TY - THES A1 - Stölzle, Sonja T1 - Licht- und Redoxregulation von Calcium-permeablen Kanälen in Arabidopsis thaliana Mesophyllzellen T1 - Light- and redoxregulation of calcium-permeable channels in Arabidopsis thaliana mesophyll cells N2 - 1. Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana sind mit Hyperpolarisations-ab-hängigen, Calcium-permeablen Kanälen ausgestattet. In Ca2+-haltigen Lösungen folgte die Nullstromspannung der Nernst-Spannung mit 27 mV bei einer zehnfachen Erhöhung der Ca2+-Konzentration. Die Sequenz an relativen Stromamplituden ergab Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). Der makroskopische Strom wurde auf der Basis einer 7,2 ± 1 pS-Leitfähigkeit bei einer Pipettenlösung mit 10 mM Ba2+ in der cell-attached Konfiguration gebildet. Die Kanäle waren sensitiv gegenüber Lanthan und Gadolinium, wobei die Stromamplitude bei 100 µM Lanthan um 97,2 ±7 % und bei 100 µM Gadolinium um 95,2 ± 7 % reduziert wurde. 2. Blaulicht induzierte den Hyperpolarisations-abhängigen, Calcium-permeablen Kanal in dunkeladaptierten, intakten Mesophyll-Protoplasten. Die Aktivierung war zeitabhängig und der Stromanstiegs erreichte eine Sättigung nach 11-16 Minuten. Weiterhin wurde bestimmt, dass eine Kanalaktivität erst bei einer Intensität an Blaulicht > 50 µmol/m2s1 induziert wird. Aufgrund der Tatsache, dass der photosynthetische Elektronentransport-Entkoppler DCMU die Aktivierung nicht verhinderte, konnte eine Beteiligung des Photosyntheseapparates ausgeschlossen werden. Eine Inhibierung der Aktivierung nach Inkubation mit dem Kinase-Inhibitor K252a war ein erster Hinweis für die Beteiligung von Phototropinen als relevante Blaulicht-Rezeptoren, da Phototropine eine Kinase-Funktion besitzen. Diese Hypothese bestätigte sich nach Überprüfung der Phototropin-knockout-Mutanten phot1-5 und phot1-5 phot2-1. Da die Aktivierung in phot1-5 reduziert war, und in phot1-5 phot2-1 keine Aktivierung der Kanäle durch Blaulicht mehr möglich war, konnte auf eine überlappende Funktion beider Photorezeptoren bezüglich der Aktivierung von Calcium-permeablen Kanälen geschlossen werden. Dagegen konnte eine Beteiligung weiterer Blaulicht-Rezeptoren, der Cryptochrome, ausgeschlossen werden. 3. Neben Blaulicht aktivierten auch reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) Hyper-polarisation-abhängige, Calcium-permeable Kanäle. Protoplasten mit intaktem Cytoplasma (cell-attached Konfiguration) zeigten nach Applikation von 5 mM H2O2 eine zeitabhängige Aktivierung der Lanthan-sensitiven Kanäle. Eine Sättigung des Stromanstiegs wurde nach ca. 25 Minuten erreicht. Neben dem Wildtyp (Col-0) wurde die Mutante dnd1 hinsichtlich Calcium-permeabler Kanäle überprüft. Sie besitzt einen nicht-funktionellen putativen cyclisch-Nukleotid-aktivierten Kanal, CNGC2, und zeigt Phänotypen bei der Pathogenabwehr. Eine histochemische DAB-Färbung ergab, dass dnd1 eine dem Wildtyp vergleichbare ROS-Produktion nach Inokulation mit avirulenten Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB besitzt. Da eine ROS- bzw. H2O2-Produktion, ein wichtiger initiierender Schritt bei Abwehrmechanismen, in der Mutante nicht beeinträchtigt war, wurde überprüft, ob ROS-aktivierte, Calcium-permeable Kanäle in dnd1 beobachtet werden konnten. Nach Applikation von 5 mM H2O2 zu intakten Protoplasten wurde keine dem Wildtyp vergleichbare Aktivierung Calcium-permeabler Kanäle festgestellt. Daraufhin konnte spekuliert werden, dass CNGC2 im Wildtyp den Calcium-permeablen Kanal repräsentiert. Eine Blaulicht-Aktivierung der Calcium-permeablen Kanäle in der Kanal-Mutante war jedoch möglich, was die Frage aufkommen ließ, ob es sich um verschiedene Kanäle mit denselben elektrophysiologischen Charakteristika handelt, oder ob es sich bei dem H2O2-aktivierten und dem Blaulicht-aktivierten Kanal um denselben Kanal handelt, der durch verschiedene Signalketten angeschaltet wird. Cyclische Nukleotide (cAMP) konnten die Kanäle in Wildtyp-Protoplasten nicht aktivieren, was dagegen sprach, dass es sich um CNGC2 handelte. Eine Inhibierung der H2O2-aktivierten Ströme durch den Calmodulin-Inhibitor W7 wies auf eine Beteiligung eines Calmodulin-abhängigen Schritts in der Signalkette hin. Untersuchungen des Calcium-permeablen Kanals in der outside-out Konfiguration mit einer dem Cytoplasma ähnlichen internen Lösung ergab, dass eine Kanalaktivität durch eine erhöhte Calcium-Konzentration (21 µM) bei Vorhandensein von Calmodulin induziert werden konnte. Cyclische Nukleotide aktivierten wie erwartet keine Hyperpolarisation-abhängigen, Calcium-permeablen Kanäle. Dies deutete darauf hin, dass CNGC2 die Calcium-permeablen Kanäle über einen Ca2+/Calmodulin-abhängigen Schritt in einer H2O2-induzierten Signalkette regulieren könnte. Lokalisationsstudien mit einem GFP-CNGC2-Fusionskonstrukt (CNGC2::mGFP4 /pPILY) zeigten, dass der Kanal in vivo im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sein könnte. Dies bestätigte die Hypothese, dass CNGC2 nicht den Calcium-permeablen Kanal in der Plasmamembran repräsentiert und dass der Verlust der Kanalaktivität in dnd1 in einer beeinträchtigten Signalkette zu suchen ist. N2 - 1. Hyperpolarisation-dependent, calcium-permeable channels have been found in Arabidopsis thaliana mesophyll cells. In Ca2+-containing solutions, the reversal potential shifted 27 mV with a tenfold increase of the Ca2+-concentration. The relative sequence of permeability was Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). The macroscopic current in the cell-attached configuration was based on a 7,2 ± 1 pS-conductance with 10 mM Ba2+ in the pipette solution. The channels were sensitive to lanthanum and gadolinium. Current amplitudes decreased 97,2 ±7 % after application of 100 µM La3+ and 95,2 ± 7 % after application of 100 µM Gd3+. 2. Blue-light (450-490 nm) induced hyperpolarisation-dependent, calcium-permeable channels in dark-adapted mesophyll-protoplasts with intact cytoplasm. The current increase was time-dependent and saturated after 11-16 minutes. Examining the dose dependence of channel activation revealed that > 50 µmol/m2s1 blue-light induces channel activity. Phototsynthesis was shown to be not involved in the signaling cascade since the photosynthetic electron-transport inhibitor DCMU did not inhibit channel activation. The inhibition of channel activation with the kinase inhibitor K252a pointet to the involvement of phototropins. This hypothesis proved to be true when the phototropin knockout mutants phot1-5 and phot1-5 phot2-1 were examined. In phot1-5, the activation was clearly reduced and in phot1-5 phot2-1 no blue-light activation was observed anymore. Furthermore, this pointed to an overlapping function of both photoreceptors. The involvement of cryptochromes, further blue-light receptors, could be excepted. 3. Beside blue-light, also reactive oxygen species (ROS) were shown to activate calcium-permeable channels in intact mesophyll protoplasts. After application of 5 mM H2O2, lanthanum-sensitive channels showed a time-dependent current increase with a saturation after approx. 25 minutes. Beside wildtype-plants (Col-0), also the mutant dnd1 has been tested. dnd1 is characterized by a truncated protein of a putative cyclic-nucleotide-gated channel, CNGC2. The plants are dwarfed in stature, have an elevated level of salicylic acid and exhibit a resistance against a variety of virulent bacterial, fungal and viral phatogens without developing a hypersensitive response. After inoculation of leaves with Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB, dnd1 showed a production of ROS like the wildtype. In contrast, an activation of calcium-permeable channels by ROS was not observed. A blue-light-dependent activation of calcium-permeable channels was still possible. This raised the question if blue-light and H2O2 activate the same channel via different signaling cascades or if there are two calcium-permeable channels. Cyclic nucleotides alone did not activate the channels, pointing to the possibility that CNGC2 does not represent the calcium-permeable channel. Furthermore, when the intact cytoplasm was lost (outside-out configuration), H2O2-induced channel activity was also observed in dnd1, possibly due to the loss of a composition of regulating compounds in the cytoplasm. Therefore it was concluded that CNGC2 does not represent the observed calcium-permeable channel and that CNGC2 is placed upstream of the activation of these channels. An inhibition of the H2O2-induced channel activation by the calmodulin (CaM) inhibitor W7 pointet to the involvement of a CaM-dependent step in the signaling cascade. When the cytoplasm was replaced with a pipette solution containing an elevated level of Ca2+ (21 µM) and CaM, channel activity was induced. Ca2+, cyclic nucleotides or CaM alone did not have this effect. This pointed to the possibility, that CNGC2 might activate calcium-permeable channels via a Ca2+/CaM-dependent signaling pathway. Subcellular localisation studies with a GFP-fusionconstruct (CNGC2::mGFP4 /pPILY) revealed that CNGC2 might be located in the endoplasmatic reticulum. This reeinforced the hypothesis that CNGC2 does not represent the calcium-permeable channel in the plasma membrane and that the loss of channel activity in dnd1 is due to an impaired signaling cascade. Also the expression of GFP-labeled CNGC2 in a heterolguous system (HEK293 cells) showed that neither the full-length nor a mutant containing a partly deletion of the N-terminal end (CNGC2::EGFP/pcDNA3.1 or CNGC2-D112::EGFP/pcDNA3.1) is transported to the plasma membrane. Therefore no electrophysiological characterization of CNGC2 in this cell line was possible. KW - Ackerschmalwand KW - Mesophyll KW - Calciumkanal KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Blaulicht KW - Patch-Clamp-Methode KW - Kanäle KW - Calcium KW - Patch-Clamp KW - Blaulicht KW - ROS KW - channels KW - calcium KW - patch-clamp KW - bluelight KW - ROS Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6975 ER - TY - THES A1 - Schulz, Alexander T1 - Molekulare Mechanismen des protonengekoppelten Zuckertransportes in Mesophyllvakuolen von Arabidopsis thaliana T1 - Molecular mechanism of the proton-coupled sugar transport in mesophyll vacuoles of Arabidopsis thaliana N2 - Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zum Zuckertransport über die Vakuolenmembran von Arabidopsis thaliana sowie dessen Energetisierung durch die V-ATPase erlangt werden. Hierfür wurden Patch-Clamp-Experimente konzipiert, die eine direkte Erfassung der Transportmechanismen, Transporteigenschaften sowie Triebkräfte des vakuolären Zuckertransportes ermöglichten. Zusätzlich wurden Lokalisations- und Interaktionsstudien zu ausgewählten Transportern mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie durchgeführt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte hinsichtlich des pflanzlichen Zuckertransports und dessen Energetisierung bearbeitet. Mittels der Patch-Clamp-Technik konnten vakuoläre glucose- und saccharose-induzierte Protonen-Transportkapazitäten in Mesophyllvakuolen von Wildtyp-pflanzen aufgelöst werden, die eindeutig einen Antiportmechanismus für beide Zucker zur Beladung der Vakuole vorschlagen. Dabei zeigten die Glucose- und Saccharoseantiporter eine geringe Affinität und hohe Transportkapazität für den jeweiligen Zucker. Auf molekularer Ebene konnte die protonengekoppelte Glucose- und Saccharoseaufnahme in die Vakuolen maßgeblich dem putativen Monosaccharid¬transporter AtTMT1/2 zugeordnet werden, der folglich als erster Glucose-Saccharose/Protonen-Antiporter identifiziert wurde. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden der Zucker- und der pH-Gradient als Triebkräfte der Zuckertransportaktivität herausgearbeitet. In diesem Zusammenhang konnte ferner ein Beitrag zur quan¬titativen Charakterisierung der V-ATPase geleistet werden, welche den Einfluss der V-ATPase aufgrund ihrer pH-abhängigen H+-Pumpaktivität auf die pH-Homöostase belegt. Demzufolge scheint die V-ATPase als pH-regulierter Energielieferant für die Zuckertransporter zu fungieren. Darüber hinaus wurde die mitogenaktivierte Proteinkinase AtVIK1 als potentieller Regulationsfaktor von AtTMT1 identifiziert. Dies gelang durch den Nachweis einer spezifischen physikalischen Interaktion zwischen AtTMT1 und AtVIK1 mittels der Bimolekularen Fluoreszenzkomplemen¬tation. Neben der AtTMT1/2-vermittelten Aufnahme der beiden Zucker Glucose und Saccharose wurde ebenso die Zuckerentlassung aus der Vakuole näher charakterisiert. Mit Hilfe vergleichender Patch-Clamp-Analysen von verschiedenen Zuckertransporter-Verlustmutanten konnte AtERDl6 als Glucose/Protonen-Symporter identifiziert werden, der sich für den Glucoseexport aus der Vakuole verantwortlich zeigt. In Bezug auf den Saccharosetransport aus der Vakuole konnte erstmals die Saccharose/Protonen-Symportfunktion von AtSUC4 in planta nach dessen transienter Überexpression in Zuckertransporter-Verlustmutanten eindeutig aufgelöst und nachgewiesen werden. Desweiteren offenbarten die hier erlangten Ergebnisse bezüglich der Glucose/Saccharose-Beladung und -Entladung von Mesophyllvakuolen, dass weitere protonengekoppelte Zuckertransporter, neben AtTMT1/2 and AtERDl6, in diesem Zelltyp existieren, deren molekulare Natur es jedoch noch gilt herauszufinden. N2 - This work provides new insights into the sugar transport across the vacuolar membrane of Arabidopsis thaliana and its energization by the V-ATPase. For this, patch-clamp experiments were specifically designed enabling low-resolution current recordings for the direct detection and characterization of the transport mechanisms, transport properties and driving forces of the vacuolar sugar transport. In addition, localization and interaction studies on selected transporters have been performed by using the confocal laser scanning microscopy. In particular, following aspects of plant sugar transport and its energization were studied. In patch-clamp experiments on mesophyll vacuoles of wild type plants, prominent glucose- and sucrose-induced proton transport capacities were resolved, which could be clearly related to an antiport mechanism used for loading the vacuole with both sugars. Thereby, the vacuolar glucose and sucrose antiporter showed a low-affinity and a high transport-capacity for the respective sugar. On the molecular level, the proton-coupled uptake of both sugars, glucose and sucrose, into the vacuole could be mainly associated with the putative monosaccharide transporter AtTMT1/2, which was consequently identified as the first glucose-sucrose/proton-antiporter. In the course of these studies, the sugar- and the pH-gradient were revealed as driving forces of the sugar transport activity. In this context, a contribution was made to a quantitative characterization of the V-ATPase that proved the influence of the V-ATPase on the pH homeostasis based on the pH dependency of the H+-pump activity. Hence, the V-ATPase seems to function as a pH-regulated energy source for the sugar transporters. Moreover, a specific physical interaction between AtTMT1 and the mitogen-activated protein kinase AtVIK1 was detected via bimolecular fluorescence complementation assays identifiying AtVIK1 as a potential regulatory factor of AtTMT1. Beside the AtTMT1/2-mediated glucose and sucrose uptake into the vacuole, the sugar release from the vacuole was also characterized. By means of comparative patch-clamp studies on mutants lacking different sugar transporters, AtERDl6 was identified as glucose/proton symporter and appears to be responsible for glucose export from the vacuole. Concerning the export of sucrose out of the vacuole, for the first time direct evidence for the sucrose/proton symport function of AtSUC4 in planta was provided after its transient overexpression in certain sugar-transporter knockout lines. Furthermore, the studies on wild type and sugar-transporter knockout lines regarding vacuolar glucose/sucrose loading and unloading also revealed that in addition to AtTMT1/2 and AtERDl6 further proton-coupled sugar transporters - of yet unknown molecular identity - must be present in mesophyll cells. KW - Ackerschmalwand KW - Vakuole KW - Saccharose KW - Glucose KW - Mesophyll KW - Protonenpumpe KW - AtTMT1/2 KW - AtSUC4 KW - AtERDl6 KW - V-ATPase KW - Mesophyllvakuole KW - Glucose/Saccharose Transport KW - Antiport KW - Symport KW - AtTMT1/2 KW - AtSUC4 KW - AtERDl6 KW - V-ATPase KW - mesophyll vacuole KW - glucose/sucrose transport KW - antiport KW - symport KW - Glucosetransport Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85596 ER -