both are characterized by chronic hyperglycemia, a condition that evokes severe comorbidities in the long-term. In the past, several standard treatment options allowed a more or less adequate therapy for diabetic patients. Albeit there is much effort to develop new therapeutic interventions to treat diabetic patients in a more efficient way, no cure is available so far. In view of the urgent need for alternative treatment options, a more systemic look on whole organ systems, their biological relation and complex interplay is needed when developing new therapeutic strategies for DM. 
T1DM is hallmarked by an autoimmune-mediated destruction of the pancreatic β-cell mass resulting in a complete lack of insulin that is in most patients restored by applying a life-long recombinant insulin therapy. Therefore, novel regenerative medicine-based concepts focus on the derivation of bioartificial β-like cells from diverse stem cell sources in vitro that survive and sustain to secrete insulin after implantation in vivo. In this context, the first part of this thesis analyzed multipotent intestinal stem cells (ISCs) as alternative cell source to derive bioartificial, pancreatic β-like cells in vitro. From a translational perspective, intestinal stem cells pose a particularly attractive cell source since intestinal donor tissues could be obtained via minimal invasive endoscopy in an autologous way. Furthermore, intestinal and pancreatic cells both derive from the same developmental origin, the endodermal gut tube, favoring the differentiation process towards functional β-like cells. In this study, pancreas-specific differentiation of ISCs was induced by the ectopic expression of the pancreatic transcription factor 1 alpha (Ptf1a), a pioneer transcriptional regulator of pancreatic fate. Furthermore, pancreatic lineage-specific culture media were applied to support the differentiation process. In general, ISCs grow in vitro in a 3D Matrigel®-based environment. Therefore, a 2D culture platform for ISCs was established to allow delivery and ectopic expression of Ptf1a with high efficiency. Next, several molecular tools were applied and compared with each other to identify the most suitable technology for Ptf1a delivery and expression within ISCs as well as their survival under the new established 2D conditions. Success of differentiation was investigated by monitoring changes in cellular morphology and induction of pancreatic differentiation-specific gene expression profiles. In summary, the data of this project part suggest that Ptf1a harbors the potential to induce pancreatic differentiation of ISCs when applying an adequate differentiation media. However, gene expression analysis indicated rather an acinar lineage-determination than a pancreatic β-cell-like specification. Nevertheless, this study proved ISCs not only as interesting stem cell source for the generation of pancreatic cell types with a potential use in the treatment of T1DM but alsoPtf1a as pioneer factor for pancreatic differentiation of ISCs in general. 
Compared to T1DM, T2DM patients suffer from hyperglycemia due to insulin resistance. In T2DM management, the maintenance of blood glucose homeostasis has highest priority and can be achieved by drugs affecting the stabilization of blood glucose levels. Recent therapeutic concepts are aiming at the inhibition of the intestinal glucose transporter Na+-D-Glucose cotransporter 1 (SGLT1). Pharmacological inhibition of SGLT1 results in reduced postprandial blood glucose levels combined with a sustained and increased Glucagon-like peptide 1 (GLP-1) secretion. So far, systemic side effects of this medication have not been addressed in detail. Of note, besides intestinal localization, SGLT1 is also expressed in various other tissues including the pancreas. In context of having a closer look also on the interplay of organs when developing new therapeutic approaches for DM, the second part of this thesis addressed the effects on pancreatic islet integrity after loss of SGLT1. The analyses comprised the investigation of pancreatic islet size, cytomorphology and function by the use of a global SGLT1 knockout (SGLT1-/-) mouse model. As SGLT1-/- mice develop the glucose-galactose malabsorption syndrome when fed a standard laboratory chow, these animals derived a glucose-deficient, fat-enriched (GDFE) diet. Wildtype mice on either standard chow (WTSC) or GDFE (WTDC) allowed the discrimination between diet- and knockout-dependent effects. Notably, GDFE fed mice showed decreased expression and function of intestinal SGLT1, while pancreatic SGLT1 mRNA levels were unaffected. Further, the findings revealed increased isled sizes, reduced proliferation- and apoptosis rates as well as an increased α-cell and reduced β-cell proportion accompanied by a disturbed cytomorphology in islets when SGLT1 function is lost or impaired. In addition, pancreatic islets were dysfunctional in terms of insulin- and glucagon-secretion. Moreover, the release of intestinal GLP-1, an incretin hormone that stimulates insulin-secretion in the islet, was abnormal after glucose stimulatory conditions. In summary, these data show that intestinal SGLT1 expression and function is nutrient dependent. The data obtained from the islet studies revealed an additional and new role of SGLT1 for maintaining pancreatic islet integrity in the context of structural, cytomorphological and functional aspects. With special emphasis on SGLT1 inhibition in diabetic patients, the data of this project indicate an urgent need for analyzing systemic side effects in other relevant organs to prove pharmacological SGLT1 inhibition as beneficial and safe.
Altogether, the findings of both project parts of this thesis demonstrate that focusing on the molecular and cellular relationship and interplay of the small intestine and the pancreas could be of high importance in context of developing new therapeutic strategies for future applications in DM patients.
N2  - Das komplexe Zusammenspiel zwischen Pankreas und Dünndarm ist von großer Bedeutung für den Zucker Stoffwechsel. Während der Dünndarm Glukose aus der Nahrung absorbiert, sezerniert der Pankreas Insulin und Glukagon für die Regulation des Blutzuckerspiegels. Bereits kleinste Fehlfunktionen in einem der beiden Organe können das fein abgestimmte Zusammenspiel aus der Balance bringen und zu schwerwiegenden Begleiterscheinungen führen. Die bekannteste Krankheit bezüglich eines gestörten Blutzuckerhaushaltes ist Diabetes mellitus (DM). Die wichtigsten Formen sind Typ1 und Typ 2 Diabetes, welche beide durch chronische Hyperglykämie gekennzeichnet sind, einem Zustand der langfristig zu schweren Komplikationen führt. Derzeit ist keine Heilung möglich, jedoch vermindert eine Vielzahl von Medikamenten und Therapien die auftretenden Symptome, was die Lebensqualität der Patienten erheblich verbessert. Für die Entwicklung von neuen Medikamenten und Therapien für DM Patienten, muss der Fokus vermehrt auf die Gesamtheit der Organ-Organ Interaktionen, sowie den entwicklungsbiologischen Ursprung der einzelnen Organe gerichtet werden.
Bei Typ 1 Diabetes werden die insulinsekretierende β-Zellen vom Immunsystem zerstört, was zu einem Mangel an Insulin führt. Deshalb ist eine regelmäßige Insulingabe unabdingbar, um eine Hyperglykämie vorzubeugen. Ein vielversprechender Ansatz um fehlendes Insulin zu kompensieren besteht darin aus Stammzellen bioartifizielle, insulinsekretierende Zellen zu generieren. In diesem Zusammenhang ist der biologische Ursprung der zu differenzierenden Zellen von großer Bedeutung. In dieser Arbeit werden daher intestinale Stammzellen (ISZ) als mögliche alternative Zellquelle beschrieben, um insulinsekretierende Zellen zu generieren. Aus medizinischer Sicht eigenen sich ISZ besonders gut für regenerative Therapien, da sie patientenspezifisch durch eine minimal-invasive Endoskopie entnommen werden können. Des Weiteren haben die beiden Organe einen gemeinsamen embryologischen Ursprung, die endodermalen Darmröhre, was die pankreatische Differenzierung begünstigen könnte. Mithilfe der ektopischen Expression des pankreatischen Masterregulators pankreatischer Transkriptionsfaktors 1 alpha (Ptf1a), sollen ISZ in insulinsekretierende β-Zell-ähnliche Zelltypen differenziert werden. Zudem soll ein pankreas-spezifisches Differenzierungsmedium die Effizienz der Differenzierung erhöhen. Da ISZ normalerweise in einer 3D Umgebung kultiviert werden, wurde für diese Arbeit eine 2D Zellkultur etabliert, um eine hocheffiziente genetische Manipulation zur ektopischen Expression von Ptf1a zu garantieren. Im nächsten Schritt wurde die bestmögliche Methode evaluiert um Ptf1a in ISZ zu integrieren, welche gleichzeitig aber das Wachstum und Überleben der Zellen nicht beeinträchtigt. Der Erfolg der angewandten Methode wurde basierend auf der Zellmorphologie, sowie der Transkription von pankreasspezifischen Genen überprüft. Die Ergebnisse dieser Studie haben gezeigt, dass die Ptf1a-induzierte Differenzierung in Verbindung mit der Applikation eines spezifischen Differenzierungsmediums das Genexpressionsprofil von Azinär Zellen induziert und nicht wie erwartet, das von endokrinen β-Zellen. Dies bedeutet, dass Ptf1a die Kapazität aufweist, ISZ in pankreatische Zellen zu konvertieren, jedoch bei der Entwicklung in Richtung insulinsekretierende β-Zellen keine Rolle spielt. Letztendlich zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass ISZ eine interessante Alternative zu pluripotenten Stammzellen darstellen. 
Im Gegensatz zu Typ 1 leiden Typ 2 Diabetes Patienten an Hyperglykämie infolge von Insulinresistenz, welche oft mit blutzuckerregulierenden Medikamenten behandelt werden können. Eine gute Therapiemöglichkeit ist die Inhibition des intestinalen Glukosetransporters SGLT1, was zu einer drastisch reduzierten postprandialen Glukoseaufnahme führt und gleichzeitig die intestinale Sekretion des Inkretins Glukose-like Peptide 1 (GLP-1) erhöht. Beides wirkt sich positiv auf die Blutzuckerregulation unter diabetischen Verhältnissen aus. Obwohl SGLT1 primär im Dünndarm exprimiert ist, wurde dessen Expression auch in anderen Organen, wie dem Gehirn, dem Herz, der Lunge und in pankreatischen α-Zellen nachgewiesen. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde daher der Einfluss des Funktionsverlustes von SGLT1 auf die Integrität pankreatischer Inselzellcluster analysiert. Im diesem Rahmen wurde die Morphologie der pankreatischen Inseln, deren Architektur und Funktion mithilfe eines etablierten murinen SGLT1 Knockout (SGLT1-/-) Modelles untersucht. Da SGLT1-/- Mäuse unter einer Standard Labordiät (SD) ein schweres Glukose-Galaktose Malabsorptions Syndrom entwickeln, erhalten die Tiere eine glukose-freie, fett-angereicherte Diät (GDFE). Um diät- und knockoutspezifische Effekte unterscheiden zu können, wurden als Kontrollen SD- und GDFE-gefütterte Wildtyp Tiere mit den SGLT1-/- Mäusen verglichen. Wildtyptiere unter GDFE Diät zeigten eine verminderte Expression und Funktionalität des intestinalen SGLT1 Transporters, während im Pankreas die SGLT1 mRNA Expression nicht von der Diät beeinflusst wurde. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben gezeigt, dass in SGLT1-/- Pankreata, die Inseln größer sind, aber auch die Proliferations- und Apoptoserate in den Inselzellen reduziert ist. Zudem befinden sich in SGLT1-/- Inseln mehr α-Zellen und weniger β-Zellen. Des Weiteren ist die typische Anordnung der endokrinen Zellen gestört. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass SGLT1 in pankreatischen Inseln eine wichtige Rolle für die strukturelle Organisation der verschiedenen Zelltypen innerhalb der Inseln spielt. Ergänzend wurde gezeigt, dass isolierte SGLT1-/- Inseln in der Gegenwart von Glukose unfähig sind Insulin oder Glukagon zu sezernieren. Weitere Untersuchungen im Tier haben ergeben, dass auch das insulinsekretionsfördernde Hormon GLP-1 in atypischer Art und Weise sekretiert wird. 
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die intestinale SGLT1 Expression und Funktion durch Nährstoffe beeinflusst werden kann. Des Weiteren wurde erstmals eine neue Funktion für SGLT1 bezüglich der strukturellen und zellulären Organisation pankreatischer Inselzellcluster beschrieben. Daten zu neuen klinischen SGLT1 Inhibitoren beschreiben lediglich eine intestinale SGLT1 Blockierung, während die Wirkung in weitern Organen nicht berücksichtigt wurde. Die Daten dieser Arbeit liefern klare Indizien dafür, dass starke Nebenwirkungen und Effekte auch in anderen SGLT1-exprimierenden Geweben und Organen auftreten könnten, wenn die SGLT1 Funktion verloren geht. 
Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Regulation des Blutzuckerspiegels auf einem komplexen Zusammenspiel zwischen Dünndarm und Pankreas basiert. Daher sollten bei zukünftigen SGLT1 Inhibitions-Studien im Menschen die Interaktionen zwischen den beiden Organen unbedingt berücksichtigt werden, um die Wirksamkeit und die Sicherheit solcher Medikamente für Diabetes Patienten besser darzulegen.
KW  - Stammzelle
KW  - Diabetes mellitus
KW  - Sglt1
KW  - GLP-1
KW  - blood glucose regulation
KW  - Intestinal stem cell
KW  - Lgr5
KW  - islets of Langerhans
KW  - pancreas
KW  - glucose
KW  - insulin
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169266
ER  - 
TY  - THES
A1  - Filatova, Alina
T1  - Mechanism and Control of Nuclear-Cytoplasmic Translocation of the Transporter Regulator RS1
T1  - Mechanismus und Kontrolle der Translokation der Transporterregulator RS1 zwischen Kern und Zytoplasma
N2  - Das RS1 Protein (Gen RSC1A1) beteiligt sich an der Regulation des Na+-D-Glukose-kotransporters SGLT1 und einiger anderer Transporter. In subkonfluenten LLC-PK1 Zellen hemmt RS1 die Freisetzung von SGLT1 aus dem trans-Golgi-Netzwerk und die Transkription von SGLT1. Während es sich in konfluenten Zellen hauptsächlich im Zytoplasma befindet, ist RS1 in subkonfluenten Zellen im Kern und im Zytoplasma lokalisiert. In der vorliegenden Arbeit wurden Mechanismus und Regulation der konfluenzabhängigen Kernlokalisation von RS1 untersucht. Dabel konnte gezeigt werden, dass die von Konfluenz abhängige Kernlokalisation von RS1 durch den Zellzyklus reguliert wird. In RS1 aus Sus scrofa (pRS1) wurde eine Sequenz identifiziert („nuclear shuttling signal“, NS), die für die konfluenzabhängige Verteilung von RS1 verantwortlich ist und sowohl das Signal für die Kernlokalisation (NLS) als auch das Signal für den Export aus dem Kern (NES) beinhaltet. Die NLS und NES Signale von RS1 vermitteln die Translokation des Proteins in den Kern und aus dem Kern mit Hilfe von Importin β1 bzw. CRM1, wobei die Verteilung von RS1 zwischen Kern und Zytoplasma durch die Aktivität des Exportsystems bestimmt wird. Es wurde gezeigt, dass die benachbarte Proteinkinase C (PKC) Phosphorylierungsstelle an Serin 370 von pRS1 die NS-gesteuerte Kernlokalisierung kontrolliert und für die vom Zellzyklus abhängige Kernlokalisation notwendig ist. Aufgrund der Ergebnisse der ortsgerichteten Mutagenese, PKC-Aktivierungsexperimenten und Massenspektrometrie-Analyse des Phosphorylierungsmusters von RS1 wurde ein Modell vorgeschlagen, das die Regulation der Kernlokalisation des RS1 Proteins in LLC-PK1 Zellen beschreibt. Dem Modell zufolge wird RS1 in subkonfluenten Zellen stark in den Kern befördert, während der Export von RS1 aus dem Kern nicht stattfindet. Das führt zur Anreicherung von RS1 im Kern. Nach Konfluenz wird Serin 370 durch PKC phosphoryliert, was die Steigerung des RS1-Exports aus dem Kern begünstigt und die überwiegend zytoplasmatische Lokalisation des Proteins in konfluenten Zellen hervorruft. Die konfluenzabhängige Regulation der Lokalisation von RS1 kann die Expression von SGLT1 während der Regeneration von Enterozyten im Dünndarm und der Regeneration von Zellen der Nierentubuli nach hypoxämischem Stress kontrollieren. Außerdem deutet die Analyse der Genexpression in embryonalen Fibroblasten der RS-/- Mäuse deutet darauf hin, dass die transkriptionale Regulation durch RS1 im Zellzyklus und bei der Zellteilung eine wichtige Rolle spielen kann. Da die Lokalisation von RS1 zellzyklusabhängig ist, kann RS1 für die Regulation der Transporter in spezifischen Phasen des Zellzyklus wichtig sein.
N2  - The RS1 protein (gene RSC1A1) participates in regulation of Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and some other solute carriers. In subconfluent LLC-PK1 cells, RS1 inhibits release of SGLT1 from the trans-Golgi network and transcription of SGLT1. In subconfluent cells, RS1 is localized in the nucleus and the cytoplasm whereas confluent cells contain predominantly cytoplasmic RS1. In the present study, the mechanism and regulation of confluence-dependent nuclear location of RS1 was investigated. Confluence dependent nuclear location of RS1 was shown to be regulated by the cell cycle. A nuclear shuttling signal (NS) in pRS1 was identified that ensures confluence-dependent distribution of pRS1 and comprises nuclear localization signal (NLS) and nuclear export signal (NES). The NLS and NES of RS1 mediate translocation into and out of the nucleus via importin ß1 and CRM1, respectively, and the nuclear/cytoplasmic distribution of the RS1 protein is determined by the nuclear export activity. The adjacent protein kinase C (PKC) phosphorylation site at serine 370 of pRS1 was shown to control nuclear localization driven by NS and is necessary for the differential localization of RS1 in quiescent versus proliferating cells. Basing on the data of site-directed mutagenesis, PKC activation experiments and mass spectrometry analysis of RS1 phosphorylation, the following model of the regulation of RS1 nuclear location in LLC-PK1 cells was proposed. In subconfluent cells, RS1 is actively imported into the nucleus whereas nuclear export of RS1 is not active leading to accumulation of RS1 in the nucleus. After confluence, phosphorylation of serine 370 of pRS1 by PKC takes place leading to enhancement of RS1 nuclear export and predominantly cytoplasmic distribution of the protein in the confluent cells. The confluence-dependent regulation of RS1 localization may control SGLT1 expression during regeneration of enterocytes in small intestine and during regeneration of renal tubular cells after hypoxemic stress. Moreover, the gene expression profiling of mouse embryonic fibroblasts with RS1-/- genotype suggests that transcriptional regulation by RS1 might be important for the cell cycle and cell division. Since RS1 localization depends on the cell cycle, RS1 might play a role in the regulation of the solute carriers during specific phases of the cell cycle.
KW  - RS1
KW  - NES
KW  - NLS
KW  - Kern
KW  - Regulation
KW  - SGLT1
KW  - Zellzyklus
KW  - Glukose
KW  - RS1
KW  - NES
KW  - NLS
KW  - nucleus
KW  - transporter regulator
KW  - SGLT1
KW  - glucose
KW  - nuclear export signal
KW  - nuclear localization signal
KW  - cell cycle
KW  - glucose
Y1  - 2009
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-38512
ER  -