TY - THES A1 - Glück, Lucia T1 - Aktivierung des MEK5/ Erk5-Signalwegs durch inhibitorische Substanzen des Mevalonatstoffwechsels T1 - Activation of the MEK5/ Erk5 signalling pathway through inhibitory substances of the mevalonate metabolism N2 - Die Osteoporose ist eine Erkrankung, die durch verminderte Dichte und erhöhte Fragilität des Knochens gekennzeichnet ist. Sie zählt zu den häufigsten Erkrankungen weltweit und geht mit erheblicher Einschränkung der Lebensqualität und erhöhter Mortalität einher. Eine Behandlungsmöglichkeit dieses schwerwiegenden Krankheitsbilds ist die Therapie mit Bisphosphonaten. Diese hemmen mit ihren antiresorptiven Eigenschaften den Knochenabbau und fördern vermutlich gleichzeitig den Knochenaufbau. Obwohl schon lange die Wirkungsweise der Bisphosphonate erforscht wird, ist noch nicht sicher geklärt, wie beispielsweise osteoanabole oder antitumoröse Effekte vermittelt werden. Einen Erklärungsansatz bietet der MEK5/ Erk5-Signalweg. Diesem werden unter anderem antiangiogenetische, antiinflammatorische und antiproliferative Eigenschaften zugesprochen. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass Statine Erk5 und Erk5-abhängige Gene aktivieren können. Statine wiederum inhibieren ebenfalls den Mevalonatstoffwechsel, jedoch weiter upstream als Bisphosphonate. Da Statine zudem osteoanabole Effekte aufweisen, lag die These nahe, dass auch Bisphosphonate ihre Wirkung über den MEK5/Erk5-Signalweg vermitteln könnten. Die These konnte im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden: Stickstoffhaltige, nicht aber stickstofffreie Bisphosphonate aktivieren Erk5 sowohl in Endothelzellen als auch in Osteoblasten. Es gilt jedoch zu bedenken, dass eine Weiterentwicklung der Substanzen mit verbesserter Aufnahme in die Zelle zur Vermeidung von Apoptose-Induktion anzustreben ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ein Knock-down der FDPS, dem Angriffspunkt der Bisphosphonate im Mevalonatstoffwechsel, ebenfalls eine Erk5-Phosphorylierung zur Folge hat. Durch Inhibition der FDPS wird die Prenylierung kleiner G-Proteine wie Cdc42 unterbunden, was eine veränderte Funktion der Proteine zur Folge hat. Ein Knock-down von Cdc42 mittels siRNA führt wiederum zu einer Aktivierung von Erk5. Auf diese Weise wurde nicht nur ein neuer Wirkungsweg der Bisphosphonate identifiziert, sondern auch ein möglicher Aktivierungsmechanismus der MEK5/ Erk5-Signalkaskade aufgedeckt. Erk5 wandert nach seiner Aktivierung in den Zellkern und beeinflusst dort die Genexpression. Im Rahmen dieser Arbeit wurden knochenrelevante Gene identifiziert, die durch Zoledronat-Stimulation induziert werden konnten. Zu diesen zählen INPP4B, das die Osteoklastogenese inhibiert, und PTHLH sowie FOSL1, welche die Osteoblastogenese fördern. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Aktivierung des MEK5/ Erk5-Signalwegs durch Zoledronat eine Geninduktion zur Folge hat, die sowohl die osteoanabole Wirkung unterstützt, als auch die katabolen Effekte hemmt. Auf diese Weise konnte neben den bereits bekannten Wirkungswegen der Bisphosphonate ein neuer identifiziert werden, der auch einen möglichen Ansatz für weitere, bisher ungeklärte Effekte von Bisphosphonaten darstellt. N2 - Osteoporosis is a disease characterised by decreased bone density and increased fragility. It is one of the most frequent diseases worldwide and leads to a considerable reduction in quality of life and increased mortality. One option to treat this severe illness is a therapy based on bisphosphonates. These drugs inhibit bone resorption while possibly stimulating bone formation. Although a lot of research has been done to elucidate the cellular mechanisms of bisphosphonates, it remains unclear how they might mediate for instance osteoanabolic or antitumor effects. One possible explanation offers the MEK5/ Erk5 signal cascade which has been implicated in the regulation of anti-angiogenetic, anti-inflammatory and anti-proliferative effects. Previous studies have shown that statins can activate Erk5 as well as Erk5-dependent genes. Moreover, statins inhibit, like bisphosphonates, the mevalonate pathway further upstream. In addition, statins show osteoanabolic effects which led to the assumption that bisphosphonates might mediate some of their effects by the MEK5/ Erk5 signal cascade as well. Within this thesis, we confirmed this assumption by revealing that nitrogen-containing, but not non-nitrogen-containing bisphosphonates activate Erk5 in endothelial cells as well as osteoblasts. But we have to be aware of the need to optimize the substances to gain a better uptake into the cells and to avoid apoptosis. Furthermore, it has been shown that a knock-down of the FDPS, which is the molecular target of bisphosphonates in the mevalonate pathway, induced a phosphorylation of Erk5 as well. Inhibition of FDPS suppresses the prenylation of small G-proteins such as Cdc42 which leads to a modified function of the proteins. A knock-down of Cdc42 by siRNA in turn leads to activation of Erk5. Thus, it has not only been identified a new molecular target of bisphosphonates, but also a possible activation mechanism of the MEK5/ Erk5 signal cascade. After its activation, Erk5 migrates to the nucleus to influence gene expression. Within this thesis we identified zoledronic acid to induce bone relevant genes such as INPP4B which inhibits osteoclastogenesis and PTHLH or FOSL1 which support osteoblastogenesis. Thus, the activation of the MEK5/ Erk5 signal cascade by zoledronic acid induces gene induction which might support anabolic and inhibit catabolic effects in bone. Like this, a new molecular mechanism of action has been identified which might represent a new approach to understand effects of bisphosphonates that have not been explained thus far. KW - Bisphosphonate KW - Mek5/Erk5-Signalweg Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-162084 ER - TY - THES A1 - Dax, Svenja T1 - Histomorphologische Charakteristika klinisch gesicherter Bisphosphonat-assoziierter Kiefernekrosen T1 - Histomorphological characteristics of clinically ensuered bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaw N2 - Bisphosphonate finden seit mehr als 25 Jahren klinischen Einsatz. Ihre Verabreichung ist mittlerweile fester Bestandteil der medikamentösen Therapie von Osteoporose, Morbus Paget, Plasmozytomen und tumorbedingten Osteolysen. Auf eine dabei für den Patienten sehr schwerwiegende und aufgrund der Therapieresistenz oftmals schwierig zu behandelnde Nebenwirkung wurde im Jahr 2003 erstmals aufmerksam gemacht. Als sicher gilt heute, dass es unter Bisphosphonat-Therapie zu Osteonekrosen im Kieferbereich kommen kann. In der vorliegenden Studie wurden 24 Fälle (14 Frauen, 10 Männer; Durchschnittsalter 66 Jahre) Bisphosphonat-assoziierter Kiefernekrosen untersucht. Die Patienten erhielten alle Aminobisphosphonate - in mehr als der Hälfte der Fälle handelte es sich dabei um das hochwirksame Zometa® (Zolendronat; Novartis). In 91,6% der Fälle waren ossär metastasierende Malignome (Mamma- und Prostata-CAs) sowie Plasmozytome/multiple Myelome Grund der Applikation. Klinisch waren freiliegender Knochen, ulzerierende Schleimhautveränderungen, Wundheilungsstörungen nach zahnärztlichen Eingriffen, Abszessbildung, Fistelung, Parästhesien, rezidivierende bzw. zunehmende Schmerzen und gelockerte Zähne zu beobachten. Die dabei auftretenden Symptome besitzen jedoch keine ausreichende Spezifität, so dass es dem Kliniker nur über die genaue Kenntnis der Anamnese möglich ist eine Bisphosphonat-assoziierte Kiefernekrose zu diagnostizieren. Die licht- und elektronenmikroskopischen Untersuchungen ergaben variable Ausprägungsmuster der Nekrose. In der Mehrheit der Fälle lag dabei eine eitrige Nekrose, in 20,8% der Fälle hingegen eine aseptische Nekrose vor. In 79,2% der Fälle trat ein Actinomyces-Befall unterschiedlicher Befallsstärke auf. In 33,3% konnten Epithelproliferate und in seltenen Fällen Anzeichen eines reaktiven Knochenumbaus (16,7%) beobachtet werden. Insgesamt besitzen die histopathologischen Veränderungen wenig Spezifität, so dass der Pathologe ohne Kenntnis des klinischen Gesamtaspektes nicht eindeutig eine Bisphosphonat-assoziierte Kiefernekrose diagnostizieren kann und zur Diagnose klinisch-anamnestische Daten und histologische Befund zusammengeführt werden müssen. Ein hinsichtlich formalpathogenetischer Überlegungen wichtiges histomorphologisches Ergebnis stellte die signifikante Zunahme der Trabekeldicken (p < 0.04) Bisphosphonat behandelten Knochens im Vergleich zu gesundem dar. Die Sklerosierung führt konsekutiv zu einer Verschlechterung der Durchblutungs- und Ernährungssituation und damit auch der Abwehrlage des Kieferknochens und stellt den entscheidenden Ausgangspunkt für die Entstehung von Osteonekrosen dar. Konsens besteht aufgrund der bisherigen Forschungsergebnisse darüber, dass zur Entwicklung der unter Bisphosphonat-Therapie beobachteten Kiefernekrosen jedoch eine Reihe zusätzlicher Risikofaktoren im Sinne eines multifaktoriellen Geschehens bedeutsam sind. In Übereinstimmungen zu anderen Forschungsarbeiten konnte in der eigenen Arbeit der zahnärztliche Eingriff als ein wichtiger Risikofaktor identifiziert werden. N2 - Since 30 years bisphosphonates are applyed for therapeutical purposes. Today they have a wide field of application in osteology, onkology and haematology. Bisphosphonates are considered to be well-tolerated medicaments. 2003 however it was advices of a serious side-effect: bisphosphonates are able to trigger osteonecrosis of the jaw. In the present study clinical symptoms and histomorphological characteristicsare examined^in 24 cases clically ensured bisphosphonate-associated osteonecrosis of the jaws. In addition patogenetic factors are discussed. KW - Histopathologie KW - Nekrose KW - Diphosphonate KW - Bisphosphonate KW - Kiefernekrosen KW - Histologie KW - bisphosphonate KW - osteonecrosis of jaw Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-43842 ER - TY - THES A1 - Eckstein, Susanne T1 - Stimulation humaner V-Gamma-9-V-Delta-2-T-Lymphozyten : Untersuchungen zur Wirkung Stickstoff-haltiger Bisphosphonate und zu bakteriellen Phosphoantigenen T1 - Stimulation of human Vgamma9 Vdelta2 T Lymphocytes: Effects of Nitrogen Containing Bisphosphonates and Phosphoantigens N2 - In der vorliegenden Arbeit werden Studien zu verschiedenen Aspekten der Stimulation von humanen Vg9Vd2-T-Lymphozyten vorgestellt. Ein Schwerpunkt war die Charakterisierung der Erkennung von Bisphosphonaten durch Vg9Vd2-T-Zellen. Weder die Alkylmonophosphonate Ethyl- und Propylphosphonat noch 3-Aminopropylphosphonat bewirkten eine Stimulation von Vg9Vd2 T-Lymphozyten. Anscheinend ist also für die gd-T-Zell-stimulierende Aktivität von Aminobisphosphonaten das Vorhandensein sowohl der Methylenbisphosphonat-Gruppe als auch des Amino-Stickstoffs entscheidend. Es wurden verschiedene Pamidronat-Derivate untersucht, die sich durch Substituenten am Stickstoffatom unterscheiden. Die meisten dieser Verbindungen konnten Vg9Vd2-T-Zellen aktivieren, die Art der Substituenten hatte aber großen Einfluss darauf, welche Konzentration des jeweiligen Bisphosphonats für eine gd-T-Zell-Antwort nötig war. Besonders negativ auf die gd-T-Zell-stimulierende Aktivität wirkte sich aus, wenn das Stickstoffatom Teil einer Säureamidbindung war. Das lässt darauf schließen, dass die Gegenwart einer positiven Ladung (durch Protonierung des Stickstoffatoms) von Bedeutung für die Bioaktivität dieser Verbindungen ist. Beim Vergleich verschiedener Bisphosphonate mit stickstoffenthaltenden Heteroaromaten (Fünfringe mit ein bis drei Stickstoffatomen) zeigte sich, dass sowohl die Position des basischen Stickstoffatoms im Ring als auch Art und Position von Ringsubstituenten Einfluss auf deren gd-T-Zell-stimulierende Aktivität haben. Es ergaben sich Hinweise, dass sich eine gesteigerte Neigung eine positive Ladung in der Seitenkette zu tragen bei diesen Verbindungen genau wie bei Aminobisphosphonaten günstig auf das gd-T-Zell-aktivierende Potential auswirkt. Durch Behandlung mit Zoledronat wurde die monozytäre Zelllinie THP-1 stimulierend für Vg9Vd2-T-Zellen. Auch weitere Zelllinien und Lymphozyten des peripheren Bluts (PBL) konnten nach Vorinkubation mit Zoledronat Vg9Vd2-T-Zellen aktivieren. Dabei genügten bei den PBL deutlich geringere Zoledronat-Konzentrationen um einen Effekt zu erzielen als bei den untersuchten Zelllinien. Für die indirekte Stimulation von Vg9Vd2-T-Zellen durch Zoledronat mittels THP-1 Zellen oder PBL war Zell-Zell-Kontakt zwischen den präsentierenden Zellen und den gd-T-Zellen Voraussetzung. Die Anwesenheit von alkalischer Phosphatase hatte keine Auswirkungen auf die gd-T-Zell-Aktivierung durch Zoledronat. Dies spricht dafür, dass Vg9Vd2-T-Zellen Oberflächenstrukturen auf anderen Zellen erkennen und dass freie Phosphoantigene bei der gd-T-Zell-Stimulierung durch Stickstoff enthaltende Bisphosphonate keine Rolle spielen. Wurde die Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat in Gegenwart von Saponin, einem Detergenz das die Durchlässigkeit der Zellmembran reversibel erhöht, durchgeführt, reichten deutlich niedrigere Konzentrationen des Bisphosphonats aus, um die THP-1 Zellen stimulierend für gd-T-Lymphozyten zu machen. Das ist ein Hinweis darauf, dass für die Aktivierung von Vg9Vd2-T-Zellen durch Zoledronat intrazelluläre Vorgänge in den „antigenpräsentierenden“ Zellen verantwortlich sein könnten. Beim Vergleich verschiedener N-BPs hinsichtlich ihrer Aktivität gegenüber gd-T-Zellen und ihrer antiresorptiven Potenz ergab sich eine erstaunlich gute Korrelation. Dies könnte darauf hinweisen, dass beide Effekte durch den gleichen Mechanismus – die Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase – zustande kommen. Die Gegenwart von Farnesol oder Geranylgeraniol während der Vorinkubation von THP-1 Zellen mit Zoledronat verringerte deren gd-T-Zell-stimulierendes Potential nicht, so dass vielleicht nicht die Verarmung an längerkettigen Isoprenoiden sondern die Anreicherung von Vorläufern zu Veränderungen in den Zellen führt, die diese schließlich erkennbar für Vg9Vd2-T-Zellen machen. Zusätzlich wurden im Rahmen dieser Arbeit einige Versuche zu bakteriellen Phosphoantigenen durchgeführt. Mittels einer selektiven HPLC-MS/MS-Methode gelang uns in einer E. coli-Probe der Nachweis eines Vg9Vd2-T-Zell-stimulierenden Pyrophosphats mit der molekularen Masse von 3-Formyl-1-butyl-pyrophosphat, einem Phosphoantigen das in Mykobakterien gefunden worden war (Belmant und Mitarbeiter, 1999). Eine weitere Strukturaufklärung war aufgrund der äußerst geringen Konzentration des Phosphoantigens nicht möglich. 2-C-Methyl-D-erythritol-2,4-cyclodiphosphat (MEcPP) ist ein Zwischenprodukt des 2-C-Methylerythritol-4-phosphat- (MEP) Wegs der Isoprenoidbiosynthese. Es wird in manchen Bakterien – z. B. Corynebacterium ammoniagenes – bei oxidativem Stress verursacht durch Benzylviologen (BV) akkumuliert. Es konnte gezeigt werden, dass Extrakte aus C. ammoniagenes, die in Gegenwart von BV kultiviert wurden, in einem höherem Maße Vg9Vd2-T-Zellen stimulieren als Proben von Bakterien, die ohne BV-Zusatz wuchsen; MEcPP wirkte selbst nicht als Phosphoantigen. Dies war ein weiterer Hinweis darauf, dass bakterielle Phosphoantigene mit dem MEP-Weg assoziiert sind. N2 - The present work focuses on different aspects of human Vg9Vd2 T lymphocyte stimulation. A main focus of this work was the characterisation of bisphosphonate recognition by Vg9Vd2 T cells. Neither the alkyl monophosphonates ethyl and propyl phosphonate nor 3-aminopropylphosphonate were able to stimulate Vg9Vd2 T lymphocytes. Apparently both the methylene bisphosphonate group and the amino group are crucial for the Vg9Vd2 T cell stimulating ability of aminobisphosphonates. We examined pamidronate derivates bearing different substituents at the nitrogen atom. Most of these compounds activated Vg9Vd2 T cells. But the nature of the substituent greatly influenced the bisphosphonate concentration necessary for gd T cell stimulation. When the nitrogen was part of an amide bond, there was a pronounced negative effect on the Vg9Vd2 T cell stimulating capacity. It can be concluded that the bioactivity of bisphosphonates depends on the presence of a positive charge (through protonation of the nitrogen atom). Comparing different bisphosphonates with nitrogen containing heteroaromatic side chains (five membered rings containing one to three nitrogen atoms) we found that the position of the basic nitrogen in the ring as well as the nature and position of ring substituents influenced their gd T cell stimulating activity. There was evidence that a higher tendency towards a positive charge in the side chain had a positive effect on the Vg9Vd2 T cell activating potential of these compounds, as we also found for aminobisphosphonates. Zoledronat pulsed cells of the monocytic cell line THP-1 stimulated Vg9Vd2 T cells. Other cell lines and peripheral blood lymphocytes (PBL) also activated Vg9Vd2 T cells after incubation with zoledronate. There was a distinctly lower concentration of zoledronate needed for PBL to become stimulatory as for the analyzed cell lines. Cell-cell-contact between the presenting cells and the Vg9Vd2 T cells was necessary for the indirect stimulation by zoledronate pulsed THP-1 cells or PBL. Alkaline phosphatase did not abolish the gd T cell activation by zoledronate. That points to the possibility that Vg9Vd2 T cells recognize surface structures on other cells and that free phosphoantigens are not involved in gd T cell stimulation by nitrogen containing bisphosphonates. When THP-1 cells were incubated with zoledronic acid in the presence of saponin, a detergent that reversibly enhances the permeability of the cell membrane, the bisphosphonate concentration needed for rendering THP-1 cells gd T cell stimulating was clearly reduced. That indicated that intracellular events caused by zoledronate (and other nitrogen containing bisphosphonates) in the “antigen presenting cells” could result in their stimulating activity. Comparing the gd T cell stimulating activity of various N-BPs with their antiresorptive potency produced an amazingly good correlation. This could indicate that both effects are based on the same mechanism – the inhibition of farnesyl pyrophosphate synthase. The presence of farnesol or geranylgeraniol during the incubation of THP-1 cells with zoledronate did not diminish their gd T cell stimulating potential. So maybe not the depletion of longer chain isoprenoids but the accumulation of precursors results in changes that finally render the cells recognisable by Vg9Vd2 T lymphocytes. Within the scope of this work we also conducted experiments concerning bacterial phosphoantigens. Using a selective HPLC-MS/MS method we detected in Escherichia coli a Vg9Vd2 T cell stimulating pyrophosphate with the molecular mass of 3-Formyl-1-butyl pyrophosphate, a phopsphoantigen found in mycobacteria (Belmant et al., 1999). Due to the exceedingly low concentration of the phosphoantigen no further structure determination was possible. 2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate (MEcPP) is an intermediate of the 2-C-Methylerythritol 4-phosphate (MEP) pathway of isoprenoid biosyntheses. In some bacteria like Corynebacterium ammoniagenes this compound is accumulated under conditions of oxidative stress caused by benzyl viologen (BV). We showed that C. ammoniagenes extracts from bacteria cultivated in the presence of BV had a higher Vg9Vd2 T cell stimulating capacity than from bacteria growing without addition of BV. MEcPP itself was not a phosphoantigen. That was further evidence for the association of bacterial phosphoantigens with the MEP-pathway. KW - T-Lymphozyt KW - Diphosphonate KW - Antigen KW - gamma delta KW - T-Zellen KW - T-Lymphozyten KW - Bisphosphonate KW - Phosphoantigene KW - gamma delta KW - T cells KW - T lymphocytes KW - bisphosphonates KW - phosphoantigens Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12140 ER - TY - THES A1 - Kirschhock, Stephanie T1 - Zum Potential des Bisphosphonat Clodronat bei der zyklischen Therapie der primären Osteoporose T1 - Potential of the bisphosphonate clodronate in cyclic treatment of primary osteoporosis N2 - 23 Patienten mit primärer Osteoporose erhielten über 1 bzw. 2 Jahre eine zyklische, niedrig dosierte Therapie mit 800 / 1600mg Clodronat p.o. über 30 d / 90 d. Ergebnisse: Unter Clodronat kam es zu einer signifikanten Zunahme der lumbalen Knochendichte ( bis zu 6%), die periphere Knochendichte blieb unverändert. Die Frakturrate im vertebralen und peripheren Skelett wurde positiv beeinflusst. Marker des Knochenumbaus zeigten keine Veränderung im Studienverlauf. Es kam zu keinen gravierenden Nebenwirkungen unter Clodronat. N2 - 23 patients with primary osteoporosis received a cyclic, low-dose therapy with clodronate ( 800 or 1600mg/d p.o.for 30 day/ 90 days ) for 1 or 2 years. Results: Clodronate increased significantly the bone-mass at the lumbar spine ( max. 6%), the bone-mass of peripher skeleton didn`t change. Clodronate produced positive effects of fracture rate of spinal and peripher skeleton. Markers of bone resorption and formation didn`t change. Clodronate was a generally well tolerated therapy for osteoporosis. KW - Osteoporose KW - Bisphosphonate KW - Clodronat KW - Osteoporosis KW - Bisphosphonates KW - Clodronate Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5296 ER -