TY  - THES
A1  - Hassold, Nicole
T1  - Dasatinib moduliert Effektorfunktionen Natürlicher Killerzellen über Einflüsse auf die Signaltransduktion und CD16-Regulation
T1  - Dasatinib modulates Natural Killer Cell Effector Functions by Influencing Signal Transduction and CD16-Regulation
N2  - NK-Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Erkennung und Eliminierung von virusinfizierten Zellen aber vor allem auch von Tumorzellen. Neue Therapieformen wie die autologe NK-Zell-Therapie versuchen sich diese Eigenschaften der NK-Zellen zu Nutze zu machen. Allerdings zeigten diese Methoden bisher nur mäßige Erfolge. Als weitere Strategie wäre die direkte Modulation der NK-Zellen denkbar. Dasatinib ist ein potenter Inhibitor einer Vielzahl von Kinasen, welche maßgeblich an der Vermittlung und Regulation von NK-Zell-Effektorfunktionen beteiligt sind. Bisher ist einerseits eine unmittelbare Inhibition der NK-Zell-Funktionen in Gegenwart von Dasatinib beschrieben, andererseits finden sich aber in klinischen Studien Hinweise auf eine Erhöhung der anti-leukämischen NK-Zell-Aktivität bei mit Dasatinib behandelten Patienten. Um ein besseres Verständnis dieser differenten Effekte zu erlangen, wurden im Rahmen dieser Arbeit neben der Zytotoxizität, Degranulation und Zytokinproduktion auch die möglichen Dasatinib-Einflüsse auf NK-Zell-Rezeptoren sowie auf molekularer Ebene die Einflüsse auf Signalmoleküle untersucht. Während in Gegenwart von Dasatinib eine Inhibition der NK-Zell-Effektorfunktionen gezeigt werden konnte, wurde nach 24 h Vorbehandlung eine signifikante Steigerung der Zytotoxizität gegenüber Daudi-Lymphomzellen als auch eine Zunahme der Zytokinproduktion und NK-Zell-Degranulation beobachtet. Diese aktivierenden Effekte waren unabhängig von der MHC-Klasse-I-Expression der Zielzellen nachweisbar. Während die Expression der NK-Rezeptoren NKG2D und LFA-1 durch Dasatinib nicht beeinflusst wurde, wurde CD16 nach der Stimulation mit K562- oder Daudi-Zellen auf Dasatinib- vorbehandelten NK-Zellen schneller herunterreguliert. Auf Proteinebene wurde die Phosphorylierung von Tyrosinresten, insbesondere auch von Lck, welches in der frühen Signaltransduktion von NK-Zellen eine wichtige Rolle spielt, in Gegenwart von Dasatinib inhibiert, während sich nach 24 h Vorbehandlung und nach Stimulation mit Zielzellen kaum Unterschiede im Phosphorylierungsniveau von p38, Akt und Erk zwischen unbehandelten und Dasatinb-behandelten NK-Zellen finden ließen. Zum Teil führte die Vorbehandlung sogar zu einer leichten Erhöhung der Phosphorylierung der Signalmoleküle Akt und Vav. Insgesamt scheint die Erhöhung der NK-Zell-Aktivität in erster Linie ein Reboud-Effekt zu sein. Die Ergebnisse der funktionellen Untersuchungen verdeutlichen die Wichtigkeit des Zeitpunktes der Dasatinib-Gabe um sich die immunmodulatorischen Effekte dieses Medikaments in der Lymphom bzw. Leukämietherapie zu Nutze zu machen.
N2  - NK cells play an important role in recognition and elimination of virally infected and malignant cells. New therapeutic approaches like autologous NK-cell therapy try to take advantage of these NK cell properties. However only moderate results could be achieved by this method. Direct modulation of NK-cells might be an alternative strategy. Dasatinib is a potent inhibitor of numerous kinases involved in transmission and regulation of NK-cell effector functions. Direct inhibition of NK –cell function in the presence of dasatinib has been described on the one hand, but on the other hand clinical trials give evidence of increased antileukaemic NK-cell activity in dasatinib treated patients. To elucidate theses opposing effects cytotoxicity, degranulation and cytokine production as well as possible influences on NK-cell receptors and signaling molecules were studied. While inhbition of NK-cell function could be shown in the presence of dasatinib, 24 h pre-treatment resulted in significant increase in cytotoxicity against Daudi lymphoma cells, cytokine production and NK-cell degranulation. These activating effects did not depend on MHC-class-I expression on target cells. While dasatinib had no influence on the expression of the NK-cell receptors NKG2D and LFA-1, downregulation of CD16 on dasatinib pre-treated NK-cells was accelerated after stimulation with K562 or Daudi cells. Phosphorylation of tyrosine residues, especially LCK, which plays an important role in early NK-cell signaling, was inhibited in the presence of dasatinib, but hardly any differences in the phosphorylation of p38, Akt and Erk could be observed when 24 h pre-treated NK cells were stimulated with target cells. A slight increase in phosphorylation levels of Akt and Vav was achieved by dasatinib pre-treatment. Altogether, the observed enhancement of NK-cell activity argues for a potential rebound effect. The results of the functional assays emphasize the importance of accurate scheduling of dasatinib doses to take advantage of its immunmodulatory effects in therapies against leukaemia and lymphoma.
KW  - Natürliche Killerzelle
KW  - Protein-Tyrosin-Kinasen
KW  - Dasatinib
KW  - NK cells
KW  - dasatinib
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66927
ER  - 
TY  - THES
A1  - Seystahl, Katharina Gertrud
T1  - Einfluss von Dasatinib auf die Expansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion von humanen Natürlichen Killer-Zellen
T1  - The impact of dasatinib on expansion, cytotoxicity and cytokine production of human Natural Killer cells
N2  - NK-Zellen spielen eine wichtige Rolle im menschlichen Immunsystem, insbesondere durch die Zerstörung von virusinfizierten Zellen und Tumorzellen sowie durch die Produktion von Zytokinen. Eine gezielte Modulation der Effektorfunktionen von NK-Zellen kann den Weg für neue Therapiestrategien gegenüber malignen Erkrankungen oder auch Autoimmunerkrankungen bahnen. Dasatinib ist ein potenter Inhibitor einer Vielzahl von Kinasen, die an der Regulation von NK-Zelleffektorfunktionen beteiligt sind und für die bereits eine Inhibition von T-Zelleffektorfunktionen gezeigt werden konnte [Schade et al. 2008; Weichsel et al. 2008]. Ein besseres Verständnis der immunmodulatorischen Eigenschaften von Dasatinib kann nicht nur neue Einsatzbereiche identifizieren, sondern auch die bereits bewährte Therapie der CML optimieren. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von Dasatinib auf die Expansion, Zytotoxizität und Zytokinproduktion von humanen NK-Zellen analysiert. Dazu wurden aus peripheren Blutlymphozyten gesunder Spender polyklonale NK-Zellen in Kokultur mit bestrahlten RPMI 8866-Zellen mit und ohne Dasatinib expandiert und NK-Zelleffektorfunktionen mit Durchfluszytometrie-basierten Experimenten untersucht. Im Detail wurde die Zytotoxizität nach dem Prinzip des FATAL-Experiments [Sheehy et al. 2001], die Degranulationsaktivität über die Expression von CD107a/b, die Produktion von TNF-α bzw. IFN-γ mit einer intrazellulären Färbung und die Apoptose- und Zelltodanalyse über Annexin-V und 7-AAD gemessen. Die Daten dieser Arbeit zeigen, dass Dasatinib die Haupteffektorfunktionen von NK-Zellen gesunder Blutspender in vitro reguliert: Die Expansionskapazität von NK-Zellen wird dosisabhängig und bei 50 nM Dasatinib vollständig inhibiert, ohne dass dies durch ein Absterben der NK-Zellen bedingt ist. Die Zytotoxizität von NK-Zellen, die unter 10 nM Dasatinib expandiert sind, ist nach Entfernen des Medikamentes restauriert, und die Degranulationskapazität und die Zytokinproduktion sind gesteigert. Bei unbehandelt expandierten NK-Zellen führt die direkte Anwesenheit von Dasatinib zu einer dosisabhängigen Hemmung der Zytotoxizität gegenüber K562-Zellen. Darüber hinaus inhibiert Dasatinib dosisabhängig die Degranulation und Zytokinproduktion von NK-Zellen bei einer Stimulation mit K562-Zellen nicht aber bei einer Stimulation mit PMA/Ca2+Ionophor. Eine indirekte Veränderung des Lyseverhaltens der NK-Zellen durch Effekte von Dasatinib auf die K562-Zellen zeigt sich nicht nach 4h, aber nach 24h im Sinne einer erhöhten Spontanlyse, aber geringeren spezifischen Lyse. Eine 24h-Vorbehandlung von K562-Zellen mit Dasatinib führt außerdem zu einer verminderten Degranulationsaktivität und Zytokinproduktion von unbehandelten NK-Zellen. Die Hemmung der NK-Zelleffektorfunktionen bei direkter Anwesenheit von Dasatinib und deren Restauration respektive Steigerung nach Entfernen des Medikaments ist am ehesten auf eine reversible Inhibition von Src-Kinase-abhängigen Prozessen der intrazellulären Signalübertragung zurückzuführen. Eine kompromittierte NK-Zellfunktion könnte während einer Behandlung mit Dasatinib zu einer Verminderung der Infektabwehr und der immunologischen Tumorüberwachung führen. Möglicherweise lassen sich jedoch die unerwünschten Wirkungen durch ein verändertes Dosisregime, wie eine Hochdosispulstherapie, bei guter Therapieeffizienz minimieren. Eine supprimierte Aktivität der NK-Zellen durch Dasatinib könnte dagegen bei der Therapie von NK-Zelllymphomen oder auch von Autoimmunerkrankungen eine neue Behandlungsoption darstellen. Aufgrund der bereits bekannten inhibitorischen Wirkung auf T-Zellfunktionen gibt es dabei möglicherweise Synergien in der immunsuppressiven Wirkung. Das immunmodulatorische Potential von Dasatinib birgt daher große Chancen sowohl im Einsatz als Immunsuppressivum, als auch in der Optimierung der bereits bewährten Therapie der CML.
N2  - NK cells play an important role in the human immune system, especially by the lysis of virally infected cells and tumor cells, but also by the production of cytokines. Modulating NK cell effector functions may help to identify new strategies in the therapy of cancer or autoimmune diseases. Dasatinib is a potent inhibitor of multiple kinases regulating NK cell effector functions and the drug was already shown to inhibit T cell effector functions. A better understanding of the modulatory effect of dasatinib on the immune system may not only identify new applications of the drug but may also help to improve the current therapy of chronic myelogenous leukemia. Thus, the impact of dasatinib on the expansion, cytotoxicity and cytokine production of human NK cells was analyzed in this thesis. NK cells from healthy human blood donors were expanded by co-culturing irradiated RPMI 8866 cells with and without dasatinib. NK cell effector functions have been examined by flow cytometry. Cytotoxicity was analyzed by a FATAL-based experiment, degranulation activity by CD107a/b expression, TNF-α and IFN-γ production by intracellular staining and viability by Annexin V and 7-AAD. The data of this work show that dasatinib regulates the main NK cell effector functions of healthy blood donors in vitro. Expansion of NK cells is dose-dependently inhibited, including a complete inhibition at 50 nM dasatinib, which is not due to a decreased viability of NK cells. After removing the drug, cytotoxicity of NK cells being expanded at 10 nM dasatinib is restored while degranulation and cytokine production are increased. When no drug is present during expansion, dasatinib inhibits NK cell cytotoxicity against K562 cells in a dose-dependent manner. Furthermore, dasatinib leads to a dose-dependent inhibition of degranulation and cytokine production of NK cells after stimulation by K562 cells but not after stimulation by PMA/Ca2+Ionophor. Indirect effects of dasatinib on NK cell cytotoxic activity by an impairment of K562 cells is not detected after 4h, but after 24h showing an increased spontaneous lysis but a decreased specific lysis. 24h-pretreating of K562 cells with dasatinib decreases degranulation and cytokine production of untreated NK cells. The inhibition of NK cell effector functions by direct presence of dasatinib and their restoration or enhancement after removing the drug are most likely due to a reversible inhibition of SRC-kinase dependent processes during intracellular signal transduction. An impaired NK cell function during the treatment with dasatinib might alter immune defense or tumor immunosurveillance. However, adverse effects could also be reduced by a high-dose pulse therapy with an equal anti-tumor efficacy. Suppressing NK cell activity by dasatinib might also be helpful in the therapy of NK cell lymphomas or autoimmune diseases. As an inhibitory effect was already shown on T cell functions, there might be a synergistic action regarding the immunosuppressive effect. The potential of dasatinib is promising not only as an immunosuppressant but also by improving the current therapy of chronic myelogenous leukemia.
KW  - Natürliche Killerzelle
KW  - Protein-Tyrosin-Kinasen
KW  - Cytotoxizität
KW  - dasatinib
KW  - NK cells
KW  - dasatinib
KW  - cytotoxicity
Y1  - 2010
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51843
ER  -