TY  - THES
A1  - Moch, Christian Peter
T1  - Analyse der mitochondrialen Dysfunktion im myokardialen Ischämie-Reperfusionsschaden unter Einfluss von Enoximon im Modell der Langendorffperfusion des Rattenherzens
T1  - Analysis of mitochondrial dysfunction in the myocardial ischemia-reperfusion injury under the influence of enoximone in the model of Langendorffperfusion of the rat heart
N2  - Hintergrund: 
Im Zuge einer akuten Herzinsuffizienz kommt es auf Grund der Ischämie und Reperfusionsschäden (IR) zur Verschlechterung der Herzfunktion. Studien bezüglich einer 15- und 20 minütigen Ischämie haben für den Phosphodiesterase3-Hemmer Enoximon bereits einen positiven Einfluss auf die Myokard- und Mitochondirenfunktion aufzeigen können. Ob diese Ergebnisse auch unter längerer Ischämiezeit reproduzierbar sind, war Gegenstand dieser Arbeit.

Material und Methoden: 
4 Gruppen wurden bezüglich ihrer Ergebnisse im Zuge einer retrograden Perfusion von Rattenherzen innerhalb der Langendorff-Apparatur verglichen. Allen Gruppen war eine 30-minütige Perfusion gemein. Als Kontrollgruppe diente IR0/30. Die Gruppen unterschieden hinsichtlich der Verwendung einer 40-minütigen Ischämiezeit vor Reperfusion (IR40/30) sowie dem Gebrauch von Enoximon mit (Enox-IR40/30) und ohne Ischämie (Enox-IR0/30). Im Rahmen des Langendorff-Versuchs wurde der linksventrikuläre Druck (LVPsys), der Koronarfluss, die Kontraktilität (LVdp/dtmax) sowie Herzenzyme bestimmt. Zur Bestimmung der Mitochondrienfunktion wurden die IFM und SSM isoliert und hinsichtlich der Atmungskettenfunktion (RCF) sowie der mPTP-Öffnung untersucht.

Ergebnisse: 
Unter IR kam es zu einem Abfall des LVPsys (p<0,01), LVdp/dtmax (p<0,004) sowie des Koronarflusses (p=0,01). Es war eine verstärkte Schwellung der Mitochondrien im Rahmen der mPTP-Öffung für IFM (p=0,01) und SSM (p<0,0001) erkennbar. Die Konzentrationen der Herzmarker GOT und hFABP stiegen an. Für Troponin T, CK und CK-MB fand sich kein signifikanter Unterschied zur Kontrollgruppe.Die Komplexaktivität der IFM war in den Komplexgruppen II-V (p<0,0001), II-IV (p<0,0001), III-V (p=0,004) und IV (p<0,0001) verringert.  In SSM zeigte sich ein Aktivitätsabfall im Komplex IV (p=0,05).
Enoximon hatte unter Ischämie keinen Einfluss auf die hämodynamischen Parameter. Gegen Ende der Messung kam es zu einem geringen Anstieg der mPTP-Öffnung der SSM (p=0,05). Die Konzentration an hFABP war verringert. Die Komplexaktivität der IFM stieg in den Komplexgruppen I-V (p=0,01), II-V (p=0,04), II-IV (p=0,02) und IV (p=0,02) gegenüber IR40/30 an. In nicht-ischämischen Myokard (Enox-IR0/30) zeigte Enoximon einen Anstieg des LVdp/dtmax (p<0,02) und verringerte die Konzentration an TroponinT (p<0,02). Während die Komplexaktivität der IFM in I-V anstieg (p=0,01), zeigte diese sich in II-V (p=0,04) und III-V (p=0,009) abgeschwächt. Für SSM war am Ende der Messung ein geringer Anstieg der mPTP- Öffnung erkennbar (p<0,04).

Diskussion: 
IR-Schäden verschlechtern die Herzleistung, führen zu einer Reduktion der Mitochondrienfunktion sowie gesteigerter Vulnerabilität der Mitochondrien im Zuge der mPTP-Öffnung. Während Studien mit kürzer Ischämiezeit für Enoximon eine Verbesserung des LVPsys, LVdp/dtmax und Koronarflusses aufzeigen konnten, waren unter 40minütiger Ischämie kein Einfluss von Enoximon mehr erkennbar. Es ließ sich unter Ischämie für Enoximon jedoch ein positiver Einfluss auf die Atmungskettenkomplexe der IFM nachweisen. Gleichzeitig war in nativem Myokard ein Anstieg des LVdp/dtmax unter Enoximon erkennbar. In Zuge von IR-Schäden scheint somit die Wirksamkeit von Enoximon stark von einem frühen Applikationszeitpunkt abhängig zu sein.
N2  - Background: 
In acute myocardial insufficiency the heart suffers due to ischemic and reperfusion injuries (I/R). The Phosphodiesterase3-inhibitor enoximone has already proven to have a cardio protective impact on the myocardium and mitochondrial function in former studies to 15- and 20 min ischemic periods. Whether or not these findings could be reproduced during longer periods of ischemia was the subject matter.

Methods: 
4 study groups were compared in terms of retrograde reperfusion of explanted rat hearts using a Langendorff-model. All groups had a 30 min perfusion time in common. The control group was IR0/30. The groups differ due to a 40 min ischaemic periode before reperfusion (IR-40/30) and the use of enoximone with (Enox-IR40/30) or without ischemia (Enxo-IR0/30). Left-ventricular pressure (LVPsys), coronary flow and contractility (LVdp/dtmax) as well as heart enzymes were measured during the Langendorff-model. To evaluate the mitochondrial function, the IFM and SSM were isolated and examined for the capacity of the reaspiratory chain function (RCF) and activity of the mitochondrial permeability pores (mPTP). 

Results: 
Due to I/R, the LVPsys (p<0,01), LVdp/dtmax (p<0,004) and coronary flow (p=0,01) declined. The susceptibility of the mPTP in IFM (p=0,01) and SSM (p<0,0001) increased. The concentration of the cardiac markers GOT and hFABP escalate, whereas Troponin T, CK and CK-MB show no significant differences compared to the control group. 
The RCF in IFM was reduced at C II-V (p<0,0001), C II-IV (p<0,0001), C III-V (p=0,004) and C IV (p<0,0001). RCF in SSM was diminished at C IV (p=0,05).
Under I/R, enoximone showed no effect at the haemodynamic parameters. For SSM a slight increase in mPTP-opening (p=0,05) occurred at the end of the meassurement.
The concentration of hFABP lessened. The RCF in IFM improved in C I-V (p=0,01), C II-V (p=0,04), C II-IV (p=0,02) and C IV (p=0,02) compared to IR40/30. In non-ischemic myocardium (Enox-IR0/30) enoximone improved LVdp/dtmax (p<0,02) and lowered the concentration of TropT (p<0,02). Whereas RCF for IFM in C I-V (p=0,01) is increased, RCF in II-V (p=0,04) and III-V (p=0,009) is weakend. For SSM a slight increase in mPTP- opening (p<0,04) occurred at the end of the meassurement.

Conclusion:
I/R-injury worsen haemodynamic parameters and function of the IFM and SSM as well as increase the mPTP Ca2+-susceptibility. Whereas studies including shorter ischemic periods showed an improvement of LVPsys, LVdp/dtmax and coronary flow, no detectable effect of enoximone could be seen due to 40 min ischemia. 
However, a positive influence at the RCF of the IFM under I/R as well as an improved LVdp/dtmax for non-ischemic myocardium could be observed. Therefore, the impact of enoximone seems highly depended on an early application in context of IR-injuries.
KW  - Enoximon
KW  - Ischämie
KW  - Mitochondrium
KW  - Ischämie-und Reperfusion
KW  - Langendorff
KW  - IFM
KW  - SSM
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-189880
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schauß, Astrid Claudia
T1  - Charakterisierung des mitochondrialen Teilungsproteins Dnm1p mittels quantitativer hochauflösender Lichtmikroskopie
T1  - Characterization of the mitochondrial fission protein Dnm1p using quantitative high resolution light microscopy
N2  - Mitochondrien verändern dynamisch durch ein balanciertes Verhältnis von Teilung und Fusion die Gestalt ihrer Netzwerke und reagieren so auf interne und externe Signale. Ein Schlülsselprotein der mitochondrialen Teilung ist die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1p, die in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Da Mitochondrien aufgrund ihres endosymbiontischen Ursprungs zwei Membranen besitzen, erfordert deren Teilung eine besondere Koordination. Unter Verwendung von photokonvertierbarem GFP wird in dieser Arbeit gezeigt, dass in S. cerevisiae die Teilung der inneren und äußeren Membran zeitlich eng gekoppelt verläuft. Dieser Prozess wird durch die GTPase Dnm1p, aber auch durch die Adaptor-Proteine Mdv1p und Caf4p sowie dem integralen Membrananker Fis1p v ermittelt. Dnm1p lagert sich zu Spiralen um den tubulären Strang an und trennt GTP-abhängig die Mitochondrien voneinander. Eine Voraussetzung für die Anlagerung dieser Spiralen stellen Matrix-Konstriktionen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Dnm1p und auch Fis1p für die Ausbildung dieser mitochondrialen Einschnürungen nicht essentiell sind. Die Untersuchung der Verteilung, Orientierung und Größe der Epitop-markierten Dnm1p-Cluster bildet den Schwerpunkt der Arbeit. Weiterhin wird der Einfluss der Teilungsproteine Fis1p, Mdv1p und Caf4p auf diese Dnm1p-Charakteristika ermittelt. Die Analyse basiert auf quantitativen Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zusätzlich werden auch neue hochauflösende Lichtmikroskope (4Pi und STED) zur genauen Lokalisation und Größenbestimmung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionsstämmen die Mehrheit der Cluster mit den Mitochondrien assoziiert ist, während in Fis1p- und Caf4p-Deletionszellen die Rekrutierung der Cluster zu den Mitochondrien gestört erscheint. Nur wenige Cluster bilden Spiralen um Matrix-Konstriktionen aus, die überwiegende Mehrheit der nicht an aktuellen Teilungsprozessen beteiligten Dnm1p-Aggregate weist dagegen im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionszellen eine polare Orientierung Richtung Zellcortex auf. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Polarität ist in Fis1p- und Caf4p-Deletionsstämmen aufgehoben, bleibt jedoch auch nach der Zerstörung des Aktin-Gerüstes aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass Dnm1p in einem Komplex mit Fis1p und Caf4p zusätzlich zu seiner Funktion als Teilungsprotein an der Anheftung der Mitochondrien an den Zellcortex beteiligt ist. Zudem scheinen die Adaptorproteine Mdv1p und Caf4p trotz molekularer Ähnlichkeit unterschiedliche Aufgaben in der Zelle zu erfüllen.
N2  - Mitochondrial networks dynamically change their shape by balanced fission and fusion in response to internal and external signals. The key protein in mitochondrial fission, the dynamin-related GTPase Dnm1p, is characterised in this study. Because of their endosymbiotic origin mitochondria possess two membranes, whose separations must be coordinated. Using photoconvertable GFP, it is shown that the division of outer and inner membranes are tightly coupled in S. cerevisiae. This separation is due to the GTPase Dnm1p, but the adaptor proteins Mdv1p and Caf4p, as well as the membrane anchor Fis1p, are also involved in mitochondrial division in yeast. Dnm1p forms spirals around the mitochondrial tubes and separates them in a GTPase-dependant manner. Matrix constrictions are presumably one precondition for the formation of spirals. In this work it is shown that Dnm1p as well as Fis1p are not essential for the formation for this mitochondrial narrowing. The main focus of the work is the analysis of the distribution, orientation and size of the epitope-tagged Dnm1p clusters in yeast cells. Additionally, the influence of the other division proteins, Fis1p, Mdv1p and Caf4p, on these Dnm1p characteristics is determined. The analysis is based on both quantitative confocal images and high resolution 4Pi and STED microscopy, for better localization and determination of the cluster sizes. The results demonstrate that in wild type and Mdv1p deletion cells, the majority of clusters are associated with mitochondria, whereas the recruitment of Dnm1p-clusters is disturbed in Fis1p and Caf4p deletion cells. While just a few clusters form spirals around matrix constrictions, the overwhelming majority of clusters, which are not involved in an actual fission process, show a polar orientation towards the cell cortex in wild type and Mdv1p deletion cells. This polarity, described for the first time in this work, is abolished in Fis1 and Caf4p deletion cells, but is maintained after the destruction of the actin cytoskeleton. The results of this work point to an additional role of Dnm1p, together with Fis1p and Caf4p, in the attachment of mitochondria to the cell cortex. Furthermore it is shown that the adaptor proteins Mdv1p and Caf4p have different roles within the cell despite of their molecular similarity.
KW  - Hefeartige Pilze
KW  - Mitochondrium
KW  - Mikroskopie
KW  - Mitochondrien
KW  - Dynamik
KW  - Hefe
KW  - STED
KW  - 4Pi
KW  - mitochondria
KW  - dynamic
KW  - yeast
KW  - STED
KW  - 4Pi
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17566
ER  - 
TY  - THES
A1  - Zürn, Christina Anika
T1  - Charakterisierung des Mitochondrialen Tumorsuppressor-Gens 1 (MTUS1) anhand von In-vitro-Untersuchungen und Etablierung eines Knockout-Maus-Modells
T1  - Characterisation of the Mitochondrial Tumor Suppressor Gene 1 (MTUS1) using in vitro investigations and generation of a knock out mouse
N2  - Das kürzlich publizierte MTUS1-Gen zeigt Eigenschaften eines Tumorsuppressor-Gens. So liegt die MTUS1-Expression in verschiedenen Tumorzelllinien vermindert vor und bei rekombinanter Expression in der schnell wachsenden Pankreaskarzinomzelllinie MiaPaCa-2 konnte die Proliferation signifikant reduziert werden. Darüber hinaus interagiert MTUS1 mit dem AT2-Rezeptor und scheint durch die Inhibierung des RTK-Signalwegs die Zellproliferation zu regulieren. Nach den Untersuchungen der MiaPaCa-2-Zelllinie konnte eine Mutation in der Exonsequenz und der vorhergesagten Promotorregion als Ursache der niedrigen MTUS1-Expression ausgeschlossen werden. Die Analyse des Promotorbereichs hinsichtlich des Methylierungsmusters der CpG- und CpNpG-Inseln brachte deutliche Methylierungsunterschiede in den CpNpG-Inseln der MiaPaCa-2-Zellen gegenüber HUVEC-Zellen zu Tage. Die anschließende Untersuchung der vorhergesagten Promotorregion mit Hilfe eines Promotor-Assays brachte die Gewissheit, dass es sich bei der untersuchten Sequenz um einen Transkription regulierenden Genabschnitt handelt. Durch die Transfektion von HUVEC-Zellen mit MTUS1-siRNA konnten nachweislich Zellen mit einem funktionellen MTUS1-Knockout hergestellt werden. Diese Zellen zeigten mit der verminderten MTUS1-Expression ein signifikant erhöhtes Wachstum. Die Ergebnisse der Zellversuche legen die Vermutung nahe, dass MTUS1 deshalb als Tumorsuppressor-Gen agieren kann, weil es die Zellproliferation reguliert und so der funktionelle MTUS1-Knockout mit einem erhöhten Zellwachstum einhergeht. Als Mechanismus der Geninaktivierung kommt die Hypomethylierung der vorhergesagten Promotorsequenz in Frage. Die Untersuchung der Colontumorgewebe und Normalgewebe von zehn Patienten mit Colonkarzinom zeigte eine deutliche Reduktion der MTUS1-Protein-Expression in 50% der Tumorgewebe. Bei diesen Patienten konnte ebenfalls eine signifikant reduzierte mRNA-Expression nachgewiesen werden. Wie bereits bei den MiaPaCa-2-Zellen nachgewiesen, zeigte sich eine Hypomethylierung der CpNpG-Inseln in den Geweben mit geringer MTUS1-Expression. Diese veränderte Methylierung könnte die Erklärung für die verminderte Transkription des MTUS1-Gens sein. Mit dem MTUS1-Knockout-Maus-Modell wurde die Grundlage für das bessere Verständnis der Funktion von MTUS1 in vivo geschaffen. Nach erfolgreicher Blastozysteninjektion und Zucht der homozygoten Knockout-Mäuse, konnte auf DNA-, mRNA- und Protein-Ebene die geglückte Ausschaltung des MTUS1-Gens bestätigt werden. Bei der Langzeituntersuchung der Tiere zeigten sich vor allem Abweichungen im Blutbild, wonach die homozygoten und heterozygoten Tiere auffallend hohe Werte an Leukozyten und Lymphozyten aufwiesen. Durch die pathologische Untersuchung konnte eine extramedulläre Hämatopoese und lymphatische Infiltrate in verschiedenen Organen nachgewiesen werden und gaben Hinweise auf eine Bluterkrankung. Nach diesen pathologischen Ergebnissen zeigten 23% der homozygoten und 17% der heterozygoten Tiere Symptome eines B-Zell-Lymphoms. Bei den Wildtyp-Tieren konnten keine pathologischen Auffälligkeiten gezeigt werden. Fast ein Viertel der homozygoten Mäuse wiesen eine Herzhypertrophie auf, oft einhergehend mit einer chronischen Glomerulonephritis und einer Atelektase der Lunge. Eine denkbare Erklärung für die blutdruckunabhängige Entstehung der Herzhypertrophie wäre eine Beeinflussung von Wachstumsfaktoren, da bereits nachgewiesen wurde, dass eine durch MTUS1 vermittelte Inhibierung von Insulin-, bFGF- und EGF-gesteuerten Signalkaskaden eine Inaktivierung von ERK2 zur Folge hatte. Mit Hilfe einer X-Gal-Färbung von verschiedenen Organen einer Wildtyp-, heterozygoten und homozygoten Maus konnten Erkenntnisse über die Genaktivität von MTUS1 in den verschiedenen Organen gewonnen werden. Zusammenfassend lässt sich von einer hohen MTUS1-Expression in den meisten Epithelzellen und Endothelzellen sprechen, außerdem weisen die Kardiomyozyten im Herz und die Purkinjefasern im Gehirn eine hohe Expression auf. Bei der Untersuchung von homozygoten und Wildtyp-Bauchhautfibroblasten wurde schließlich eine geringere Zellgröße der homozygoten Fibroblasten festgestellt. Mit der X-Gal-Färbung konnte nachgewiesen werden, dass das MTUS1-Protein vorwiegend in der Nähe des Zellkerns lokalisiert ist. Eine der untersuchten homozygoten Fibroblastenlinien zeigte gegenüber den anderen Fibroblasten eine deutlich erhöhte Proliferation. Das könnte ein Hinweis auf eine antiproliferative Wirkung von MTUS1 und eine Erklärung für die kleinere Zellgröße der homozygoten Fibroblasten sein. Als Zusammenfassung aller hier gezeigten Ergebnisse konnte die Hypothese untermauert werden, dass es sich bei MTUS1 um ein Tumorsuppressor-Gen handelt, das seine antiproliferativen Eigenschaften wahrscheinlich in Kooperation mit dem AT2-Rezeptor durch die Inhibierung des RTK-Signalwegs vermittelt.
N2  - The recently published MTUS1 gene exhibits characteristics of a tumor suppressor gene. Thus the MTUS1 expression is decreased in different tumor cell lines and the recombinant expression of MTUS1 could reduce the proliferation in the fast growing pancreatic tumor cell line MiaPaCa-2. Beyond that, MTUS1 interacts with the AT2 receptor and seems to regulate the cell proliferation by the inhibition of the RTK signaling pathway. After the investigations of the MiaPaCa-2 cell line, a mutation in the exon sequence or the predicted promoter region could be excluded as a cause of the low MTUS1 expression. The analysis of the promoter range regarding the methylation pattern of the CpG and CpNpG islands did not reveal differences in the methylation of the CpG islands, but clear discrepancies in the CpNpG islands of the MiaPaCa-2 cells in contrast to the HUVEC cells. The subsequent investigation of the predicted promoter sequence with a promoter assay approved the hypothesis that the examined sequence has properties for the regulation of gene transcription. HUVEC cells with a functional MTUS1 knockout could be obtained by the transfection with MTUS1 siRNA. The experiment with these cells exhibited that cells without MTUS1 expression can proliferate significantly faster. The assumption that MTUS1 could act like a tumor suppressor gene by affecting the regulation of the cell proliferation is thereby confirmed. The investigation of the tumor tissue and normal tissue of ten patients with colorectal carcinoma revealed a clear reduction of the MTUS1 protein expression in 50% of the tumor tissues. In these tissues a significantly reduced MTUS1 mRNA expression could also be proven. The methylation pattern of the CpG islands showed no differences between tumor and normal tissue, but there was a hypomethylation of the CpNpG islands in the tissue with less MTUS1 Expression. This methylation pattern could be the explanation for the decreased transcription of the MTUS1 gene. With the MTUS1 knockout mouse model the basis for a better understanding of the MTUS1 function in vivo has been created. After successful injection of stem cells into blastocysts and breeding of the homozygote knockout mice, the elimination of the MTUS1 gene could be proven on DNA, mRNA and protein level. The long-term investigation showed discrepancies in the haemogram of the wildtype, heterozygote and homozygote mice. The homozygote and heterozygote animals had remarkably high values of leukocytes and lymphocytes, while the values of the erythrocytes and the thrombocytes decreased. The pathological investigation could detect extramedullary haematopoiesis in spleen, lymph node and kidneys of the heterozygote and homozygote mice, in addition lymphocytic infiltrates in spleen, kidneys, lung, liver, lymph node and salivary gland were discovered, probably referring to a blood illness. To these pathological results 23% of the homozygote and 17% of the heterozygote animals showed symptoms of a B-cell-lymphoma. The wildtype animals showed no abnormality regarding the extramedullary haematopoiesis or the lymphocytic infiltration in organs. Nearly a quarter of the homozygote mice exhibited a hypertrophy of the heart, often accompanied with a chronic glomerulonephritis and an atelectasis of the lung. The interaction with growth factors could be an explanation for the blood pressure independent hypertrophy because MTUS1 can inhibit the insulin, bFGF and EGF signaling cascades. With the help of the X-gal staining of different organs from wildtype, heterozygote and homozygote mice, informations about the MTUS1 activity could be gathered. In summary MTUS1 showed a high expression in epithelial and endothelial cells, in the cardiomyocytes in the heart and the pukinje cells in the brain. During the analysis of the homozygote and wildtype fibroblasts a smaller height of the homozygote fibroblasts was determined. With the X-gal staining it could be proven that the MTUS1 protein is located predominantly in the perinuclear region. One of the examined homozygote fibroblast lines showed a significant higher proliferation rate in comparison to the wildtype and two other homozygote fibroblast lines. This could be again a reference of the antiproliferative effect of MTUS1 and an explanation for the smaller cell height of the homozygote fibroblasts. The summary of all results supports the hypothesis that MTUS1 has characteristics of a tumor suppressor gene. For the antiproliferative effect MTUS1 seems to cooperate with the AT2 receptor to inhibit the RTK signaling pathway.
KW  - Tumorsuppressor-Gen
KW  - Mitochondrium
KW  - Knockout <Molekulargenetik>
KW  - MTUS1
KW  - Tumorsuppressor-Gen
KW  - MTUS1
KW  - tumor suppressor gene
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18951
ER  - 
TY  - THES
A1  - Czisch, Michael
T1  - Die Rolle von Bcl-2 bei der UV- und TRAIL-induzierten Keratinozytenapoptose
T1  - The role of Bcl-2 in UV- and TRAIL-induced keratinocyte apoptosis
N2  - In Keratinozyten wird sowohl durch UVB als auch durch PUVA-Bestrahlung Apoptose induziert. Wir untersuchten die in Keratinozyten durch UVB, PUVA, UVA und Todesliganden wie TRAIL ausgelösten Apoptosewege näher. UVB und PUVA, nicht aber UVA-Bestrahlung lösen in vitro Keratinozytenapoptose aus. 2-4 h nach UVB beobachteten wir die Aktivierung von Caspasen. Nach PUVA setzt die Aktivierung von Caspasen wesentlich später ein, nämlich erst 12 h nach Bestrahlung. Passend dazu, ist ein Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials 6-8 h nach UVB und 12-14 h nach PUVA detektierbar. Die Überexpression des Proteins Bcl-2 verhindert den Verlust des mitochondrialen Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach UVB, und vermittelt auch einen klonogen Schutz, unabhängig von der Bildung reaktiver Sauerstoffradikale. Im Gegensatz dazu verzögert es den Verlust des Transmembranpotentials und die Caspase-Aktivierung nach PUVA nur und verhindert sie nicht. PUVA-bestrahlte Zellen können sich nicht weiter teilen, sind also durch Bcl-2 nicht klonogen geschützt.
N2  - An important response of keratinocytes to UVB or PUVA irradiation is the induction of apoptosis. In order to understand the apoptotic responses of keratinocytes, we compared UVB, PUVA, UVA irradiated and TRAIL-treated keratinocytes for the activation of major apoptosis signalling pathways. UVB and PUVA, but not UVA irradiation induced keratinocyte apoptosis in vitro. Activation of caspases was detectable within 2 – 4 h after UVB irradiation. Interestingly, caspase activation following PUVA was delayed, beginning by 12 hours post irradiation. In line, mitochondrial transmembrane potential (MTP) decreased 6 – 8 hours after UVB, whereas PUVA mediated MTP loss started only 12 - 14h post irradiation. Interestingly, Bcl-2 overexpression protected against UVB induced early MTP loss and caspase activation. Moreover, Bcl-2 also protected clonogenic survival following UVB irradiation independent of the UV-induced generation of reactive oxygen species. In marked contrast, although Bcl-2 delayed PUVA induced MTP loss and caspase activation, Bcl-2 overexpressing keratinocytes failed to protect clonogenic survival following PUVA. Interestingly, similar levels of ROS were produced by UVA and PUVA irrespective of the expression of Bcl-2, suggesting that ROS generation does not have a major role in PUVA induced activation of apoptosis signalling. We conclude that distinct pathways independent of caspases are employed to exert the cell death program in PUVA and UVB induced apoptosis. While PUVA-induced cell death overcomes Bcl-2 protected mitochondrial pathways of apoptosis, UVB induced cell death is dose-dependently protected by Bcl-2. Our data suggest that PUVA-induced DNA damage rather than ROS generation plays the key role for PUVA induced apoptosis.
KW  - Bcl-2
KW  - Apoptose
KW  - UV
KW  - UVB
KW  - UVA
KW  - PUVA
KW  - Keratinozyten
KW  - HaCaT
KW  - TRAIL
KW  - Zytochrom c
KW  - Caspasen
KW  - ROS
KW  - Mitochondrium
KW  - Bcl-2
KW  - apoptosis
KW  - UV
KW  - UVB
KW  - UVA
KW  - PUVA
KW  - keratinocytes
KW  - HaCaT
KW  - TRAIL
KW  - cytochrome c
KW  - caspases
KW  - reactive oxygen species
KW  - mitochondria
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-10903
ER  - 
TY  - THES
A1  - Leucht, Annalena
T1  - Einfluss der mitochondrialen Ca\(^{2+}\)-Aufnahme auf die nukleäre Ca\(^{2+}\)-Konzentration in ventrikulären Kardiomyozyten der Maus
T1  - The effect of mitochondrial Ca\(^{2+}\) uptake on the nuclear Ca\(^{2+}\) concentration in murine ventricular cardiomyocytes
N2  - Nach Stimulierung mit einem IP3-Rezeptor Agonisten wird die mitochondriale Ca2+-Aufnahme stimuliert. Wenn diese mitochondriale Ca2+-Aufnahme durch Dantrolen oder Ru360 blockiert wird, dann steigt nachfolgend das zytosolische [Ca2+] an. Nach Blockierung des mRyR durch Dantrolen steigt zusätzlich durch die Beeinflussung der passiven Komponente des nukleären Ca2+-Transienten das nukleäre [Ca2+] an. Dieses erhöhte nukleäre [Ca2+] hat letztlich eine Hypertrophie zur Folge. Somit können Mitochondrien, die in ihrer Funktion gestört sind, zur Entwicklung der Hypertrophie beitragen.
N2  - After treatment with an IP3-receptor agonist mitochondria takes up calcium. If this uptake is blocked by dantrolene or Ru 360 the cytosolic calcium increases. When the mRyR is blocked by dantrolene the nuclear calcium is additionally increased.
KW  - Mitochondrium
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Calcium-Aufnahme
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-220289
ER  - 
TY  - THES
A1  - Schäfer, Ingo
T1  - Fremdgenexpression in humanen Mitochondrien
T1  - Artificial gene expression in human mitochondria
N2  - Bei einer Vielzahl neuromuskulärer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, können Mutationen in beiden Genomen die Auslöser dieser Erkrankungen darstellen. Veränderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Auslöser behandelt werden können. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste grün fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsfähigkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielführend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung für die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden können. Durch eine Ansäuerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigsäure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Größe des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen für die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig grün fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt für die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor müssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine höhere Transfektionseffizienz zu erreichen.
N2  - Mitochondrial dysfunctions play an important role in a variety of neuromuscular and neurodegenerative diseases. As the proteins of the respiratory chain complexes are encoded by the mitochondrial DNA as well as the nuclear genome, mutations in both could trigger solely the diseases. Up to now, changes of the mitochondrial DNA could not be corrected, hence, therapies were designed to decrease symptoms in patients. In this context, the limiting factor to cure these disease relies on the DNA transport into the mitochondria. The aim of this work was to insert exogenous DNA into the mitochondria of human cultured cells by physical transfection methods. A variety of different vectors was constructed to express the mitochondrially adapted green fluorescent mtEGFP within mitochondria. The ability of these constructs to be expressed and processed was proved by in vitro assays using a mitochrondrial extract. In the transfection experiments using the gene gun, we succeeded for the first time to introduce exogenous plasmid DNA into human mitochondria. The mtEGFP expressed by the transfected vectors could definitely be localized to the mitochondria of the cells. Transfections using magnetic particles as mediator could not be used, because the particles exhibit an autofluorescence which prevents a detection of the mtEGFP expression. An essential prerequisite for the transfection of mitochondria by mechanical methods like microinjection is the reversible induction of megamitochondria, since they could not be penetrated as small regular organelles. Acidification of the culture medium with sodium acetate or acetic acid led to mitochondria exhibiting almost the size of the nucleus, thus giving ideal conditions for microinjection. In the applied microinjection experiments using the mitochondrial expression vectors, cells displayed mitochondria with distinct green fluorescence. In summary, human mitochondria were transfected successfully for the first time with mitochondrial expression vectors. This is a fundamental step in the development of new therapies targeting mitochondrial myopathies. However, the transfection methods have to be optimized to achieve higher transfection efficiencies.
KW  - Mitochondrium
KW  - Heterologe Genexpression
KW  - Mitochondrien
KW  - mitochondria
KW  - gene expression
KW  - Transfektion
KW  - Mensch
KW  - Genexpression
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85202
ER  - 
TY  - THES
A1  - Werner, Jana Sophia
T1  - Frequenzabhängigkeit der IP3-induzierten Calciumregulation in murinen ventrikulären Kardiomyozyten
T1  - Frequency dependence of IP3-induced calcium regulation in murine ventricular cardiomyocytes
N2  - In Kardiomyozyten ist Calcium (Ca2+) ein wichtiges Signalmolekül und eine präzise Regulation der Ca2+ Konzentration in den Zellkompartimenten erforderlich. Ca2+ wird Angiotensin II-induziert und vom Botenstoff IP3 vermittelt aus IP3 Rezeptoren des Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) freigesetzt, was zur mitochondrialen Ca2+ Aufnahme führt. Diese Kommunikationswege zwischen SR und Mitochondrium sind u.a. bei der Herzinsuffizienz durch pathologische Umbauprozesse gestört. Zudem zirkulieren bei Herzinsuffizienz vermehrt Hormone wie AngII, welches u.a. die intrazelluläre IP3 Konzentration steigert und als Hypertrophie Signal wirkt. Dieser Arbeit geht die Vermutung voraus, dass eine gestörte mitochondriale Ca2+ Aufnahme durch Veränderung des nukleären Ca2+ Transienten die hypertrophe Genexpression beeinflussen kann. Es wurde an ventrikulären Kardiomyozyten von adulten Mäusen mit kardiospezifischem MCU Knock out oder MCU Wildtyp untersucht, wie sich Ca2+ Transienten in Zytosol und Nukleus bei AngII-Stimulation und Störung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme durch Blockade des mRyR1 oder des MCU verändern. Zum Vergleich wurde der Effekt des β adrenerg vermittelten, IP3 unabhängigen Ca2+ Anstiegs beobachtet. Zur Untersuchung der Frequenzabhängigkeit der Effekte wurde die elektrische Stimulation wurde variiert. Die Arbeit zeigt, dass sich die Blockade der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme unterschiedlich auf den nukleären Ca2+ Transienten auswirkt: Bei AngII-Stimulation kam es in Folge der Blockade des mRyR1, nicht aber des MCU, zur Steigerung des nukleären Ca2+ Transienten. Dieser Effekt war bei 1 Hz Stimulationsfrequenz, nicht aber nach einer Steigerung auf 4 Hz zu beobachten. Bei β adrenerger Stimulation hingegen veränderte die Blockade des MCU oder des mRyR1 die Ca2+ Transienten im Kern nicht signifikant. Die Arbeit verdeutlicht die Bedeutung der IP3 vermittelten Ca2+ Freisetzung für die Kontrolle der Ca2+ Konzentrationen in unterschiedlichen zellulären Kompartimenten.
N2  - Calcium (Ca2+) serves as a critical signaling molecule within cardiomyocytes, necessitating precise regulation of Ca2+ concentrations across cellular compartments. Angiotensin II (AngII) triggers Ca2+ release through inositol trisphosphate (IP3) receptors located on the sarcoplasmic reticulum (SR), a process mediated by the secondary messenger IP3, resulting in mitochondrial Ca2+ uptake. Perturbations in these communication pathways have been implicated in heart failure due to pathological remodeling processes. Additionally, in heart failure elevated levels of hormones like AngII have been observed, which increases intracellular IP3 concentration, thereby acting as a signal for hypertrophy. This work is based on the assumption that impaired mitochondrial Ca2+ uptake can influence hypertrophic gene expression by altering the nuclear Ca2+ transient. The investigation was conducted using ventricular cardiomyocytes obtained from adult mice with cardiac-specific MCU (mitochondrial calcium uniporter) knockout and MCU wildtype, analyzing alterations in cytosolic and nuclear Ca2+ transients upon AngII stimulation and impairment of mitochondrial Ca2+ uptake by blocking mRyR1 (ryanodine receptor) or MCU. Additionally, the impact of β-adrenergic mediated IP3-independent Ca2+ elevation was assessed, with varying electrical stimulation frequencies to explore frequency-dependent effects. The findings reveal distinct effects of mitochondrial Ca2+ uptake blockade on nuclear Ca2+ transients. While mRyR1 blockade, but not MCU blockade, augmented nuclear Ca2+ transients during AngII stimulation, this effect was evident at 1 Hz stimulation frequency and not after increase to 4 Hz. Conversely, β-adrenergic stimulation yielded no significant changes in nuclear Ca2+ transients upon MCU or mRyR1 blockade. This work underscores the significance of IP3-mediated Ca2+ release in controlling Ca2+ concentrations across diverse cellular compartments.
KW  - Calciumtransport
KW  - Herzinsuffizienz
KW  - Angiotensin II
KW  - Mitochondrium
KW  - Inositoltrisphosphat
KW  - mitochondrialer Ryanodin-Rezeptor (mRyR1)
KW  - calcium signaling
KW  - Excitation-Transcription-Coupling
KW  - IP3 signaling
KW  - Mitochondrialer Uniporter (MCU)
KW  - Mitochondrialer Uniporter Knock out (MCU-KO)
Y1  - 2023
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-323158
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kukat, Christian
T1  - Fusion, Fission und Nucleoids in Megamitochondrien
T1  - Fusion, fission and nucleoids in megamitochondria
N2  - In rho0-Zellen, die über keine mitochondriale DNA (mtDNA) mehr verfügen, entstehen während der Kultivierung Megamitochondrien durch endogene Milchsäure-Azidifizierung des Kulturmediums. Diese Riesenorganellen bilden sich dabei durch mitochondriale Fusionsereignisse und/oder eine Hemmung der Fission. In Zellen mit mitochondrialem Genom ist es ebenso möglich Megamitochondrien durch artifizielles Ansäuern des Kulturmediums zu induzieren. Diese Erkenntnisse wurden im Rahmen dieser Arbeit als Werkzeug verwendet, um Einblicke in mitochondriale Fusions- und Fissionsereignisse zu erlangen. Zunächst wurde die Fusion mitochondrialer Matrixkompartimente mithilfe der photoaktivierbaren Variante des grünen fluoreszierenden Proteins (PA-GFP) untersucht. Hiermit konnte gezeigt werden, dass das Vermischen der Matrixkompartimente nach der Fusion ein sehr schneller Prozess ist. Die Analyse der Bildung und Rückbildung der Megamitochondrien erfolgte sowohl konfokal- als auch elektronenmikroskopisch, wobei sich zeigte, dass die Matrix der Riesenorganellen kaum mehr Cristae beinhaltet. Die Rückbildung der Megamitochondrien zum normalen Netzwerk ist ein sehr schneller Prozess, bei dem schon nach 15 min keine vergrößerten Organellen mehr sichtbar sind. Dies indiziert, dass der Rückbildungsprozess wahrscheinlich durch Veränderungen von verfügbaren Proteinen durchgeführt wird, ohne die Induzierung von Proteinneusynthese. Untersuchungen auf ultrastruktureller Ebene zeigten, dass es während der Rückbildung zur Formation von drei unterschiedlichen Mitochondrientypen kam, die sich in ihrer Morphologie stark unterschieden. Weiterhin wurden vergleichende Studien zur Bildung der Megamitochondrien durchgeführt, bei denen der Einfluss von Atmungsketten-Inhibitoren auf die Bildung von Milchsäure-induzierten Riesenorganellen untersucht wurde. Die Resultate deuten für die Megamitochondrieninduktion auf eine Abhängigkeit auf ein intaktes Membranpotential hin. Immunzytochemisch wurde die endogene Lokalisation der mitochondrialen Fusions- und Fissionsproteine Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L am Modellsystem der Megamitochondrieninduktion aufgeklärt. Es zeigte sich, dass diese Proteine punktförmig an der äußeren Membran der Riesenorganellen lokalisieren Um das Modellsystem an lebenden Zellen zu nutzen, wurden Vektoren konstruiert, die fluoreszenzmarkierte Proteine der mitochondrialen Fusions- und Fissionsmaschinerie exprimierten. Hiermit konnte einerseits die Lokalisation von Mitofusin 1, Mitofusin 2, hFis1 und Drp1/DNM1L in lebenden Zellen nach Induktion der Megamitochondrien analysiert werden und andererseits der Einfluss der Überexpression dieser Proteine auf die Bildung der Riesenorganellen dokumentiert werden. Die Ergebnisse machten deutlich, dass nur die Überepxression von hFis1 die Bildung der Megamitochondrien verhinderte. Ein weiterer Schwerpunkt der vorliegenden Arbeit lag in der Visualisierung und Dynamik mitochondrialer Nucleoids in lebenden Zellen. Nucleoids sind Protein-DNA-Komplexe, in denen mitochondriale Genome organisiert sind. Mit dem Farbstoff PicoGreen gelang es mtDNA in lebenden Zellen zu färben und Dynamikstudien der punktförmigen Strukturen mikroskopisch festzuhalten. Während sich mtDNA im mitochondrialen Netzwerk nur marginal aufgrund stattfindender Fusions- und Fissionsereignisse bewegte kam es in den Milchsäure-induzierten Megamitochondrien zu einer extensiven und extrem schnellen Bewegung von mitochondrialer DNA. In anschließenden Versuchen wurde der mitochondriale Transkriptions- und Verpackungsfaktor TFAM als fluoreszentes Fusionsprotein in Zellen transfiziert und Kolokalisationsstudien zeigten, dass das Fusionsprotein mit mtDNA kolokalisiert. In den Riesenorganellen präsentierten punktförmige TFAM-gefärbte Nucleoids ein sehr dynamisches Verhalten mit schneller Bewegung. In rho0-Zellen ohne mitochondriale DNA war die TFAM-Fluoreszenz hingegen gleichmäßig verteilt. Ein weiterer Nucleiodbestandteil ist das mitochondriale DNA-Einzelstrangbindeprotein SSBP1, welches in Megamitochondrien ebenso ein sehr dynamisches Verhalten aufwies. Eine mitochondrial-zielgesteuerte und EGFP-markierte Restriktionsendonuklease wies ebenfalls das typische, punktförmige Nucleoidmuster im mitochondrialen Netzwerk auf, was auf eine Interaktion mit der mtDNA schließen lässt. In rho0-Zellen ohne mtDNA kam es jedoch zur gleichmäßigen Verteilung des Konstruktes in den Mitochondrien. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit sowohl Einblicke in die Biologie der Megamitochondrien gewonnen, als auch Erkenntnisse über die Dynamik mitochondrialer Protein-DNA-Komplexe, wobei der Schwerpunkt hierbei auf einer Analyse mit Hilfe optischer Methoden lag.
N2  - During the cultivation of rho0 cells, which are devoid of mitochondrial DNA (mtDNA), excessive endogenous lactic acid production during the fermentation process drives the development of megamitochondria. These giant organelles are formed by mitochondrial fusion events and/or the repression of fission. Megamitochondria formation is inducible in cells containing mtDNA by an artificial acidification of the culture medium by lactic acid. This work exploits these findings in order to investigate mitochondrial fusion and fission events. Fusion of mitochondrial matrix compartments was examined with the aid of the photoactivatable variant of the green fluorescent protein (PA-GFP), showing that the mixing of matrix components after fusion is an extremely fast process. Formation and reversion of megamitochondria was analyzed by confocal and electron microscopy, revealing that the matrix of giant organelles contains only rudiment structures of cristae organization. Reversion of the megamitochondria to a normal network displays fast kinetic characteristics. This indicates that the restoration process most likely is performed by alterations of novel protein expression. Additional assessment on an ultrastructural level displayed the occurrence of three different types of mitochondria during the reversion, which strongly differed in their morphology. To gain insights into the mechanism of megamitochondria formation and reversion comparative studies were performed with various inhibitors of the respiratory chain. The results indicated a dependence on an intact membrane potential for the induction of megamitochondria. Localization of the endogenous mitochondrial fusion and fission proteins mitofusin 1, hFis1 and Drp1/DNM1L were analyzed in megamitochondria by immunocytochemistry, demonstrating that these proteins localize foci-like to the outer membrane of the giant organelles. Fluorescently tagged proteins of the mitochondrial fusion and fission apparatus (mitofusin 1, mitofusin 2, hFis1 and Drp1/DNM1L) were used in localization and overexpression experiments in living cells by transient transfection. The results revealed that only the overexpression of hFis1 inhibited the formation of megamitochondria. Another main focus of this thesis was the visualization and dynamics of mitochondrial nucleoids in living cells. Nucleoids are protein-DNA complexes representing organizational units for the mitochondrial genomes The dye PicoGreen was used to stain mtDNA in living cells and the dynamics of nucleoid movement was analyzed by fluorescent and confocal microscopy. While mitochondrial DNA showed only marginal movements due to ongoing fusion and fission events in a mitochondrial network, an extensive and extremely fast movement in the lactic acid-induced megamitochondria could be observed. In subsequent experiments the mitochondrial transcription and packaging factor TFAM was fluorescently tagged and transfected into cells. Colocalization studies showed that this fusion protein colocalizes with mitochondrial DNA. In the giant organelles foci-like TFAM-stained nucleoids displayed a very dynamic performance with fast movement. However, in rho0 cells without mitochondrial DNA the TFAM-fluorescence was uniformly distributed. An additional nucleoid constituent and marker for mitochondrial DNA is the mitochondrial single-stranded DNA-binding protein SSBP1, and it could be shown that SSBP1 also exhibits very dynamic characteristics in megamitochondria. A mitochondrial-targeted and EGFP-tagged restriction endonuclease also exhibited the typical, punctual nucleoid pattern in the mitochondrial network, suggesting an mtDNA interaction. In rho0 cells, however, the construct was uniformly distributed in the mitochondrial matrix. In summary, in the present thesis optical and mechanistic insights into the biology of megamitochondria were obtained. This approach was further exploited to study the dynamics of mitochondrial protein-DNA complexes with optical methods.
KW  - Mitochondrium
KW  - Cytologie
KW  - Mitochondrien
KW  - mitochondria
Y1  - 2008
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30467
ER  - 
TY  - THES
A1  - Kukat, Alexandra
T1  - Mitochondriale Fusions- und Fissionsvorgänge am Modellsystem von Mega-Mitochondrien einer rho0-Zelllinie
T1  - Mitochondrial fusion and fission on the model system of megamitochondria of a rho0 cell line
N2  - Viele Funktionen der Mitochondrien basieren auf Prozessen, an denen sowohl mitochondriale wie auch kernkodierte Genprodukte beteiligt sind. Durch zahlreiche Interaktionen ist der Einfluss dieser Einzelkomponenten auf das zelluläre System oftmals nur schwierig erkennbar. Mit Hilfe von rho0 -Zellen, deren Mitochondrien über kein eigenes Genom mehr verfügen, kann die mitochondriale Genkomponente ausgeschlossen werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zunächst die metabolischen, proliferativen und morphologischen Eigenschaften einer rho0-Zelllinie 143B.TK-K7 untersucht, welche durch die Expression einer mitochondrial zielgesteuerten Restriktionsendonuklease hergestellt wurde. Während der Kultivierung bilden sich im Zytoplasma der 143B.TK-K7-Zellen mit fortlaufender Kultivierungszeit und zunehmenden Azidifizierung des Mediums Mega-Mitochondrien. Diese entstehen sowohl durch zahlreiche Fusionsereignisse als auch einem Schwellen durch vermehrten Wassereinfluss in die Mitochondrienmatrix. Alle Mitochondrien liegen dann als große kugelförmige Strukturen in der Zelle vor und nehmen somit die geringste Oberfläche zu einem vorhandenen Volumen ein. Die Entstehung der Mega-Mitochondrien ist dabei abhängig von einer hohen Protonenkonzentration zusätzlich zu einer ausreichend großen Menge an Laktat im Medium (Milchsäure). Zudem zeigt sich, dass auch in Zellen, welche noch ein mitochondriales Genom besitzen, durch diese Bedingungen die Bildung von Mega-Mitochondrien induziert werden kann. Bei der Entstehung der Mega-Mitochondrien handelt es sich zunächst nicht um apoptotische Vorgänge, da durch den Austausch des aziden Mediums eine äußerst schnelle Rückbildung in ein, den rho0-Zellen ähnliches Mitochondriennetzwerk erfolgt. Metabolische Untersuchungen zeigen, dass für die Rückbildung der Mega-Mitochondrien zu einem Netzwerk ausschließlich die im Medium vorhandene Protonenkonzentration ausreichend gering sein muss. Durch immunzytochemische Untersuchungen wurde deutlich, dass sowohl das mitochondriale Fusionsprotein MFN2 wie auch das Fissionsprotein DNM1L während der Entstehung und auch Rückbildung der Mega-Mitochondrien in punktförmigen Bereichen an der äußeren Mitochondrienmembran lokalisieren. Um zu überprüfen, ob die Bildung der Mega-Mitochondrien durch einer Überexpression von Proteinen der Fissionsmaschinerie verhindert wird, wurden PAGFP- bzw. EGFP-Fusionsproteine mit hFis1 und DNM1L hergestellt und in die 143B.TK-K7-Zellen transfiziert. Dabei führt eine verstärkte Expression von hFis1 zu aggregierten Mitochondrien, welche zwar anschwellen, nach einem Mediumwechsel jedoch trotzdem bestehen bleiben. Eine Überexpression von DNM1L hat keinen Einfluss auf die Entstehung und Rückbildung der Mega-Mitochondrien. Durch Inhibierung des Tubulin- bzw. Aktin-Zytoskeletts, konnte gezeigt werden, dass eine Zerstörung des Tubulin-Zytoskeletts auf die Entstehung und Rückbildung der Mega-Mitochondrien keine Auswirkungen hat. Die Untersuchungen zu dem Einfluss des Aktin-Zytoskeletts zeigen, dass die Mega-Mitochondrien ringförmig von dem Aktin-Zytoskelett umgeben sind. Mit Hilfe von Fluoreszenzprotein-Markern für die äußere und innere Mitochondrienmembran wurden die Mega-Mitochondrien als Modellsystem für mitochondriale Fusions- und Fissionsstudien verwendet. Somit konnte in der vorliegenden Arbeit mitochondriale Fusion und Fission zum ersten Mal an lebenden Zellen direkt beobachtet werden und führte nachfolgend zu der Einteilung von Fusionsvorgängen der Mitochondrien in einen Modus 1, bei dem eine zeitlich gekoppelte vollständige Fusion von sowohl äußerer wie auch innerer Membran geschieht und einen Modus 2, bei dem die Fusion der äußeren Membranen ohne die Fusion der inneren Membranen erfolgt. In ähnlicher Weise kann die Fission von Mitochondrien unterteilt werden. In einem als Modus 1 bezeichneten Mechanismus beginnt die Rückbildung der Mega-Mitochondrien zunächst mit einer Tubulierung der Mitochondrien hin zu langen Mitochondrienschläuchen, die einen nur geringen Durchmesser besitzen. Erst dann treten vermehrt zeitlich sehr schnell ablaufende Fissionsvorgänge auf. Zusätzlich wurde ein Modus 2-Mechanismus der Fission beobachtet, welcher aus einer unvollständigen Fusion resultiert, bei dem die inneren Membranen noch nicht miteinander verschmolzen sind. Auf elektronenmikroskopischer Ebene finden während der Mega-Mitochondrien-Bildung drastische Veränderung von zwiebelringartigen Cristae hin zu einer Abnahme von inneren Membranstrukturen und der elektronendichte im Matrixraum statt. Somit ist im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine optische Beobachtung sowohl dieser Bewegungen wie auch von Fusions- und Fissionsprozessen und deren zeitlich Auflösung in vivo mit Hilfe der Mega-Mitochondrien gelungen.
N2  - A variety of mitochondrial features are based on processes involving mitochondrially encoded as well as nuclear encoded gene products. By means of these manifold interactions it is difficult to discern the influences of the single components. One effort to overcome these difficulties was the development of cells devoid of endogenous mtDNA (so called rho0 cells) and therefore to exclude the mitochondrial genetic component. The aim of this thesis was the investigation of the metabolic, proliferative and morphologic characteristics of a rho0 cell line (143B.TK-K7) based on a 143B.TK- background. This cell line was developed by the expression of a mitochondrially targeted restriction endonuclease. During the cultivation and proceeding acidification of the culture medium by lactic acid megamitochondria developed in the cytoplasm of the 143B.TK-K7 cells. These megamitochondria form both by multiple fusion events and an additional increase in water influx into the matrix. All mitochondria then exist as large spherical structures with diameters of up to 7 µm and therefore receive the smallest surface area to a given volume. The formation of megamitochondria is dependent on a high proton production level additional to a sufficient amount of lactate (lactic acid) in the medium. Furthermore it is possibly to induce megamitochondria in cells still possessing a mitochondrial genome by these conditions. The formation of megamitochondria is not a sign of apoptotic processes per se, because the back-formation of the megamitochondria into a rho0-like network can be induced very fast by the exchange of the acidulated medium. Initial deformations of the megamitochondria are followed by tubulation in progressive mitochondria tubules and numerous fission events. Metabolic analyses show that this backformation only depends on a sufficient low concentration of protons in the medium. When the given threshold is not being traversed the megamitochondria persist. Immunocytological investigations both of the fusion protein MFN2 and the protein of the fission machinery DNM1L demonstrate a constant mitochondrial distribution in focal regions of the outer mitochondrial membrane during formation as well as back-formation of megamitochondria. By overexpressing the fission proteins hFis1 and DNM1L respectively in 143B.TK-K7 cells, it should be tested whether or not megamitochondria develop. The enhanced expression of hFis1 led to the formation of aggregated mitochondria that indeed swell but persist after changing the medium. The overexpression of DNM1L has no influence on the formation as well as the back-formation of the megamitochondria. Incubation of the cells with inhibitors for the tubulin respectively actin cytoskeleton evidenced that the destruction of the tubulin cytoskeleton has no consequence for the formation and back-formation of megamitochondria. Unclear results were obtained with inhibitors of the actin cytoskeleton probably due to secondary effects of the inhibitors to the cells. However the findings showed that the megamitochondria are embedded into the actin cytoskeleton. Additionally the megamitochondria were used as a model system for mitochondrial fusion and fission events. For this purpose fluorescent protein markers for the inner and outer mitochondrial membrane were created. With these tools it was possible to observe directly mitochondrial fusion and fission in living cells by confocal microscopy. Furthermore this led to the classification of fusion processes of the mitochondria in a mode 1 with temporally coupled fusion of outer and inner membrane and a mode 2 where the fusion of outer membrane occurs independent of the inner membrane fusion. In a similar way the fission of mitochondria can be sub-classified: mode 1 is featured during the back-formation of megamitochondria by increasing tubulation events in long mitochondrial tubules with thin diameters. Only at this point very fast fission events could be observed. Furthermore in a fission mode 2 that results from an incomplete fusion of inner mitochondrial membranes, the outer membrane invaginates from one side along the unfused inner membranes until two separate mitochondrial units exist. During the megamitochondria formation on electron microscopic level drastic changes occur from fuzzy onion like structures to a decrease of inner membranes and electron density in the matrix. Additionally inversions and inclusions consisting of one membrane and also double membranes are evident. Comparisons with confocal microscopy images show that these inclusions apparently accomplish undirected movements with high velocity. In the present thesis it was possible to observe for the first time these movements as well as mitochondrial fusion and fission in living cells with an outstanding optical and temporal resolution.
KW  - Mitochondrium
KW  - Spaltung
KW  - Verschmelzung
KW  - Mitochondrien
KW  - rho0
KW  - mitochondria
KW  - rho0
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-26484
ER  - 
TY  - THES
A1  - Löwer, Linda
T1  - Mitochondrien Targeting: Untersuchungen zum antiproliferativen Effekt des Antibiotikums Tigecyclin bei humanen kolorektalen Karzinomzelllinien
T1  - Targeting mitochondria: The antiproliferative effect of the antibiotic tigecycline against human colorectal cancer cell lines
N2  - In der vorliegenden Arbeit wurde der antiproliferative Effekt des Antibiotikums Tigecyclin an den fünf humanen kolorektalen Karzinomzelllinien HCT116, Colo678, Colo741, LS174T, RKO untersucht. Der antiproliferative Effekt von Tigecyclin wurde als halbmaximale inhibitorische Konzentration oder IC50 bestimmt. Dabei war der antiproliferative Effekt von Tigecyclin für die untersuchten kolorektalen Karzinomzellen bei einer Inkuba¬tionszeit von drei Tagen mit IC50-Werten von 5,6 bis 29,6 µmol/L stärker als der für Fibroblasten (nicht-transformierte Kontrollzellen) mit einem IC50-Wert von 64,5 µmol/L. Zum Nachweis eines antiproliferativen Effektes von Tigecyclin auch bei verlängerten Inkubationszeiten wurde das Medium nach drei Tagen gewechselt und die Zellen mit und ohne Tigecyclin bis Tag 7 weiterkultiviert. Ohne Tigecyclin nahm der antiproliferative Effekt leicht ab und damit der Anteil vitaler Zellen zu. Wurden kolorektale Karzinomzellen kontinuierlich mit Tigecyclin kultiviert, blieb der antiproliferative Effekt über den Zeitraum von sieben Tagen erhalten. Ein synergistischer Effekt zwischen Tigecyclin und 5-Fluoruracil bzw. Oxaliplatin war nicht nachzuweisen. Fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen mit dem Farb¬stoff JC-1 zeigen, dass Tigecyclin zu einem Zusammenbruch des elektro¬chemischen Potentialgradienten der mitochondrialen Atmungskette führte. Bei höheren Konzen¬trationen an Tigecyclin (75 µmol/L) nahm bei HCT116 die Anzahl an Zellen mit defekter Atmungskette in den Mitochondrien stärker zu als bei Fibroblas¬ten. Einen Zusammenhang zwischen Depolarisierung und molekularen Mecha¬nismen des Zelltods herzustellen, gelang bei zwei von fünf Tumorzelllinien (HCT116, RKO) durch Nachweis des Autophagiemarkers LC3-II.
N2  - In this thesis we analyzed the antiproliferative effect of the antibiotic tigecycline on five human colorectal cancer cell lines (HCT116, Colo678, Colo741, LS174T, RKO). Cell viability was assayed by crystal violet staining. The antiproliferative activity against colorectal cells (IC50 values from 5,6- 29µmol/L) has been stronger compared to fibroblasts (IC50: 64,5 µmol/L). Depending on the tigecycline-dose cytostatic and cytotoxic effects were present and persisted for an extended incubation period of 7 days. The antiproliferative effect vanished after removal of tigecycline from the investigated cell cultures thus indicating a reversible mode of action. No synergistic effect could be shown when tigecycline was combined with 5-fluoruarcil or oxaliplatin. Via fluorescence microscopic experiments with the dye JC-1 we were able to show that tigecycline induces a depolarization of the inner mitochondrial membrane potential. Further investigation by western blot showed that autophagy seems to play a role in cell death in some of the treated cancer cell lines. 
 
KW  - Tigecyclin
KW  - Colonkrebs
KW  - Dickdarmkrebs
KW  - Darmkrebs
KW  - Mitochondrium
KW  - Kolorektales Karzinom
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178979
ER  -