TY  - THES
A1  - Wagner, Carina
T1  - Dictyostelium als Wirtsmodell und Funktionsanalyse des Virulenzfaktors Mip aus Legionella pneumophila
T1  - Dictyostelium as Host Model and Funktion Analysis of the Virulence Faktor Mip out of Legionella pneumophila
N2  - Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 beschrieben, nachdem der Erreger aus dem Lungengewebe eines Patienten isoliert wurde, der an einer schweren atypischen Pneumonie erkrankt war. Das Bakterium zeichnet sich durch ein duales Wirtssystem aus und kann sich sowohl in Protozoen als auch in humanen Zellen vermehren. Ein Ziel dieser Arbeit war es, wichtige Faktoren einer Legionelleninfektion seitens der Wirtszelle zu betrachten. Als Wirtsmodell diente die soziale Amöbe Dictyostelium discoideum. Mit Hilfe eines von Patrick Farbrother (Universität Köln) etablierten Dictyostelium DNA-Microarrays mit 5906 genspezifischen Sonden, wurde die Genexpression von D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion durch L. pneumophila untersucht. Zur Kontrolle dienten uninfizierte Zellen, und Zellen, die mit L. hackeliae bzw. einer dotA-Mutante von L. pneumophila koinkubiert wurden. Diese beiden Stämme weisen eine verminderte Pathogenität bzw. ein deletiertes Pathogenitätsgen auf. Für den Zeitpunkt 24 h nach Infektionsbeginn wurden 140 Gene gefunden, die in D. discoideum in Reaktion auf eine Infektion mit L. pneumophila differentiell exprimiert werden. Einige Gene codieren bereits bekannte Proteine von D. discoideum. Dazu gehören das RtoA (ratioA, Fusion von Vesikeln), Discoidin I, CotB (spore coat Protein SP70) und die lysosomale α-Mannosidase. Mit Hilfe von Homologie-Suchen konnte weiteren unbekannten Proteinen eine Funktion zugeteilt werden. Hierzu zählen die Chaperone ClpB (heat shock protein Hsp104), β’-COP (coat protein) und drei calciumbindende Proteine. Nach Einteilung in funktionelle Kategorien, konnte gezeigt werden, dass viele Gene reguliert werden, deren Produkte am Aminosäure-Metabolismus beteiligt sind oder bei denen es sich um ribosomale Proteine handelt. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit das Nramp-Protein von D. discoideum näher untersucht. Nramp transportiert zweiwertige Kationen über die phagosomale Membran. Es konnte festgestellt werden, dass die Aufnahme von L. pneumophila und M. avium in eine nramp-Mutante deutlich reduziert ist. Allerdings ist eine vermehrte Replikation von Legionellen und Mykobakterien in der Wirtsmutante zu beobachten. In Zusammenarbeit mit Salvatore Bozzaro (Turin, Italien) konnte gezeigt werden, dass während einer Infektion mit L. pneumophila die nramp-Expression sinkt und bereits nach 48 h annähernd keine nramp-RNA im Northern-Blot nachweisbar ist. Im Gegensatz dazu bleibt die nramp-Expression während einer Infektion mit M. avium relativ konstant. In Infektionsstudien konnte nachgewiesen werden, dass sich die Endozytobionten TUME1, UWE25 und UWC6 in D. discoideum vermehren können. Mit Hilfe von spezifischen Cy3-markierten 16S-rRNA Sonden wurde die intrazelluläre Zunahme der Bakterien über 48 h beobachtet. Zum Zeitpunkt 48 h nach Inokulation konnte eine erhöhte Anzahl der drei Endozytobionten in D. discoideum festgestellt werden. Anhand von elektronenmikro-skopischen Aufnahmen konnte gezeigt werden, dass die Stämme TUME1 und UWE25 im Zytoplasma des Wirtes von membranösen Strukturen eng umschlossen sind. UWC6 konnte sowohl in Vakuolen als auch frei im Zytoplasma nachgewiesen werden. Die Lokalisierung der Endozytobionten entspricht ihrer Lokalisierung in ihren natürlichen Wirten. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Funktionsanalyse des Mip-Proteins aus L. pneumophila. Das Mip-Protein von Legionella gehört in die Klasse der FK506-Bindeproteine. Es besitzt Peptidyl-Prolyl cis/trans Isomeraseaktivität und bildet Homodimere. Mip kann an die extrazelluläre Matrix von Lungenepithelzellen binden, speziell an das Collagen IV. Mit Hilfe von Transwell-Versuchen konnte festgestellt werden, dass Mip für die Penetration von Legionella durch eine Barriere aus Lungenepithelzellen verantwortlich ist. Die Penetrationsfähigkeit konnte nach Hemmung der PPIase-Aktivität durch FK506 bzw. Rapamycin gehemmt werden. Ebenso waren Legionellen nach Hemmung der Serinproteaseaktivitäten im Transwell-System nicht mehr in der Lage die Barriere aus Epithelzellen mit extrazellulärer Matrix zu durchwandern. Mit Hilfe von Degradationsassays mit S35-markierter extrazellulärer Matrix konnte gezeigt werden, dass mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix degradieren können. Nach Hemmung der PPIase-Aktivität bzw. Serinproteaseaktivität konnten mip-positive Legionellen extrazelluläre Matrix nicht mehr degradieren.
N2  - The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila is the etiological agent of Legionnaire’s disease. It was first described in the year 1977 after isolation of the lung of a patient who had a severe atypical pneumonia. The bacterium possesses a dual host system and can replicate within protozoa and human cells. The main focus of this work was to identify host cell factors which are important during Legionella infection. As a host model system we used the social amoeba Dictyostelium discoideum. In cooperation with Patrick Farbrother (University of Cologne) who established a Dictyostelium DNA-microarray we have been able to investigate the gene expression of Dictyostelium during Legionella infection. The microarray consists of 5906 gene-specific probes representing about half the genome of D. discoideum. As controls we isolated RNA from uninfected cells and cells after coincubation with L. hackeliae as well as a dotA-mutant of L. pneumophila. Both are Legionella strains with reduced pathogenicity and a deleted pathogenicity gene respectively. Approximately 24 h after infection we identified 140 differentially expressed D. discoideum genes. Some of these genes encode well characterised D. discoideum proteins like RtoA (ratioA, vesicle fusion protein), Discoidin I, CotB (spore coat protein SP70) and the lysosomal α-Mannosidase. By homology searches the functions of others could be assigned, like the chaperones ClpB (heat shock protein Hsp104), β’-COP (coat protein) and three calcium-binding proteins. When characterising the probes by cellular processes the alteration of gene expression was analysed on functional level. A lot of genes were regulated whose products are involved in nucleotid metabolism or that are ribosomal proteins. Furthermore we investigated the role of the Nramp-protein of D. discoideum. L. pneumophila as well as M. avium were more efficiently phagocytosized from wildtype Dictyostelium than from nramp-mutants. In contrast to phagocytosis, the replication rate of both bacteria was much higher in the mutant than in the wildtype. In cooperation with Salvatore Bozzaro (Turin, Italy) we have been able to show a decrease of nramp-expression during infection with Legionella. Approximately 48 h after infection virtually no nramp-RNA was detectable by northern blots. In contrast to these results, the nramp-expression was nearly constant during an infection by Mycobacteria. By infection studies it was shown that the endocytobionts TUME1 UWE25 and UWC6 were able to replicate within D. discoideum. The intracellular increase of the bacteria within 48 h was detected by fluorescent in situ hybridisation with specific Cy3-labeled 16S-rRNA probes. By means of electron micrographs we were able to show that the strains TUME1 and UWE25 resided within the host cytoplasm closely surrounded by membranous structures. UWC6 was found in vacuoles as well as in the cytoplasm. Localisation of the endocytobionts corresponds to their localisation in their natural hosts. A further aim of this work was to investigate the function of the L. pneumophila Mip-protein. The Mip-protein of Legionella belongs to the FK506 binding proteins. Mip exhibits peptidyl-prolyl cis/trans isomerase activity and creates homodimers. We showed that mip binds to the extracellular matrix of lung epithelial cells especially to collagen IV. By using the transwell-system we demonstrated that Mip is responsible for Legionella penetrating a barrier of lung epithelial cells and their extracellular matrix. After blocking the PPIase-activity by FK506 or Rapamycin, the ability of Legionella-penetration was dramatically reduced. Also after inhibition of serinprotease-activities in the transwell-system, Legionella was not able to penetrate through the barrier. Degradation-assays with S35-labeled extracellular matrix indicated that mip-positive Legionella are able to degrade extracellular matrix. After inhibiting the PPIase-activity or serinprotease-activities mip-positive Legionella were no longer able to degrade extracellular matrix.
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Virulenzfaktor
KW  - Dictyostelium discoideum
KW  - Modell
KW  - Dictyostelium
KW  - Virulenzfaktors Mip
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Mip
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-12488
ER  - 
TY  - THES
A1  - Köhler, Rolf
T1  - Entwicklung eines GFP-Reportersystems in Legionella und molekularbiologische Funktionsanalyse des Legionella Mip-Proteins
T1  - Development of a GFP-Reportersystems in Legionella and molecular analysis of the Legionella Mip-protein
N2  - Das fakultativ intrazelluläre Bakterium Legionella pneumophila wurde erstmals 1977 als Erreger der Legionellose, einer schweren atypisch verlaufenden Pneumonie identifiziert. Es besitzt ein duales Wirtssystem und kann sich sowohl in aquatischen Habitaten in Protozoen als auch in phagozytierenden Humanzellen als Pathogen vermehren. Zur Analyse der komplexen Interaktion zwischen Pathogen und Wirtszelle wurde in dieser Arbeit ein GFP (Green Fluorescent Protein)-Reportersystem etabliert und erfolgreich eingesetzt. Es erlaubt ein in vivo Monitoring von Legionella Infektionen und ermöglicht die schnelle Quantifizierung bakterieller Invasion in Wirtszellen in Abhängigkeit von verschiedenen Faktoren. Zur Etablierung der GFP-vermittelten Fluoreszenz wurde eine transkriptionelle Fusion des gfpmut2-Gens mit dem Legionella spezifischen mip ("macrophage infectivity potentiator")-Promoter (Pmip) konstruiert. Zusätzlich wurde ein Vektor mit dem von Listeria stammenden sod ("super oxid dismutase")-Promoter eingesetzt. Mit diesen Vektoren transformierte Legionella-Stämme zeigten nach entsprechender Anregung eine starke Grünfluoreszenz und belegen somit erstmals die Funktionalität von GFP in Legionella. Durch den Einsatz von Fluoreszenzmikroskopie, Spektrofluorimetrie und Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) wurden die Stämme hinsichtlich der Unterschiede in der Virulenz und der intrazellulären Vermehrung untersucht. Ergebnisse, die durch die zeitaufwendige Bestimmung von CFU-Werten ermittelt wurden, konnten verifiziert und damit die Validität des GFP-Reportersystems in Legionella bestätigt werden. Quantitative Analysen der mip-Promoteraktivität belegen die konstitutive Expression und zeigen, dass Unterschiede in der Virulenz nicht auf variierende mip-Promoteraktivität zurückzuführen sind. Darüber hinaus konnte der Einfluss verschiedener Phagozytose-Inhibitoren auf die Aufnahme von Legionellen in die Protozoenwirte Acanthamoeba castellanii und Hartmannella vermiformis mittels des GFP-Reportersystems quantifiziert und qualitativ bewertet werden. Durch die Verwendung des Inhibitors Cytochalasin D konnte ein Einfluss Mikrofilament-abhängiger Phagozytose auf die Aufnahme in H. vermiformis und A. castellanii ausgeschlossen werden. Wie in Inhibitionsstudien mit Cycloheximid und Methylamin bestätigt werden konnte, erfolgt die Phagozytose in H. vermiformis wahrscheinlich vorwiegend über Rezeptor-vermittelte-Endozytose. Dem Protozoenwirt A. castellanii stehen dagegen zusätzliche Möglichkeiten der bakteriellen Internalisierung zur Verfügung. Diese Ergebnisse bestätigen die postulierte Heterogenität der Aufnahme-Mechanismen innerhalb verschiedener Protozoenwirte. Nach erfolgter Phagozytose von L. pneumophila wird der endosomale Weg der Phagolysosom- Reifung blockiert, hierfür wird die Sekretion bislang unbekannter Effektoren verantwortlich gemacht. Durch die Konstruktion von C-terminalen Mip::GFP-Fusionsproteinen sollte die Detektion einer eventuellen Translokation des Mip-Proteins als Virulenzfaktor innerhalb der Wirtszelle ermöglicht werden. Die erzeugten Fusionsproteine waren wahrscheinlich aufgrund der homodimeren Mip-Struktur instabil und wurden nicht über die Cytoplasmamembran hinweg transportiert. Sie erwiesen sich daher als nicht geeignet, dieser Fragestellung weiter nachzugehen. Da die in vivo Funktion von PPIasen (Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen) wie dem Mip-Protein in Prokaryoten bis heute weitgehend unbekannt ist, sollte im zweiten Teil dieser Arbeit versucht werden, einen Interaktionspartner zu identifizieren und den Einfluss der Dimerisierung und der PPIase-Aktivität des Mip-Proteins auf die Virulenz von L. pneumophila zu untersuchen. Durch Quervernetzung-Experimente konnte ein putativer, prokaryotischer Interaktionspartner des Legionella Mip-Proteins detektiert werden. Die N-terminale Aminosäure-Sequenzierung ergab jedoch keinerlei Homologie zu bereits bekannten Legionella- oder anderen Proteinen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass eine N-terminale Blockierung die Aufklärung der Sequenz ursächlich verhindert. Wie in früheren Arbeiten gezeigt wurde, ist die PPIase-Aktivität des Legionella Mip-Proteins für die Invasion und das intrazelluläre Überleben in Protozoen, Monozyten und der Makrophagen-ähnlichen Zelllinie U937 nicht notwendig. Ein weiteres Charakteristikum des Proteins ist seine homodimere Struktur und die Assoziation mit der äußeren Membran. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. G. Fischer in Halle konnte durch Deletion der N-terminalen Domäne (AS 4-79) ein verkürztes Dimer-defizientes Legionella Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) erzeugt und biochemisch charakterisiert werden. Durch site-spezifische Mutagenese N-terminal lokalisierter Aminosäuren (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) konnte deren Beteiligung an der Dimerisierung nachgewiesen werden. Zur Analyse des Einflusses der dimeren Ouartärstruktur auf die Pathogenität wurde ein mip-negativer Stamm mit dem nur noch als Monomer vorliegenden Mip-Protein (L.p.FKBP-20-3, 80-213) in cis komplementiert und die Expression sowie Integration in L. pneumophila PhilI JR32-2.4 verifiziert. Ergebnisse aus Infektionsstudien zeigten deutlich, dass die Dimerisierung des Legionella Mip-Proteins und nicht die Isomerase-Aktivität für die Infektion von monozellulären Systemen entscheidend ist. Im Gegensatz dazu konnte in Tierexprimenten (Meerschweinchen) die Beteiligung der Isomerase-Aktivität an der Pathogenität von L. pneumophila nachgewiesen werden. Der Verlust der Isomerase-Aktivität wirkt sich, verglichen mit dem monozellulären System (A. castellanii), im Tiermodel wesentlich dramatischer auf das intrazelluläre Überleben aus. Mit site-spezifisch verändertem Mip-Protein komplementierte Legionella-Stämme zeigten eine intrazelluläre Vermehrung in Abhängigkeit der gemessenen in vitro Isomerase-Restaktivität. Durch den Einsatz der dimerisierungsdefizienten Mip-Komplementante, L. pneumophila PhilI JR32-2.4, wurde die Notwendigkeit der Dimerisierung des Mip-Proteins auch im Tiermodell bestätigt. Durch die vorliegende Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Funktion der Isomerase-Aktivität für die Infektion monozellulärer Systeme und höherer Organismen unterschiedlich ist.
N2  - The facultative intracellular bacterium Legionella pneumophila was first identified in 1977 as the etiologic agent of legionellosis, a severe and atypical pneumonia. It possesses a dual host system which allows the bacteria to replicate in protozoa in aquatic habitats as well as a pathogen in human phagocytic cells. In order to analyze the complex interaction of the bacterial pathogen and its host cells, in this thesis a new GFP reporter system was established and sussessfully evaluated. It is now possible to monitor a Legionella infection in vivo and to quantify bacterial invasion influenced by different factors in a more convenient way. To analyze GFP expression in Legionella a transcriptional fusion of the gfpmut2 gene with the Legionella-specific mip (macrophage infectivity potentiator) promoter was constructed. In addition, a vector habouring the sod (super oxid dimutase) promoter derived from Listeria monocytogenes was used. Following transformation into Legionella strains strong GFP-mediated fluorescence was detected confirming the functionality of GFP in Legionella for the first time. Using fluorescence microscopy, spectrofluorimetry and flow cytometry (FACS-analysis) the strains were examined regarding differences in virulence and intracellular replication. Re-confirming results from earlier studies obtained by using enumeration of CFU values showed the validity of the method. Quantification of the mip promoter activity revealed a constitutively expression, this indicates that differences in Legionella virulene are not due to variations in mip promoter activity. Moreover, the influence of different phagocytosis inhibitors on Legionella uptake into the protozoan hosts Acanthamoeba castellanii and Hartmannella vermiformis using the GFP reporter system was examined. Application of cytochalasin D had no influence on bacterial uptake in A. castellanii and H. vermiformis suggesting in microfilament-independent mechanism. Phagocytosis in H. vermiformis is mainly accomplished using receptor-mediated phagocytosis as it was evident from inhibition studies with cycloheximide and methylamine. In contrast, phagocytosis in A. castellanii is mediated by other receptors or additional mechanisms are available. This results confirm the proposed heterogeneity of uptake mechanisms by different protozoan hosts. After L. pneumophila is phagocytosed the endosomal pathway of phagosome maturation is blocked, by means of secreted but as yet unidentified effector molecules. To study a putative protein translocation C-terminal Mip::GFP fusion proteins were constructed. The stability of the proteins was rather weak which is likely due to the dimeric conformational state of the Mip protein. In addition, transport over the cytoplasmic membran was not accomplished. Therefore the fusion proteins proved not to be useful for examine translocational events. Because of the unknown in vivo function of bacterial PPIases the focus in the the second part of this work was to identify a putative interaction partner of the Mip protein and to elucidate the influence of dimerization and PPIase activity on Legionella's virulence. Using cross linking experiments a putative interaction partner could be detected. N-terminal sequencing revealed no homology to already known Legionella or other proteins. N-terminal blockade of the putative partner molecule may be the cause that hampered sequence identification. It has been shown that the isomerase activity of the Legionella Mip protein is not necessary for invasion and intracellular survival in protozoan, monocytes and U937 macrophages. Additional features of the protein are its homodimeric conformational state and the assoziation with the outer membrane. In cooperation with the group of Prof. Dr. G. Fischer in Halle a N-terminal truncated (aa 4-79) dimerization-deficient Mip protein (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) was constructed and biochemically characterized. Using site specific mutagenesis participation of the N-terminal located amino acids (K11A/D32A, Y16A/D32A und M38,42E) in the dimerization of the Mip protein was confirmed. To analyze the influence on pathogenicity of the dimeric state of the Mip protein a mip negative strain was complemented by providing the gene encoding the monomeric Mip (L.p.FKBP25-20-3, 80-213) in cis. The proper integration and protein expression was confirmed. The results demonstrate that the isomerase activity is dispensable for intracellular growth in protozoan hosts. Moreover, the results clearly demonstrated that dimerization and not the isomearse activity are essential for virulence of Legionella in a monocellular system. In contrast, it could be shown that the isomerase activity is necessary for full virulence in the animal model (guinea pigs). The loss of the isomerase avtivity have a more dramatic impact on the intracellular survival of Legionella compared to the monocellular system (A. castellanii). Moreover, Legionella strains replicated intracellulary dependent on their remaining in vitro isomerase activity. Using the monomeric Mip expressing strain L.p.JR32-2.4 it could be demonstrated that dimerization also plays a role in the animal model. This work provides evidence for a different role of the isomerase activity of the Mip protein in monocellular systems and during the infection of higher organisms.
KW  - Legionella pneumophila
KW  - Bakterielle Infektion
KW  - Grün fluoreszierendes Protein
KW  - In vivo
KW  - Legionella pneumophila
KW  - GFP-Reportergen
KW  - in vivo Monitoring
KW  - Fluoreszenzmikroskopie
KW  - FACS-Analyse
KW  - MIP
KW  - PPIasen
KW  - Dimerisierung
KW  - Legionella pneumophila
KW  - GFP-reportersystem
KW  - in vivo monitoring
KW  - fluorescence microscopy
KW  - FACS-analysis
KW  - Mip
KW  - PPIases
KW  - dimerization
Y1  - 2000
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1594
ER  -