TY  - THES
A1  - Hellmann, Tina Verena
T1  - Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren
T1  - Influence of the coreceptor Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) on the Bone Morphogenetic Protein signaling pathway
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die größte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schlüsselfunktionen während der frühen Embryogenese inne und regulieren darüber hinaus die Organogenese sowie die Homöostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale über zwei Typen transmembranärer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur fünf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegenüber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuität der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden können, müssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. Kürzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben – die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. Für das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abhängige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widersprüchlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zunächst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies ermöglichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodomänen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberflächen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten darüber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodomänen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der lösliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabhängig inhibiert, während die membranverankerte RGMb-Variante eine Verstärkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberflächen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodomänen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivität neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich für die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodomäne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere Überlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren für die Ausbildung der beobachteten Selektivität verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellulärer Ebene analysieren zu können, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte für BMP-Rezeptoren sowie für RGMb synthetisiert und ein funktionelles Färbeprotokoll für die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit präsentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt für die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Darüber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, möglicherweise völlig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifität und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden könnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge für eine zukünftige detaillierte Aufklärung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abhängigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellulärer Ebene dar.
N2  - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) comprise the largest subgroup of the Transforming Growth Factor-β (TGF-β) superfamily of secreted growth factors. They are key regulators of early embryogenesis and orchestrate the development as well as the homeostasis of several tissues and organs in adult organisms. BMPs transduce their signals through two types of transmembrane serine/threonine kinase receptors termed type I and type II receptors. An imbalance in BMP-ligand and receptor numbers - about twenty different BMP-ligands face only five type I and three type II receptors - causes a pronounced promiscuity in ligand/receptor interactions. Therefore, a complex regulatory network is necessary to enable specific signaling of each BMP ligand despite a temperospatial expression overlap. Most of the discovered regulatory processes inhibit BMP-signal transduction. Recently, the first membrane-associated BMP-specific agonists - the Repulsive Guidance Molecule (RGM) family of coreceptors comprised of RGMa, RGMb and RGMc - have been discovered. Aside from stimulatory effects, evidence for a potential inhibitory activity of the RGM family member RGMb on BMP-induced signal transduction has previously been described. To clarify these contradictory RGMb functions, extensive biochemical and biophysical characterizations were carried out. In the course of this work, an efficient expression and purification strategy was established resulting in great yields of highly pure recombinant RGMb coreceptor protein. Subsequent in vitro binding assays based on surface plasmon resonance (SPR) showed that RGMb specifically interacts with BMP ligands, while no binding to other subfamily members could be detected. Contradicting published data, no direct interactions of the RGMb coreceptor with type I and type II receptor ectodomains were determined. Furthermore, cell-based competition assays revealed that soluble RGMb protein lacking the glycosylphosphatidylinositol anchor dose-dependently inhibits BMP-induced signal transduction. Characterizing the influence of the membrane anchored RGMb coreceptor on BMP signaling pointed to a more complex situation. Hence, only minor deviations of the BMP-dependent signal transduction in RGMb-transfected compared to control cells could be detected. These differences could possibly indicate a sensitizing activity of the RGMb coreceptor on BMP-signaling as it has been described before. SPR-based co-injection experiments revealed that BMP ligands bound to RGMb lose their ability to interact with type I receptor ectodomains. Thus, the coreceptor blocks the type I receptor binding epitope, thereby neutralizing the signaling activity of BMP ligands. However, comparative experiments using BMP variants pointed out that the coreceptor/ligand interface involves other binding hot spot residues than the type I receptor/ligand interaction. Analyzing the influence of RGMb on the BMP/type II receptor interaction based on SPR measurements led to a different outcome: In the presence of the RGMb coreceptor, BMP ligands were solely able to interact with the extracellular domain of the type II receptor ActR IIB, while no binding could be detected with neither ActR II nor BMPR II ectodomains. Hence, binding of the coreceptor does not directly interfere with the BMP ligand/type II receptor core interface, whereas a partial peripheral overlap of RGMb with the type II receptor epitope may evoke the observed selectivity for ActR IIB. In order to clarify the observed interactions in the cellular context, RGMb and BMP receptor fusion constructs based on the SNAP-/CLIP-tag® technology as well as efficient labeling protocols and confocal microscopic procedures were established. The biochemical characterization of RGMb along with the extensive interaction studies of this coreceptor with a multiplicity of BMP-ligands and their receptors presented in this work, narrow down the location of the RGMb binding epitope, thus providing an ideal starting point for the subsequent determination of the coreceptor binding domain by site directed mutagenesis. Moreover, the presented in vitro binding studies point to a more complex and possibly novel regulatory mechanism of the BMP signal transduction by RGMb than previously assumed. Thus, the presence of the coreceptor selectively regulates the type II receptor specificity and potentially also the recruitment of BMP-ligands into certain membrane compartments (e.g. lipid raft-domains), herewith fine-tuning BMP-induced signals. The SNAP- and CLIP tag® fusion constructs produced in this work together with the established protocols for confocal microscopy analyses provide efficient tools for subsequent extensive examinations of theses regulatory processes in living cells (e.g. by FRET measurements).
KW  - Knochen-Morphogenese-Proteine
KW  - Rezeptor
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - Bone morphogenetic protein
KW  - Transforming Growth Factor
KW  - coreceptor
KW  - BMP
Y1  - 2013
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568
ER  - 
TY  - THES
A1  - Straube, Frank
T1  - Untersuchungen zur Rolle von CD8 bei der Aktivierung von gamma-delta-T-Zellen der Ratte
T1  - Investigation of the role of CD8 for the activation of rat gammadelta T cells
N2  - CD8 wird von thymisch gereiften a/b T Zellen als CD8ab-Heterodimer exprimiert und dient als Korezeptor bei der MHC Klasse I (MHC I) restringierten Antigenerkennung. In dieser Funktion stabilisiert CD8 die Bindung des T Zellrezeptors (TCR) an seinen Liganden (MHC I mit antigenem Peptid) und vermittelt darüber hinaus kostimulatorische Signale an die T Zelle. Die Antigene der g/d T Zellen sind bis auf einige Ausnahmen unbekannt, aber g/d T Zellen von Maus und Mensch weisen im allgemeinen höchstwahrscheinlich keine MHC-restringierte Antigenerkennung auf. Dementsprechend findet man auf den meisten g/d T Zellen dieser Spezies keinen der MHC-spezifischen Korezeptoren CD4 oder CD8. In auffälligem Gegensatz dazu exprimieren in der Milz der Ratte bis zu 80 Prozent der g/d T Zellen das CD8ab-Heterodimer. Um die mögliche Funktion von CD8ab auf g/d T Zellen besser zu verstehen, wurden zunächst die CD8-vermittelten Signale untersucht. Eine Schlüsselrolle bei der Initiierung der TCR-Signalkaskade kommt der mit CD8a assoziierten Proteintyrosinkinase p56lck zu. Diese ist, wie durch Kopräzipitationsexperimente gezeigt wurde, bei a/b und g/d T Zellen gleichermaßen mit CD8 assoziiert und zeigt dieselbe Kinaseaktivität. Weiterhin konnte in vitro ein kostimulatorisches Potential von CD8-spezifischen Antikörpern für a/b und g/d T Zellen gezeigt werden. Demnach besitzt CD8 auf a/b und g/d T Zellen prinzipiell eine vergleichbare Fähigkeit zur Übertragung kostimulatorischer Signale. Es war folglich naheliegend, einen Zusammenhang zwischen der CD8ab-Expression der g/d T Zellen mit einer möglichen MHC I estringierten Antigenerkennung zu prüfen. Da bisher keine Antigene für g/d T Zellen der Ratte bekannt sind, wurden die Antigen bindenden Regionen des g/d TCR analysiert. Bei Antigenrezeptoren von Mensch und Maus bestehen nämlich charakteristische Längenunterschiede zwischen den mit dem Antigen interagierenden CDR3-Proteinschleifen (englisch: complementarity determining regions), die in der Verknüfungsregion der V-, D- und J-Gensegmente codiert sind. Bei Maus und Mensch sind die CDR3-Längen der TCRd-Kette ähnlich variabel und etwa so lang wie bei der schweren Kette des B Zellrezeptors. Dagegen sind die CDR3-Regionen der TCRb-Kette sehr kurz, was wahrscheinlich durch die notwendige Interaktion des MHC-Peptid-Komplexes mit allen drei CDR-Schleifen bedingt wird. Daraus wurde geschlossen, daß die Bestimmung der CDR3d-Längen Aussagen über eine mögliche MHC-Restriktion von g/d T Zellen der Ratte erlauben sollte. Zur Durchführung der CDR3d-Längenanalysen wurde die Methode des Spektratyping etabliert. Hierfür wurden in der Milz häufig vorkommende TCRd V-Gensegmente (DV105 und fünf Mitglieder der ADV7-Familie) partiell kloniert und sequenziert. In CD8 positiven und negativen g/d T Zellen wurden sowohl DV105 als auch Mitglieder der ADV7-Familie jeweils etwa gleich häufig exprimiert. Spektratyp-Analysen ergaben in g/d T Zellen der Ratte für beide V-Genfamilien etwas längere CDR3d-Schleifen als bei der Maus; CD8ab positive, CD8aa positive und CD8 negative g/d T Zellen der Ratte besaßen identische Längenspektren. Demnach kann man die CD8ab-Expression von g/d T Zellen der Ratte nicht als Hinweis auf eine der klassischen MHC-Restriktion ähnliche Antigenerkennung werten. Als spezifische Eigenschaft von g/d T Zellen der Ratte wurde eine Modulation der CD8b-Genexpression nachgewiesen, die mit der Stärke des Aktivierungssignals zunahm. Nach Aktivierung in vitro exprimierte ein großer Teil zuvor CD8ab positiver g/d T Zellen nur noch das CD8aa-Homodimer, das auf MHC I restringierten a/b T Zellen deutlich schlechtere Korezeptoreigenschaften aufweist als das CD8ab-Heterodimer. Die Modulation war irreversibel, fand prätranslational statt und zeigte keine Einflüsse auf Effektorfunktionen der g/d T Zellen wie Interferon-g-Produktion oder zytotoxische Fähigkeiten. Über die physiologische Bedeutung dieser Modulation kann nur spekuliert werden, doch könnte sie ein Mechanismus sein, um den Schwellenwert für Signale einer erneuten T Zellaktivierung zu erhöhen. Darüber hinaus limitiert sie den Nutzen der CD8ab-Expression als Marker für die thymisch gereifte Linie von g/d T Zellen.
N2  - CD8 is expressed on thymus derived a/b T cells and serves as the co-receptor for MHC class I (MHC I) restricted antigen recognition. In this role CD8 stabilises the binding of the T cell receptor (TCR) to its ligand (MHC with antigenic peptide) and moreover transduces co-stimulatory signals to the T cell. Aside from few examples the antigens of g/d T cells are unknown, but mouse and human g/d T cells most probably do not possess a MHC restricted way of antigen recognition. Correspondingly most g/d T cells of these species do not express one of the MHC specific co-receptors CD4 or CD8. In striking contrast up to 80 per cent of splenic rat g/d T cells express the CD8ab heterodimer. To understand the putative function of CD8ab expressed by rat g/d T cells, CD8 signalling was investigated first. The protein tyrosine kinase p56lck plays a key role at the initiation of the TCR signalling cascade. This kinase is equally associated with CD8 on a/b and g/d T cells as found by co-precipitations, and it shows the same kinase activity there. Furthermore, in vitro a co-stimulatory potential of CD8 specific antibodies could be demonstrated for a/b and g/d T cells likewise. Therefore in principle, CD8 possesses similar co-stimulatory properties on rat a/b and g/d T cells. Consequently a correlation between CD8ab expression and a possible MHC I restriction of rat g/d T cells was tested. Because no antigens have been found for rat g/d T cells so far, the antigen binding regions of the g/d TCR were investigated. It is known that the complementarity determining region 3 (CDR3) protein loops, which are encoded by the region of V, D, and J gene segment joining, show characteristic length differences: CDR3 lengths of mouse and human TCRd chains show the same variability and are as long as CDR3 of the B cell receptor heavy chain. In contrast, the CDR3 regions of TCRb chains are very short, what probably results from the necessity of interaction between MHC and all three CDR loops. In consequence, determining the CDR3d lengths should allow predictions about a possible MHC restriction of rat g/d T cells. For CDR3d length analysis a method called spectratyping was established. First of all, common TCRd V segments from rat spleen (DV105 and five members of the ADV7 gene family) were cloned and sequenced partially. Both gene families were expressed in about the same frequency by CD8 negative and CD8 positive g/d T cells, respectively. For both V segment families the spectratyping analyses revealed somewhat longer CDR3d loops in rat than in mouse g/d T cells. CD8ab or CD8aa positive and CD8 negative g/d T cells showed exactly the same CDR3d length spectra. Therefore the CD8ab expression of rat g/d T cells is no indication for a MHC restricted antigen recognition. As a specific property of rat g/d T cells an activation dependent down modulation of the CD8b chain could be demonstrated, that increased with the strength of the activating signal. Following activation in vitro, a major percentage of g/d T cells which previously expressed CD8ab, solely expressed the CD8aa homodimer. On MHC I restricted a/b T cells CD8aa is known to show poor co-stimulatory potential compared to CD8ab. The modulation was irreversible, occurred on a pre-translational level and did not influence g/d T cell effector functions like interferon-g production or cytotoxicity. A physiological role of the modulation is speculative so but the CD8b modulation might be a mechanism to increase the signalling threshold for a following T cell activation. Moreover, the modulation limits the use of CD8ab expression as a marker for the thymically derived g/d T cell lineage.
KW  - Antigen CD8
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Aktivierung <Physiologie>
KW  - Korezeptor
KW  - gammadelta T Zelle
KW  - Ratte
KW  - CD8
KW  - coreceptor
KW  - gammadelta T cel l
KW  - rat
KW  - CD8
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-2381
ER  -