TY  - THES
A1  - Bergfeld, Arne
T1  - Das pH-regulierte Protein 1 (Pra1) von \(Candida\) \(albicans\) moduliert CD4\(^+\) T-Zell-Antworten der Maus in vitro durch direkte Bindung an die T-Zell-Oberfläche
T1  - The pH-regulated protein 1 (Pra1) of \(Candida\) \(albicans\) modulates mouse CD4\(^+\) T cell responses in vitro by directly binding to the T cell surface
N2  - Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar.
Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann.
Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden.
Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen.
Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit.
Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt.
Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α.
N2  - Infections caused by C. albicans on mucosal surfaces are a common disease in patients suffering from suppression of the T cell immune defense. Blood stream infections by the yeast C. albicans (candedemia) represent still a severe complication in patients in intensive care units with high rates of lethality.
The pH-regulated antigen 1 (Pra1) is a protein produced by C. albicans which is present on the surface of the fungi and is secreted into the supernatant of fungal cultures as well. Pra1 can bind to human T cells via the surface protein CD46. It is known, that this protein can also bind to certain immune cells of mice (monocytes and phagocytes). Binding to T cells of mice is not yet known. A characterization of the interaction of Pra1 with immune cells of mice would be valuable, because mice act as a biological model system for the investigation of infections with C. albicans. In this paper, it could be shown that recombinant Pra1 (rPra1) can bind to mouse CD4+ T cells as well.
After the finding that rPra1 can bind to CD4+ T cells, different parameters determining this binding have been studied. Zinc was found to be one influencing factor on the binding. Pra1 can bind free zinc ions and by the addition of ZnCl2 while incubating T cells with Pra1 the signal of bound Pra1 to CD4+ T cells could be increased.
Aspf2, a protein from Aspergillus fumigatus with high homology to Pra1, was not able to bind to these cells.
In in-vivo-experiments with animals infected with C. albicans, no wild-typic secreted Pra1 was found bound to T cells. Supernatant from C. albicans cultures produced, after incubation in vitro, a signal for cell-bound Pra1 on CD4+ T cells. Kinetics of the binding of rPra1 to T cells showed a constant increase of signal over the time of incubation. The off-kinetics revealed a decrease of cell-bound rPra1 over time to the edge of detectability.
The receptor of Pra1 on T cells has not been identified yet. The structurally and functionally comparable surface proteins Crry, CD59a and CD55 were tested in knockout mice for each of these proteins and could be excluded as possible receptors.
After binding of secreted Pra1 to neutrophilic granulocytes these cells experience a decreased capacity to phagocytose pathogens. The binding of Pra1 to CD4+ T cells leads to a costimulation of T cells, which results in increased cell activation and proliferation. This costimulatory capacity of Pra1 can be augmented by adding 10 μM zinc chloride.
During activation of naïve CD4+ T cells Pra1 reduces the secretion of IFN-γ. The reduction of IFN-γ-producing cells is not due to an influence of Pra1 during cell activation of naive CD4+ T cells to Th1 cells and is also not due to induction of apoptosis in IFN-γ-producing Th1 cells. The binding of Pra1 to ex-vivo isolated CD4+ T cells reduces the in vitro secretion of IFN-γ after stimulating these cells via their T cell receptor. Additionally, the secretion of IL-2 and TNF-α was reduced.
KW  - Candida albicans
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Interferon <gamma->
KW  - Tumor-Nekrose-Faktor <alpha>
KW  - Interleukin 2
KW  - C. albicans
KW  - CD4+
KW  - T-Zelle
KW  - IFN-g
KW  - Pra1
Y1  - 2018
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-169716
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TY  - THES
A1  - Hummel, Jonas Florian
T1  - Hüllproteine endogener Retroviren interferieren mit der allostimulatorischen Aktivität dendritischer Zellen
T1  - Human endogenous retrovirus envelope proteins target dendritic cells to modulate T-cell activation
N2  - Das humane Genom besteht zu ungefähr 8 % aus humanen endogenen Retroviren (HERVs),
jedoch sind viele aufgrund von Mutationen oder Deletionen nicht mehr funktionell. Trotzdem
wurden funktionelle HERV-Proteine gefunden, welche offene Leserahmen (ORFs) besitzen
und für funktionelle Hüll-Glykoproteine wie z.B. Syncytin-1, Syncytin-2 und HML-2
kodieren. Diese HERV-Hüllproteine beinhalten eine suppressive Domäne (SU) und
induzieren möglicherweise eine Immunsuppression diverser Immunzellen während einer
gesunden Schwangerschaft.
In dieser Arbeit wurden spezifisch die modulatorischen Eigenschaften verschiedener HERVHüllproteine
(Syncytin-1, -2 und HML-2) auf Immunzellen untersucht.
Wir konnten zeigen, dass die HERV-Bindungsrezeptoren ASCT-1, -2 und MFSD2A auf der
Oberfläche von T-Zellen und DCs exprimiert werden. Für funktionelle Experimente wurden
HERV-Hüllproteine transgen in CHO-Zellen exprimiert, die als Effektorzellen in Ko-Kultur-
Systemen verwendet wurden. Es konnte keine Hemmung der PMA/Ionomycin-stimulierten
T-Zell-Proliferation durch die Effektorzellen gefunden werden. Darüber hinaus
beeinträchtigten die Effektorzellen nicht die Expression von Reifungsmarkern auf DCs nach
LPS-Aktivierung, induzierten jedoch die Produktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-
12 und TNF-α. Dagegen inhibierten die konstitutiv HERV-Hüllprotein-exprimierenden
Chorionkarzinom-Zelllinien BeWo und JEG die PMA/Ionomycin-stimulierte T-Zell-
Proliferation sehr effektiv. Die Chorionkarzinom-Zelllinien hatten ebenfalls keinen Einfluss
auf die phänotypische LPS-DC-Reifung, modulierten aber die LPS-DC-Zytokin-Antwort sehr
effektiv zu einem suppressiven Profil durch eine Inhibition der pro-inflammatorischen
Zytokine IL-12 und TNF-α sowie einen Anstieg von anti-inflammatorischem IL-10. BeWound
JEG-Zellen, aber auch HERV-Hüllprotein-exprimierende Effektorzellen verändern die
durch LPS-DC-stimulierte allogene T-Zell-Proliferation. Dies war mit einer verringerten
Bildung von DC/T-Zell-Konjugaten sowie mit einer Hemmung der IFN-γ-Sekretion und der
Ca2+-Mobilisation dieser T-Zellen assoziiert. Des Weiteren wurden eine reduzierte p-Tyrosin-
Akkumulation und kein Ausschluss des F-Aktin-Signals in der immunologischen Synapse,
der Kontaktstelle dieser DC/T-Zell-Konjugate, gefunden.
Zusammenfassend lassen diese Ergebnisse vermuten, dass HERV-Hüllproteine die T-Zell-
Proliferation nicht direkt beeinflussen, sich aber modulierend auf DCs auswirken und dadurch
mit deren allogene T-Zell-Proliferation interferieren.
N2  - Human endogenous retroviruses (HERVs) comprise about 8 % of the human genome but
many are not functional due to mutations or deletions. However, some HERVs have been
reported to harbor open reading frames (ORFs) and are coding for functional envelope (env)
glycoproteins (Syncytin-1, Syncytin-2 and HML-2). These HERV env glycoproteins have
suppressive domains (SU) and may modulate immune cells especially in the placenta where
they are highly expressed.
In this work, we investigated the ability of different HERV envs (Syncytin-1, -2 and HML-2)
to modulate immune cell function.
We showed that HERV binding receptors ASCT-1, -2 and MFSD2A are expressed by T-cells
and DCs. For functional analysis, HERV envs were transiently expressed in CHO-cells which
were then used as effector cells for co-culture assays. We demonstrated that HERV env
expressing CHO effector cells did not significantly inhibit PMA/Ionomycin stimulated T-cell
proliferation, and did not prevent phenotypic maturation of DCs in response to LPS.
However, they did strongly augment the release of the pro-inflammatory cytokines IL-12 and
TNF-α from LPS-DCs. In contrast, BeWo and JEG choriocarcinoma cell-lines constitutively
expressing HERV env proteins reduced the T-cell proliferation very effectively. These celllines
did not prevent phenotypic maturation of LPS-DCs, but shifted their cytokine response
towards an immune suppressive profile by inhibiting the pro-inflammatory cytokines IL-12
and TNF-α and enhancing the release of the anti-inflammatory cytokine IL-10. The
choriocarcinoma cell-lines and CHO effector cells inhibited the LPS-DC induced allogenic Tcell-
proliferation. This was associated with a loss of DC/T-cell conjugate frequency as well as
with an impairment of IFN-γ release and Ca2+ mobilization in T-cells. In addition, we
observed an aberrant pattern of p-tyrosine and F-actin signal in the interface of these DC/Tcell
conjugates.
Altogether, these findings suggest that HERV proteins do not target T-cell activation directly,
but modulate the DCs' ability to promote T-cell expansion.
KW  - Syncytin
KW  - dendritische Zelle
KW  - T-Lymphozyt
KW  - HERV
KW  - immunologische Synapse
KW  - DC/T-Zell-Konjugate
KW  - T-Zelle
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118964
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TY  - THES
A1  - Wellner, Mirjam
T1  - T-Zell-Charakterisierung im peripheren Blut bei Kindern mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
T1  - Peripheral Blood T Cell Characterization in Children with Inflammatory Bowel Disease
N2  - Die Inzidenz von chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (CED), insbesondere von Morbus Crohn (MC), nimmt weltweit zu, was auch eine Vielzahl an Kindern betrifft. Obwohl die Krankheit in den letzten Jahrzehnten Gegenstand zahlreicher Forschungsarbeiten war, ist die Pathogenese nicht abschließend geklärt.
Diese Arbeit vergleicht T-Zellen gesunder pädiatrischer Probanden mit T-Zellen pädiatrischer CED Patienten mittels Flowcytometrie unter Berücksichtigung von Differenzierungsstadium, Krankheitsaktivität, Therapie und CMV-Status.
Die Verteilung der T-Zell-Subpopulationen zeigt keine signifikanten Unterschiede zwischen Patienten und Kontrollen, jedoch zeigen sich für TH1 und TH17 Zellen Unterschiede zwischen MC Patienten und Kontrollen, welche auch mit Krankheitsaktivität und Therapie korrelieren. Der Anteil von CXCR3+ Zellen ist innerhalb der CD4+ Memory-Populationen und innerhalb der CD8+ Memory- und Effektor-Populationen bei MC Patienten – vor allem mit aktiver Erkrankung bzw. ohne Therapie – deutlich geringer als bei Kontrollen. Gleichzeitig zeigt sich der Anteil an CCR6+ Zellen sowie der Anteil an IL 17+CCR6+ Zellen bei MC Patienten in Remission sowie unter Therapie mit TNFα-Blockern höher als bei Kontrollen. Zudem sind die Effektor-Zell-Gleichgewichte bei MC zugunsten von TH17 Zellen verschoben. Somit unterstützt die Arbeit die weitverbreitete Hypothese einer gesteigerten TH17-Antwort bei MC. Auch zeigt sich eine Verminderung der TH1-Zellen im peripheren Blut bei aktiv erkrankten MC Patienten im Vergleich zu Kontrollen, was sich möglicherweise durch eine Abwanderung oder Umwandlung dieser Zellen bei aktivem MC erklären lässt.
Desweiteren zeigt sich, dass CED Patienten eine verstärkte Neigung zur vorzeitigen Immunoseneszenz aufzuweisen scheinen, was durch eine latente CMV-Infektion nochmals verstärkt erscheint. Einige CMV-assoziierte Veränderungen der T-Zell-Differenzierung, wie z.B. die CD45RA-Reexpression sowie die TNFα- und IFNγ-Mehrexpression, zeigen sich bei CMV+ CED Patienten zudem ausgeprägter als bei CMV+ Kontrollen. Interessant ist daher, dass CMV+ Probanden und CED Patienten Veränderungen aufweisen, die sich teilweise zu addieren scheinen.
N2  - There is a globally increasing incidence of Inflammatory Bowel Disease (IBD), especially of Crohn’s disease, which can also be seen in children. Despite the disease being studied intensively over the recent decades, the pathogenesis is not yet completely understood.
This study compares t cells isolated from pediatric IBD patients with those of healthy donors using flow cytometry and taking into account cell differentiation status, disease activity, current therapeutic regime and the donor’s CMV status.
T cell subsets show no significant distributional differences between patients and controls. However, TH1 and TH17 cells show differences between patients with Crohn’s disease and controls, which correlate with disease activity and therapy. The proportion of CXCR3+ cells is reduced within CD4+ memory subsets and CD8+ memory and effector subsets, especially in patients with active disease or without therapy. At the same time CCR6+ and IL-17+CCR6+ subsets are increased in patients with Crohn’s disease in remission or under therapy compared to controls. Furthermore, effector cell balances are shifted towards TH17 cells in patients with Crohn’s disease, supporting the widespread hypothesis of an increased TH17 response in Crohn’s disease. Additionally, TH1 cells are diminished in peripheral blood of patients with active Crohn’s disease compared to controls, possibly suggesting a migration of these cells into tissue or a differentiation into other subsets.
As an additional finding, IBD patients exhibited an increased tendency for premature immunosenscence, which was even more distinct in patients with latent CMV infection. Some changes in t cell differentiation commonly attributed to CMV infection, like reexpression of CD45RA and increased expression of TNFα and IFNγ, are more pronounced in CMV positive IBD patients, than in CMV positive healthy donors. Interestingly, the combination of IBD with CMV infection partially add up to more pronounces changes in CD4+ t cells and especially in CD8+ t cells.
KW  - Chronisch-entzündliche Darmerkrankung
KW  - Morbus Crohn
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Colitis ulcerosa
KW  - T-Zelle
KW  - Immunoseneszenz
KW  - Cytomegalievirus
Y1  - 2019
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-192424
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TY  - THES
A1  - Schrama, David
T1  - T-Zell-priming außerhalb sekundärer lymphatischer Gewebe
T1  - T-cell priming outside of secondary lymphoid tissue
N2  - T-Zellimmunantworten werden normalerweise durch folgenden Weg initiiert: unreife dendritische Zellen nehmen Antigen in der Peripherie auf, wandern in die sekundären lymphatischen Organe, wobei sie auf ihrem Weg sowohl reifen als auch das Antigen prozessieren. In den sekundären lymphatischen Organen angekommen, präsentieren sie als reife dendritische Zellen den T-Zellen die Antigene in Form von Peptiden zusammen mit kostimulierenden Molekülen. Dadurch rufen sie eine spezifische T-Zellantwort hervor. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob nicht Situationen herbeigeführt werden können, die ein T-Zell priming außerhalb der sekundären lymphatischen Organe erlauben. Dazu wurden ein murines Modell, bei dem das Zytokin Lymphotoxin-alpha spezifisch am Tumor angereichert wurde, und ein humanes Modell, bei dem reife, antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden, untersucht. Im murinen Modell zeigte sich, dass die gerichtete Anreicherung von Lymphotoxin-alpha am Tumor zu dessen Zerstörung führte, welche durch T-Zellen vermittelt wurde, und mit der Induktion eines tertiären lymphatischen Gewebes am Tumor assoziiert war. Dieses tertiäre lymphatische Gewebe war durch die Kompartimentalisierung von T- und B-Zellen und der Präsenz von high endothelial venules charakterisiert und besaß zudem mit dendritischen Zellen und naïven T-Zellen alle Voraussetzungen für ein in loco priming. Dementsprechend konnte in der Folge der gerichteten Lymphotoxin-alpa Therapie im Tumor ein Anstieg am T-Zellinfiltrat, welches sich oligoklonal zusammensetzte, beobachtet werden. In vitro Experimente verdeutlichte die Tumorspezifität der Therapie-induzierten T-Zellantwort, da die T-Zellen auf ein Tumorantigen mit der Ausschüttung von Interferon gamma reagierten und die Tumorzellen lysierten. Im humanen Modell wurden Hautbiopsien von Melanompatienten untersucht, denen im Rahmen einer klinischen Studie autologe, in vitro generierte und antigenbeladene DC intradermal appliziert wurden. Die Patienten erlaubten die Entnahme von Hautbiopsien aus den Injektionsstellen für wissenschaftliche Untersuchungen. Eine Induktion bzw. Verstärkung einer spezifischen T-Zellantwort durch die Vakzinierung mit antigenbeladenen dendritischen Zellen konnte bereits in zahlreichen Arbeiten und auch in dem in dieser Arbeit untersuchten Patientenkollektiv gezeigt werden. Bei der Analyse der Injektionsstellen zeigt sich, dass ein großer Teil der injizierten dendritischen Zellen in der Vakzinierungsstelle verharren und dass diese unabhängig von einer Beladung mit Antigen zu einer Induktion von high endothelial venules Charakteristika führte. Waren die dendritischen Zellen mit Antigen beladen, so führte dies zu einem stärkeren T-Zellinfiltrat in den Injektionsstellen, wobei sowohl naïve als auch central memory T-Zellen nachgewiesen wurde. Diese Zellen wurden vermutlich durch die Überexpression der DC CK1 und SDF1 Chemokinen in den Injektionsstellen, die chemotaktisch auf T-Zellen wirken, angezogen. Das Infiltrat in den Injektionsstellen war oligoklonal und wies tumorspezifische T-Zellen auf. Nachdem diese T-Zellklone im Blut der Patienten vor der Vakzinierung nicht nachweisbar waren, müssen sie zumindest in den Injektionsstellen expandiert sein. Interessanterweise konnte einer dieser Klone in Metastasen nachgewiesen werden, die nach der Vakzinierung dem Patienten entfernt wurden. In beiden Modellen wurde also durch die Manipulation des Mikromilieus, d.h. Lymphotoxin-alpa Anreicherung am Tumor bzw. Injektion von reifen dendritischen Zellen in die Haut, Strukturen wie z.B. high endothelial venules induziert, die ein in loco priming ermöglichen sollten. Dementsprechend riefen diese Veränderungen ein Tumorantigen-spezifisches Infiltrat hervor. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass T-Zell priming auch außerhalb sekundärer lymphatischer Organe erfolgen kann. Prinzipiell scheint also nur der Kontakt von reifen, antigenbeladenen dendritischen Zellen mit den entsprechenden antigenspezifischen, naïven T-Zellen entscheiden zu sein. Die Möglichkeit des in vitro primings bekräftigt diese These. In vivo erfolgt dieses Aufeinandertreffen normalerweise in den sekundären lymphatischen Organen, doch konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass Veränderungen des Mikromilieus diesen Kontakt auch in anderen Geweben ermöglicht.
N2  - Cellular immune responses are initiated by direct interaction of naïve T cells with professional antigen presenting cells, i.e., dendritic cells. In general, this interaction takes place in secondary lymphoid organs: immature dendritic cells capture antigen in the periphery, and while homing to the secondary lymphoid organs they mature and process the antigen. In these organs they present peptides derived from the antigen together with co-stimulatory molecules to the naïve T cells and thereby initiate an antigen-specific T cell response. In the present work we tested if situations can be created allowing priming outside secondary lymphoid organs. To this end, a murine model in which lymphotoxin-alpha was specifically accumulated at the tumor site and a human model where in vitro generated, matured and antigen pulsed dendritic cells were injected intradermal into the patients were investigated. In the murine model the accumulation of lymphotoxin-alpha at the tumor site led to the eradication of the tumor. This therapeutic success was mediated by T cells and associated with the induction of a tertiary lymphoid tissue characterized by compartmentalized T and B cell aggregates and the presence of high endothelial venules. Moreover, with dendritic cells and naïve T cells present in these tissues requirements for in loco priming were fulfilled. Indeed, targeted lymphotoxin-alpha enlarged the T cell-infiltrate within the tumor. In vitro assays demonstrated the tumor-specificity of the therapy-induced infiltrate. In the human model skin biopsies taken from melanoma patients receiving dendritic cell based vaccination and participating at a clinical I study were investigated. The patients provided informed consent to participate in this experimental procedure and to donate skin biopsies for immunological monitoring. Skin biopsies were taken from the injection sites in which autologous, in vitro generated, maturated and antigen-pulsed dendritic cells were injected. Several reports including one about patients from the present patient cohort demonstrated the induction and/or enhancement of tumor specific T cell responses subsequent to dendritic cells based vaccination therapy. Our analysis demonstrated that most of the injected dendritic cells were entrenched at the injection site. The mere presence of mature dendritic cells in the skin caused the induction of high endothelial venules. In case the dendritic cells were pulsed with antigen the T cell infiltrate was enlarged and consisted both of naïve and central memory T cells. These cells were presumably attracted by the overexpression of the T cell attractant chemokines DC-CK1 and SDF-1 leading to an oligoclonal T cell infiltrate composed partially of tumor specific T cells. As T cell clones detected within the injections sites were not present among the peripheral blood lymphocytes, these clones were at least expanded in the injection sites. Notably, one clone could be detested in metastases of one patient excised after the vaccination. In both models manipulation of the microenvironment, i.e. targeting lymphotoxin-alpa to the tumor or injecting mature dendritic cells into the skin, respectively, induced structures like high endothelial venules which should enable in loco priming. Accordingly, these changes induced a tumor antigen specific T cell infiltrate. Thus, these results imply that T cells can be primed outside of secondary lymphoid tissues. Generally, the contact between mature, antigen presenting dendritic cells and the respective antigen specific T cells should be the only necessity for priming. Notably, the possibility of in vitro priming sustains this thesis. In vivo secondary lymphoid organs enable this contact. The present work, however, demonstrates that this contact can also take place in different tissue caused by manipulation of the respective microenvironment.
KW  - T-Lymphozyt
KW  - Priming
KW  - Melanom
KW  - Melanom
KW  - T-Zelle
KW  - priming
KW  - tertiäres lymphatisches Gewebe
KW  - Immunoconjugate
KW  - melanoma
KW  - T-cell
KW  - priming
KW  - tertiary lymphoid tissue
KW  - immunoconjugate
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15060
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TY  - THES
A1  - Hühne, Tom
T1  - Untersuchungen zur selektiven Induktion von Zelltod in CD4+ Foxp3- konventionellen T-Zellen der Maus durch Hemmung der sauren Sphingomyelinase \(in\) \(vitro\)
T1  - Analysis of the selective induction of cell death in murine CD4+ Foxp3- conventional T cells by inhibition of acid sphingomyelinase \(in\) \(vitro\)
N2  - Die saure Sphingomyelinase (Asm) ist ein lysosomales Enzym, das sezerniert werden kann und die Reaktion von Sphingomyelin zu Ceramid und Phosphocholin katalysiert. Seine Funktion ist bedeutsam für die Aufrechterhaltung des zellulären Lipidstoffwechsels und für die Integrität der Plasmamembran. Enzymdefekte sind an der Pathogenese von Infektionen und zahlreichen Stoffwechselerkrankungen wie z.B. der Niemann-Pick-Krankheit, Diabetes mellitus Typ II und auch an der Entstehung psychischer Erkrankungen beteiligt.
Immunologisch bedeutsam ist, dass durch Hemmung der Asm mit trizyklischen Antidepressiva (TZA) oder Serotonin-Wiederaufnahme-Inhibitoren (SSRI) die Frequenz CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatorischer T-Zellen (Treg) der Maus erhöht wird. Grund für die Frequenzerhöhung ist jedoch nicht die Erhöhung der absoluten Treg-Zellzahl, sondern das selektive Sterben CD4+ CD25- Foxp3- konventioneller T-Zellen (Tconv). Erstaunlicherweise führt die Behandlung mit dem kompetitiven Asm-Inhibitor ARC39, einem Bisphosphonat, nicht zu diesem Effekt.
Es konnte gezeigt werden, dass IL-2 die regulatorischen T-Zellen vor dem durch Asm-Hemmung induziertem Zelltod schützt. In Abwesenheit von IL-2 gehen auch Treg-Zellen durch die Asm-Inhibition zugrunde. Treg-Zellen exprimieren konstitutiv CD25, den IL-2-Rezeptor, dessen α-Kette die Bindungsstelle von Interleukin-2 bildet. Die β- und γ-Kette des Rezeptors sind an der Bindung des Transkriptionsfaktors STAT5 beteiligt, das wiederum die Gentranskription von antiapoptotischen Proteinen wie bcl-2 und bcl-x sowie CD25 fördert. Dahingehend wurde versucht, den verantwortlichen Faktor für den Schutz von Treg-Zellen vor dem Zelltod in der IL-2-Signaltransduktion zu identifizieren. Der Transkriptionsfaktor STAT5 konnte hierbei ausgeschlossen werden. Weder die genetische Überexpression noch die Defizienz von STAT5 hatten Einfluss auf das T-Zell-Gleichgewicht. Die genauen molekularen Mechanismen der Treg-spezifischen IL-2-Protektion bleiben daher ungeklärt. Zu diskutieren sind der Einfluss von Zn2+-Ionen, Januskinasen und Mitgliedern der FoxO-Familie.
Die zugrundeliegende Hypothese, dass das spezifische Sterben konventioneller T-Zellen auf einer Erhöhung der lysosomalen Membranpermeabilität (LMP) besteht, woraufhin proapoptotisch wirksame Cathepsine ins Zytosol freigesetzt werden und Caspasen zur Auslösung von Apoptose führen, konnte nicht abschließend bestätigt werden. Jedoch wurde nachgewiesen, dass durch Inhibition von Cathepsinen das Sterben konventioneller T-Zellen in Abwesenheit von IL-2 verlangsamt wird. Eine Protektion der Tconv-Zellen durch Caspase-Inhibitoren kann nur bei hohen
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Konzentrationen des Inhibitors ZVAD bei gleichzeitig geringer Asm-Inhibitor-Konzentration erreicht werden. In Zusammenschau der Ergebnisse müssen weitere Formen des Zelltods neben der Apoptose, etwa eine durch Asm-Inhibition induzierte Ferroptose, in Erwägung gezogen werden.
Neben dem durch Asm-Inhibition erzeugten Lipidstress begünstigt das Vorliegen von hypoxischen Bedingungen die Induktion von Zelltod. Schon das alleinige Auftreten von Hypoxie ohne den Einfluss von Asm-Inhibitoren führt zu einer Treg-Frequenzerhöhung. Der Hypoxie-induzierte Faktor HIF-1α induziert die Expression von Foxp3, wodurch die Differenzierung und Suppressivität von CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg-Zellen gefördert wird. Der Einfluss von Hypoxie spielt womöglich vor allem in der Tumortherapie eine entscheidende Rolle. HIF-1α regt hypoxische, nicht-vaskularisierte Tumorareale zur Neovaskularisation an und bremst durch die Frequenzerhöhung regulatorischer T-Zellen die eigene Immunabwehr. Ein Abbau des Transkriptionsfaktors HIF-1α stellt somit eine therapeutische Option in der Therapie solider Tumoren dar.
Abschließend lässt sich also festhalten, dass die relative Frequenzerhöhung regulatorischer T-Zellen durch Asm-Inhibition nicht durch Apoptose erklärt werden kann, sondern alternative Erklärungsmodelle wie z.B. die Ferroptose in Betracht gezogen werden müssen. Die Protektion CD25+ regulatorischer T-Zellen beruht auf der Wirkung von IL-2 und wird durch Hypoxie positiv beeinflusst. Eine genaue Identifizierung der für den Zelltod relevanten Mechanismen ist erforderlich, um sichere therapeutische Maßnahmen im Rahmen von Infektionen und Autoimmunkrankheiten zu etablieren.
N2  - The acid sphingomyelinase (Asm) is a lysosomal enzyme that can be secreted and catalyses the cleavage of sphingomyelin to ceramide and phosphocholine. Its function is important for the maintenance of cellular lipid metabolism and for the integrity of the plasma membrane. Enzyme defects are involved in the pathogenesis of infections and numerous metabolic diseases such as Niemann-Pick disease, diabetes mellitus type II and also in the development of mental illness.
It is of immunological importance that the inhibition of the Asm with tricyclic antidepressants (TCA) or serotonin reuptake inhibitors (SSRI) leads to an increase of the frequency of CD4+ CD25+ Foxp3+ regulatory T cells (Treg) in the mouse. The reason for this frequency increase is not an increase in the absolute Treg cell count, but rather due to the selective death of CD4+ CD25- Foxp3- conventional T cells (Tconv) Surprisingly, treatment with the competitive Asm-inhibitor ARC39, a bisphosphonate, does not lead to this effect.
It could be demonstrated that IL-2 protects regulatory T cells from cell death induced by Asm inhibition. In the absence of IL-2, Treg cells also die due to Asm inhibition. Treg cells constitutively express CD25, the IL-2 receptor, whose α-chain forms the binding site of interleukin-2. The β- and γ-chain of the receptor are involved in the binding of the transcription factor STAT5, which itself promotes gene transcription of anti-apoptotic proteins such as bcl-2 and bcl-x as well as CD25. Therefore, we tried to identify the responsible factor responsible for protecting Treg cells from cell death in IL-2 signal transduction. The transcription factor STAT5 was excluded. Neither the genetic over-expression nor the deficiency of STAT5 had any influence on the T-cell balance. The exact molecular mechanisms of Treg specific IL-2 protection remain unexplained. The influence of Zn2+ ions, Janus kinases and FoxO-family members will be discussed.
The underlying hypothesis that the specific death of conventional T cells is based on an increase in lysosomal membrane permeability (LMP), whereupon proapoptotic cathepsins are released into the cytosol and caspases lead to the induction of apoptosis could not be conclusively confirmed. However, it has been shown that inhibition of cathepsins slows down the death of conventional T cells in the absence of IL-2. A protection of Tconv cells by caspase inhibitors can only be achieved at high concentrations of the inhibitor ZVAD with simultaneously low Asm inhibitor concentrations. In summary, other forms of cell death besides apoptosis, such as ferroptosis induced by Asm inhibition, need to be considered.
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Besides lipid stress induced by Asm inhibition, the presence of hypoxic conditions favors the induction of cell death. Even the mere occurrence of hypoxia without the influence of Asm inhibitors leads to an increase in Treg frequency. Hypoxia-induced factor HIF-1α induces Foxp3 expression, promoting differentiation and suppressiveness of CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg cells. The influence of hypoxia possibly plays a decisive role especially in tumor therapy. HIF-1α stimulates hypoxic, non-vascularized tumor areas to neovascularize and slows down the own immune defense by increasing the frequency of regulatory T cells. A degradation of the transcription factor HIF-1α is therefore a therapeutic option in the therapy of solid tumors.
In conclusion, it can be stated that the relative frequency increase of regulatory T cells by Asm inhibition cannot be explained by apoptosis, but alternative explanation models such as ferroptosis must be considered. The protection of CD25+ regulatory T cells is based on the effect of IL-2 and is positively influenced by hypoxia. A precise identification of the mechanisms relevant for cell death is necessary to establish safe therapeutic measures in the context of infections and autoimmune diseases.
KW  - Sphingomyelinphosphodiesterase
KW  - Desipramin
KW  - Regulatorischer T-Lymphozyt
KW  - Sphingomyelinase
KW  - Desipramin
KW  - T-Zelle
KW  - Regulatorische T-Lymphozyt
Y1  - 2021
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-248351
ER  - 
TY  - THES
A1  - Vogtmann, Alexandra
T1  - Vergleichende Untersuchungen zur automatisierten Auswertung von Elispot-Platten mit verschiedenen Bildanalysesystemen
T1  - Quality of different image analysis systems for evaluation of the ELISPOT
N2  - Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, erstmals unterschiedliche automatisierte Bildanalysesysteme in der Auswertung von Elispot-Proben miteinander zu vergleichen. Neben dem Vergleich der Anzahl der gemessenen Spots, sollten die Zeit für die Messungen, die Genauigkeit, Richtigkeit und Präzision untersucht werden. Weiterhin sollten die Zuverlässigkeit der Messungen sowie die Einflussgrößen der einzelnen Bildanalysesysteme geprüft werden. Es wurden Elispotproben von verschiedenen Spezies (Maus und Human) und von verschiedenen unabhängigen Arbeitsgruppen verwendet. Die verglichenen Bildanalysesysteme bestanden aus den aufeinander abgestimmten Komponenten Mikroskop, Farbkamera, Motortisch mit Steuerung, Analysesoftware und Rechner. Sie unterschieden sich in ihren Mikroskopen, in der Anzahl der pro Well aufgenommenen Bilder und in der damit erreichten Bildpunktauflösung. Beim KS Elispot wurden im Auflichtmikroskop pro Well 12 Bilder über eine Farbkamera aufgenommen, die Bildpunktauflösung für ein 760x580 Pixel Bild eines Wells betrug 2.6µm. Beim KS Elispot compact 0.65-Zoom-Einstellung wurde im Stereomikroskop pro Well 1 Bild über eine Farbkamera aufgenommen und eine Bildpunktauflösung von 12µm erreicht. Beim KS Elispot 1.25-Zoom-Einstellung wurden im Stereomikroskop 4 Bilder pro Well über eine Farbkamera erstellt, die Bildpunktauflösung betrug 6µm. Im Bezug auf den Faktor Zeit war das KS Elispot compact dem KS Elispot deutlich überlegen. Bei Verwendung eines Bildes pro Well bzw. 4 Bildern pro Well wertete das KS Elispot compact eine komplette 96-Well-Mikrotiterplatte bis zu 6 Mal schneller bzw. mindestens doppelt so schnell aus wie das KS Elispot. Die hohe Auflösung des KS Elispot resultiert in einer langen Auswertungszeit der einzelnen Platten. Werden große Mengen von Elispot-Proben ausgewertet, so bietet das KS Elispot compact aufgrund seiner kürzeren Messzeiten eine deutliche Ersparnis an Zeit und damit gegenüber dem KS Elispot unter diesem Gesichtspunkt einen entscheidenden Vorteil. Die Variabilität der Messungen lag bei allen Systemen niedrig, ohne nennenswerte Unterschiede zwischen den Systemen. Die höchste Zuverlässigkeit bei der Spoterkennung konnte für das System KS Elispot nachgewiesen werden. Es erkannte nahezu alle echten Spots und mehr echte Spots als das KS Elispot compact. Das KS Elispot wies im Gegensatz zum KS Elispot compact keine falsch-positiven Spots auf. Bei Verwendung von 4 Bildern pro Well arbeitete das KS Elispot compact zuverlässiger als bei Erstellung von nur einer Aufnahme pro Well: der Anteil an falsch-positiven Spots am Ergebnis sank und der Anteil der richtig erkannten Spots stieg. Die Werte lagen jedoch immer noch unterhalb der Ergebnisse, die das KS Elispot erzielt hatte. Das KS Elispot compact erkannte grundsätzlich in denselben Wells weniger Spots als das KS Elispot, das der tatsächlichen Anzahl der Spots am nächsten kam. Bei Verwendung von nur einer Aufnahme pro Well identifizierte das KS Elispot compact deutlich weniger Spots als bei Aufnahme von 4 Bildern pro Well. Die deutlichsten Unterschiede zwischen den beiden Systemen KS Elispot und KS Elispot compact wurden bei der Messung durch das KS Elispot compact mit einem Bild pro Well bei Spotzahlen über 100 bei Mausspots und über 400 bei Humanspots gesehen. Die zwischen dem KS Elispot und dem KS Elispot compact nachgewiesenen Unterschiede waren bei kleinen Spots (bis 100µm) deutlich größer als bei Spots größerer Durchmesser. Der Vergleich der Systeme erbrachte, dass das hochauflösende KS Elispot eine bessere Auswertungsqualität als das KS Elispot compact bietet, insbesondere bei der Auswertung von Elispot-Proben, die sehr viele und zudem sehr kleine Spots enthielten. Beim KS Elispot compact war die Messung mit 4 Bildern pro Well der Auswertung mit nur einem Bild pro Well bezüglich der Zuverlässigkeit klar überlegen. Bei Verwendung des KS Elispot compact sollte deshalb bei sehr kleinen Spots zumindest die mit 4 Bildern pro Well arbeitende Einstellung gewählt werden. Weiterhin ist zu bemerken, dass eine optimale Auswertung von Elispot-Proben durch automatisierte Reader-Systeme maßgeblich durch die Präparation der verwendeten Elispot-Proben und die daraus resultierende Qualität der Spots beeinflusst wird. Zahlreiche Artefakte, eine starke Untergrundfärbung oder nicht deutlich ausgebildete typische Spotmerkmale können die Messergebnisse eines Systems beeinträchtigen. Hierbei wurde das KS Elispot compact System stärker beeinflusst als das KS Elispot System. In dieser Arbeit konnte nachgewiesen werden, dass die Auswertung der Elispot-Proben und damit die gewonnenen Ergebnisse von dem verwendeten, automatisierten Lesesystem abhängen.Die Arbeit unterstreicht den hohen Stellenwert der Standardisierung, Validierung und Optimierung aller Komponenten der Elispot-Methode. Dies ist auch gerade in Bezug auf die Weiterentwicklung dieser Technik und die Eröffnung von weiteren Einsatzspektren unerlässlich.
N2  - Enzyme Linked Immuno Spot assay (ELISPOT) is currently the first choice for the immune monitoring of patients in clinical vaccination trials with cancer or chronic viral infections. The capacity to identify antigen-specific T- or B-cells ex vivo without prolonged prestimulation in vitro in frequencies as low as 1/106 PBMC makes this technique so attractive. Many scientists work in optimizing and standardizing of this assay for more sensitivity, reproducibility, accuracy and transferability of this method. However, there remains a need for the quality and validation assessment of the different Elispot evaluation methods. Automated evaluation is superior for the counting by eye approach as presenting more accurate and reliable results with less variability. By now, several automated image analysis systems have been developed for the evaluation of Elispot plates. They mainly differ in the reader unit acquiring images with different resolutions and in the equipped software packages with different adjustments for spot definition (users’ setting). We compared 2 image-analysis systems with low and high resolution using the KS Elispot and the KS Elispot compact (both Carl Zeiss, Microscopy, Halldergmoos, Germany). The KS Elispot (R1) scans the spots with a colour camera on a microscope with incident light (Zeiss Axioplan 2) acquiring at least 12 images per well (resolution between 2.0 and 2.5 per pixel). The KS Elispot compact reads the spots with a colour camera on a stereo microscope (Zeiss, Stemi 2000C) acquiring one image per well (R2) or 4 images per well (R3). Images in both systems are digitized using 24-bit colour resolution and are evaluated by the KS Elispot software. We evaluated 3 human and 4 mouse 96-well-microtiter-plates of g-IFN-Elispot with brownish-stained spots. Statistic analysis was done using Bland-Altman-plots. Numbers of spots ranges from 0-900 spots per well in plates with human and from 0-250 spots per well in plates with mouse spots with a spot size range from 20-300µm (75% of mouse spots within 20-100µm). R1 measures higher numbers of human and mouse spots. Identification and, therefore, number of spots are more reliable evaluated by R1 than by R2 or R3. In spot numbers over 400 (human) and over 100 (mouse) R2 counts less spots per well than R3. Conclusions: KS Elispot compact evaluates at least 3 times faster than KS Elispot, numbers of spots measured by KS Elispot are more reliable than measured by KS Elispot compact, KS Elispot detects more human and mouse spots than KS Elispot compact, KS Elispot compact counts higher and more reliable number of spots when acquiring 4 images per well compared to 1 image per well, noticeably, in spot numbers over 400 (human) and over 100 (mouse) per well, for evaluation of small spots (20-50µm) at least 4 images per well should be acquired.
KW  - Elispot
KW  - T-Zelle
KW  - Zytokine
KW  - Immunmonitoring
KW  - Bildanalyse
KW  - Elispot
KW  - T-Cells
KW  - immunmonitoring
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18395
ER  -