TY  - THES
A1  - Kruhm, Michaela
T1  - Identifizierung und Isolierung Aspergillus fumigatus spezifischer T-Zell-Rezeptoren und funktionelle Charakterisierung nach Transfer auf humane T-Zellen
T1  - Identification and Isolation of Aspergillus fumigatus specific T-cellreceptors and functional characterisation after Transfer on human T-cells
N2  - Der humanpathogene Pilz Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) kann in immunsupprimierten Patienten zum Teil schwere invasive Infektionen auslösen. Trotz Fortschritten in den Behandlungsmöglichkeiten und der medikamentöser Prophylaxe bleibt die Sterblichkeitsrate bei invasiven Erkrankungen hoch. Aus diesem Grund ist die Entwicklung von spezifischeren Immuntherapien von Nöten. Ein Ansatz ist die genetische Modifikation von T Zellen, durch den Transfer von A. fumigatus spezifischen T Zell Rezeptoren (TCRs), für eine adoptive Therapie. Um dieses Konzept zu evaluieren wurden TCRs, die für die extrazellulären Zellwandglykonase Crf1 (Crf1/p41) spezifisch sind, auf primäre T Zellen transferiert und die Effektor-Funktion analysiert.
Das Crf1/p41 Epitop induziert bei gesunden Spendern eine funktionelle TH1 Immunantwort gegen A. fumigatus und führt zur Produktion hoher Mengen von Interferon γ (IFN-γ). Für die Identifikation von A. fumigatus spezifischen TCRs wurden siebenunddreißig Crf1/p41 spezifische T Zellklone von drei HLA DRB1*04 Spendern generiert. Anschließend wurden die TCR β Ketten über die sehr variable komplementaritätsbestimmende Region 3 (CDR3) bestimmt. Es konnten zwölf unterschiedliche TCRs ermittelt werden, von denen vor allem die variablen β (Vβ) Kette 18 sehr dominant, während die Vβ Ketten 1 und 6 nur in wenigen Klonen vertreten waren. Zur weiteren Charakterisierung der Crf1/p41 spezifischen TCRs wurden die variablen α (Vα) Ketten bestimmt (Vα 3, Vα 15 und Vα 26). Somit liegt eine polyklonale T Zell Immunantwort vor. Anschließend wurden die Crf1/p41 spezifischen TCRs in den retroviralen Vektor pMP71 kloniert und auf Jurkat 76 Zellen, welche keinen endogenen TCR exprimieren, und auf primäre CD4+ T Zellen transferiert. Die Expression von Crf1/p41 spezifischen TCRs, transduziert in CD4+ T Zellen, zeigten spenderspezifische Unterschiede und die Expression war niedriger im Vergleich zu den transduzierten Jurkat 76 Zellen. Daher wurde auf Optimierungsstrategien zurückgegriffen, die für den adoptiven Transfer mit TCR-modifizierten T Zellen zur Behandlung von Krebs entwickelt wurden. Angewandt wurden die Codonoptimierung der TCR codierenden Sequenz, Murinisierung der TCR konstanter Ketten, Induktion einer weiteren Disulfidbrücke. Ebenfalls wurde das Vektorsystem optimiert. Der Optimierungsprozess der Crf1/p41 spezifischen TCR 1 führte zu einer erhöhten Oberflächenexpression des TCR sowohl in Jurkat 76 (3 bis 5fach) als auch in primären CD4+ T Zellen (2fach). In funktionellen Analysen wurde die Proliferationsfähigkeit und IFN-γ Produktion, durch die Stimulation von transduzierten CD4+ T Zellen (TCR 1 optimiert) mit Crf1/p41 beladenen dendritischen Zellen (DCs), bestätigt.
Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Transfer von A. fumigatus spezifischen TCRs eine protektive anti-fungale Immunantwort fördern könnte. Demzufolge auch als ein geeignetes Mittel in einer potentiellen Immuntherapie gegen A. fumigatus Infektionen in immunsupprimierten Patienten, eingesetzt werden könnte.
N2  - The human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus (A. fumigatus) can cause severe invasive infections in immunosuppressed patients. Despite progresses in the treatment and prophylaxis of invasive infections the mortality rate remains high. On that account the development of a more specific immune therapy seems necessary. One approach is genetic modification of T cells by transfer of A. fumigatus specific T cell receptors (TCR) for an adoptive therapy. To evaluate this concept, TCRs specific for a peptide derived from extracellular cell wall glucanase Crf1 (Crf1/p41) were transferred to primary T cells. Than their effector function was analyzed.
In healthy donors the epitope Crf1/p41 induces a functional TH1 immune response towards A. fumigatus combined with a high Interferon-γ (IFN-γ) production. To identify A. fumigatus specific TCRs, thirty-seven Crf1/p41 specific T cell clones were generated from three HLA-DRB1*04 positive healthy donors. Afterwards, the TCR β chains were analyzed by sequencing the most variable complementarity determining region 3 (CDR3). Twelve different TCRs were detected whereas variable β (Vβ) 18 was very dominant, and Vβ 1 and Vβ 6 were present only in some clones. For further characterization of Crf1/p41 specific TCRs, variable α (Vα) chains were identified (Vα 3, Vα 15 and Vα 26). Thus, the T cell response is polyclonal. Subsequently Crf1/p41 specific TCRs were cloned into the retroviral vector pMP71 and transduced into Jurkat 76 cells that lack the expression of endogenous TCR, and into primary CD4+ T cells. The expression of Crf1/p41 specific TCR transduced in CD4+ T cells was donor-dependent and the expression was lower compared to transduced Jurkat 76 cells. Consequently, optimizing strategies engineered for TCR-modified adoptive T cell transfer in cancer therapy were used to induce a higher TCR expression on T cells. Those strategies include codon-optimization of the TCR coding sequence, murinization of constant chains of TCR, induction of an additional disulfide bond. Additionally the vector system was optimized. The optimization process of Crf1/p41 TCR 1 led to a higher surface expression in Jurkat 76 (3-5x) and primary CD4+ T cells (2x). Functional analyses revealed proliferation and IFN-γ production after the stimulation of transduced CD4+ T cells (TCR 1 optimiert) with Crf1/p41 pulsed mature dendritic cells (mDC).
These data suggest that the transfer of A. fumigatus specific TCRs might foster protective anti-fungal immune responses. Therefore this might be a suitable tool for immunotherapeutic use against A. fumigatus infections in immunosuppressed patients.
KW  - Aspergillus fumigatus
KW  - T-Lymphozyten-Rezeptor
KW  - T-Zell-Rezeptor Transfer
KW  - T cell rezeptor transfer
KW  - T-Zellrezeptor
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112184
ER  - 
TY  - THES
A1  - Mehling, Beatrix
T1  - Klonierung und Charakterisierung eines polymorphen MHC Kl. I-Moleküls der LEW.1F-Ratte, das präferentiell Va8.2-exprimierende CD8-T-Zellen expandiert
T1  - Cloning and characterization of a polymorphic MHC class I molecule of the LEW.1F rat, which preferentially expands Va8.2 positive CD8 T-cells
N2  - Der MHC der Lewis.1F-Ratte (RT1f) stimuliert die präferentielle Expansion von CD8-T-Zellen, die das V-Segment 8.2 (AV8S2) der TCR-alpha-Kette verwenden. Sowohl als Folge der positiven thymischen Selektion in der Lewis.1F-Ratte (LEW.1F) wie auch bei der RT1f-Alloerkennung. Es war Ziel dieser Arbeit, das MHC Kl. I-Molekül der LEW.1F-Ratte, das diese präferentielle Expansion von AV8S2-Zellen induziert, zu klonieren sowie die Kontaktpunkte der Interaktion zwischen dem MHC-Molekül und AV8S2 zu kartieren. Über RT-PCR wurde ein MHC-I-Gen der LEW.1F-Ratte (RT1.Af) isoliert, sequenziert und zusammen mit einem anderen MHC-I-Gen aus der LEW.1F-Ratte (A2f) analysiert, das von einer Arbeitsgruppe aus Babraham (Cambridge, UK) gefunden worden war. Durch einen Nukleotidsequenz-Vergleich von Af und A2f mit bekannten Ratte-MHC-I-Genen konnte gezeigt werden, daß die Sequenzen beider charakteristisch für Ratte-MHC-I-Gene sind. Beide Moleküle wurden stabil in L-Zellen, rCD80-transfizierte P815-Zellen und T-Zellhybridomen (THO35/1) exprimiert. Die serologische Charakterisierung mit 19 RT1f-reaktiven Alloantikörpern ergab, daß sich die LEW.1F-Serologie alleine durch Af erklären läßt. In einem Zytotoxizitätstest mit LEW.1F-reaktiven zytotoxischen T-Lymphozyten, wurde Af spezifisch erkannt, A2f dagegen nicht. Serologie und Zytotoxizitätstest zeigen, daß die RT1f-spezifische Alloerkennung das Af-Molekül fokussiert, A2f unbedeutend scheint. Möglicherweise, da dieses Molekül in der LEW.1F-Ratte nur schwach exprimiert ist. Die Interaktion von Af und A2f mit AV8S2-Zellen wurde mittels einer MLR (gemischte Lymphozytenreaktion) in der Alloerkennung untersucht: Af, nicht aber A2f, stimuliert die präferentielle Expansion AV8S2-positiver CD8-T-Zellen in der Alloreaktion. Somit ist Af als das Molekül identifiziert, daß die Überselektion von AV8S2-Zellen vermutlich auch in der thymischen Repertoire-Selektion induziert. Zur Kartierung der Af/AV8S2-Interaktion wurden Hybridmoleküle aus Aa und Af gentechnisch hergestellt: Aa und Af unterscheiden sich extrazellulär nur in sieben Aminosäuren, die konzentriert auf zwei Regionen des MHC-Moleküls liegen: "Region I" (AS 62, 63, 65, 69, 70) und "Region II" (167, 169). Aa stimuliert keine präferentielle AV8S2-Zell-Expansion, daher muß die charakteristische Kombination dieser sieben Aminosäuren für die präferentielle Interaktion mit AV8S2-positiven CD8-T-Zellen ausschlaggebend sein. Durch MLRs mit Hybrid-exprimierenden Stimulatorzellen wurde gezeigt, daß beide Regionen zur präferentiellen Expansion AV8S2-exprimierender CD8-T-Zellen beitragen. Durch den Vergleich mit anderen Daten unseres Labors konnte dargelegt werden, daß die beta-Kette zur präferentiellen Interaktion von AV8S2-Zellen mit Af keinen spezifischen Beitrag leistet. Ebenso unbeteiligt ist die Komplementarität-bestimmende Region 2 (CDR2) der alpha-Kette. Die charakteristischen Sequenzen von CDR1alpha und CDR3alpha dagegen sind für die präferentielle Expansion von AV8S2-positiven CD8-T-Zellen durch Af essentiell.
N2  - It was shown previously that RT1f (the MHC of the LEW.1F rat) preferentially expands AV8S2 (V-segment 8.2 of the TCR-alpha chain) expressing T-cells in positive thymic selection in the LEW.1F rat (overselection) as well as AV8S2 cells alloreactive to RT1f. As the preferential AV8S2 expansion was only detected in the CD8 T-cells, a MHC class I molecule of the LEW.1F rat was postulated to be responsible for the overselection. In this thesis the MHC I molecule of the LEW.1F rat promoting preferential expansion of AV8S2 CD8 T-cells in allorecognition was identified. To this end a MHC I molecule of the LEW.1F rat, Af, was cloned and sequenced. Together with A2f, another MHC I molecule of the LEW.1F rat, cloned and sequenced by a group from Babraham/UK, Af was expressed in various cell lines and hybridomas. The two molecules were tested for recognition by RT1f-reactive antibodies and cytotoxic T-lymphocytes. By these criteria Af was defined as a MHC class I molecule of the LEW.1F rat whereas A2f was not. The ability to overselect AV8S2 CD8 T-cells was examined by MLR (mixed lymphocyte reaction). Preferential interaction of this TCR segment with Af but not A2f has therefore been demonstrated. Thus Af is the molecule preferentially expanding AV8S2 cells. To identify the Af/AV8S2-contact points hybrids between Aa and Af were generated: Extracellularly, Aa differs from Af in only seven aminoacids, which are clustered in two different regions (region I and II). Yet Aa is not able to promote preferential expansion of AV8S2 CD8 T-cells. Therefore the specific combination of the seven aminoacids differing between the two molecules are crucial in the observed preferential AV8S2 reactivity of Af. In generating hybrids differing in these regions, equal contributions of both regions for recognition by AV8S2 RT1f-reactive CD8 T-cells could be demonstrated. By theoretical implication the Af/AV8S2 interaction points could be narrowed down further: On the side of the MHC, solely the presumably directly TCR-contacted MHC aminoacids 62, 65, 69 and 167 are likely to be involved in AV8S2-cell expansion. On TCR side, the beta-chain is not involved in specific Af interaction. Only complementarity determining regions 1 and 3 of the TCR-alpha chain are essential for preferential interaction with Af by AV8S2 positive CD8 T-cells.
KW  - Antigen CD8
KW  - T-Lymphozyt
KW  - MHC Klasse I
KW  - Molekulargenetik
KW  - T-Zellrezeptor
KW  - MHC Kl. I
KW  - positive thymische Selektion
KW  - Alloreaktion
KW  - gemischte Lymphozytenreaktion
KW  - CD8 T-Zell-Subpopulation
KW  - T-cell receptor
KW  - MHC class I
KW  - positive thymic selection
KW  - alloreaction
KW  - MLR
KW  - CD8 T-cell subpopulation
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1727
ER  - 
TY  - THES
A1  - Deutschländer, Angela
T1  - Über den Beitrag von Valpha- und Jalpha-Segmenten des T-Zellrezeptors von CD8 T-Zellen der Ratte bei RT1f-spezifischer Alloreaktion und positiver Selektion im Thymus
T1  - Contribution of TCR Va and Ja segments of rat CD8 T cells during RT1f-dependent alloreactivity and positive thymic selection
N2  - Va8.2+ CD8 T-Zellen von LEW.1F Ratten (MHC-Haplotyp f) werden während der Reifung im Thymus zehnfach überselektioniert: 14 Prozent der reifen LEW.1F CD8 T-Zellen exprimieren Va8.2; CD8 T-Zellen von MHC kongenen RT1f- Stämme sind nur zu 1-2 Prozent Va8.2+. Gleichzeitig führt die RT1f-spezifische allogene Stimulation reifer LEW (MHC Haplotyp l) CD8 T-Zellen zu einer bevorzugten Expansion von Va8.2+ T-Zellen. Dies überrascht, da die positive Selektion unreifer Thymozyten eine niedrigere Avidität zwischen T-Zelle und Antigen-präsentierender Zelle erfordern soll als Alloreaktivität. Ein bevorzugter Vb-Gebrauch wurde weder bei RT1f-spezifischer positiver Selektion noch Alloreaktion gefunden. Das Ja-Repertoire von RT1f-alloreaktiven Va8.2 TCR ist restringiert, ihre CDR3a Schleifen sind kurz, homogen und besitzen wenig N-Nukleotidinsertionen; ein hydrophob/amphiphatisches Motiv erhöht wahrscheinlich die Peptidpromiskuität. Va8.2+ LEW.1F T-Zellen besitzen ein weniger restringiertes Ja-Repertoire; ein hydrophobes Motiv der CDR3a-Schleife wurde seltener gefunden; weitere Restriktionen der CDR3a-Schleife fanden wir nicht. Nicht-alloreaktive LEW CD8 T-Zellen zeigten keine Restriktionen im Bereich Ja/CDR3a. Va8.2 vermittelt MHC-spezifische positive Selektion und Alloreaktivität. Alloreaktionen erfordern einen zusätzlichen Beitrag der CDR3a-Schleife, deren Gestaltung wahrscheinlich Kontakte mit einem hochdiversen Peptidsatz und zusätzliche MHC-Molekül-Kontakte ermöglicht. Unsere Ergebnisse sind vereinbar mit Röntgenstrukturanalysen des T-Zellrezeptor (TCR)/pMHC-Komplexes und dem "differential-avidity model" der TCR-vermittelten Antigenerkennung bei thymischer Selektion und Aktivierung reifer T-Zellen. Sie dokumentieren die Bedeutung der Erkennung polymorpher MHC-Strukturen durch keimbahnkodierte TCR-Segmente und sprechen gegen eine ausschließliche Peptidspezifität von positiver Selektion und Alloreaktivität.
N2  - Va8+ CD8 T cells of LEW.1F rats (MHC haplotype f) are 10-fold overselected during positive thymic selection. Allostimulation with RT1Af leads to preferential expansion of mature Va8+ LEW (MHC haplotype l) CD8 T cells. This is surprising, since positive selection of immature thymocytes is thought to require a lower avidity between T cell and antigen presenting cell than alloreactivity of peripheral T cells. Va8+ T cell receptor (TCR) variable domains of LEW.1F CD8 T cells, LEW and RT1f-alloreactive LEW CD8 T cells were compared. All variable domains used Va8.2. No preferential expression of Vb-TCR segments was found. RT1f-alloreactive LEW T cells used a restricted Ja repertoire, and their CDR3a loops were short, homogenous in lenghth, and showed little addition of N-nucleotides; a hydrophobic/amphiphatic CDR3a motif, that was found in 40 per cent, possibly increases peptide promiscuity of the TCR. LEW.1F T cells also showed a restricted Ja usage, but to a much smaller extent; a hydrophobic CDR3a motif was found in only 22 per cent. Non-alloreactive LEW T cells showed no restrictions regarding Ja/CDR3a usage. The results demonstrate that a single TCR Va segment can promote both MHC allele-specific positive selection and alloreactivity and that the latter is more dependent on additional contributions of the CDR3a loop, possibly by promoting reactivity with a highly diverse set of MHC-bound peptides or by providing additional MHC contacts. Furthermore the findings argue against an exclusive peptide-specificity of positive thymic selection and alloreactivity.
KW  - T-Zellrezeptor
KW  - positive Selektion
KW  - Alloreaktivität
KW  - MHC-Molekül
KW  - Ratte
KW  - T cell receptor
KW  - positive selection
KW  - alloreactivity
KW  - MHC-molecule
KW  - rat
Y1  - 2001
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2554
ER  -