TY - THES A1 - Horn, Hannes T1 - Analysis and interpretation of (meta-)genomic data from host-associated microorganisms T1 - Analyse und Interpretation von (meta-)genomischen Daten aus Wirt-assoziierten Mikroorganismen N2 - Host–microbe interactions are the key to understand why and how microbes inhabit specific environments. With the scientific fields of microbial genomics and metagenomics, evolving on an unprecedented scale, one is able to gain insights in these interactions on a molecular and ecological level. The goal of this PhD thesis was to make (meta–)genomic data accessible, integrate it in a comparative manner and to gain comprehensive taxonomic and functional insights into bacterial strains and communities derived from two different environments: the phyllosphere of Arabidopsis thaliana and the mesohyl interior of marine sponges. This thesis focused first on the de novo assembly of bacterial genomes. A 5–step protocol was developed, each step including a quality control. The examination of different assembly software in a comparative way identified SPAdes as most suitable. The protocol enables the user to chose the best tailored assembly. Contamination issues were solved by an initial filtering of the data and methods normally used for the binning of metagenomic datasets. This step is missed in many published assembly pipelines. The described protocol offers assemblies of high quality ready for downstream analysis. Subsequently, assemblies generated with the developed protocol were annotated and explored in terms of their function. In a first study, the genome of a phyllosphere bacterium, Williamsia sp. ARP1, was analyzed, offering many adaptions to the leaf habitat: it can deal with temperature shifts, react to oxygen species, produces mycosporins as protection against UV–light, and is able to uptake photosynthates. Further, its taxonomic position within the Actinomycetales was infered from 16S rRNA and comparative genomics showing the close relation between the genera Williamsia and Gordonia. In a second study, six sponge–derived actinomycete genomes were investigated for secondary metabolism. By use of state–of–the–art software, these strains exhibited numerous gene clusters, mostly linked to polykethide synthases, non–ribosomal peptide synthesis, terpenes, fatty acids and saccharides. Subsequent predictions on these clusters offered a great variety of possible produced compounds with antibiotic, antifungal or anti–cancer activity. These analysis highlight the potential for the synthesis of natural products and the use of genomic data as screening toolkit. In a last study, three sponge–derived and one seawater metagenomes were functionally compared. Different signatures regarding the microbial composition and GC–distribution were observed between the two environments. With a focus on bacerial defense systems, the data indicates a pronounced repertoire of sponge associated bacteria for bacterial defense systems, in particular, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, restriction modification system, DNA phosphorothioation and phage growth limitation. In addition, characterizing genes for secondary metabolite cluster differed between sponge and seawater microbiomes. Moreover, a variety of Type I polyketide synthases were only found within the sponge microbiomes. With that, metagenomics are shown to be a useful tool for the screening of secondary metabolite genes. Furthermore, enriched defense systems are highlighted as feature of sponge-associated microbes and marks them as a selective trait. N2 - Mikroben–Wirt Interaktionen sind der Schlüssel, um zu verstehen “Wie?” und “Warum?” Mikroben in bestimmten Umgebungen vorkommen. Mithilfe von Genomik und Metagenomik lassen sich Einblicke auf dem molekularen sowie ökolgischen Level gewinnen. Ziel dieser Arbeit war es, diese Daten zugänglich zu machen und zu vergleichen, um Erkenntnisse auf taxonomischer und funktionaler Ebene in bakterielle Isolate und bakterielle Konsortien zu erhalten. Dabei wurden Daten aus zwei verschiedenen Umgebungen erhoben: der Phyllosphäre von Arabidopsis thaliana und aus der Mesohyl–Matrix mariner Schwämme. Das Ziel war zunächst, bakterieller Genome denovo zu assemblieren. Dazu wurde ein Protokoll, bestehend aus 5 Schritten, entwickelt. Durch Verwendung verschiedener Soft- ware zum Assemblieren konnte SPAdes als am besten geeignet für die gegebenen Daten herausgearbeitet werden. Durch anfängliches Filtern der Daten konnte erste Kontamina- tion entfernt werden. Durch das Anwenden weiterer Methoden, welche ursprünglich für metagenomische Datensätze entwickelt wurden, konnten weitere Kontaminationen erkannt und von den “echten” Daten getrennt werden. Ein Schritt, welcher in den meisten pub- lizierten Assembly–Pipelines fehlt. Das Protokoll ermöglicht das Erstellen hochqualitativer Assemblies, welche zur weiteren Analyse nicht weiter aufbereitet werden müssen. Nachfolgend wurden die generierten Assemblies annotiert. Das Genom von William- sia sp. ARP1 wurde untersucht und durch dessen Interpretation konnten viele Anpassungen an die Existenz in der Phyllosphäre gezeigt werden: Anpassung an Termperaturveränderun- gen, Produktion von Mycosporinen als Schutz vor UV–Strahlung und die Möglichkeit, von der Pflanze durch Photosynthese hergestellte Substanzen aufzunehmen. Seine taxonomische Position wurde aufgrund von 16S rRNA sowie vergleichende Genomik bestimmt. Dadurch konnte eine nahe Verwandtschaft zwischen den Gattungen Williamsia und Gordonia gezeigt werden. In einer weiteren Studie wurden sechs Actinomyceten–Genome, isoliert aus Schwämmen, hinsichtlich ihres Sekundärmetabolismus untersucht. Mihilfe moderner Software konnten in zahlreiche Gen–Cluster identifiziert werden. Zumeist zeigten diese eine Zugehörigkeit zu Polyketidsynthasen, Nichtribosomalen Peptidsynthasen, Terpenen, Fettsäuren oder Sac- chariden. Durch eine tiefere Analyse konnten die Cluster mit chemischen Verbindungen assoziiert werden, welche antibakterielle oder fungizide Eigenschaften besitzen. In der letzten Untersuchung wurden Metagenome von drei Schwämmen sowie Meerwasser auf funktioneller Ebene verglichen. Beobachtet wurden Unterschiede in deren mikrobiellen Konsortien und GC–Gehalt. Schwamm–assoziierte Bakterien zeigten ein ausgeprägtes Inventar an Verteidigungsmechanismen gegenüber deren Vertretern aus dem Meerwasser. Dies beinhaltete vor allem: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats, das Restriktions-Modifikationssystem, DNA Phosphorothioation, oder Gene, welche das Wachstum von Phagen hemmen können. Gene für Sekundärmetabolite waren zwischen Schwamm– und Meerwasser–Metagenomen unterschiedlich stark ausgeprägt. So konnten Typ I Polyketidsynthasen ausschließlich in den Schwamm–Metagenomen gefunden werden. Dies zeigt, dass metagenomische Daten ebenso wie genomische Daten zur Untersuchung des Sekundärmetabolismus genutzt werden können. Des Weiteren zeigt die Anhäufung an Verteidigungsmechanismen eine Anpassung von Schwamm–assoziierten Mikroben an ihre Umgebung und ist ein Hinweis auf deren mögliche selektive Eigenschaft. KW - Bakterien KW - Meeresschwämme KW - Metagenom KW - Phyllosphäre KW - Ackerschmalwand KW - Metagenomics KW - Genomics KW - Phyllosphere KW - Sponges KW - Bacteria KW - Deep sequencing KW - Arabidopsis thaliana KW - Bioinformatics Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152035 ER - TY - THES A1 - Seltmann, Martin Alexander T1 - Bildung und Funktion von Jasmonaten während Seneszenz-Prozessen in Arabidopsis thaliana T1 - Formation an Function of Jasmonates during Senescence-Processes in Arabidopsis thaliana N2 - Jasmonsäure und verwandte Oxylipine wurden bisher als Substanzen, die an der Regulation von Initialisierung und Progression der Blattseneszenz beteiligt sein sollen, kontrovers diskutiert. Bisherige Studien haben sich dabei auf die exogene Applikation von Jasmonaten oder die Messung endogener Spiegel beschränkt. Um die Funktion von Jasmonaten in der Seneszenz-Regulation zu klären, wurden in dieser Arbeit die Profile freier und membranveresterter Oxylipine sowie die Auswirkungen verminderter Oxylipinbildung während der natürlichen Seneszenz und Seneszenz-ähnlicher Prozesse induziert durch Dunkel- und Sorbitol-Inkubation in Blättern von Arabidopsis thaliana untersucht. Jasmonsäure sowie freie 12-Oxo-Phytodiensäure steigen während dieser drei Prozesse an, mit dem stärksten Anstieg von Jasmonsäure nach Dunkelinkubation. Eine deutliche Akkumulation membranveresterter Oxylipine (Arabidopside) konnte lediglich nach Flottierung auf Sorbitol festgestellt werden. Die Mengen an plastidären Mono- und Digalaktosyl-Diacylglycerolen verringerten sich jedoch während der Behandlungen bzw. im Verlauf der Alterung. Zur Untersuchung möglicher Funktionen ansteigender Jasmonat-Konzentrationen wurden Lipoxygenase 2 RNAi-Pflanzen konstruiert, welche basal Jasmonsäure und 12-Oxo-Phytodiensäure produzieren können, jedoch keinen Anstieg während Seneszenz- bzw. Stress-Prozessen zeigen. Die Gehalte an Chlorophyll und Membranlipiden sowie die Genexpression entwicklungsspezifischer Seneszenzmarker waren während der natürlichen und der dunkelinduzierten Seneszenz in diesen Pflanzen nicht verändert. Dies legt nahe, dass diese Oxylipine im Verhältnis zu anderen endogenen Faktoren keine bzw. nur geringe Wirkungen auf die Seneszenz-Progression haben. Aus den gemachten Beobachtungen kann vielmehr geschlossen werden, dass bei diesen Prozessen die Akkumulation von Jasmonaten eher die Folge eines veränderten Lipid-Metabolismus als ein Auslöser der Seneszenz ist. Im Gegensatz dazu zeigen die Lipoxygenase 2 RNAi-Linien eine verlangsamte Seneszenz nach Sorbitol-Behandlung. Ähnlich verhält sich die Allenoxid-Synthase Mutante dde2-2, die zwar 13-Lipoxygenase-Produkte aber keine Jasmonate bilden kann. Dies bedeutet, dass die Jasmonate und nicht andere 13-Lipoxygenase-Produkte für die Seneszenz-ähnlichen Symptome unter diesen Bedingungen verantwortlich sind. Dabei stellt die Sorbitol-induzierte Seneszenz einen Stress-Prozess dar, der sich in vielen Punkten von der natürlichen Seneszenz unterscheidet aber große Ähnlichkeiten zur Seneszenz-Induktion nach exogener Jasmonat-Applikation aufweist. Lipoxygenase 2 ist also durch die Bereitstellung von Oxylipinen weniger in Entwicklungs- als vielmehr in Stress-Prozesse involviert. N2 - Jasmonic acid and related oxylipins have been controversely discussed to be involved in regulating the initiation and progression of leaf senescence. Present studies mostly focus on exogenous application of jasmonates or measurements of endogenous levels. To this end we analysed profiles of free and esterified oxylipins during natural senescence and upon induction of senescence-like phenotypes by dark treatment and flotation on sorbitol in Arabidopsis thaliana. Jasmonic acid and free 12-oxo-phytodienoic acid increased during all three processes with the strongest increase of jasmonic acid after dark treatment. Arabidopside content did only increase considerably in response to sorbitol treatment. Mono- and digalactosyldiacylglycerols decreased during these treatments and aging. Lipoxygenase 2 RNAi plants were generated which produce basal levels of jasmonic acid and 12-oxo-phytodienoic acid but do not exhibit accumulation during natural senescence or upon stress treatment. Chlorophyll loss, degradation of membrane lipids as well as expression of senescence markergenes during aging and upon dark incubation was not altered suggesting that these oxylipins are less or not involved in regulating these processes in comparison to other endogenous factors. From these observations it could be further concluded, that jasmonate accumulation in those processes is rather a result of altered lipid metabolism than a promoter of senescence. In contrast, lipoxygenase 2 RNAi lines and the allene oxid synthase deficient mutant dde2-2 were less sensitive to sorbitol treatment than the wild type. This indicates that jasmonates but not other 13-lipoxygenase products are responsible for senescence-like symptoms. Furthermore sorbitol-induced senescence represents a stress-related process, which is similar to senescence processes induced by exogenous jasmonate application but rather than to natural developmental processes. To this end lipoxygenase 2 is rather involved in stress-related processes by providing oxylipins than in developmental functions. KW - Ackerschmalwand KW - Jasmonate KW - Altern KW - Schmalwand KW - Lipide KW - Lipidstoffwechsel KW - Oxylipine KW - Lipoxyg KW - Senescence KW - Jasmonates KW - Lipids KW - Oxylipins KW - Lipoxygenase Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51563 ER - TY - THES A1 - Dindas, Julian T1 - Cytosolic Ca\(^2\)\(^+\), a master regulator of vacuolar ion conductance and fast auxin signaling in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Zytosolisches Ca\(^2\)\(^+\), ein zentraler Regulator der vakuolären Ionenleitfähigkeit und der schnellen Auxin-Signaltransduktion in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Das Phytohormon Auxin erfüllt wichtige Funktionen bei der Initiierung von pflanzlichen Geweben und Organen, wie auch in der Steuerung des Wurzelwachstums im Zusammenspiel mit äußeren Reizen wie Schwerkraft, Wasser- und Nähstoffverfügbarkeit. Diese Funktionen basieren dabei vor allem auf der Auxin-abhängigen Regulation von Zellteilung und -streckung. Wichtig für letzteres ist dabei die Kontrolle des Zellturgors durch die Vakuole. Als Speicher für Nährstoffe, Metabolite und Toxine sind Vakuolen von essentieller Bedeutung. Vakuolär gespeicherte Metabolite und Ionen werden sowohl über aktive Transportprozesse, als auch passiv durch Ionenkanäle, über die vakuoläre Membran mit dem Zytoplasma ausgetauscht. In ihrer Funktion als second messenger sind Kalziumionen wichtige Regulatoren, aber auch Gegenstand vakuolärer Transportprozesse. Änderungen der zytosolischen Kalziumkonzentration wirken nicht nur lokal, sie werden auch mit einer Signalweiterleitung über längere Distanzen in Verbindung gebracht. Im Rahmen dieser Arbeit wurden elektrophysiologische Methoden mit bildgebenden Methoden kombiniert um Einblicke in das Zusammenspiel zwischen zytosolischen Kalziumsignalen, vakuolärer Transportprozesse und der Auxin-Physiologie im intakten pflanzlichen Organismus zu gewinnen. Kalziumsignale sind an der Regulierung vakuolärer Ionenkanäle und Transporter beteiligt. Um dies im intakten Organismus zu untersuchen wurden im Modellsystem junger Wurzelhaare von Arabidopsis thaliana Messungen mit intrazellulären Mikroelektroden durchgeführt. Mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemm-Technik konnte bestätigt werden, dass die vakuoläre Membran der limitierende elektrische Wiederstand während intravakuolärer Messungen ist und so gemessene Ionenströme in der Tat nur die Ströme über die vakuoläre Membran repräsentieren. Die bereits bekannte zeitabhängige Abnahme der vakuolären Leitfähigkeit in Einstichexperimenten konnte weiterhin mit einer einstichbedingten, transienten Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration korreliert werden. Durch intravakuoläre Spannungsklemmexperimente in Wurzelhaarzellen von Kalziumreporterpflanzen konnte dieser Zusammenhang zwischen vakuolärer Leitfähigkeit und der zytosolischen Kalziumkonzentration bestätigt werden. Die Vakuole ist jedoch nicht nur ein Empfänger zytosolischer Kalziumsignale. Da die Vakuole den größten intrazellulären Kalziumspeicher darstellt, wird seit Langem diskutiert, ob sie auch an der Erzeugung solcher Signale beteiligt ist. Dies konnte in intakten Wurzelhaarzellen bestätigt werden. Änderungen des vakuolären Membranpotentials wirkten sich auf die zytosolische Kalziumkonzentration in diesen Zellen aus. Während depolarisierende Potentiale zu einer Erhöhung der zytosolischen Kalziumkonzentration führten, bewirkte eine Hyperpolarisierung der vakuolären Membran das Gegenteil. Thermodynamische Überlegungen zum passiven und aktiven Kalziumtransport über die vakuoläre Membran legten dabei den Schluss nahe, dass die hierin beschriebenen Ergebnisse das Verhalten von vakuolären H+/Ca2+ Austauschern wiederspiegeln, deren Aktivität durch die protonenmotorische Kraft bestimmt wird. Im Rahmen dieser Arbeit stellte sich weiterhin heraus, dass zytosolisches Kalzium ebenso ein zentraler Regulator eines schnellen Auxin-induzierten Signalweges ist, über den der polare Transport des Hormons reguliert wird. Im gleichen Modellsystem junger Wurzelhaare konnte gezeigt werden, dass die externe Applikation von Auxin eine sehr schnelle, Auxinkonzentrations- und pH-abhängige Depolarisation des Plasmamembranpotentials zur Folge hat. Synchron zur Depolarisation des Plasmamembranpotentials wurden im Zytosol transiente Kalziumsignale registriert. Diese wurden durch einen von Auxin aktivierten Einstrom von Kalziumionen durch den Ionenkanal CNGC14 hervorgerufen. Experimente an Verlustmutanten als auch pharmakologische Experimente zeigten, dass zur Auxin-induzierten Aktivierung des Kalziumkanals die Auxin-Perzeption durch die F-box Proteine der TIR1/AFB Familie erforderlich ist. Durch Untersuchungen der Auxin-abhängigen Depolarisation wie auch des Auxin-induzierten Einstroms von Protonen in epidermale Wurzelzellen von Verlustmutanten konnte gezeigt werden, dass die sekundär aktive Aufnahme von Auxin durch das hochaffine Transportprotein AUX1 für die schnelle Depolarisation verantwortlich ist. Nicht nur die zytosolischen Kalziumsignale korrelierten mit der CNGC14 Funktion, sondern ebenso die AUX1-vermittelte Depolarisation von Wurzelhaaren. Eine unveränderte Expression von AUX1 in der cngc14 Verlustmutante legte dabei den Schluss nahe, dass die Aktivität von AUX1 posttranslational reguliert werden muss. Diese Hypothese erfuhr Unterstützung durch Experimente, in denen die Behandlung mit dem Kalziumkanalblocker Lanthan zu einer Inaktivierung von AUX1 im Wildtyp führte. Die zytosolische Beladung einzelner epidermaler Wurzelzellen mit Auxin hatte die Ausbreitung lateraler und acropetaler Kalziumwellen zur Folge. Diese korrelierten mit einer Verschiebung des Auxin-Gradienten an der Wurzelspitze und unterstützten somit eine hypothetische Kalziumabhängige Regulation des polaren Auxin Transports. Ein Model für einen schnellen, Auxin induzierten und kalziumabhängigen Signalweg wird präsentiert und dessen Bedeutung für das gravitrope Wurzelwachstum diskutiert. Da die AUX1-vermittelte Depolarisation in Abhängigkeit von der externen Phosphatkonzentration variierte, wird die Bedeutung dieses schnellen Signalwegs ebenso für die Anpassung des Wurzelhaarwachstums an eine nicht ausreichende Verfügbarkeit von Phosphat diskutiert. N2 - The phytohormone auxin performs important functions in the initiation of plant tissues and organs, as well as in the control of root growth in conjunction with external stimuli such as gravity, water and nutrient availability. These functions are based primarily on the auxin-dependent regulation of cell division and elongation. Important for the latter is the control of the cell turgor by the vacuole. As storage for nutrients, metabolites and toxins, vacuoles are of vital importance. Vacuolar stored metabolites and ions are exchanged across the vacuolar membrane with the cytoplasm via active transport processes as well as passively through ion channels. In their function as second messenger, calcium ions are important regulators but also subject to vacuolar transport processes. Changes in the cytosolic calcium concentration not only act locally, but are also associated with signal transduction over longer distances. In this work, electrophysiological methods were combined with imaging techniques to gain insights into the interaction between cytosolic calcium signals, vacuolar transport processes and auxin physiology in the intact plant organism. Calcium signals are involved in the regulation of vacuolar ion channels and transporters. In order to investigate this in the intact organism, intracellular microelectrode measurements were performed in the model system of bulging Arabidopsis thaliana root hairs. By means of the two-electrode voltage-clamp technique, it could be confirmed that the vacuolar membrane is the limiting electrical resistance during intravacuolar measurements and thus measured ion currents actually represent only the currents across the vacuolar membrane. The already known time-dependent decrease of vacuolar conductivity during intravacuolar experiments could be further correlated with an impalement-related, transient increase of the cytosolic calcium concentration. Intravacuolar voltage-clamp experiments in root hair cells of calcium reporter plants confirmed this relationship between vacuolar conductivity and the cytosolic calcium concentration. However, the vacuole is not just a recipient of cytosolic calcium signals. Since the vacuole represents the largest intracellular calcium reservoir, it has long been argued that it is also involved in the generation of such signals. This could be confirmed in intact root hair cells. Changes in the vacuolar membrane potential affected the cytosolic calcium concentration in these cells. While depolarizing potentials led to an increase of the cytosolic calcium concentration, hyperpolarization of the vacuolar membrane caused the opposite. Thermodynamic considerations of passive and active calcium transport across the vacuolar membrane suggested that the results described herein reflect the behaviour of vacuolar H+/Ca2+ exchangers whose activity is determined by the proton motive force. In addition, cytosolic calcium has been shown to be a key regulator of a rapid auxin-induced signaling pathway that regulates polar transport of the hormone. In the same model system of bulging root hairs it could be shown that the external application of auxin results in a very fast, auxin concentration- and pH-dependent depolarization of the plasma membrane potential. Synchronous with the depolarization of the plasma membrane potential, transient calcium signals were recorded in the cytosol. These were caused by an auxin-activated influx of calcium ions through the ion channel CNGC14. Experiments on loss-of-function mutants as well as pharmacological experiments showed that the auxin-induced activation of the calcium channel requires auxin-perception by the F-box proteins of the TIR1/AFB family. Investigations of auxin-dependent depolarization as well as the auxin-induced influx of protons into epidermal root cells of loss-of-function mutants showed that the secondary active uptake of auxin by the high-affinity transport protein AUX1 is responsible for the rapid depolarization Not only the cytosolic calcium signals correlated with CNGC14 function, but also the AUX1-mediated depolarization of root hairs. An unchanged expression of AUX1 in the cngc14 loss-of-function mutant suggested that the activity of AUX1 must be post-translationally regulated. This hypothesis was supported by experiments in which treatment with the calcium channel blocker lanthanum led to inactivation of AUX1 in the wild type. The cytosolic loading of individual epidermal root cells with auxin resulted in the spread of lateral and acropetal calcium waves. These correlated with a shift of the auxin gradient at the root apex and thus supported a hypothetical calcium-dependent regulation of polar auxin transport. A model for a rapid, auxin-induced and calcium-dependent signaling pathway is presented and its importance for gravitropic root growth is discussed. Since AUX1-mediated depolarization varied with external phosphate concentration, the importance of this rapid signaling pathway is also discussed for the adaptation of root hair growth to an inadequate availability of phosphate. KW - Ackerschmalwand KW - Auxine KW - Vakuole KW - Calcium KW - Elektrophysiologie KW - Pflanzenhormone KW - Hormontransport KW - Ionenleitfähigkeit KW - Signaltransduktion KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-158638 ER - TY - THES A1 - Reisberg, Eva T1 - Der Einfluss von Trichomen und kutikulären Lipiden auf die bakterielle Besiedelung von Arabidopsis thaliana-Blättern T1 - The influence of trichomes and cuticular lipids on Arabidopsis thaliana leaf-associated bacterial communities N2 - Die oberirdischen Oberflächen von Pflanzen sind von komplexen mikrobiellen Konsortien besiedelt deren Zusammensetzung von verschiedenen Faktoren abhängig ist. In der vorliegenden Promotionsarbeit wurden zwei Eigenschaften pflanzlicher Oberflächen auf mögliche Auswirkungen auf ihre bakterielle Besiedelung hin untersucht. Dazu wurden Wildtyplinien und Mutanten von Arabidopsis thaliana eingesetzt. Zunächst wurde die bakterielle Besiedelung von A. thaliana Wildtyplinien in kultivierungsbasierten Experimenten untersucht. Es wurde hierbei ein Überblick über die kultivierbare Diversität auf Pflanzen, die unter kontrollierten Bedingungen im Klimaschrank gewachsen waren und Pflanzen, die einen Freilandaufenthalt durchlaufen hatten, gewonnen. Der Einfluss von nicht-drüsigen Trichomen von A. thaliana auf die Quantität und Diversität der bakteriellen Besiedelung wurde am A. thaliana Col-0-Wildtyp mit normaler Behaarung und der trichomlosen gl1-Mutante untersucht. Mithilfe von DAPI-Färbungen und nachfolgender Zellzählung wurden die bakteriellen Gemeinschaften der beiden Pflanzenlinien quantifiziert. Dabei zeigten sich keine pflanzenlinienspezifischen Unterschiede. Durch die Amplifizierung der bakteriellen 16S rRNA-Gene der Gemeinschaft und den nachfolgenden Einsatz der Denaturierenden Gradientengelelektrophorese (DGGE) wurde ein Überblick über die Diversität der vorherrschenden Bakteriengruppen gewonnen. Obwohl Trichome als bevorzugte Siedlungsplätze von Bakterien gelten, wurden hier auch hinsichtlich der Diversität der bakteriellen Gemeinschaften keine Unterschiede zwischen den untersuchten Pflanzenlinien gefunden. Als weiteres artspezifisches Merkmal von Pflanzenoberflächen wurde die Zusammensetzung der kutikulären Wachse als Einflussfaktor untersucht. Dafür wurden vier eceriferum-Mutanten (cer) von A. thaliana in Landsberg erecta (Ler) Wildtyp-Hintergrund eingesetzt, die sich hinsichtlich der kutikulären Wachszusammensetzung ihrer Blätter unterschieden. Zur Untersuchung der Diversität der bakteriellen Besiedelung wurde zunächst ein DGGE-Screening durchgeführt. Hier zeigten sich deutliche pflanzenlinienspezifische Unterschiede, die vor allem die Gemeinschaften der cer9- und der cer16-Mutante betrafen. Zur genaueren Charakterisierung der bakteriellen Gemeinschaften der fünf Pflanzenlinien wurde die Amplicon-Pyrosequenzierung eingesetzt. Hierbei stellte sich die bakterielle Diversität auf allen Pflanzenlinien entsprechend des Phyllosphärenhabitats moderat divers und ungleich verteilt dar. Die Identifizierung der sequenzierten Phylotypen ließ eine bakterielle Kerngemeinschaft erkennen. Weiterhin wurden 35 Phylotypen identifiziert, die differenziell auf einzelnen Pflanzenlinien auftraten. Hier handelte es sich um den pflanzenlinienspezifischen Teil der bakteriellen Gemeinschaften. Die statistische Analyse zeigte deutlich divergente Muster für die analysierten Bakteriengemeinschaften der fünf Pflanzenlinien. Vor allem die Gemeinschaften der cer6-, cer9- und cer16-Linie konnten in einer UniFrac-basierten Clusteranalyse von den anderen Pflanzenlinien abgegrenzt werden. Diese Ergebnisse zeigen klar, dass die Mutationen in der Wachsbiosynthese zu divergenten bakteriellen Gemeinschaften führten. N2 - The above-ground parts of plants are colonized by diverse microbial consortia. Their composition is determined by several different factors. In the present study, two common features of plant surfaces and their potential effects on phyllosphere bacteria were investigated. Wildtype lines and several mutants of Arabidopsis thaliana were chosen for these investigations. Initially the bacterial communities on A. thaliana were investigated by a cultivation based approach. First insights into the culturable bacterial diversity on plants, that were grown under controlled climatic conditions or had experienced an outdoor growth period, could be provided. The influence of non-glandular trichomes of A. thaliana leaf surfaces on the quantity and diversity of associated bacterial communities was studied. The A. thaliana Col-0 wildtype which has trichomes on its leaves and the trichomeless gl1-mutant were used for the experiments. For quantification of the bacterial communities DAPI-staining and counting of total cells was applied. No plant line-specific differences were observed. To gain an overview on the diversity of the microbiota of the two plant lines, 16S rRNA-gene-based Denaturing Gradientgelelectrophoreses (DGGE) was used. Trichomes have been described to be preferred colonization sites for bacteria. However, in these experiments no differences in the diversity of the bacterial communities on the two plant lines were observed. Moreover the potential effect of plant cuticular wax composition on phyllosphere bacterial communities was studied. Consequently, four eceriferum (cer) wax mutants with distinct alterations in cuticular wax composition and the A. thaliana Landsberg erecta wildtype were selected. For diversity analysis of the communities an initial DGGE-screening was conducted. The community profiles and subsequent statistical analyses showed distinct patterns for the five plant lines, especially for the cer9 and the cer16 mutant. For a more detailed community analysis, a next generation amplicon pyrosequencing approach was conducted. Upon application of this methodology the communities on all five plant lines were shown to be moderately diverse and uneven, typical for phyllosphere habitats. Identification of community members showed a bacterial core community shared by all plant lines. However, a considerable plant line-specific community was detected, consisting of 35 phylotypes which were differentially present on certain plant lines. Statistical analyses of the sequenced bacterial communities showed distinct patterns for the five plant lines. Specifically, the cer6, cer9 and cer16-mutant communities formed distinct clusters in a UniFrac-based analysis. The results showed that the mutations affecting the wax biosynthesis of the investigated plant lines led to divergent associated bacterial communities. KW - Ackerschmalwand KW - Bakterien KW - Phyllosphäre KW - phyllosphere KW - amplicon pyrosequencing KW - bacterial communities KW - Arabidopsis thaliana KW - cuticular waxes KW - Botanik KW - Mikrobiologie KW - Bakterien KW - Ökologie KW - Phyllosphäre KW - Kutikula KW - Vielfalt KW - Schmalwand Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83971 ER - TY - THES A1 - Horntrich, Claudia T1 - Die Funktion von Membranlipidnanodomänen für Signaltransduktionsprozesse in Pflanzen T1 - Analysis of signalling processes in Lipid Membrane domains N2 - In vielen tierischen Zellen und in Hefe wurden Membrandomänen als Plattformen für die Etablierung von Signalkomplexen bereits gut beschrieben (Foster et al., 2003) und entsprechend ihrer Resistenz gegenüber nicht-ionischen Detergenzien charakterisiert (Shogomori et al., 2003). Die Behandlung von Membranen mit solchen Detergenzien kann zu Artefakten führen und die Anwesenheit eines Proteins in diesen so genannten „DRMs“ bedeutet noch nicht, dass es auch in nativen Membrandomänen lokalisiert ist. Allerdings muss man sich, mangels besserer Methoden zur Aufreinigung von Membrandomänen, heute noch der Methode der DRM-Aufreinigung durch Detergenzien bedienen, um eine erste Vorstellung von der Proteinzusammensetzung dieser bestimmten Membranbereiche zu erhalten. Mittels Sterolreduktion der DRMs durch die Behandlung der isolierten Membranfraktionen mit MCD und anschließender HPLC-ESI-Massenspektrometrie, konnten 80 Proteine identifiziert werden, die somit als potentiell in Membrandomänen lokalisiert gelten können. Unter diesen befanden sich die beiden Arabidopsis-Remorine AtRem1.2 und AtRem1.3, die Ca2+-abhängige Proteinkinase CPK21 und die Proteinphosphatase 2C ABI1. Dieses Phosphatase-Kinase-Paar reguliert den membranständigen, im Mesophyll exprimierten, Anionenkanal SLAH3 in ABA-abhängiger Weise (Geiger et al., 2011). Mit Hilfe biochemischer, massenspektrometrischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass die Phosphatase ABI1 in Abwesenheit von ABA die Interaktion zwischen der Kinase CPK21 und dem Anionenkanal SLAH3 unterbindet. Dies geschieht indem SLAH3 und CPK21 aus den Membrandomänen in die umgebenden Membranbereiche verlagert werden und somit eine phosphorylierungsabhängige Aktivierung des Anionenkanals verhindert wird (Demir et al., 2013). Unter den in Nanodomänen lokalisiert Proteinen, konnte auch die NADPH-Oxidase AtrbohD als schwach sterolabhängig identifiziert werden. Diese zeigte im Gegensatz zu der homologen Oxidase AtrbohF, nach transienter Koexpression in Arabidopsis-Epidermiszellen zwar eine Lokalisation in distinkten Membrandomänen, aber keine Kolokalisation mit dem zuvor etablierten Membrandomänenmarker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). Dieses Ergebnis impliziert, dass es verschiedene Arten von Membrandomänen geben könnte und dass die beiden Oxidasen (zumindest zeitweise) in unterschiedlichen Membrankompartimenten lokalisiert und dadurch womöglich auch unterschiedlich reguliert sein können. Nach Koexpression der Oxidase AtrbohD mit den weiteren 12 der insgesamt 16 Arabidopsis-Remorinen, konnte eine Kolokalisation der Oxidase mit AtRem1.4 bestätigt werden. Das Remorin AtRem1.4 zeigt in weiteren Versuchen nicht nur eine deutliche Lokalisierung in anderen sterolreichen Membrandomänen als AtRem1.3, es zeigt auch eine eindeutige laterale Immobilität und kann somit als ein Marker für Membrandomänen etabliert werden. Somit bestätigt sich die Annahme, dass es auch in Pflanzen unterschiedliche Arten von Membrankompartimenten gibt. Zu diesem Zeitpunkt war noch kein, die Funktion der Oxidase regulierender Interaktionspartner von AtrbohD bekannt, um die Frage des Zusammenhangs zwischen Lokalisation und Funktion der Oxidase beantworten zu können. Mit Hilfe verschiedener mikroskopischer Techniken (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) zur Untersuchung von Protein-Protein-Interaktionen, konnte aus einer Auswahl von fünf Mesophyll-lokalisierten und Ca2+-unabhängigen Snrk2-Kinasen, zwei potentielle Interaktionspartner identifiziert werden. Genau wie mit der homologen Oxidase AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), interagiert die ABA-abhängige Kinase OST1/Snrk2.6 auch mit AtrbohD. Bei dem zweiten potentiellen Interaktionspartner handelt es sich um Snrk2.7. Die Behandlung der transfizierten und in den Interaktionsmessungen eingesetzten Zellen mit der sterolreduzierenden Reagenz MCD resultierte in einem signifikanten Anstieg der zuvor gemessenen Interaktionseffizienzen (EFRET) aller fünf ausgewählten Snrk2-Kinasen mit AtrbohD. Eine Interaktion zwischen zwei Proteinen muss nicht zwingend bedeuten, dass sie eine funktionelle Einheit in einem Signalweg darstellen. Aus diesem Grund wurde der Einfluss der identifizierten potentiellen Interaktionspartner auf die ROS-Produktionsaktivität der NADPH-Oxidase AtrbohD untersucht. Es zeigt sich, dass Snrk2.7 die ROS-Produktion durch die Oxidase auf ein vergleichbar hohes Niveau steigern kann, wie die zu diesem Zeitpunkt als Interaktionspartner der Oxidase AtrbohD identifizierte Ca2+-abhängige Kinase CPK5 (Dubiella et al., 2013). Die Kinase Snrk2.7 interagiert also nicht nur mit AtrbohD, sondern kann die Oxidase auch phosphorylieren (wahrscheinlich an einer der beiden für die Phosphorylierung von AtrbohD als essentiell beschriebenen Positionen S343 oder S347 (Nühse et al., 2007) und nicht an der untersuchten Position S39) und somit aktivieren. Dem hingegen zeigt OST1, trotz einer zuvor bestätigten Interaktion mit AtrbohD, nicht die Fähigkeit diese Oxidase auch aktivieren zu können. Die Snrk2.7-vermittelte Aktivität von AtrbohD ist ebenfalls deutlich durch eine Behandlung der transfizierten Zellen mit MCD induzierbar. Die NADPH-Oxidase AtrbohD wird also in Abhängigkeit ihrer Lokalisierung in spezifischen Membrandomänen reguliert. Wenn die zwei essentiellen Phosphorylierungsstellen durch eine Punktmutation ausgeschaltet werden und die Oxidase nicht mehr als Antwort auf Pathogene aktiviert werden kann, lokalisiert diese nicht mehr in den AtRem1.4-markierten Membrandomänen. Auch zeigt sich, dass die Aktivität der Oxidase, induziert durch eine Interaktion mit der nicht in Membrandomänen lokalisierten Snrk2-Kinase Snrk2.7, gesteigert werden kann, wenn durch MCD die sterolreichen Membrandomänen abgereichert werden. Eventuell dienen Membrandomänen, zumindest im pflanzlichen System, nicht nur der Etablierung von Signalkomplexen, sondern in einigen Fällen auch der Negativregulierung von bestimmten Proteinaktivitäten, wie zum Beispiel in diesem Fall, der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS). N2 - In animal cells and yeast, membrane domains have been extensively characterized as signalling platforms (Foster et al., 2003) and characterized upon their resistance to treatment with non-ionic detergents (Shogomori et al., 2003). Such treatment of membranes can result in formation of artefacts and the appearance of a protein in these so-called “DRMs” is not necessarly related with its localization in native membrane domains. The lack of improved preparative methods, results in further use of DRM preparation to get a first insight into the protein composition of special membrane areas. The protein composition of isolated and MCD-treated detergent resistant membrane (DRM) fractions from purified plasma membrane of Arabidopsis thaliana was investigated by HPLC-ESI mass spectrometry. Eighty proteins could be identified which are thought to be localized in sterol rich membrane domains. Among these sterol-dependent proteins the two Remorins AtRem1.2 and AtRem1.3 and two essential ABA signalling components, namely the protein phosphatase 2C ABI1 and the kinase CPK21, could be identified. This phosphatase-kinase pair was very recently demonstrated to regulate the stomatal aperture via SLAH3-mediated anion release in an ABA-dependent manner (Geiger et al., 2011). Using biochemical, mass spectrometrical and microscopic approaches it could be shown that, in absence of ABA, the phosphatase ABI1 prevents the interaction between CPK21 and SLAH3 by dislocation of both proteins from membrane domains to surrounding membrane areas, which inhibits the phosphorylation and the activation of the channel (Demir et al., 2013). Among the potentially membrane domain localized proteins, the NADPH-oxidase AtrbohD could be identified to be weakly dependent upon a sterol rich environment. In contrast to the homologous AtrbohF, the isoform D shows no colocalization upon coexpression with the established membrane domain marker AtRem1.3 (Demir et al., 2013). This result implies that there must be co-residing membrane domains and that both oxidases are (at least temporarily) located in different membrane compartments. This could imply functionally different membrane platformes to regulate specific signalling cascades. After Coexpression of AtrbohD with 12 of the altogether 16 Remorin proteins, a colocalization with AtRem1.4 could be confirmed. In further experiments not only a clear localization in other membrane domains than the ones marked by AtRem1.3, but also a clear lateral immobility could be proofed for AtRem1.4, which therefore can be accepted as a marker for another kind of membrane domains. Regarding these results, the existence of diverse Types of membrane compartments, also in plants, can be accepted. At this time point of the investigations, no interaction partner of AtrbohD was known to regulate the function of the oxidase. Therefore, the relationship between localization and function of the oxidase was still an open question. Using different microscopic techniques (BiFC, SE-FRET, AB-FRET) to study protein-protein interactions, two potential interaction partners out of a set of five mesophyll expressed Ca2+-independent Snrk2-kinases, could be identified. The ABA-dependent kinase OST1/Snrk2.6, which also interacts with AtrbohF (Sirichandra et al., 2007), was demonstrated to be a potential interaction partner of AtrbohD as well as Snrk2.7. The treatment of transfected cells with MCD leads to a significant induction of the measured interaction efficiencies (EFRET) of all the five analysed Snrk2-kinases with AtrbohD. An interaction between two proteins does not automatically mean a functional regulation of a signalling pathway, therefore the influence of the identified potential interacting partners of AtrbohD on the ROS-producing activity was analysed. At this time point the Ca2+-dependent kinase CPK5 was identified to be an interacting and phosphorylating partner of AtrbohD. The kinase Snrk2.7 can induce the ROS-producing activity of AtrbohD to a similar level than CPK5, which means Snrk2.7 is not only interacting with AtrbohD, but also regulating its activity. The phosphorylation and activation of AtrbohD by Snrk2.7 is probably mediated by one of the two essential phosphorylation sites S343 and S347 (Nühse et al., 2007), but not on the analysed S39. In contrast, the kinase OST1 is indeed interacting with AtrbohD, but obviously not regulating its activity. The Snrk2.7-mediated ROS-producing activity of AtrbohD is also inducible upon treatment of the transfected cells with MCD. The NADPH-oxidase AtrbohD is regulated in dependency to its localization in specific membrane domains. Mutation oft the two essential phosphorylation sites leads to a dislocation from AtRem1.4-marked membrane domains. Treatment with MCD, that means disruption of the sterol rich membrane environment, resulted in significantly increased ROS-producing activity of AtrbohD upon interaction with the non-domain located kinase Snrk2.7. Probably the membrane domains do not only function as signalling platforms in plants, but in some cases also for negative regulation of certain protein activity, such as the production of reactive oxygen species (ROS). KW - Membrandomänen KW - AtrbohD KW - ROS KW - Ackerschmalwand KW - Plasmamembran KW - Signalpeptide Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107362 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Laura T1 - Die funktionelle Rolle der Transkriptionsfaktoren bZIP1 und bZIP53 in der Arabidopsis thaliana- Wurzel nach Salstress T1 - The functional role of bZIP1 and bZIP53 transcription factors in salt treated roots of Arabisopsis thaliana N2 - Die zunehmende Versalzung des Bodens führt weltweit zu starken Ernteeinbußen. Ob- wohl die Wurzeln der Pflanzen als erstes mit dem Salzstress in Berührung kommen, ist noch nicht viel über Signaltransduktionswege in Wurzeln zur Anpassung der Pflanze an Salzstress bekannt. Die bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe S1, bZIP1 und bZIP53, werden gewebespezifisch in der Wurzel nach Salzstress aktiviert. In dieser Arbeit werden diese bZIPs in ein Netzwerk eingeordnet, von der Aktivierung der Tran- skriptionsfaktoren bis zur Funktion in der Regulation des Stoffwechsels in der salzgest- ressten Pflanze. Die Aktivierung von bZIP1 kann über verschiedene sowohl ionische als auch osmotische Stimuli erfolgen und ist abhängig von Calcium, der HEXOKINASE 1 und SnRK1- Kinasen (Snf1 RELATED PROTEIN KINASE 1). Die dunkelinduzierte Expression von bZIP1 wird HXK1-abhängig durch Glucose inhibiert, bei Energiemangelbedingungen ist die Aktivierung von bZIP1 SnRK1-abhängig. Beide Enzyme spielen auch in der salzinduzierten Expression von bZIP1 eine Rolle. Über Transkriptom- und Me- tabolomanalysen kann gezeigt werden, dass bZIP1 und bZIP53 an der Umprogram- mierung des Kohlenhydrat- und Aminosäuremetabolismus teilhaben. Besonders Gene der Glukoneogenese (PYRUVAT ORTHOPHOSPHAT DIKINASE und FRUCTOSE- 1,6-BISPHOS- PHATASE) bzw. des Aminosäurekatabolismus (BRANCHED- CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2, METHYLCROTONYL- COA-CARBOXYLASE A und HOMOGENTISATE 1,2-DIOXYGENASE ) werden von den Transkriptionsfaktoren reguliert. Das spricht für eine Umprogrammierung des Metabolismus und der Mobilisierung von Energie aus Aminosäuren zur Anpassung an die Stressbedingungen. Die Transkriptionsfaktoren der Gruppe S1 bilden vorzugsweise Heterodimere mit der Gruppe C. Mit Mutantenanalysen, die zum einen die Transkriptionsfaktoren des C/S1-Netzwerks und zum anderen Komponenten der Abscisinsäure (ABA) abhängigen Signaltransduktion beinhalten, konnte ein Signaltransduktionsnetzwerk aufgestellt werden, das die Antwort auf abiotischen Stress mittels des Signalwegs über ABA, SnRK2 und AREB (ABA RESPONSIVE ELEMENTS-BINDING PROTEIN) mit der SnRK1-vermittelten Antwort auf Energiemangelbedingungen in der Pflanze verknüpft. Die gefundenen stress- bzw. energieresponsiven Gene konnten nach den Mutantenana- lysen auf Grund ihrer unterschiedlichen Regulation in vier Klassen eingeteilt werden, wovon nur eine, die Klasse 4, von dem C/S1 Netzwerk reguliert wird. Die Klassen 1- 3 sind unabhängig von den bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe C. Die Klasse 1 bilden typische ABA-responsive Gene, die von den Gruppe A-bZIPs reguliert werden. Faktoren der Gruppe A sind auch an der Expression der Gene der Klasse 2 beteiligt, diese werden aber auch durch bZIP1 und bZIP53 induziert. Dieser Klasse konnten Gene zugeordnet werden, die im Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren eine Rolle spielen. Am Aminosäureabbau sind außerdem die Gene der Klasse 2 beteiligt. Für diese Gene konnte eine Expressionsregulation durch bZIP1 und bZIP53 gezeigt werden. Für die Bestimmung möglicher Heterodimerisierungspartner bedarf es noch weiterer Analysen. Dieses Model, das den abitoschen Stress abhängigen ABA-Signalweg mit dem ener- gieabhängigen SnRK1-Signaltransduktionsweg verknüpft, zeigt die präzise Regulation von mindestens 4 Gen-Klassen, deren Expression durch die Kombination verschiedener bZIP-Transkriptionsfaktoren aktiviert wird. N2 - Increasing salinization of soil has led to significant crop loss worldwide. Notwith- standing the fact that plant roots are the first to be affected by salt stress, signal transduction pathways in roots for salt stress adaptation are still mostly unknown In this work the group S1 bZIP transcription factors bZIP1 and bZIP53 that are spe- cifically induced by salt stress in roots, were functionally characterized with respect to their role in salt stress response in plants. Transcriptional activation of bZIP1 can be mediated by both ionic and osmotic stimuli and is dependent on Ca2+, HEXO- KINASE 1 (HXK1) and the SnRK1 kinases (Snf1 RELATED PROTEIN KINASE 1). Dark induced expression of bZIP1 is inhibited by glucose depending on HXK1 acti- vity. In starvation conditions the transcription of bZIP1 is mediated by SnRK1. Here both signaling enzymes are shown to be involved in salt induced bZIP1 transcripti- on. Transcriptome and metabolome analyses reveal an important function of bZIP1 and bZIP53 concerning the reprogramming of primary carbohydrate and amino acid metabolism during salt stress in the Arabidopsis root. Particularly genes involved in gluconeogenesis (PYRUVAT ORTHOPHOSPHAT DIKINASE and FRUCTOSE-1,6- BISPHOSPHATASE )or amino acid catabolism (BRANCHED- CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2, METHYLCROTONYL- COA-CARBOXYLASE A and HOMO- GENTISATE 1,2-DIOXYGENASE) are regulated by these transcription factors. This points to reprogramming of metabolism and remobilization of energy by amino acid degradation under stress. Group S1 bZIPs preferably form heterodimers with group C bZIP transcription factors. Mutant analyses of C/S1 bZIPs and ABA signaling com- ponents, respectively, revealed a complex network connecting abiotic stress responses via ABA-SnRK2-AREB (ABA RESPONSIVE ELEMENTS-BINDING PROTEIN) to SnRK1 mediated starvation responses. The detected genes were grouped in four classes according to their different regulation, of which only class 4 is regulated by the C/S1 network. Classes 1-3 are controlled independently of group C transcription factors. Class 1 contains typical ABA responsive genes, regulated by group A bZIPs. These are also involved in gene expression of class 2 genes, which are as well induced by bZIP1 and bZIP53. Genes of branched chain amino acid catabolism belong to this class. Al- so involved in amino acid catabolism are genes of class 2, these genes were shown to be transcriptionally regulated by bZIP1 and bZIP53. Further analyses are required to reveal possible heterodimerization partners. This model, that links the abiotic stress responding ABA pathway to the energy dependent SnRK1 signaling pathway, reveals at least four gene classes that are very precisely regulated by combining different bZIP transcription factors. KW - Salzstress KW - salt KW - Transkriptionsfaktor KW - Ackerschmalwand KW - transcription factors KW - root KW - Wurzel Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99423 ER - TY - THES A1 - Gohlke, Jochen T1 - Die Rolle von DNA-Methylierungen in der Entwicklung und Physiologie vonAgrobacterium-induzierten Arabidopsis-Tumoren T1 - The role of DNA methylation in development and physiology of Agrobacterium-induced Arabidopsis tumors N2 - Agrobacterium tumefaciens ist ein pathogenes Bodenbakterium, welches nach Integration seiner T-DNA in das pflanzliche Genom die Bildung von tumorartigen Wucherungen, den sogenannten Wurzelhalsgallen, an einer Reihe unterschiedlicher Wirtspflanzen verursacht. Die Expression der T-DNA-codierten Onkogene resultiert in der Proliferation und Differenzierung der sogenannten Wurzelhalsgallen, einem Prozess, welcher mit weitreichenden transkriptionellen und physiologischen Veränderungen verbunden ist. Für DNA-Methylierungen ist bekannt, dass diese zu Genexpressionsveränderungen beitragen, welche neoplastisches Wachstum in Säugetieren begünstigen. Über die Funktion epigenetischer Prozesse für die Physiologie und Entwicklung pflanzlicher Tumore ist bisher hingegen wenig bekannt. Daher wurde in dieser Arbeit das Methylierungsmuster von Wurzelhalsgallen, welche an Arabidopsis thaliana induziert wurden, sowohl genomweit als auch auf Basis einzelner Gene bestimmt. Dabei zeigte sich, dass die Onkogene ipt, iaaH und iaaM welche mit der T-DNA ins Genom integriert werden und die Proliferation auslösen, im Tumorgewebe unmethyliert vorliegen. Dennoch sind die Onkogene empfänglich gegenüber epigenetischen Modifikationen, da die siRNA-vermittelte Methylierung sowohl ihre Transkription als auch das Tumorwachstum unterbindet. Eine genomweite Studie der DNA-Methylierungsmuster mittels Tiling-Array-Analysen von immunopräzipitierter methylierter DNA zeigte ein global hypermethyliertes Tumor-Genom im Vergleich zum tumorfreien Sprossgewebe. Diese Beobachtungen stehen im Gegensatz zu den Methylierungsmustern der meisten Säuger-Tumore, welche typischerweise mit globaler Hypomethylierung und lokaler Hypermethylierung von Promotor-Sequenzen assoziiert sind. Im Unterschied dazu waren die Promoter-Sequenzen im Pflanzentumor eher hypomethyliert. Die Methylierungsunterschiede zwischen Wurzelhalsgallen und Sprossgewebe korrelierten mit transkriptionellen Veränderungen. Speziell Gene, welche in Entwicklungsprozessen und Zellteilung involviert sind, waren von Methylierungsänderungen betroffen. Dies impliziert, dass insbesondere diese Prozesse epigenetisch kontrolliert werden. Die Methylierung von Genen, welche einer transkriptionellen Kontrolle durch ABA unterliegen, war durch eine ABA-Behandlung induzierbar. DNA-Methylierungen kontrollieren somit wahrscheinlich essenzielle physiologische Prozesse während der Tumorentwicklung wie beispielsweise die ABA-vermittelte Trockenstressanpassung. Arabidopsis-Mutanten, welche in Nicht-CG-Methylierungsprozessen beeinträchtigt sind, entwickelten größere Tumore als die Kontrollpflanzen der entsprechenden Wildtypen. Dies weist auf eine Inhibierung des Tumor-Wachstums durch ein hypermethyliertes Genom, insbesondere der Nicht-CG-Motive hin. Insgesamt zeigen die Ergebnisse, dass Genexpression, physiologische Prozesse und die Entwicklung pflanzlicher Tumore einer Regulation durch DNA-Methylierung unterliegen. N2 - Agrobacterium tumefaciens is a plant pathogen which causes formation of crown gall tumors on a wide range of host species as a result of integration of its T-DNA into the plant genome. Expression of the T-DNA encoded oncogenes triggers proliferation and differentiation of crown galls, a process which is associated with severe global gene expression and physiological changes. DNA methylation changes are known to contribute to transcriptional changes which facilitate neoplastic growth in mammals. However, the role of epigenetic processes in physiology and development of plant tumors is not yet understood. Therefore, in this study the methylation pattern of Arabidopsis crown galls was analyzed on a genome-wide and single gene level. The proliferation-provoking oncogenes ipt, iaaH and iaaM, which are integrated into the plant genome along with the T-DNA, were shown to be unmethylated in the tumor genome. Nevertheless, they are susceptible to epigenetic modifications as siRNA-mediated methylation prevented both oncogene transcription and subsequent tumor development. The genome-wide analysis of DNA methylation by methylcytosine immunoprecipitation and tiling arrays revealed a globally hypermethylated tumor genome compaired to that of the tumor-free stems. This contrasts the methylation patterns in most mammalian cancers, which are typically associated with global hypomethylation and local hypermethylation of gene promoters. In crown gall tumors, promoters where rather hypomethylated. Methylation differences of crown galls and stem tissue correlated well with transcriptional changes. Especially genes involved in development and cell division were differentially methylated, implying that these processes are epigenetically controlled in the tumor. Methylation of genes which are known to be transcriptionally inhibited in an ABA-dependent manner was inducible upon ABA treatment. This suggests that DNA methylation controls essential physiological processes during crown gall development, such as ABA-mediated drought stress adaption. Arabidopsis mutants impaired in non-CG methylation developed larger tumors than wild-type controls, which indicates that hypermethylation of non-CG motifs inhibits plant tumor growth. In summary, the results of this study provide evidence that gene expression, physiological processes and the development of plant tumors are regulated by DNA methylation. KW - Abscisinsäure KW - Ackerschmalwand KW - DNS KW - Methylierung KW - Wurzelhalsgalle KW - DNA-Methylierung KW - Wurzelhalsgallen KW - ABA KW - Tumorentwicklung KW - DNA methylation KW - crown galls KW - ABA KW - tumor development Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77732 ER - TY - THES A1 - Glenz, René T1 - Die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion T1 - The role of sphingobases in plant cell death reaction N2 - Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod. In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert. In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei. N2 - Sphingobases are the building blocks for the biosynthesis of sphingolipids. While complex sphingolipids form a major part of eukaryotic membranes, sphingobases, which are also called long-chain bases (LCBs), are well-known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes. In the animal system, antagonistic effects of nonphosphorylated sphingobases (LCBs) and their phosphorylated counterparts (LCB-Ps) have been reported in many cell functions, with a particular focus on apoptosis, and the underlying signaling pathways have been elucidated in detail. In contrast, few records of an antagonistic effect and the potential signal transduction mechanisms have been established in plants. Several lines of evidence point to a regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Mutations in genes related to sphingobase metabolism may cause spontaneous PCD and altered cell death reactions. (ii) Levels of LCBs are increased under different cell death conditions. (iii) Necrotrophic pathogens produce toxins, like fumonisin B1 (FB1), interfering with sphingolipid metabolism of the host plant and, thus, causing PCD. (iv) Treatment of plants with LCBs, but not LCB-Ps, induces cell death. In the present study the role of sphingobases in plant cell death reactions, with a focus on the examination of the hypothesis of an antagonistic cell death-inhibitory effect of LCB-Ps, has been investigated. Using conductivity-based measurements of Arabidopsis thaliana leaf discs, cell death induced by treatment with LCBs and separated or combined feeding of LCB-Ps was determined. That kind of quantification allowed the verification of an inhibitory effect of LCB-Ps on LCB-induced cell death, which was published elsewhere. However, by simultaneous measurement of the applied sphingobase levels in the tissue with HPLC-MS/MS, this antagonism could be explained by a reduced uptake of the LCB in the presence of the LCB-P, which was also confirmed by a separated treatment with the sphingobases. In addition to that an impact of exogenous applied LCBs and LCB-Ps on cell death in A. thaliana induced by Pseudomonas syringae has been investigated. For LCB-Ps no cell death inhibitory effect was observed. Similarly, there was no impact for LCB-Ps on the cell death induced by recombinant expression of an avirulence protein in Arabidopsis. For LCBs, a direct antibacterial effect against P. syringae was shown in this work. This puts previous findings of an inhibitory effect of LCBs on pathogen-induced cell death in plants into a new perspective. In further approaches, Arabidopsis mutants of enzymes of the sphingobase metabolism (LCB kinase, LCB-P phosphatase, LCB-P lyase) were functionally characterized with regard to altered in situ levels of LCBs/LCB-Ps. The phenotype of the mutants in response to fumonisin B1 was determined in a growth assay with seedlings, and by cell death measurements in leaf discs, which were accompanied by quantification of sphingobase levels. The sensitivity of different lines to FB1 was closely correlated with the levels of LCBs, while high contents of LCB-Ps alone were not able to reduce cell death. Some mutants even showed a correlation of highly enhanced LCB-P levels with a pronounced sensitivity to FB1. The results of the present study challenge the hypothesis of an antagonistic effect of phosphorylated sphingobases on plant cell death. Instead, a detailed analysis of sphingobase levels revealed a positive correlation of LCB contents with cell death. The conducted experiments not only provide further evidence for a cell death-promoting effect of nonphosphorylated sphingobases, but also contribute to the comprehension of sphingobase homeostasis, as well as of the sphingobase-induced PCD in plants. KW - Sphingolipide KW - Phytosphingosine KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Zelltod KW - Sphingobasen (LCB, LCB-P) KW - Ackerschmalwand KW - programmierter Zelltod KW - Sphingobases KW - Arabidopsis KW - programmed cell death Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187903 ER - TY - THES A1 - Mumm, Patrick T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen der Ionenflüsse und ihrer Regulation in Stomakomplex-bildenden Zellen von Zea mays und Schließzellen von Arabidopsis thaliana T1 - Electrophysiological analysis of ion fluxes and their regulation in stomatal cell of Zea mays and guard cells of Arabidopsis thaliana N2 - 1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenomme-nen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays gewonnen werden: a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-ähnliche Anionenkanäle identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkanäle der Schließzellen wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert. b. Darüber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-Elektroden-Technik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenläufige Polarisation des Membranpotentials während der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein zu Mais ähnliches Verhalten während der Stomabewegung zeigte und gegenläu-fig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein ähnli-ches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend. c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkali-sierung während der Licht-induzierten Stomaöffnung beobachtet, die bei Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zurückkehrte. d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen konnte ein Volumenverhältnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw. 1:4 bei geöffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden. Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewon-nenen Erkenntnisse schlüssig in ein Modell zur Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Neben- und Schließzellen während der Licht-induzierten Stomabewegung eingebunden werden. 2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließ-zellen in Patch-Clamp-Experimenten näher untersucht. Dabei waren die S-Typ-Anionenströme bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1-Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universität Würzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-Typ-Anionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 ko-diert für einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-ähnliche Anionenströme generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion dar-stellte oder den Chlorid-basierten Lösungen externes Nitrat zugegeben wurde, scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg für die Ent-lassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen. 3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkanäle in A. thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal ähnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsab¬hängigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabhängigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana nicht durch externes Malat beeinflusst. Jedoch war unter externen Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, während unter externen Sulfatbe¬dingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszu¬machen waren. ALMT12 scheint demnach für den Malat-aktivierten Teil des R-Typ-Anionenkanals verantwortlich zu sein. N2 - 1. Within this dissertation the following new insights into the coordinated ion transport between guard and subsidiary cells of Zea mays were gained: a. Using the patch clamp technique on subsidiary and guard cell protoplasts, S-type-like anion channels were identified in both cell types. In subsidiary cells they were inhibited by elevated cytosolic calcium con-centrations and stimulated by ABA and cytosolic alkalinization. In con-trast, the S-type-like guard cell anion channels were hardly influenced by alkalinization and stimulated upon a rise in the cytosolic free calcium level. b. Impaling of subsidiary cells in intact Zea mays plants with microeletrodes revealed a reversed membrane polarization during light-/darkness-induced stomatal movement. Since the membrane potential of Hordeum vulgare subsidiary cells showed a similar behavior that was, however, reversed in the surrounding guard cells during stomatal movement, a similar change in the membrane potential of Zea mays guard cells is most likely. c. Furthermore an alkalinization in Zea mays subsidiary cell could be moni-tored during light-induced stomatal opening, which returned to original values after stomatal closure. d. Based on reconstructed 3D-models of intact maize stomatal complexes, a volume ratio between guard cells and subsidiary cells of 1:6 and 1:4 of open and closed stomata, respectively, were estimated. The obtained results could be conclusively embedded in a model that decribes the shuttle transport of ions between guard and subsidiary cells during light-induced stomatal movement. 2. Patch clamp studies on guard cells of A. thaliana CPK23- and OST1-loss-of-function mutants showed strongly reduced S-type anion currents after stimula-tion through Ca2+ or ABA compared to wild type. These in vivo data support the results of the working group of Prof. R. Hedrich (University Würzburg), that OST1 and CPK23 are directly interacting with the S-type anion channel in A. thaliana. The SLAC1-homologue gene SLAH3 is encoding for a nitrate perme-able S-type anion channel in guard cells. Since SLAC1-loss-of-funtion mutants generate S type anion currents when nitrate is the dominating anion or nitrate is present in chloride-based solutions, SLAH3 seems to represent an alternative pathway for anion efflux in guard cells. 3. The R-type anion channels from Arabidopsis thaliana guard cells were electro-physiologically characterized and revealed similar electrical characteristics as those known from Vicia faba guard cells: strong voltage dependence, fast activa-tion- and deactivation kinetics. In contrast to Vicia faba, however, the voltage dependence was not modulated by external malate. But in the presence of exter-nal malate the current response in ALMT12-loss-of-function mutants was strongly reduced, while similar anion currents were monitored in wild type and almt12 mutant plants in the absence of external malate. These results indicate that ALMT12 is likely responsible for the malate-activating component of the R-type anion channel. KW - Schließzelle KW - Spaltöffnung KW - Anionentranslokator KW - Ackerschmalwand KW - Mais KW - Schließzellen KW - Stomata KW - Anionenkanäle KW - Arabidopsis KW - anion channel KW - guard cell KW - maize KW - arabidopsis KW - stomata Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49267 ER - TY - THES A1 - Jeworutzki, Elena T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen zur frühen Erkennungsphase zwischen Pflanzen und Mikroorganismen T1 - Electrophysiological analyses of the early recognition phase between plants and microorganism N2 - An der pflanzlichen Plasmamembran geschieht die erste Wahrnehmung von mikrobiellen Molekülen, die MAMPs genannt werden. MAMP/PAMP Rezeptoren leiten frühe Abwehrantworten, wie die Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS), externe Alkalisierung oder Ethylen, ein. Die Arabidopsis FLS2 rezeptorartige Kinase (RLK) stellt einen plasmamembran-lokalisierten MAMP Rezeptor dar, der über die Detektion des Flagellum von Pseudomonas species, eine basale Immunität in Arabidopsis thaliana vermittelt. Flg22, der kürzeste aktive Teil des bakteriellen Flagellins besteht aus 22 Aminosäuren und ist der bestuntersuchte bakterielle Elizitor. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir eine starke Beteiligung von Ionenflüssen in der Initiationsphase der basalen Immunität. Unsere Messungen an intakten Arabidopsis Pflanzen und Pflanzengeweben sind in höchstem Masse reproduzierbar und öffnen eine neue Sicht, über die Natur von Ionentransporten in der Pflanzen - Mikroben Interaktion. Als Antwort auf die Applikation von flg22, haben wir nach einer Verzögerungsphase von etwa 2 Minuten eine transiente, dosis-abhängige Depolarisation (EC50=0,2 nM) in Mesophyll- und Wurzelhaarzellen von A. thaliana messen können. Das um 2 Aminsäuren kürzere Peptid flg22 Δ2 oder das Flagellin anderer Bakterien (Agrobacterium or Azospirillum) führten zu keiner Membrandepolarisation. Ebenso konnten keine Membranspannungsänderungen in dem Arabidopsis Ökotypen Ws-0, dem der funktionelle FLS2 Rezeptor fehlt, detektiert werden. Die Komplementation von Ws-0 Pflanzen mit dem intakten FLS2 Rezeptorgen rief eine Resensibilisierung für flg22 hervor. Mit dem EF-Tu Elizitor Peptid aus E.coli, welches durch den Arabidopsis MAMP Rezeptor EFR detektiert wird, wurden ähnliche Ergebnisse erzielt. Auf der Basis von Aequorin wurden Kalzium-induzierte Lumineszenzmessungen durchgeführt, in denen ein transienter Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration als Antwort auf die Applikation von flg22 gemessen werden konnte. Dosis-Abhängigkeitsmessungen von flg22 und [Ca2+]cyt wiesen zwei unterschiedliche EC50 Werte, von 43 ± 2 pM und 67 ± 42 nM, auf. Möglicherweise wird auf zwei verschiedene Kalziumpools zugegriffen oder es werden zwei verschiedene Kalziumleitfähigkeiten aktiviert. Die Ionenkanalaktivierung und folgende Depolarisation benötigt die aktive Rezeptorkinase. In bak1-4 Arabidopsis Pflanzen, in denen die FLS2 Untereinheit BAK1 – eine weitverbreitete RLK, die auch mit dem Brassinosteroid Rezeptor assoziiert ist – fehlt, konnte keine Depolarisation als Antwort auf flg22 gemessen werden. Arabidopsis Mesophyllzellen zeigten die typische Alkalisierung des Apoplasten als Antwort auf flg22. Nicht-invasive MIFETM Experimente mit Ionen-selektiven Elektroden ergaben, dass der pH-Anstieg durch einen Einstrom von Protonen hervorgerufen wurde. Zusätzlich wurde ein Ausstrom von Chlorid und Kalium aufgezeichnet. Ähnlich wie das Kalziumsignal waren alle detektierten Ionenströme von transienter Natur. Im zweiten Ansatz wurden Membranpotential-Messungen durchgeführt, während in der externen Lösung die Konzentrationen von Protonen, Kalzium, Kalium oder Anionen variiert wurden. Nur eine Änderung des Anionengradienten hatte einen entscheidenden Einfluss auf die flg22-induzierte Depolarisation, was die Wichtigkeit der Anionenkanalaktivierung unterstreicht. Exudat Analysen ergaben, dass Nitrat das bevorzugt transportierte Ion ist. Unter zahlreichen getesteten Ionenkanalblockern erwies sich lediglich Lanthan als effektiver Blocker des flg22-induzierten zytosolichen Kalziumanstiegs, des Protoneneinstroms und der Membrandepolarisation. Da Lanthan bekanntlich unspezifische Kationenkanäle blockt, kann man an diesem Punkt davon ausgehen, dass Kalzium-aktivierte Anionenkanäle die Membrandepolarisation vermitteln und darauf eine Aktivierung von auswärtsgerichteten Kaliumkanälen folgt. Zukünftige Studien mit Doppelläufigen-Mikroelektroden Spannungsklemmexperimenten oder externen ionenselektiven Elektroden an intakten Schliesszellen werden helfen weitere Informationen über die Natur der Ionenkanäle in der basalen Immunität oder generell in der Pflanzen-Mikroben Interaktion zu erhalten. Über die elektrophysiologische Charakterisierung der multiplen Ionenströme in der basalen Immunität hinaus, ist natürlich der nächste wichtige Schritt das oder die Gene zu finden, die für die Ionenkanäle oder Transporter kodieren, die durch nicht nekrotisierende Elizitoren wie flg22 in der basalen Immunantwort in Pflanzen aktiviert werden. N2 - The plant plasma membrane represents the first site for recognition of microbial patterns called MAMPs. MAMP receptors mediate early defense responses including production of reactive oxygen species (ROS), external alkalinisation or ethylene. The Arabidopsis FLS2 receptor-like kinase (RLK) represents a plasma-membrane localized MAMP receptor that provides for innate immunity in Arabidopsis thaliana plants by specifically recognizing the flagellum (flg) of Pseudomonas species. Flg22, the shortest active part of flagellin, composed by 22 aminoacids is the best established bacterial elicitor that. About the role of ion channels in innate immunity nothing was known yet. In the current work we show a strong involvement of ion fluxes in the initiating phase of innate immunity. Our measurements on intact Arabidopsis plants and plant tissues are highly reproducible and open a new view of ion channel functions in plant microbe interactions. In response to the application of flg22, after a delay of about 2 minutes, we recorded a transient, dose-dependent depolarization (EC50=0.2 nM) in mesophyll and root hair cells of A. thaliana. Following wash-out of the peptide elicitor and recovery of the membrane potential to resting potential values within 70 ± 9 min, depolarizations could be elicited several times. No membrane depolarization was evoked upon application of flg22Δ2, a truncated flg22 peptide, or by application of flagellin from other bacteria (Agrobacterium or Azospirillum). Likewise, depolarization was not observed in the natural knockout mutant of the Arabidopsis ecotype Ws-0 lacking the functional FLS2 receptor. Complementation of transgenic Ws-0 plants with the functional FLS2 receptor restored flg22 sensitivity, indicating that FLS2 is essential for flg22 evoked membrane potential changes. Similar results were obtained using the E. coli EF-Tu elicitor peptide elf18, which is recognized by the Arabidopsis MAMP receptor EFR. Aequorin based calcium measurements allowed us to record a transient increase in cytosolic calcium concentration in response to applied flg22. Dose-response studies revealed two distinct EC50 values for the calcium response of 43 ± 2 pM and 67 ± 42 nM respectively. This indicates that two different calcium pools or two different calcium permeabilities in the plasma membrane were activated by flg22. In line with a requirement of receptor-kinase activity for ion channel activation and subsequent depolarization, the latter was completely blocked by the kinase inhibitor K-252a. In bak1-4 Arabidopsis plants, lacking the FLS2 subunit BAK1 – a promiscuous RLK also associated with the brassinosteroid receptor - no depolarisation was measured in response to flg22. This indicated that both RLKs – FLS2 and BAK1 – are required for flagellin induced ion channel activation. Arabidopsis mesophyll cells showed the typical alkalinization of the apoplast in response to flg22. Noninvasive experiments with vibrating ion-selective electrodes revealed that this pH rise was due to an influx of protons. In addition an efflux of chloride and potassium was recorded. All fluxes were transient in nature, as was the observed calcium signal. Simultaneous measurements using two ion-selective electrodes showed a delay of the potassium efflux in comparison to the other ions that participate in the flg22 response. In the second approach, membrane potential measurements were performed while changing extracellular concentrations of protons, calcium, potassium or anions. Changing the anion gradient had the greatest impact on flg22 induced depolarization, suggestive of anion channel activation. Exudates analyses of flg22 treated leaves revealed that nitrate was the favored anion transported. Among many putative channel blocking agents tested, only lanthanum was identified to be potent in blocking the flg22 induced the cytosolic calcium rise, proton influx, and membrane potential depolarization. Since lanthanum represents a non-specific cation channel blocker, we favor to conclude that a calcium dependent activation of anion channels mediated membrane potential depolarization and consequently outward rectifying potassium channels. Future studies with double-barreled microelectrode voltage-clamp or external ion selective electrodes on intact guard cells may help to gain further information about the nature of ion channels in innate immunity or plant microbe interaction in general. Of course, all over the electrophysiological characterization of the multiple ion fluxes in innate immunity the next important step would be to discover the gene(s) coding for ion channels or transporters activated by non necrotic elicitors as flg22 in the innate immune response of plants. KW - Calcium KW - Induzierte Resistenz KW - Ackerschmalwand KW - Ionenkanal KW - Elektrophysiologie KW - Pseudomonas syringae KW - Membranpotenzial KW - Flagelline KW - Ionenkanäle KW - Anionen KW - Rezeptorkinasen KW - basale Immunität KW - Einstichmessungen KW - innate immunity KW - Calcium KW - Anion KW - ion channels KW - receptor kinases KW - flagellin KW - membrane potential KW - Pseudomonas syringae KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47489 ER - TY - THES A1 - Wehner, Nora T1 - Etablierung und Anwendung molekularer Methoden zur Analyse des Arabidopsis thaliana Transkriptionsfaktor-ORFeoms T1 - Establishment and application of molecular tools to analyse the Arabidopsis thaliana transcription factor ORFeome N2 - Transkriptionsfaktoren (TF) sind wichtige Regulatoren der Genexpression. In Arabidopsis kodieren ca. 1500-2000 Gene für TF, von denen die Mehrheit bis heute nicht funktionell charakterisiert ist. Um die Aufklärung der TF-Funktionen weiter voranzutreiben, werden daher Analyse-Plattformen für Hochdurchsatzverfahren immer wichtiger. In den letzten Jahren sind umfangreiche Gateway® -kompatible ORF (open-reading-frame)-Kollektionen für Arabidopsis aufgebaut worden, die nun als nützliche Ressourcen für genetische Analysen zur Verfügung stehen. Auf Grundlage dieser Kollektionen wurde in dieser Arbeit eine neue Screening-Plattform etabliert, mit der trans-regulatorische Eigenschaften von TF in einem Hochdurchsatzverfahren untersucht werden können. Ein Mikrotiterplatten-System für Protoplastentransformationen erlaubt die transiente Koexpression von 96 verschiedenen TF-Expressionsvektoren mit einem Promotor:Luciferase-Reporter der Wahl. Das Transaktivierungspotential jedes einzelnen TF kann über die Luciferaseaktivität bestimmt werden, indem emittierte Lumineszenz in einem Luminometer detektiert wird. Die Funktionalität des PTA (Protoplast Trans Activation)-Systems wurde anhand einer Transaktivierungsstudie der bereits gut charakterisierten Promotoren von RD29A und PDF1.2 und der ERF (Ethylene Response Factor)-TF-Familie überprüft, wobei bekannte Bindungsspezifitäten der TF bestätigt werden konnten. Für das System wurde eine umfassende Arabidopsis TF-Kollektion aufgebaut. Ca. 950 verschiedene Gateway® -kompatible TF-Expressionsvektoren stehen für Screening-Ansätze zur Verfügung. Für das PTA-System wurden verschiedene Anwendungen etabliert. Neben transaktivierenden, konnten beispielsweise auch repressive Eigenschaften von TF bestimmt werden. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass es möglich ist, (I) die Expression von Promotoren gezielt durch verschiedene Stimuli, wie Salz oder Pflanzenhormone zu modulieren, (II) Protein-Protein-Interaktionen zu bestimmen, sowie (III) den Einfluss von Signalmolekülen (wie z. B. Kinasen) auf ihre Aktivierungseigenschaften zu untersuchen. Das PTA-System wurde in verschiedenen Screening-Ansätzen zur Identifizierung transkriptioneller Regulatoren pflanzlicher Stressantworten eingesetzt. In einer Analyse des Auxin-induzierbaren GH3.3-Promotors wurde dabei gezeigt, dass weit mehr bZIP-TF Einfluss auf die Auxin-vermittelte GH3.3-Expression haben, als bisher angenommen. Beispielsweise zeigten bZIP16 und bZIP68 ein höheres Transaktivierungspotential, als die bisher beschriebenen bZIP-Regulatoren der GH3.3-Expression. In einem zweiten Ansatz wurde die koordinierte Regulation der Biosynthese von Tryptophan-abgeleiteten antimikrobiellen Sekundärmetaboliten (Indol-Glukosinolate, Camalexin) untersucht. Dabei konnten ERF-TF der phylogenetischen Gruppen VIII und IX als potentielle Regulatoren mehrerer wichtiger Gene der Biosynthesewege identifiziert werden. Mit einem zusätzlichen Screening-Ansatz der gesamten TF-Expressionsvektor-Kollektion und einem Markerpromotor des Camalexin-Biosynthesewegs wurden weitere potentielle Regulatoren identifiziert, von denen einige bereits in der Pathogenantwort beschrieben sind. In einem weiteren Schwerpunkt dieser Arbeit wurde die von Weiste et al. (2007) etablierte Arabidopsis thaliana TF-ORF-Überexpressions-Kollektion (AtTORF-EX) erweitert. Mit Hilfe des dafür entwickelten Hochdurchsatzverfahrens zur Generierung stabil transformierter Pflanzenlinien wurden neue Überexpressionssamen-Kollektionen hergestellt und anschließend in einem Screening-Ansatz auf erhöhte Toleranz gegenüber oxidativem Stress getestet, wobei die Chemikalie Paraquat als oxidativer Stress-Geber eingesetzt wurde. Die TF bZIP1 und OBP1 konnten dabei als Resistenz-vermittelnd identifiziert werden. Zusammenfassend wurden in dieser Arbeit mit Hilfe beider Systeme neue potentielle Regulatoren pflanzlicher Stressantworten identifiziert. N2 - Transcription factors (TFs) are important cellular regulators of gene expression. In Arabidopsis approximately 1500-2000 genes encode for TFs. Until now, the majority of these genes has not been functionally characterized. To further promote the evaluation of TF function, high-throughput tools are required. In recent years, comprehensive Arabidopsis open reading frame (ORF) collections have been established, which are valuable resources for functional genomics. Based on these collections a high-throughput microtiter plate based Protoplast Trans Activation (PTA) system has been established to screen for TFs which regulate a given promoter:Luciferase construct in planta. 96 protoplast transfection experiments can be performed simultaneously in a standard microtiter plate. Transactivation of a promoter:Luciferase reporter is measured via luciferase imaging. A screening collection of roughly 950 TFs expression vectors has been assembled using Gateway® technology and can be tested in various screening approaches. In this respect, it is possible to analyze transactivating as well as repressive properties. Moreover (I) stimulus induced transcription, (II) studies of protein-protein interaction and (III) the impact of signaling molecules (e.g. kinases) on the promoters activation potential can be measured. To demonstrate the feasibility of the high-throughput system, the transactivating properties of the Ethylene Response Factor (ERF) TF family were studied in combination with the well-characterized RD29A and PDF1.2 promoters. By this means, known binding specificities of the TF family were confirmed. Furthermore, the PTA-System was applied to identify transcriptional regulators involved in plant stress responses. In one approach the influence of bZIP TFs on the auxin-inducibility of the GH3.3-promoter was studied. In particular, bZIP16 and bZIP68 showed a stronger transactivation potential than those bZIPs which were previously described to regulate this auxin-responsive promoter. In an independent approach the transcriptional regulation of tryptophan-derived antifungal compounds (indol-glycosinolates, camalexin) biosynthesis has been studied. ERF TFs of the groups VIII and IX were identified as potential regulators of several biosynthetic genes. A subsequent screening approach of a key promoter of the camalexin biosynthetic pathway disclosed further potential regulators. Among these TFs, many have been described previously in plant pathogen responses. As a second approach to examine TF function the Arabidopsis thaliana TF ORF-EXpression-library (AtTORF-EX) established by Weiste et al. (2007) was extended. The developed high-throughput transformation procedure was used to generate new TF overexpression seed collections. Afterwards the library was applied in a screening approach to identify regulators which mediate enhanced tolerance towards the oxidative stress inducing chemical Paraquat. Thus, the TFs bZIP1 and OBP1 were found to promote resistance against Paraquat when overexpressed in Arabidopsis. In summary, using both approaches novel putative regulators of plant stress response signaling were identfied. KW - Ackerschmalwand KW - Transkriptionsfaktor KW - Protoplast KW - High throughput screening KW - Genaktivierung KW - Arabidopsis thaliana KW - transcription factor KW - protoplast KW - high throughput screening KW - gene activation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72057 ER - TY - THES A1 - Saupe, Stefanie T1 - Funktion des Lipidtransferproteins 2 (LTP2) und dessen Rolle bei der Bildung von durch Agrobacterium tumefaciens induzierten Wurzelhalsgallen an Arabidopsis thaliana T1 - Function of lipid transfer protein 2 (ltp2) and its function in Agrobacterium tumefaciens induced crown gall development on Arabidopsis thaliana N2 - In Tumoren an Arabidopsis thaliana, induziert über Agrobacterium tumefaciens (Stamm C58), ist von den 49 bekannten Lipidtransferproteinen (LTPs) nur die Expression von LTP2 stark erhöht (Deeken et al., 2006). Mutanten ohne LTP2-Transkripte (ltp2KO) entwickeln deutlich kleinere Tumore als der Wildtyp. Durch die permanenten Zellstreckungs- und Dehnungsprozesse besitzen Tumore keine intakte Epidermis (Efetova et al., 2007). Dies wiederum führt zum Verlust einer vollständigen Cuticula-Schicht, welche von der Epidermis produziert wird und dieser als Barriere zur Umwelt aufgelagert ist. Um den transpirationsbedingten Wasserverlust zu minimieren, werden in Tumoren langkettige Aliphaten in die äußeren Zellschichten eingelagert (Efetova et al., 2006). Ein ähnliches Szenario findet um Verwundungsareale statt (Kolattukudy et al., 2001). Die Gen-Expression von LTP2 wird nicht durch tumorinduzierende Agrobakterien ausgelöst. Faktoren wie Verwundung, sowie die Applikation des Trockenstress-Phytohormons Abscisinsäure (ABA) begünstigen die LTP2-Gen-Expression positiv. Außerdem ist der LTP2-Promotor in Gewebe aktiv, in welchem sekundäre Zellwandmodifikationen auftreten, sowie insbesondere in Abscissionsschichten von welkenden Organen. Ungerichtete Lipidanalysen der ltp2KO-Mutante im Vergleich zum Wildtyp zeigten nur signifikante Veränderungen in der Menge definierter Sphingolipide – obwohl bislang eine Beteiligung von LTP2 am Transfer von Phospholipiden postuliert wurde. Allerdings kann das LTP2-Protein, wie Protein-Lipid-Overlay-Analysen demonstrierten, weder komplexen Sphingolipide noch Sphingobasen binden. Neben Sphingobasen sind auch langkettige Fettsäuren Bestandteile von Sphingolipiden und diese sind wiederum Bindepartner von LTP2. Um eine eventuelle Beteiligung von LTP2 an der Bildung von Suberin von Tumoren zu zeigen, wurde dieses analysiert. Die GC-MS-Analysen des Tumor-Suberins haben jedoch veranschaulicht, dass durch das Fehlen von LTP2-Transkripten das Lipidmuster nicht beeinträchtigt wird. Eine Überexpression von LTP2 im gesamten Kormophyten war trotz drei unabhängiger experimenteller Ansätze nicht möglich. Daher wurde das Protein ektopisch in epidermalen Zellen exprimiert (CER5Prom::LTP2). Die Transgenen CER5Prom::LTP2 wiesen einige morphologische Besonderheiten auf, wie verminderte Oberflächenhydrophobizität, aberrante Blüten- und Blattmorphologien etc., die typisch für Wachsmutanten sind. GC-MS-Analysen der cuticulären Wachse dieser transgenen Pflanzen zeigten, einen erhöhten Gehalt an C24- und C26-Fettsäuren, wohingegen die korrespondierenden Aliphaten wie Aldehyde und Alkane dezimiert waren. Unterstützend zeigten Lokalisationsanalysen, dass das LTP2-Protein an/in der Plasmamembran assoziiert ist. Somit kann die These aufgestellt werden, dass LTP2 langkettigen, unverzweigten Aliphaten (Fettsäuren) an der Grenzfläche Plasmamembran/Zellwand transferiert, die zur Versieglung und Festigung von Zellwänden benötigt werden. N2 - Out of 49 known lipid transfer protein (LTP) only the expression of LTP2 is highly increased in tumors induced on Arabidopsis thaliana via Agrobacterium tumefaciens (strain C58; Deeken et al., 2006). Mutants with no LTP2 transcripts (ltp2KO) develop significantly smaller tumors than the wild-type. Due to the permanent cell stretch and elongation processes tumors do not possess an intact epidermal layer (Efetova et al., 2007). This leads to the loss of a complete cuticle layer, which is produced by the epidermis and builds up a barrier to the environment. To minimize the transpirational water loss, long-chain aliphatic compounds are incorperated into the outer cell layers of tumors (Deeken et al., 2006). The gene expression of LTP2 is not triggered by tumor-inducing agrobacteria. Instead, factors such as wounding and the application of the phytohormone abscisic acid (ABA) induce the LTP2 gene expression. In addition, the LTP2 promoter is highly active in tissue, in which secondary cell wall modifications occur, and in the abscission zone of wilting organs. Untargeted lipid analyzes of ltp2KO mutant in comparison to the wild type showed significant changes in the amount of defined sphingolipids only - although the involvement of LTP2 has been postulated for the transfer of phospholipids. However, the LTP2 protein, as protein-lipid overlay analysis demonstrated, binds neither complex sphingolipids nor sphingobases. Instead LCFAs, which are part of sphingolipids are binding partners of LTP2. In order to show a possible involvement of LTP2 in the formation of tumor-suberin GC-MS analyzes were performed. These demonstrated that the composition of the lipid-pool is not altered in ltp2KO plants. Overexpression of LTP2 was not possible in spite of three independent experimental approaches. The protein was instead expressed ectopically in epidermal cells (CER5Prom::LTP2). The transgenes CER5Prom::LTP2 showed some morphological abnormities, such as reduced surface hydrophobicity, aberrant flowers and leaf morphologies, which are typical for wax mutants. GC-MS analyzes of the cuticular wax of those transgenic lines revealed an increased amount of C24- and C26- fatty acids. Furthermore LTP2 was localized at the plasma membrane. Thus, this thesis proposes a role of LTP2 in the transfer of long chain, unbranched aliphatics (fatty acids), which are needed to seal up and strengthen cell walls at the interface plasma membrane and cell wall. KW - Ackerschmalwand KW - Suberin KW - Cutinase KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Lipid-Carrier-Proteine KW - Lipidtransferprotein KW - Fettsäure KW - Aliphaten Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-105449 ER - TY - THES A1 - Maierhofer, Tobias T1 - Funktionelle Charakterisierung von SLAC1-homologen Anionenkanälen aus Arabidopsis thaliana T1 - Functional characterization of SLAC1-homologous anion channels from Arabidopsis thaliana N2 - S-Typ (slow)-Anionenkanäle vermitteln in Schließzellen den Efflux von Chlorid und Nitrat, welcher letztendlich zum Schließen der Stomata, z.B. als Antwort auf Trockenstress, führt. Dabei kommt dem Phytohormon Abscisinsäure (ABA) eine zentrale Rolle zu. Es wird als Antwort auf Trockenheit synthetisiert und vermittelt über eine schnelle ABA-Signaltransduktionskette die Aktivierung von S-typ Anionenkanälen. SLAC1 war die erste Komponente eines S-Typ-Anionenkanals, die in Schließzellen identifiziert wurde. Durch die Expression in Xenopus Oozyten, konnte SLAC1 als S-Typ-Anionenkanal funktionell charakterisiert werden und seine Regulation über Kinasen (OST1, CPK21/23) und Phosphatasen (ABI1, ABI2) beschrieben werden. Mit diesen Untersuchungen gelang ein entscheidender Durchbruch bei der Entschlüsselung von Netzwerken, welche den Anionentransport in Schließzellen als Antwort auf Trockenstress regulieren. Im Laufe dieser Arbeit konnte in Schließzellen von Arabidopsis auch die Expression des SLAC1 Homolog 3 (SLAH3) nachgewiesen werden. Die Koexpression von SLAH3 mit der Ca2+-abhängigen Proteinkinase CPK21 in Xenopus Oozyten führte zu Nitrat-induzierten Anionenströmen. Dabei wurde die Aktivität dieses S-Typ-Anionenkanals, sowohl durch Phosphorylierung, als auch durch Kalzium und Nitrat gesteuert. Ähnlich wie bei der Regulation von SLAC1 konnte die Aktivität von SLAH3 durch die Proteinphosphatase ABI1, aus der Familie der PP2Cs, blockiert werden. Diese Eigenschaft von ABI1 passt sehr gut zur bekannten Rolle dieser Phosphatase in Schließzellen: ABI1 ist ein negativer Regulator der ABA-Signalkaskade und wird durch ABA inhibiert. Unsere biophysikalischen Analysen führten schließlich zur Rekonstitution des schnellen ABA-Signaltransduktionsweges. Die Bindung von ABA an den Komplex aus ABA-Rezeptor (RCAR/PYL/PYR) und ABI1 bewirkt die Inaktivierung von ABI1 und somit die Aktivierung von CPK21. Für deren volle Aktivität ist eine ABA-abhängige Erhöhung der zytosolischen Ca2+-Konzentration notwendig. Die aktivierte Kinase CPK21 ist schließlich in der Lage, den Anionenkanal SLAH3 zu phosphorylieren und in der Anwesenheit von Nitrat zu aktivieren. Somit liefert die Identifizierung und Charakterisierung von SLAH3, als den Nitrat-, Kalzium- und ABA-sensitiven Anionenkanal in Schließzellen, Einblicke in die Beziehung zwischen der Reaktion dieses Zelltyps auf Trockenstress, der Funktion von Nitrat als Signalmolekül und dem Nitratmetabolismus. Für die meisten höheren Pflanzen stellt Nitrat die wichtigste Stickstoffquelle dar. Die Nitrataufnahme über die Wurzel repräsentiert daher den entscheidenden Schritt für den Stickstoff-Metabolismus. Ausgehend von den Zellen des Wurzelkortex muss das Nitrat für den Langstreckentransport in die oberen Pflanzenorgane, in die Xylemgefäße der Stele eingebracht werden. Die Identifikation von Proteinen und Genen, die für den Nitrattransport verantwortlich sind, ist für das Verständnis der Nitrataufnahme und -verteilung in der Pflanze eine Grundvoraussetzung. Dabei scheinen Protonen-gekoppelte Transporter der NRT1-, bzw. NRT2-Klasse, die Verschiebung von Nitrat aus dem Boden in die Wurzeln zu bewerkstelligen. Aus der Endodermis, bzw. den Xylem-Parenchymzellen muss Nitrat anschließend in das extrazelluläre Medium der Xylemgefäße freigegeben werden, um über den Transpirationssog in den Spross zu gelangen. Auch am Transport dieses Anions in das Xylem ist mit NRT1.5 ein Nitrattransporter der NRT1-Klasse beteiligt, jedoch ergaben Experimente an NRT1.5-Verlustmutanten, dass weitere Transportmechanismen für den Efflux von Nitrat in das Xylem existieren müssen. Im Rahmen dieser Doktorarbeit konnte das SLAC1-Homolog 2 (SLAH2) funktionell in Xenopus Oozyten exprimiert werden. Mit Hilfe der BIFC-Methode wurde gezeigt, dass dabei die Interaktion mit der Ca2+-abhängigen Proteinkinase CPK21 essentiell ist. Elektrophysiologische Experimente verdeutlichten, dass SLAH2 einen Nitrat-selektiven S-Typ-Anionenkanal repräsentiert, dessen Aktivität gleichzeitig durch die Anwesenheit eben dieses Anions im externen Medium reguliert wird. Durch die Promoter:GUS-Technik gelang es, die Lokalisation von SLAH2 exklusiv in den Zellen der Wurzelstele von Arabidopsis nachzuweisen. Aufgrund des stark negativen Membranpotentials pflanzlicher Zellen und der vorliegenden Anionengradienten, dürften Anionenkanäle in erster Linie den Ausstrom von Anionen vermitteln. Da in Nitrat-Aufnahme-Experimenten an SLAH2-Verlustmutanten, im Vergleich zu Wildtyp-Pflanzen, ein geringerer Nitratgehalt im Spross, dagegen eine höhere Konzentration dieses Anions in den Wurzeln zu detektieren war, scheint der S-Typ-Anionenkanal SLAH2 am Transport von Nitrat aus den Wurzeln in die Blätter beteiligt zu sein. Dabei könnte er entweder direkt an der Beladung des Xylems mit Nitrat mitwirken, oder diese durch seine potentielle Funktion als Nitratsensor regulieren. N2 - S-type (slow)-anion channels in guard cells mediate the efflux of chloride and nitrate which finally leads to the closing of stomata, e.g. in response to drought stress. Hereby the phytohormone abscisic acid (ABA) plays a central role. It is synthesized in response to drought and mediates the activation of S-type anion channels via a fast ABA signal transduction pathway. SLAC1 was the first component of S-type anion channels that was identified in guard cells. Following expression in Xenopus oocytes, SLAC1 could be functionally characterized as a S-type anion channel and its regulation via kinases (OST1, CPK21/23) and phosphatases (ABI1, ABI2) could be demonstrated. These studies represented a crucial breakthrough in decoding networks that regulate the anion transport in guard cells in response to drought stress. In the course of this work the expression of the SLAC1 homolog 3 (SLAH3) was detected in guard cells of Arabidopsis, too. In line with the phosphorylation-dependent activation of SLAC1, coexpression of SLAH3 with the Ca2+-dependent protein kinase CPK21 in Xenopus oocytes resulted in nitrate-induced anion currents. Thus the activity of this S-type anion channel was controlled by phosphorylation as well as via calcium and nitrate. Similar to the regulation of the activity of SLAC1, SLAH3 could be blocked by the protein phosphatase ABI1, a member of the PP2C family. This property of ABI1 is well in line with its known physiological role in guard cells: ABI1 represents a negative regulator of ABA signaling and is inhibited by ABA. Our biophysical and biochemical analyses resulted in the reconstitution of the fast ABA signal transduction pathway: Binding of ABA to the complex of the ABA receptor (RCAR/PYL/PYR) and ABI1 leads to the inactivation of ABI1 and thus to the activation of CPK21. For its full activity an ABA-dependent increase in the cytosolic Ca2+ concentration is necessary. The activated kinase CPK21 is finally able to phosphorylate and activate the anion channel SLAH3 in the presence of nitrate. Thus, the identification and characterization of SLAH3 as the nitrate, calcium and ABA sensitive anion channel in guard cells, provides insights into the relationship between the reaction of this cell type to drought stress, the function of nitrate as a signaling molecule and the nitrate metabolism. Nitrate represents the most important nitrogen source for the majority of higher plants. Nitrate uptake by roots is therefore a decisive step in the nitrogen metabolism of plants. Starting from the cells of the root cortex nitrate is loaded into the xylem vessels of the stele for long-distance transport into the aerial plant organs. The identification of proteins and genes that are responsible for the transport of nitrate is a basic requirement for the understanding of nitrate uptake and distribution in the plant. Thereby proton coupled transporters of the NRT1 and NRT2 class seem to be responsible for the translocation of nitrate from the soil to the root. From the endoderm and the xylem parenchyma cells nitrate is then released into the extracellular medium of the xylem vessels to enter the transpiration stream to the shoot. NRT1.5, a transporter of the NRT1 family, was shown to be involved in this process. However, experiments on NRT1.5-deficient mutants showed that additional transport mechanisms for the efflux of nitrate into the xylem must exist. In the course of this dissertation the SLAC1 homolog 2 (SLAH2) was functionally expressed in Xenopus oocytes. With the help of the BIFC method it could be shown that hereby the interaction with the Ca2+-dependent protein kinase CPK21 is essential. Electrophysiological experiments demonstrated that SLAH2 represents a nitrate-selective S-type anion channel whose activity is regulated by the presence of this anion in the external medium. The localization of SLAH2 exclusively in the cells of the Arabidopsis root stele was detected via the promoter:GUS technique. Due to the hyperpolarized membrane potential of plant cells and the outward-directed anion gradients, it is likely that anion channels primarily mediate the efflux of anions. Nitrate uptake experiments on SLAH2 loss of function mutants revealed a lower nitrate content in the shoot compared to wild-type plants, whereas a higher concentration of this anion was detected in the roots. This indicates that the S-type anion channel SLAH2 is involved in the transport of nitrate from the roots into the leaves. Thereby SLAH2 could either be directly responsible for the xylem loading with nitrate or it could regulate this process by its potential function as a nitrate sensor. KW - Ackerschmalwand KW - Anionentranslokator KW - Nitration KW - Schließzelle KW - Stomaschluss KW - SLAC1 KW - S-Typ KW - stomatal closure KW - SLAC1 KW - S-type KW - Schmalwand Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85406 ER - TY - THES A1 - Bieber, Michael T1 - Funktionelle Charakterisierung zweier Lipid Transfer Proteine in der Arabidopsis thaliana Pathogenantwort T1 - Functional characterization of two lipid transfer proteins involved in Arabidopsis thaliana pathogen defense response N2 - Die Multigenfamilie der Lipid Transfer Proteine (LTP) stellt eine Gruppe von kleinen Proteinen dar, welche in allen höheren Landpflanzen vorkommen. In der Modellpflanze Arabidopsis thaliana werden 92 Proteine zur Klasse der LTPs gezählt. Die Benennung der Proteinfamilie basiert auf dem beobachteten in vitro Transfer von Lipiden zwischen zwei Membranen. Alle LTPs weisen ein konserviertes, 8 Cysteine beinhaltendes Motiv und eine hydrophobe Tasche auf, welche für die Bindung hydrophober Moleküle verantwortlich ist. Aufgrund ihrer Signalsequenz werden LTPs über den sekretorischen Weg in den extrazellulären Raum geschleust. Für einige pflanzliche LTPs konnte eine derartige Sekretion bereits nachgewiesen werden. Für andere LTPs wird eine Funktion in der Kutinbildung, der Embryogenese oder der pflanzlichen Immunantwort gegen Phytopathogene postuliert. Letzteres wurde für DIR1 (DEFECTIVE IN INDUCED RESISTANCE 1) und AZI1 (AZELAIC ACID INDUCED 1) nachgewiesen, während von LTPIV.4 (At4g55450) nur bekannt ist, dass die Expression spezifisch in Antwort auf Pathogene induziert ist. Aus diesem Grund wurde in der vorliegenden Arbeit die Funktion von LTPIV.4 und AZI1 in Bezug auf die pflanzliche Pathogenantwort in Arabidopsis thaliana untersucht. Anhand von GFP-Fusionsproteinen konnte für LTPIV.4 und AZI1 eine Endoplasmatische Retikulum-Lokalisierung detektiert werden. Auch eine gewebespezifische Promotoraktivität von LTPIV.4 an den Leitgeweben und in jungen sich entwickelnden Blättern konnte identifiziert werden. Diese Erkenntnisse lassen darauf schließen, dass LTPIV.4 möglicherweise an der Signaltransduktion am/im Leitgewebe mitverantwortlich ist. Im Fokus dieser Arbeit stand die spezifische Einordnung von LTPIV.4 in der Ausbildung der lokalen bzw. systemischen Immunantwort von Arabidopsis thaliana. Anhand einer Infektion von Wildtyppflanzen und LTPIV.4 Mutanten mit zwei verschiedenen Pseudomonasstämmen konnte eine LTPIV.4-abhängige Steigerung der pflanzlichen Resistenz gegen die biotrophen Bakterien nachgewiesen werden. In der Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia hingegen zeigte sich keine LTPIV.4 Abhängigkeit. Da die Hormone Salicylsäure (SA) und Jasmonsäure (JA) in der Ausbildung der pflanzlichen Abwehr gegen verschiedene Pathogene wichtig sind, wurden die Hormonlevel von SA und JA in ltpIV.4, 35S::LTPIV.4 sowie in Wildtyppflanzen analysiert. Die untersuchten Phytohormongehalte zeigten eine LTPIV.4 unabhängige, schnelle Akkumulation von SA nach der Infektion mit virulenten (vir) Pseudomonas syringae pv. maculicola (Psm) und eine spätere Erhöhung der JA-Gehalte. Es konnte somit kein regulatorischer Effekt von LTPIV.4 auf die SA- sowie die JA-Gehalte detektiert werden. Die Expression von SAG13 (SENESCENCE-ASSOCIATED GENE 13) und OXI1 (OXIDATIVE SIGNAL-INDUCIBLE 1), welche eine Funktion im programmierten Zelltod (PCD) haben beziehungsweise durch oxidativen Stress induziert werden, war hingegen erhöht in konstitutiv LTPIV.4 exprimierenden Pflanzen, verglichen mit dem Wildtyp von LTPIV.4. Als ein weiterer Ansatzpunkt für die funktionelle Charakterisierung von LTPIV.4 wurde die in vitro Identifizierung möglicher Substrate mittels Lipid-Protein-Interaktionsanalysen, sowie einer unspezifischen Metabolomanalyse herangezogen. Bei den Interaktionsanalysen konnten Phosphatidsäuren (PA), Phosphatidylglycerine (PG), Monogalactosyldiacylglycerole (MGDG) und auch Digalactosyldiacylglycerole (DGDG) als Interaktionspartner von LTPIV.4 identifiziert werden. Die Metabolomanalyse zeigte einen quantitativen Unterschied zwischen Wildtyp/35S::LTPIV.4 und ltpIV.4 bei einigen MGDG, DGDG und PG Spezies. Aus den in dieser Arbeit gewonnen Daten lässt sich somit schließen, dass LTPIV.4 nach Pathogen/Schaden-assoziierte molekulare Muster- (PAMP/ DAMP-) Erkennung, z.B. von Psm, SA-abhängig vermehrt gebildet wird. Da die konstitutive Expression von LTPIV.4 sowohl zu erhöhter OXI1 und SAG13 Expression als auch zu erhöhter Resistenz gegenüber Psm führt, lässt sich ein Modell aufstellen, in dem LTPIV.4 als positiver Regulator des PCD die Pathogenresistenz von Arabidopsis erhöht. Der zugrunde liegende Mechanismus ist unbekannt. Die Bindung von PAs, PGs, MGDGs und DGDGs an LTPIV.4 in vitro könnte darauf hindeuten, dass auch in vivo hydrophobe Moleküle gebunden und möglicherweise transportiert werden und dies ein Teil der Pathogenantwort ist. Es wäre z.B. denkbar, dass eine mögliche Translokation von LTPIV.4 über das ER in das Zytoplasma oder den apoplastischen Raum erfolgt. Dort interagiert LTPIV.4 mit durch ROS gebildeten, oxidierten Lipiden oder DAMPs und löst entweder symplastisch durch eine Interaktion in der Infizierten Zelle oder in intakten Nachbarzellen durch eine weitere Signaltransduktionskaskade den PCD sowie eine erhöhte ROS Bildung aus, oder das LTP interagiert spezifisch mit oxidierten Lipiden oder DAMPs von abgestorbenen Nachbarzellen, und löst eine intrazelluläre Signalkaskade mit Initiierung des PCD sowie erhöhter ROS-Bildung aus. AZI1 wurde als zweites LTP in dieser Arbeit einbezogen. Ausgehend von der Beobachtung, dass die konstitutive Expression von AZI1 die Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogene Botrytis cinerea erhöht, sollte in der vorliegenden Arbeit detailiert untersucht werden, ob AZI1 eine Rolle in der Resistenz gegen das nekrotrophe Pathogen Sclerotinia sclerotiorum spielt. Die azi1-1 Mutante zeigte hierbei jedoch eine erhöhte Resistenz gegen den nekrotrophen Pilz Sclerotinia sclerotiorum. Da bisher keine Unterschiede in der Genexpression von spezifischen Markergenen in WT und azi1-1 Pflanzen nach Sklerotiniainfektion festgestellt werden konnte und es auch für LTPs bekannt ist, dass sie eine Rolle in der Kutikulasynthese spielen, wäre eine Hypothese, dass die unterschiedlichen Infektionsphänotypen mit Sclerotinia und Botrytis auf eine strukturelle Veränderung der Kutikulabeschaffenheit zurückzuführen sind. Weiterhin konnte für AZI1 eine mögliche Rolle in der Verwundungsantwort detektiert werden, da sowohl die AZI1 Genexpression, als auch die erhaltenen basal signifikant erhöhten 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA)-Gehalte auf eine negativ regulatorische Rolle von AZI1 in der Verwundungs-abhängigen JA-Signaltransduktion hindeuten. N2 - Functional characterization of two lipid transfer proteins involved in Arabidopsis thaliana pathogen defense response KW - Lipid-Carrier-Proteine KW - Lipid Transfer Proteine KW - plant pathogen resistance KW - pflanzliche Pathogenresistenz KW - lipid transfer proteins KW - Arabidopsis thaliana KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - Pseudomonas syringae KW - AZI1 KW - AZI1 KW - Ackerschmalwand KW - Resistenz KW - Pseudomonas syringae Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97682 ER - TY - THES A1 - Larisch, Christina T1 - Laser Mikrodissektion als Tool für gewebespezifische Expressionsanalysen in Pflanzen: Methodik und Anwendung T1 - Laser Microdissection as a tool for tissue specific expression analyses in plants: method and application N2 - Die Laser Mikrodissektion konnte in der vorliegenden Arbeit als geeignetes Tool für Expressionsanalysen pflanzlicher Gewebe weiterentwickelt werden. Nach einer umfangreichen Optimierung der Technik und Anpassung an die jeweiligen Gegebenheiten der zu analysierenden pflanzlichen Gewebe konnten unterschiedliche physiologische Fragestellungen an verschiedenen Pflanzen bearbeitet werden. Methodische Fortschritte Bei den Arbeiten an infiltrierten Arabidopsis-Pflanzen zeigten sich die methodischen Verbesserungen besonders deutlich: i. Die Zeit der Probengenerierung konnte um 60 80 % reduziert werden, wobei gleichzeitig die Qualität und Quantität der isolierten RNA erheblich verbessert wurden. ii. Dadurch konnte auf die in Deeken et al. (2008) beschriebene Voramplifikation, die stets zum Verlust niedrig exprimierter Gene führt, verzichtet und eine deutlich größere Zahl an im Phloem exprimierten Genen identifiziert werden. iii. Dass dabei 95 % der bei Deeken et al. beschriebenen Phloem-Gene wiedergefunden wurden, zeigt die hohe Reproduzierbarkeit der LMPC-Technik, die durch die Optimierung erreicht werden konnte. Pathogenantwort im Arabidopsis-Phloem iv. Die Laser Mikrodissektion konnte entsprechend i iii eingesetzt werden, um Phloem-Proben von Arabidopsis-Blütenstielen nach Pathogenbefall zu sammeln. v. Bei der Suche nach entsprechenden Phloem-mobilen Signalen, die in systemischen Geweben zur Auslösung der SAR führen, zeigte sich, dass im Phloem der Arabidopsis-Blütenstiele v. a. der Jasmonsäureweg angeschaltet wird. SAR-Marker fanden sich kaum induziert. vi. Im Vergleich der Mikroarray- und qPCR-Ergebnisse wird deutlich, dass mittels LMPC die Vorgänge im Phloem deutlich besser aufgelöst werden können, da die Untersuchungen an kompletten Blütenstielen deutliche Abweichungen gegenüber den Phloem-Arrays aufwiesen. Die Analysen der Mikroarrays sowie die zugehörigen Zeitreihenexperimente sind noch nicht abgeschlossen. Pappel-Holzstrahlen als Schaltstelle der saisonalen Umsteuerung vii. Die Laser Mikrodissektion kann alternativ auch in einem inversen Ansatz angewendet werden. viii. Über auf diese Weise angereicherte Holzstrahlen der Pappel war es möglich, tiefgreifende Einblicke in die Saisonalität der Pappel zu erlangen. ix. Zusammen mit Metabolit- und qPCR-Analysen lieferten diese Ergebnisse einen zeitlichen Ablaufplan der zugrundeliegenden physiologischen Prozesse, insbesondere bei der Umsteuerung von der Dormanz zur Wiederaufnahme des aktiven Wachstums im Frühjahr. N2 - In this dissertation, the Laser Microdissection could be further improved for usage as an adequate tool for expression analyses of plant tissues. Following a large optimization of the technique itself and an adaptation to the conditions of the plant tissues to be analyzed, different physiological questions could be processed using distinct plant species. Methodic improvements Especially while working with infiltrated Arabidopsis plants the methodic improvements were visible: i. The time for sample-generation could be decreased by 60-80 %, at the same time quality and quantity of the isolated RNA could be significantly enhanced. ii. By this the in Deeken et al. (2008) described pre-amplification step, which always leads to loss of low expressed genes, could be omitted, and a considerable higher number of phloem-expressed genes could be identified. iii. Finding 95 % of the in Deeken et al. specified genes in the new list demonstrates the high reproducibility of the LMPC-technique which could be achieved by the optimization. Pathogen response in the Arabidopsis phloem iv. The Laser Microdissection could be used accordingly to i-iii to collect phloem-samples of Arabidopsis inflorescence stalks after a pathogen infection. v. By searching for corresponding phloem-mobile signals that lead to an induction of SAR in systemic tissues it appeared that predominantly the jasmonic acid pathway activated in the phloem of Arabidopsis inflorescence stalks. SAR-marker genes were hardly induced. vi. Comparison of the microarray- and qPCR-data revealed that LMPC shows the processes in the phloem more specific, because analyses of complete inflorescence stalks showed explicit differences to the phloem-microarrays. Analyses of the microarrays as well as the corresponding time course experiments are not yet completed. Poplar wood rays as switch point of seasonal remodeling vii. Alternatively, the Laser Microdissection can be used in an inverted approach. viii. By this approach enriched poplar wood rays allowed deep insight into seasonality of poplar. ix. Together with metabolite- and qPCR-analyses these results provided a timetable of underlying physiological processes, especially during the remodeling from dormancy to resumption of active growth in spring. KW - Pappel KW - Ackerschmalwand KW - Laser KW - Mikrodissektion KW - Pflanzengewebe KW - Genexpression KW - Laser Mikrodissektion KW - Saisonalität KW - Holzstrahlen KW - systemische Resistenz KW - Laser Microdissection KW - seasonality KW - wood rays KW - systemic resistance Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70182 ER - TY - THES A1 - Stölzle, Sonja T1 - Licht- und Redoxregulation von Calcium-permeablen Kanälen in Arabidopsis thaliana Mesophyllzellen T1 - Light- and redoxregulation of calcium-permeable channels in Arabidopsis thaliana mesophyll cells N2 - 1. Mesophyllzellen von Arabidopsis thaliana sind mit Hyperpolarisations-ab-hängigen, Calcium-permeablen Kanälen ausgestattet. In Ca2+-haltigen Lösungen folgte die Nullstromspannung der Nernst-Spannung mit 27 mV bei einer zehnfachen Erhöhung der Ca2+-Konzentration. Die Sequenz an relativen Stromamplituden ergab Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). Der makroskopische Strom wurde auf der Basis einer 7,2 ± 1 pS-Leitfähigkeit bei einer Pipettenlösung mit 10 mM Ba2+ in der cell-attached Konfiguration gebildet. Die Kanäle waren sensitiv gegenüber Lanthan und Gadolinium, wobei die Stromamplitude bei 100 µM Lanthan um 97,2 ±7 % und bei 100 µM Gadolinium um 95,2 ± 7 % reduziert wurde. 2. Blaulicht induzierte den Hyperpolarisations-abhängigen, Calcium-permeablen Kanal in dunkeladaptierten, intakten Mesophyll-Protoplasten. Die Aktivierung war zeitabhängig und der Stromanstiegs erreichte eine Sättigung nach 11-16 Minuten. Weiterhin wurde bestimmt, dass eine Kanalaktivität erst bei einer Intensität an Blaulicht > 50 µmol/m2s1 induziert wird. Aufgrund der Tatsache, dass der photosynthetische Elektronentransport-Entkoppler DCMU die Aktivierung nicht verhinderte, konnte eine Beteiligung des Photosyntheseapparates ausgeschlossen werden. Eine Inhibierung der Aktivierung nach Inkubation mit dem Kinase-Inhibitor K252a war ein erster Hinweis für die Beteiligung von Phototropinen als relevante Blaulicht-Rezeptoren, da Phototropine eine Kinase-Funktion besitzen. Diese Hypothese bestätigte sich nach Überprüfung der Phototropin-knockout-Mutanten phot1-5 und phot1-5 phot2-1. Da die Aktivierung in phot1-5 reduziert war, und in phot1-5 phot2-1 keine Aktivierung der Kanäle durch Blaulicht mehr möglich war, konnte auf eine überlappende Funktion beider Photorezeptoren bezüglich der Aktivierung von Calcium-permeablen Kanälen geschlossen werden. Dagegen konnte eine Beteiligung weiterer Blaulicht-Rezeptoren, der Cryptochrome, ausgeschlossen werden. 3. Neben Blaulicht aktivierten auch reaktive Sauerstoff-Spezies (ROS) Hyper-polarisation-abhängige, Calcium-permeable Kanäle. Protoplasten mit intaktem Cytoplasma (cell-attached Konfiguration) zeigten nach Applikation von 5 mM H2O2 eine zeitabhängige Aktivierung der Lanthan-sensitiven Kanäle. Eine Sättigung des Stromanstiegs wurde nach ca. 25 Minuten erreicht. Neben dem Wildtyp (Col-0) wurde die Mutante dnd1 hinsichtlich Calcium-permeabler Kanäle überprüft. Sie besitzt einen nicht-funktionellen putativen cyclisch-Nukleotid-aktivierten Kanal, CNGC2, und zeigt Phänotypen bei der Pathogenabwehr. Eine histochemische DAB-Färbung ergab, dass dnd1 eine dem Wildtyp vergleichbare ROS-Produktion nach Inokulation mit avirulenten Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB besitzt. Da eine ROS- bzw. H2O2-Produktion, ein wichtiger initiierender Schritt bei Abwehrmechanismen, in der Mutante nicht beeinträchtigt war, wurde überprüft, ob ROS-aktivierte, Calcium-permeable Kanäle in dnd1 beobachtet werden konnten. Nach Applikation von 5 mM H2O2 zu intakten Protoplasten wurde keine dem Wildtyp vergleichbare Aktivierung Calcium-permeabler Kanäle festgestellt. Daraufhin konnte spekuliert werden, dass CNGC2 im Wildtyp den Calcium-permeablen Kanal repräsentiert. Eine Blaulicht-Aktivierung der Calcium-permeablen Kanäle in der Kanal-Mutante war jedoch möglich, was die Frage aufkommen ließ, ob es sich um verschiedene Kanäle mit denselben elektrophysiologischen Charakteristika handelt, oder ob es sich bei dem H2O2-aktivierten und dem Blaulicht-aktivierten Kanal um denselben Kanal handelt, der durch verschiedene Signalketten angeschaltet wird. Cyclische Nukleotide (cAMP) konnten die Kanäle in Wildtyp-Protoplasten nicht aktivieren, was dagegen sprach, dass es sich um CNGC2 handelte. Eine Inhibierung der H2O2-aktivierten Ströme durch den Calmodulin-Inhibitor W7 wies auf eine Beteiligung eines Calmodulin-abhängigen Schritts in der Signalkette hin. Untersuchungen des Calcium-permeablen Kanals in der outside-out Konfiguration mit einer dem Cytoplasma ähnlichen internen Lösung ergab, dass eine Kanalaktivität durch eine erhöhte Calcium-Konzentration (21 µM) bei Vorhandensein von Calmodulin induziert werden konnte. Cyclische Nukleotide aktivierten wie erwartet keine Hyperpolarisation-abhängigen, Calcium-permeablen Kanäle. Dies deutete darauf hin, dass CNGC2 die Calcium-permeablen Kanäle über einen Ca2+/Calmodulin-abhängigen Schritt in einer H2O2-induzierten Signalkette regulieren könnte. Lokalisationsstudien mit einem GFP-CNGC2-Fusionskonstrukt (CNGC2::mGFP4 /pPILY) zeigten, dass der Kanal in vivo im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert sein könnte. Dies bestätigte die Hypothese, dass CNGC2 nicht den Calcium-permeablen Kanal in der Plasmamembran repräsentiert und dass der Verlust der Kanalaktivität in dnd1 in einer beeinträchtigten Signalkette zu suchen ist. N2 - 1. Hyperpolarisation-dependent, calcium-permeable channels have been found in Arabidopsis thaliana mesophyll cells. In Ca2+-containing solutions, the reversal potential shifted 27 mV with a tenfold increase of the Ca2+-concentration. The relative sequence of permeability was Ba2+ (131,8 ± 20) > Ca2+ (100) > Mg2+ (84,3 ± 18). The macroscopic current in the cell-attached configuration was based on a 7,2 ± 1 pS-conductance with 10 mM Ba2+ in the pipette solution. The channels were sensitive to lanthanum and gadolinium. Current amplitudes decreased 97,2 ±7 % after application of 100 µM La3+ and 95,2 ± 7 % after application of 100 µM Gd3+. 2. Blue-light (450-490 nm) induced hyperpolarisation-dependent, calcium-permeable channels in dark-adapted mesophyll-protoplasts with intact cytoplasm. The current increase was time-dependent and saturated after 11-16 minutes. Examining the dose dependence of channel activation revealed that > 50 µmol/m2s1 blue-light induces channel activity. Phototsynthesis was shown to be not involved in the signaling cascade since the photosynthetic electron-transport inhibitor DCMU did not inhibit channel activation. The inhibition of channel activation with the kinase inhibitor K252a pointet to the involvement of phototropins. This hypothesis proved to be true when the phototropin knockout mutants phot1-5 and phot1-5 phot2-1 were examined. In phot1-5, the activation was clearly reduced and in phot1-5 phot2-1 no blue-light activation was observed anymore. Furthermore, this pointed to an overlapping function of both photoreceptors. The involvement of cryptochromes, further blue-light receptors, could be excepted. 3. Beside blue-light, also reactive oxygen species (ROS) were shown to activate calcium-permeable channels in intact mesophyll protoplasts. After application of 5 mM H2O2, lanthanum-sensitive channels showed a time-dependent current increase with a saturation after approx. 25 minutes. Beside wildtype-plants (Col-0), also the mutant dnd1 has been tested. dnd1 is characterized by a truncated protein of a putative cyclic-nucleotide-gated channel, CNGC2. The plants are dwarfed in stature, have an elevated level of salicylic acid and exhibit a resistance against a variety of virulent bacterial, fungal and viral phatogens without developing a hypersensitive response. After inoculation of leaves with Pseudomonas syringae DC 3000 pv. tomato avrB, dnd1 showed a production of ROS like the wildtype. In contrast, an activation of calcium-permeable channels by ROS was not observed. A blue-light-dependent activation of calcium-permeable channels was still possible. This raised the question if blue-light and H2O2 activate the same channel via different signaling cascades or if there are two calcium-permeable channels. Cyclic nucleotides alone did not activate the channels, pointing to the possibility that CNGC2 does not represent the calcium-permeable channel. Furthermore, when the intact cytoplasm was lost (outside-out configuration), H2O2-induced channel activity was also observed in dnd1, possibly due to the loss of a composition of regulating compounds in the cytoplasm. Therefore it was concluded that CNGC2 does not represent the observed calcium-permeable channel and that CNGC2 is placed upstream of the activation of these channels. An inhibition of the H2O2-induced channel activation by the calmodulin (CaM) inhibitor W7 pointet to the involvement of a CaM-dependent step in the signaling cascade. When the cytoplasm was replaced with a pipette solution containing an elevated level of Ca2+ (21 µM) and CaM, channel activity was induced. Ca2+, cyclic nucleotides or CaM alone did not have this effect. This pointed to the possibility, that CNGC2 might activate calcium-permeable channels via a Ca2+/CaM-dependent signaling pathway. Subcellular localisation studies with a GFP-fusionconstruct (CNGC2::mGFP4 /pPILY) revealed that CNGC2 might be located in the endoplasmatic reticulum. This reeinforced the hypothesis that CNGC2 does not represent the calcium-permeable channel in the plasma membrane and that the loss of channel activity in dnd1 is due to an impaired signaling cascade. Also the expression of GFP-labeled CNGC2 in a heterolguous system (HEK293 cells) showed that neither the full-length nor a mutant containing a partly deletion of the N-terminal end (CNGC2::EGFP/pcDNA3.1 or CNGC2-D112::EGFP/pcDNA3.1) is transported to the plasma membrane. Therefore no electrophysiological characterization of CNGC2 in this cell line was possible. KW - Ackerschmalwand KW - Mesophyll KW - Calciumkanal KW - Reaktive Sauerstoffspezies KW - Blaulicht KW - Patch-Clamp-Methode KW - Kanäle KW - Calcium KW - Patch-Clamp KW - Blaulicht KW - ROS KW - channels KW - calcium KW - patch-clamp KW - bluelight KW - ROS Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6975 ER - TY - THES A1 - Demir, Fatih T1 - Lipid rafts in Arabidopsis thaliana leaves T1 - Lipid Rafts in Arabidopsis thaliana Blättern N2 - Arabidopsis thaliana (A.th.) mesophyll cells play a pivotal role in the regulation of the drought stress response. The signaling & transport components involved in drought stress regulation within lipid rafts of the plasma membrane were investigated by DRM isolation from highly purified plasma membranes. Detergent treatment with Brij-98 and Triton X-100 resulted in a total of 246 DRM proteins which were identified by nano HPLC-MS/MS. The majority of these proteins could be isolated by Triton X-100 treatment (78.5 %) which remains the ”golden” standard for the isolation of DRMs. Comparing in-gel and in-solution digestion approaches disclosed additional protein identifications for each method but the in-gel approach clearly delivered the majority of the identified proteins (81.8 %). Functionally, a clear bias on signaling proteins was visible – almost 1/3 of the detected DRM proteins belonged to the group of kinases, phosphatases and other signaling proteins. Especially leucine-rich repeat receptor-like protein kinases and calcium-dependent protein kinases were present in Brij-98 & Triton X-100 DRMs, for instance the calcium-dependent protein kinase CPK21. Another prominent member of DRMs was the protein phosphatase 2C 56, ABI1, which is a key regulator of the ABA-mediated drought stress response in A.th. The lipid raft localization of the identified DRM proteins was confirmed by sterol-depletion with the chemical drug MCD. Proteins which depend upon a sterol-rich environment are depleted from DRMs by MCD application. Especially signaling proteins exhibited a strong sterol-dependency. They represented the vast majority (41.5 %) among the Triton X-100 DRM proteins which were no longer detected following MCD treatment. AtRem 1.2 & 1.3 could be shown to be sterol-dependent in mesophyll cells as well as two CPKs (CPK10 & CPK21) and the protein phosphatase ABI1. AtRem 1.2 & 1.3 could be proven to represent ideal plant lipid raft marker proteins due to their strong presence in Triton X-100 DRMs and dependency upon a sterol-rich environment. When fluorescence labeled AtRem 1.2 & 1.3 were transiently expressed in A.th. leaves, they localized to small, patchy structures at the plasma membrane. CPK21 was an intrinsic member of Triton X-100 DRMs and displayed extreme susceptibility to sterol-depletion by MCD in immunological and proteomic assays. Calcium-dependent protein kinases (CPKs) have already been studied to be involved in drought stress regulation, for instance at the regulation of S-type anion channels in guard cells. Hence, further transient expression studies with the anion channel SLAH3, protein kinase CPK21 and its counterpart, protein phosphatase ABI1 were performed in Nicotiana benthamiana. Transient co-expression of CPK21 and the anion channel SLAH3, a highly mesophyll- specific homologue of the guard cell anion channel SLAC1, resulted in a combined, sterol-dependent localization of both proteins in DRMs. Supplementary co-expression of the counterpart protein phosphatase ABI1 induced dislocation of SLAH3 from DRMs, probably by inactivation of the protein kinase CPK21. CPK21 is known to regulate the anion channel SLAH3 by phosphorylation. ABI1 dephosphorylates CPK21 thus leading to deactivation and dislocation of SLAH3 from DRMs. All this regulative events are taking place in DRMs of A.th. mesophyll cells. This study presents the first evidence for a lipid raft-resident protein complex combining signaling and transport functions in A.th. Future perspectives for lipid raft research might target investigations on the lipid raft localization of candidate DRM proteins under presence of abiotic and biotic stress factors. For instance, which alterations in the DRM protein composition are detectable upon exogenous application of the plant hormone ABA? Quantitative proteomics approaches will surely increase our knowledge of the post-transcriptional regulation of gene activity under drought stress conditions. N2 - Mesophyllzellen spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung der Trockenstress-Antwort in der Pflanze Arabidopsis thaliana (A.th.). Um die an der Trockenstress-Antwort beteiligten Signaltransduktions- und Transportproteine zu identifizieren, die sich in Lipid Rafts der pflanzlichen Plasmamembran befinden, wurden Detergent-Resistant Membranes (DRMs) aus hochreinen Arabidopsis Plasmamembran-Präparationen isoliert. Behandlung dieser hochreinen Plasmamembran mit den Detergentien Brij-98 und Triton X-100 führte zur Identifikation von 246 DRM Proteinen, die mittels der nano HPLC-MS/MS Technologie detektiert wurden. Hierbei war festzustellen, dass das Detergens Triton X-100 eindeutig den Standard für die Isolierung von DRMs darstellt. Die große Mehrheit (78,5 %) der identifizierten DRM Proteine konnte nämlich mit Triton X-100 aufgereinigt werden. Vergleichende Anwendung verschiedener Verdaumethoden (In-Gel & In-Lösung Verdau) zeigte auf, dass jede Methode einen unterschiedlichen Pool an Proteinen identifiziert. Das Gros der analysierten Proteine (81,8 %) konnte jedoch auch alleine durch In-Gel Verdau ermittelt werden. Unter den identifizierten DRM Proteinen stellten Proteine, die an der Signaltransduktion beteiligt sind, fast 1/3 dar. Diese Proteingruppe wurde hauptsächlich durch Kinasen und Phosphatasen vertreten. Insbesondere Leucin-reiche rezeptor-artige and Calcium-abhängige Proteinkinasen waren in Brij-98 & Triton X-100 DRMs zu beobachten, z.B. die Calcium-abhängige Proteinkinase CPK21. Ebenso in Triton X-100 DRMs wurde die Proteinphosphatase 2C 56 (ABI1) lokalisiert, die eine zentrale Rolle bei der ABA-vermittelten Antwort auf Trockenstress in A.th. inne hat. Zur Bestätigung der Lipid Raft Lokalisation der identifizierten DRM Proteine wurden Sterole aus der Plasmamembran mittels der Chemikalie Methyl-ß-D-cyclodextrin entfernt. Besonders Proteine, die an der Signalweiterleitung beteiligt sind, zeigten eine starke Abhängigkeit von der Präsenz der Sterole. Sie waren besonders betroffen: 41,5 % der Proteine, die nach MCD Behandlung nicht mehr in DRMs identifiziert wurden, gehörten zur Gruppe der Signaltransduktionsproteine. Beispiele waren sowohl die Calcium-abhängigen Proteinkinasen CPK10 & CPK21, als auch die Proteinphosphatase ABI1. Die A.th. Remorine AtRem 1.2 & 1.3 stellen ideale Kandidaten für pflanzliche Lipid Raft Markerproteine dar, da beide sowohl ziemlich stark in Triton X-100 DRMs vertreten, als auch im besonderen Maße auf die Präsenz von Sterolen in DRMs angewiesen sind. Fluoreszenzmarkierte AtRem 1.2 & 1.3 Fusionskonstrukte lokalisierten bei transienter Expression in A.th. Blättern in kleinen, punktförmigen Strukturen an der Plasmamembran. Diese Strukturen zeigten frappierende Ähnlichkeit zu bereits bekannten Mustern von Lipid Raft Proteinen in Hefen und Säugetieren. CPK21 stellte ein besonderes Mitglied der Triton X-100 DRMs dar, welches ebenfalls stark auf die Präsenz von Sterolen in DRMs angewiesen war. Dies konnte durch immunologische and massenspektrometrische Experimente nachgewiesen werden. Calcium-abhängige Proteinkinasen (CPKs) sind an der Regulierung der Trockenstress-Antwort in Pflanzen beteiligt, z.B. bei der Aktivierung von S-typ Anionenkanälen in Schließzellen von A.th. Aufgrund dieser Beteiligung an der Trockenstress-Antwort, wurden transiente Co-Expressionsstudien des Anionenkanals SLAH3, der Proteinkinase CPK21 und ihrem Gegenspieler, der Proteinphosphatase ABI1 in Nicotiana benthamiana Blättern durchgeführt. Transiente Co-Expression von CPK21 und SLAH3, einem zum schließzell-spezifischen Anionenkanal SLAC1 homologen Protein in Mesophyllzellen, resultierte in einer sterol-abhängigen Co-Lokalisation beider Proteine in DRMs. Zusätzliche Gabe vom Gegenspieler ABI1 führte zum Verschwinden von SLAH3 aus DRMs, was möglicherweise auf die Inaktivierung der Proteinkinase CPK21 durch ABI1 zurückzuführen ist. Für CPK21 konnte schon aufgezeigt werden, dass es den Anionenkanal SLAH3 durch Phosphorylierung aktiviert. ABI1 hingegen dephosphoryliert die Proteinkinase CPK21 und führt zur Deaktivierung vom Anionenkanal SLAH3, welcher dann auch nicht mehr in DRMs lokalisierbar ist. Diese streng regulierten Prozesse im Rahmen der Trockenstress-Antwort spielen sich in DRMs von A.th. Mesophyllzellen ab. Die vorliegende Arbeit ist der erste Bericht eines Lipid Raft-lokalisierten Proteinkomplexes, der Signalweiterleitung und Transportprozesse in Arabidopsis Lipid Rafts vereint. Zukünftige Lipid Raft Studien könnten sich mit der Lokalisation von putativen DRM Proteinen nach Anwendung von abiotischen und biotischen Stressfaktoren befassen. So könnte man sich die Frage stellen, inwiefern sich die Proteinzusammensetzung in DRMs von der Zugabe des pflanzlichen Hormons Abscisinsäure (ABA) beeinflussen läßt. Insbesondere quantitative Proteomstudien werden in Zukunft mit Sicherheit unser Wissen über die posttranskriptionelle Regulation der Genaktivität bei Trockenstress erweitern. KW - Ackerschmalwand KW - Abscisinsäure KW - Plasmamembran KW - Stressreaktion KW - Mesophyll KW - ABA KW - DRMs KW - Membrandomänen KW - Trockenstress KW - Anionenkanal KW - Biomembran KW - Blatt KW - Membran KW - ABA KW - DRMs KW - Membrane domains KW - Drought stress KW - Anion channel Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53223 ER - TY - THES A1 - Griebel, Thomas T1 - Local and systemic resistance in Arabidopsis thaliana in response to Pseudomonas syringae: impact of light and phytosterols T1 - Lokale und systemische Resistenzausbildung in Arabidopsis thaliana gegen Pseudomonas syringae: Der Einfluss von Licht und pflanzlichen Sterolen N2 - Inoculation with plant pathogens induces a diverse range of plant responses which potentially contribute to disease resistance or susceptibility. Plant responses occuring in consequence of pathogen infection include activation of classical defence pathways and changes in metabolic activity. The main defence route against hemibiotrophic bacterial pathogens such as Pseudomonas syringae is based on the phytohormone salicylic acid (SA). SA-mediated responses are strictly regulated and have also been shown to depend on external factors, e.g. the presence of light. A major goal of this work was to provide a better understanding of the light dependency of plant defence responses mediated through SA. The second part of the project focussed on the influence of plant sterols on plant resistance. I analyzed leaf lipid composition and found that accumulation of the phytosterol stigmasterol in leaves and in isolated (plasma) membranes is a significant plant metabolic process occurring upon pathogen infection. N2 - Eine Infektion mit Pathogenen veranlasst Pflanzen zur Aktivierung zahlreicher Abwehrreaktionen, welche entscheidend dazu beitragen können, ob die Pflanze anfällig ist und erkrankt oder eine erfolgreiche Resistenz ausbilden kann. Die Abwehr gegen hemibiotrophe bakterielle Pathogene basiert vor allem auf der verstärkten Bildung des Pflanzenhormons Salicylsäure (SA) und der Aktivierung SA-vermittelter Abwehrreaktionen. Beides ist nicht nur intern genau reguliert, sondern auch von externen Faktoren beeinflusst. So trägt zum Beispiel die Verfügbarkeit von Licht wesentlich zum Ausmaß und zum Erfolg dieser Abwehrreaktionen bei. Ein Ziel dieser Arbeit ist es, zu einem besseren Verständnis des Einflusses von Licht auf die Pathogenabwehr beizutragen. Das zweite Projekt dieser Arbeit stellt die Lipidzusammensetzung pathogen-infizierter Blätter in den Mittelpunkt. Bei der Analyse pflanzlicher Sterole zeigte sich unter anderem, dass das C22-ungesättigte Sterol Stigmasterol in Blättern und in daraus isolierten Plasmamembranen nach Pathogenbehandlungen akkumuliert. KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Resistenz KW - Licht KW - Phytosterine KW - Phytopathologie KW - Schmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - pflanzliche Sterole Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48370 ER - TY - THES A1 - Latz, Andreas T1 - Lokalisation, Funktion und Regulation pflanzlicher Tandem-Poren-Kaliumkanäle in Arabidopsis thaliana T1 - Localization, function and regulation of plant tandem-pore potassium-channels in Arabidopsis thaliana N2 - Lokalisation - Alle TPKs bis auf TPK4, der in der Plasmamembran lokalisiert ist, sind im Tonoplasten lokalisiert. - Das 14-3-3-Bindemotiv bzw. der komplette N-Terminus spielt im Gegensatz zu den tierischen TPK´s keine Rolle beim Targeting (und evtl. auch beim Assembly), da ein Austausch der N-Termini bzw. Mutationen im 14-3-3- Bindemotiv keinen Einfluss auf die subzelluläre Lokalisation hat. - Im C-Terminus ist möglicherweise ein strukturelles Motiv bzw. eine Erkennungssequenz für das Targeting in unterschiedliche Zielmembranen lokalisiert. Eventuell ist hier auch eine Assembly-Domäne für den Zusammenbau der unterschiedlichen Kanaluntereinheiten vorhanden. TPK4 - Der Kaliumkanal TPK4 wird nach Agro-Infiltration in dem pflanzlichen Expressionssystem Nicotiana benthamiana exprimiert. - TPK4 ist auch in diesem Expressionssystem in der Plasmamembran der Zelle lokalisiert. - Die Ströme, welche aus Mesophyllzellen von TPK4 infiltrierten Blättern abgeleitet wurden, gleichen denen, von TPK4 exprimierenden Oocyten von Xenopus laevis. Somit hat TPK4 in beiden Expressionssystemen die gleichen elektrophysiologischen Eigenschaften. TPK1 - TPK1 bindet über die C-terminalen EF-Hände Calcium und wird durch diese Interaktion aktiviert. - TPK1 interagiert phosphospezifisch und isotypspezifisch mit dem 14-3-3- Protein GRF6. Diese Interaktion führt zur Aktivierung des Kanals. - Die Kinasen CPK3 und CPK29, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 phosphorylieren um eine Interaktion mit 14-3-3-Proteinen zu ermöglichen, gehören zur Familie der CDPKs - Diese Kinasen sind selbst Calcium aktiviert und aller Wahrscheinlichkeit nach unter physiologischen Bedingungen inaktiv. Erst ein Anstieg der freien Calciumkonzentration führt zur Aktivierung der Kinase in der Zelle und damit zur Aktivierung des Kanals. - Das 14-3-3-Bindemotiv ist das einzige Target der CDPK´s im N-Terminus von TPK1 - Die Phosphatase, welche das 14-3-3-Bindemotiv von TPK1 dephosphoryliert gehört zur Familie der PP2A-Proteinphosphatasen. - Es ist möglich, dass die Kinase und damit auch der Kanal durch Salzstress und durch Kaliumunterversorgung aktiviert werden und somit die Signalkaskade für die Aktivierung von TPK1 über Kinasen/14-3-3/Calcium in einen stressphysiologischen Kontext involviert ist. - tpk1.3- und cpk3.1-Verlustmutanten zeigen eine Reduktion in der Keimungsrate unter Salzstress und limitierten Kaliumangebot. Es kann über einen funktionalen Komplex bestehend aus TPK1 und TPC1 zur Aufrechterhaltung der Na+/K+-Homeostase und der elektroneutralen Aufnahme von Na+ in die Vakuole unter Salzstressbedingungen spekuliert werden. N2 - Localization - All TPK´s with the exception of TPK4 are located in the tonoplast. TPK4 however is localized in the plasmamembrane. - The 14-3-3 binding motif and the whole N-terminus does not play a role in the targeting process because swapping the N-termini has no effect on the targeting - The C-terminus might harbour a targeting motif as well as an assembly domain TPK4 - TPK4 is expressed in Nicotiana benthamiana after agro-infiltration and is localized in the plasmamembrane. - The electrophysiological properties of TPK4 expressed in tobacco are similar to TPK4 expressed in oocytes of Xenopus laevis. TPK1 - TPK1 interacts with the 14-3-3 protein GRF6 in a phosphospecific and isotypspecific manner. - Interaction of TPK1 with GRF6 leads to channel activation. - The kinases CPK3 and CPK29 are able to phosphorylate the 14-3-3 binding motif of TPK1 in vitro. - These kinases are activated by elevated levels of free cytosolic calcium. - The phosphatase responsible for the dephosphorylation of the 14-3-3 binding domain of TPK1 belongs to the family of the PP2A proteinphosphatases. - It is possible that the kinases are activated under salt stress conditions and thereby phosphorylate the 14-3-3 binding domain of TPK1 leading to the interaction with GRF1 and activation of TPK1. - Germination is reduced under salt stress conditions and limited K+ supply in tpk1.3 and cpk3.1 knockout plants. KW - Ackerschmalwand KW - Signaltransduktion KW - Vakuole KW - Kaliumkanal KW - Salzstress KW - 14-3-3 KW - Calcium KW - Proteinkinase KW - 14-3-3 . calcium KW - protein kinase Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-24915 ER - TY - THES A1 - Mishina, Tatiana E. T1 - Mechanisms of local and systemic defences in Arabidopsis thaliana in response to host and non-host strains of Pseudomonas syringae N2 - Stickstoffmonooxid (NO) wird als wichtige Signalkomponente bei der Entwicklung der Hypersensitiven Reaktion beschrieben. Außerdem wird NO eine Rolle als Signalmolekül bei der Expression von Abwehrgenen wie PR-1, PAL1 oder Chalkonsynthase (CHS) und bei der Akkumulation von Salicylsäure zugeordnet (Durner et al., 1998). In der vorliegenden Arbeit wurden transgene Pflanzen mit veränderten endogenen NO-Spiegeln verwendet, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Interaktionen zu untersuchen. Arabidopsis-Pflanzen, die aufgrund der Expression einer NO Dioxygenase erniedrigte NO-Gehalte aufweisen, zeigen nach einem Angriff avirulenter Pathogene einen abgeschwächten oxidative burst und eine reduzierte Expression von Genen des Phenylpropanbiosyntheseweges. Weitere Experimente mit transgenen Pflanzen, die eine bakterielle NO-Synthase exprimieren, legen nahe, dass eine konstitutive Erhöhung der NO-Spiegel nicht zu einer konstitutiv verstärkten Pathogenabwehr führt. Möglicherweise ist eine graduelle Steigerung der NO-Gehalte nach Pathogenkontakt für die Induktion pflanzlicher Abwehrreaktionen erforderlich. Im Gegenteil, die NOS-exprimierenden Pflanzen waren anfälliger gegen bakterielle Pathogene als Wildtyp-Pflanzen und zeigten eine abgeschwächte SAR-Reaktion. Die Ergebnisse deuten auch darauf hin, dass NO eine wichtige Rolle bei der Regulation des Redoxstatus in der Pflanzenzelle spielt. Diese Funktion von NO ist wichtig beim Seneszenzvorgang. Entsprechend der Ergebnisse dieser Arbeit kann NO als negativer Regulator der Blattseneszenz angesehen werden. Die Wirkungsweise von NO auf molekularer Ebene und die Signalkaskaden, in die NO involviert ist, sind immer noch nicht ausreichend verstanden. In zukünftigen Experimenten wird es notwendig sein, die selektive Quantifizierung von NO in intaktem Pflanzengewebe zu gewährleisten, die Proteintargets von NO zu identifizieren und die Struktur und Funktion NO-modifizierter Biomoleküle zu entschlüsseln, um die Rolle von NO in Pflanze-Pathogen-Wechselwirkungen besser verstehen zu lernen. Die Nichtwirtsresistenz beruht auf mehreren Verteidigungsebenen, welche konstitutive und induzierte Komponenten beinhalten. Die Bedeutung induzierter Abwehrreaktionen für die Nichtwirtsresistenz gegen bakterielle Pathogene ist nicht vollständig klar. Die Daten der vorliegenden Arbeit legen nahe, dass das Wachstum von Nichtwirtsbakterien in Arabidopsis-Blättern durch vorgebildete toxische Substanzen und durch induzierte Zellwandverstärkungen gehemmt wird. Nichtwirtsbakterien verursachen eine schnelle Induktion der Expression der Ligninbiosynthesegene PAL1 und BCB, die unabhängig vom Typ III-Sekretionssystem ist und möglicherweise zur Papillenbildung beiträgt. Darüber hinaus ist die Überlebensrate der Nichtwirtsbakterien in den extrazellulären Räumen der Arabidopsis pal1-Mutante höher als in Wildtyp-Pflanzen, was die funktionelle Bedeutung der PAL1-Expression bei der Nichtwirtsresistenz verdeutlicht. Außerdem zeigen die Experimente, dass Nichtwirtsbakterien in ähnlicher Weise wie Wirtsbakterien die Akkumulation von Salicylsäure und die Expression von PR-Genen induzieren. Die Induktion dieser Abwehrkomponenten ist abhängig von einem intakten Typ III-Sekretionssystem. Die Signalwege, auf denen nach Kontakt mit Nichtwirtsbakterien und Wirtsbakterien Abwehrreaktionen induziert werden, sind ähnlich. Es wurden jedoch zwischen zwei verschiedenen Nichtwirtsstämmen auch unterschiedliche Signalwege aktiviert, was möglicherweise auf ein unterschiedliches Repertoire von TypIII-Effektoren der beiden Stämme zurückgeführt werden kann. Trotz der Aktivierung dieser induzierten Abwehr zeigen Experimente mit klassischen Abwehrmutanten, dass SA- und JA-abhängige Abwehrreaktionen nicht direkt zur Nichtwirtsresistenz gegen P. syringae beitragen. Weiterhin zeigt diese Arbeit, dass die Nichtwirtsresistenz des Arabidopsis-Ökotyps Col-0 effektiver ist als die des Ler-0-Ökotyps, obwohl bei letzterem die Resistenz gegen virulente Bakterien höher ist. Diese Unterschiede scheinen nicht mit der unterschiedlichen Glucosinolatzusammensetzung der beiden Ökotypen im Zusammenhang zu stehen. Um das Verständnis der Nichtwirtsresistenz von Arabidopsis gegenüber P. syringae zu verbessern, können in zukünftigen Experimenten Doppel- und Triplemutanten hergestellt werden, die gleichzeitig Defekte in der zellwandabhängigen Abwehr (Lignin- und Callosebiosynthese) und in klassischen, SA-abhängigen Abwehrreaktionen aufweisen. Auch können Analysen des Genom-Polymorphismus und der Zusammensetzung von Sekundärmetaboliten in den Ökotypen Ler-0 und Col-0 zu einem besseren Verständnis der Nichtwirtsresistenz führen. Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass ein lokaler, symptomfreier Kontakt von Arabidopsis-Blättern mit Nichtwirtsbakterien, TTSS-defiziente Bakterien und allgemeine bakterielle Elicitoren (PAMPs) wie Flagellin und Lipopolysaccharide die systemisch erworbene Resistenz innerhalb der Gesamtpflanze hervorrufen. Die symptomlose systemische Resistenzreaktion findet in SAR-defizienten Mutanten nicht statt, wird jedoch in der Jasmonat-insensitiven jar1-Mutante, die keine ISR-Reaktion ausbilden kann, beobachtet. Durch Behandlung von Arabidopsis-Blättern mit unterschiedlichen Inokuli von virulenten oder avirulenten P. syringae-Stämmen wurde auch eine deutliche Korrelation des Ausmaßes der SAR-Induktion mit der Höhe der SA-Akkumulation oder der PR-Genexpression, aber nicht mit der Nekrosenbildung oder der JA-Produktion, am Infektionsort festgestellt. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass nicht die Hypersensitive Reaktion oder Gewebenekrosen, sondern möglicherweise die Stärke bestimmter Abwehrreaktionen am Ort der Inokulation zur Auslösung der SAR beitragen. Die Befunde, dass die systemische Resistenz auch durch PAMPs und durch TTSS-defekte P. syringae-Stämme erhöht wird, verdeutlicht die wichtige Rolle von allgemeinen Elicitoren bei der SAR-Induktion. In künftige Experimenten kann untersucht werden, ob verschiedene PAMPs die SAR in synergistischer Weise induzieren und ob allgemeine Elicitoren pilzlicher Herkunft SAR auslösen können. Weiterhin können die molekulare Prozesse spezifiziert werden, die stromabwärts von PAMP-Erkennungsprozessen für die SAR-Ausbildung notwendig sind. In weiteren Experimenten könnte die Hypothese überprüft werden, ob einzelner PAMPs als mobile SAR-Langstreckensignale fungieren können. Durch phytopathologische Charakterisierung von T-DNA-Knockout-Linien, die Defekte in Genen aufweisen, welche in Arabidopsis nach einer P. syringae-Infektion aufreguliert werden, konnte das FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1)-Gen als notwendige Komponente der SAR in Arabidopsis identifiziert werden. So bleiben die im Wildtyp induzierten systemischen Abwehrreaktionen und die Erhöhung der systemischen Resistenz nach lokaler Inokulation mit P. syringae in fmo1-Knockout-Pflanzen vollständig aus. Weiterhin korreliert die systemische Expression des FMO1-Gens eng mit der SAR-Induktion. So gibt es bei allen Abwehrmutanten, die keine SAR nach Kontakt mit P. syringae ausbilden können, keine FMO1-Expression in distalen Blättern inokulierter Pflanzen. Umgekehrt verhält es sich mit Arabidopsis-Linien, die die SAR ausbilden. Die erhaltenen Ergebnisse deuten darauf hin, dass FMO1 eine wichtige Komponente eines Signalverstärkungszyklus darstellt, der in nichtinfizierten, systemischen Teilen der Pflanze wirkt, um die SAR zu ermöglichen. In künftigen Experimenten soll der postulierte Amplifizierungsmechanismus experimentell verifiziert werden. Die Konstruktion von transgenen Linien, die ein FMO1:GFP-Fusionsprodukt exprimieren, kann Informationen über die zelluäre Lokalisation des FMO1-Proteins liefern. Weiterhin können vergleichende Analysen der chemischen Zusammensetzung von Blattextrakten der fmo1 Knockout-Linien, von FMO1-Überexprimierern und von Wildtyp-Pflanzen zur Aufklärung der biochemischen Reaktion beitragen, die die FMO1-Monooxygenase katalysiert. In Anlehnung an die Funktion von yFMO, die die einzige Flavin-abhängige Monooxygenase der Hefe darstellt, kann überprüft werden, ob FMO1 die korrekte Faltung von Proteinen am endoplasmatischen Retikulum vermittelt. Schließlich kann durch die Identifizierung weitere SAR-Gene nach der beschriebenen Strategie und durch funktionelle Charakterisierung der zugehörigen Proteine das Verständnis der SAR-Reaktion auf molekularer Ebene weiter verbessert werden. N2 - NO has been described as an important component involved in the development of the hypersensitive reaction (Delledonne et.al., 1998). Furthermore, NO induces expression of a set of defence gene, such as PR-1, PAL1 and chalcone synthase (CHS), and accumulation of SA (Durner et al., 1998). In this study, transgenic plants with altered NO levels were used to study the role of NO in plant defence. Arabidopsis plants which, due to expression of a bacterial NO dioxygenase, exhibit lower levels of NO than wild-type plants, show several weakened defence response, including the oxidative burst and expression of phenylpropanoid pathway genes. By contrast, constitutive expression of a bacterial NO synthase in Arabisopsis results in increased levels of endogenous NO. However, these plants do not show constitutively activated defence responses, but suffer from increased susceptibility to various strains of P. syringae. This might indicate that a gradient in NO production rather than constitutive elevation of NO is necessary to trigger plant defence responses. Nevertheless, NO seems to be important for regulation of the oxidative state in plant cells. This function of NO is important during leaf senescence. The data of the present work indicate that NO acts as senescence-delaying factor during plant development. The molecular action of NO in plants and signalling cascades in which NO is involved as second messenger are still poorly understood. Experiments addressing the selective quantification of NO in intact plant tissue, the identification of NO-target proteins as well as the function of NO-modified biomolecules might help to understand the role of NO in plants. Non-host resistance consists of several layers of defence that include preformed compounds existing in plants before pathogen infection and induced defences which the plant activates after recognition of a pathogen. The role of inducible defences in preventing multiplication of non-adapted bacteria is not clear. Our experiments suggest that to restrict non-adapted bacterial growth, pre-formed antimicrobial compounds and an early inducible cell wall-based defence might play an important role in Arabidopsis leaves. Upon inoculation with non-adapted bacteria, we have observed early, TTSS-independent up-regulation of PAL1 and BCB, two lignin biosynthesis genes which might be involved in papilla formation or other kinds of cell wall fortification. Moreover, Arabidopsis pal1 knockout lines permit significantly higher survival of non-adapted bacteria in leaves than wild-type plants, suggesting a functional importance of PAL1 up-regulation. Although non-host bacteria, like host bacteria, induce accumulation of SA and PR gene expression in a TTSS-dependent manner, SA-dependent or JA/ET-dependent defences do not directly contribute to non-host resistance. Moreover, non-adapted bacteria activate similar defence signalling pathways as do host bacteria. However, because of varieties in effector protein composition between different non-adapted bacterial strains, the activated signalling pathways might also include different compounds. The Arabidopsis ecotype Ler 0 is more susceptible to a non-adapted strain of P. syringae than ecotype Col-0. Although differences in glucosinolate content and composition between those ecotypes exist, they are probably not a major reason for the observed difference in non-host resistance. To further understand the mechanisms underlying non-host resistance, the generation of double or triple mutants with deficits in both cell wall-based defences and SA-dependent signal cascades is necessary. Moreover, the study of genome polymorphism and composition of secondary metabolites between Ler-0 and Col-0 can shed new light into the mechanisms of non-host resistance against bacterial pathogens. Additionally, experiments addressing papilla formation and callose biosynthesis in Ler-0 and Col-0 could help to further elucidate bacterial non-host resistance. Our data indicate that localized contact of Arabidopsis leaves with non-adapted bacteria, type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) induce systemic acquired resistance (SAR) at the whole plant level. This finding contrasts the general belief that an HR or other leaf necroses are required for SAR induction. The observed symptomless systemic response was abolished in all SAR-deficient mutants tested in this study, but was intact in the jar1 mutant, which is compromised in induction of ISR, indicating that non-host bacteria and PAMPs induce SAR in a mechanistically similar way than host bacteria. In addition, our data show that the extent of SA accumulation or PR gene expression induced at sites of virulent or avirulent P. syringae inoculation rather than the amount of tissue necroses or jasmonate accumulation determine the magnitude of SAR. The fact that systemic responses were also triggered after local treatment with type III secretion-defective P. syringae strains and bacterial PAMPs indicate that induction of SAR is TTSS-independent. Instead, recognition of general elicitors like flagellin and LPS play an important role in activation of the SAR process. To broaden the concept of PAMP-based SAR initiation, further general elicitors from bacteria and fungal pathogens should be tested for their capability to induce SAR. Screens for mutants with deficiency in SAR activation by individual PAMPs can help to identify new components involved in the SAR signalling cascade. Possible functions of PAMPs as mobile systemic signals should be tested in future experiments. By selection of candidate genes whose expression is up-regulated in Arabidopsis leaves infected with avirulent and virulent P. syringae and pathophysiological analyses of corresponding T-DNA knockout lines, FLAVIN-DEPENDENT MONOOXYGENASE1 (FMO1) was identified as a key SAR regulator. SAR triggered by P. syringae is completely abolished in fmo1 mutant plants, and pathogen-induced expression of FMO1 in systemic leaves is closely correlated with the capability of different Arabidopsis lines to develop SAR. According to our findings, we have proposed that the FMO1 acts in signal amplification in non-inoculated, systemic leaves to trigger SAR. Experimental verification of the postulated potential amplification cycle underlying SAR should be tested in future experiments. The generation of transgenic lines expressing FMO1::GFP will provide useful information about the cellular localization of the FMO1 protein. Moreover, a comparative metabolomic analysis using SAR-induced wild-type, fmo1 knockout and FMO1 overexpressing lines can be used to identify substrates and reaction products of the FMO1 monooxygenase. As the single yeast FMO (yFMO) provides oxidizing equivalents at the ER for correct protein folding, expression of FMO1 in yfmo mutant yeast combined with protein activity assays might indicate whether FMO1 exhibits functional similarities with yeast FMO, e.g. in assuring proper folding of ER-targeted proteins essential for SAR establishment. Identification of further genes involved in activation of systemic resistance and biochemical characterization of the corresponding proteins can help to understand the SAR process in more detail. KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Induzierte Resistenz KW - Stickstoffmonoxid KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - systemisch erworbene Resistenz KW - Stickstoffmonoxid KW - Nichtwirtsresistenz KW - Arabidopsis thaliana KW - Pseudomonas syringae KW - systemic acquired resistance KW - nitric oxide KW - non-host resistance Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-23160 ER - TY - THES A1 - Hirsche, Jörg T1 - Metabole Regulation von Pollenentwicklung und Pollenkeimung durch Zucker T1 - Metabolic regulation of pollen development and pollen germination by sugars N2 - Invertasen spielen eine zentrale Rolle im Metabolismus der Pflanzen und werden über eine Vielzahl von Faktoren in ihrer Regulation beeinflusst. Invertasen mit pH-Optimum im sauren Bereich liegen dabei als vakuoläre und zellwandgebundene Isoformen einer Genfamilie in den Pflanzen vor. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zum ersten Mal 9 putative Invertasen aus der Nutzpflanze Brassica napus, sowie 4 weitere putative Mitglieder der bereits bekannten Tabakinvertasenfamilie isoliert und Expressionsprofile für die neu klonierten Invertasen erstellt. Symplastisch isolierte Zellen, wie z. B. Pollen und Pollenschläuche, sind auf die Expression zellwandgebundener Invertasen besonders angewiesen, da sie Kohlen-hydrate primär in Form von Fructose und Glucose aufnehmen, die über die Invertasen-vermittelte Spaltung aus Saccharose gebildet werden. An Tabak hatten Goetz et al. (2001) gezeigt, dass eine Inhibierung dieser pollen¬spezi¬fischen Invertaseaktivität zu männlich sterilen Pflanzen führt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass durch Inhibierung der Zellwandinvertase¬aktivität mittels Antisense-Technik oder Expression des proteinogenen Invertase-Inhbitors AtC/VIF2 auch männlich sterile Arabidopsis-Pflanzen generiert werden können. Ein Aktivitätsvergleich der Invertase-promotoren von Nin88 aus Tabak und AtcwINV2 aus Arabidopsis im jeweiligen homo- und heterologen System zeigte jedoch, dass der Einsatz dieser pollenspezifischen Promotoren zur Erzeugung männlich steriler Pflanzen über Familiengrenzen hinweg nicht möglich ist. Neben ihrer Funktion als Energieträger stellen Kohlenhydrate auch Signalmoleküle dar, die in die Regulation zentraler Prozesse der Pflanzen eingreifen. Anhand von Keimungsanalysen mit Arabidopsis-Pollen wurde festgestellt, dass Hexokinase-unabhängige Signalingwege involviert sein müssen, um ein Auskeimen der Pollen zu ermöglichen. Dabei kann die Hexokinase-vermittelte Inhibition der Pollenkeimung vermutlich durch die Beteiligung anderer Signaling-Wege aufgehoben werden. Es wurde außerdem die zuckerabhängige Ausbildung blasenartiger Strukturen an Arabidopsis-Pollen nachgewiesen, die vermutlich durch einen Zucker-spezifischen Abbruch des Pollenschlauchwachstums gebildet werden. N2 - Invertases with acid pH-optimum play a central role in plant metabolism and are regulated by numerous biotic and abiotic factors. They consist of vacuolar and extracellular isoforms of a gene family in plants. For the first time 9 putative members of the invertase family of Brassica napus, as well as 4 additional putative tobacco acid invertases were cloned in this work and expression profiles were analysed. Symplastically isolated cells, like pollen and pollen tubes, in particular depend on the expression of extracellular invertases, since they prefer the uptake of glucose and fructose. These hexoses are generated by the invertase-mediated cleavage of sucrose. Goetz et al. (2001) have shown on tobacco that inhibition of the pollen specific invertase activity lead to male sterile plants. In this work it was shown that inhibition of cell wall invertase activity via antisense technology or expression of the proteinaceous invertase inhbitor AtC/VIF2 also causes male sterility in Arabidopsis thaliana. Comparison of the promoter activities of the invertases Nin88 (tobacco) and AtcwINV2 (Arabidopsis) in the corresponding homo- and heterologous systems revealed that the use of these pollen specific promoters for generating male sterile plants is not possible in diverse plant families. Besides their function as energy source, carbohydrates are signaling molecules that influcence regulation of central processes in the plants. On the basis of germination assays with Arabidopsis pollen, it was shown that hexokinase-independent signaling pathways must be involved to permit normal pollen germination. In this context, hexokinase-mediated inhibition of pollen germination might be overrode by the involvement of other signaling pathways. In addition, the sugar-dependent generation of bubble-like structures at Arabidopsis pollen was demonstrated, which might be caused by the sugar-specific interruption of pollen tube growth. KW - Pollen KW - Ackerschmalwand KW - Invertase KW - Tabak KW - Raps KW - Sink-Source-Relation KW - Pollenschlauch KW - Signaling KW - Hexokinase KW - Pollenkeimung KW - Invertase-Inhibitor KW - männliche Sterilität KW - Zucker-Signaling KW - Promotoraktivität KW - pollen germination KW - pollen tube KW - sugar signaling KW - male sterility KW - promoter activity Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29654 ER - TY - THES A1 - Schulz, Alexander T1 - Molekulare Mechanismen des protonengekoppelten Zuckertransportes in Mesophyllvakuolen von Arabidopsis thaliana T1 - Molecular mechanism of the proton-coupled sugar transport in mesophyll vacuoles of Arabidopsis thaliana N2 - Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse zum Zuckertransport über die Vakuolenmembran von Arabidopsis thaliana sowie dessen Energetisierung durch die V-ATPase erlangt werden. Hierfür wurden Patch-Clamp-Experimente konzipiert, die eine direkte Erfassung der Transportmechanismen, Transporteigenschaften sowie Triebkräfte des vakuolären Zuckertransportes ermöglichten. Zusätzlich wurden Lokalisations- und Interaktionsstudien zu ausgewählten Transportern mit Hilfe der konfokalen Laser Scanning Mikroskopie durchgeführt. Im Einzelnen wurden folgende Aspekte hinsichtlich des pflanzlichen Zuckertransports und dessen Energetisierung bearbeitet. Mittels der Patch-Clamp-Technik konnten vakuoläre glucose- und saccharose-induzierte Protonen-Transportkapazitäten in Mesophyllvakuolen von Wildtyp-pflanzen aufgelöst werden, die eindeutig einen Antiportmechanismus für beide Zucker zur Beladung der Vakuole vorschlagen. Dabei zeigten die Glucose- und Saccharoseantiporter eine geringe Affinität und hohe Transportkapazität für den jeweiligen Zucker. Auf molekularer Ebene konnte die protonengekoppelte Glucose- und Saccharoseaufnahme in die Vakuolen maßgeblich dem putativen Monosaccharid¬transporter AtTMT1/2 zugeordnet werden, der folglich als erster Glucose-Saccharose/Protonen-Antiporter identifiziert wurde. Im Zuge dieser Untersuchungen wurden der Zucker- und der pH-Gradient als Triebkräfte der Zuckertransportaktivität herausgearbeitet. In diesem Zusammenhang konnte ferner ein Beitrag zur quan¬titativen Charakterisierung der V-ATPase geleistet werden, welche den Einfluss der V-ATPase aufgrund ihrer pH-abhängigen H+-Pumpaktivität auf die pH-Homöostase belegt. Demzufolge scheint die V-ATPase als pH-regulierter Energielieferant für die Zuckertransporter zu fungieren. Darüber hinaus wurde die mitogenaktivierte Proteinkinase AtVIK1 als potentieller Regulationsfaktor von AtTMT1 identifiziert. Dies gelang durch den Nachweis einer spezifischen physikalischen Interaktion zwischen AtTMT1 und AtVIK1 mittels der Bimolekularen Fluoreszenzkomplemen¬tation. Neben der AtTMT1/2-vermittelten Aufnahme der beiden Zucker Glucose und Saccharose wurde ebenso die Zuckerentlassung aus der Vakuole näher charakterisiert. Mit Hilfe vergleichender Patch-Clamp-Analysen von verschiedenen Zuckertransporter-Verlustmutanten konnte AtERDl6 als Glucose/Protonen-Symporter identifiziert werden, der sich für den Glucoseexport aus der Vakuole verantwortlich zeigt. In Bezug auf den Saccharosetransport aus der Vakuole konnte erstmals die Saccharose/Protonen-Symportfunktion von AtSUC4 in planta nach dessen transienter Überexpression in Zuckertransporter-Verlustmutanten eindeutig aufgelöst und nachgewiesen werden. Desweiteren offenbarten die hier erlangten Ergebnisse bezüglich der Glucose/Saccharose-Beladung und -Entladung von Mesophyllvakuolen, dass weitere protonengekoppelte Zuckertransporter, neben AtTMT1/2 and AtERDl6, in diesem Zelltyp existieren, deren molekulare Natur es jedoch noch gilt herauszufinden. N2 - This work provides new insights into the sugar transport across the vacuolar membrane of Arabidopsis thaliana and its energization by the V-ATPase. For this, patch-clamp experiments were specifically designed enabling low-resolution current recordings for the direct detection and characterization of the transport mechanisms, transport properties and driving forces of the vacuolar sugar transport. In addition, localization and interaction studies on selected transporters have been performed by using the confocal laser scanning microscopy. In particular, following aspects of plant sugar transport and its energization were studied. In patch-clamp experiments on mesophyll vacuoles of wild type plants, prominent glucose- and sucrose-induced proton transport capacities were resolved, which could be clearly related to an antiport mechanism used for loading the vacuole with both sugars. Thereby, the vacuolar glucose and sucrose antiporter showed a low-affinity and a high transport-capacity for the respective sugar. On the molecular level, the proton-coupled uptake of both sugars, glucose and sucrose, into the vacuole could be mainly associated with the putative monosaccharide transporter AtTMT1/2, which was consequently identified as the first glucose-sucrose/proton-antiporter. In the course of these studies, the sugar- and the pH-gradient were revealed as driving forces of the sugar transport activity. In this context, a contribution was made to a quantitative characterization of the V-ATPase that proved the influence of the V-ATPase on the pH homeostasis based on the pH dependency of the H+-pump activity. Hence, the V-ATPase seems to function as a pH-regulated energy source for the sugar transporters. Moreover, a specific physical interaction between AtTMT1 and the mitogen-activated protein kinase AtVIK1 was detected via bimolecular fluorescence complementation assays identifiying AtVIK1 as a potential regulatory factor of AtTMT1. Beside the AtTMT1/2-mediated glucose and sucrose uptake into the vacuole, the sugar release from the vacuole was also characterized. By means of comparative patch-clamp studies on mutants lacking different sugar transporters, AtERDl6 was identified as glucose/proton symporter and appears to be responsible for glucose export from the vacuole. Concerning the export of sucrose out of the vacuole, for the first time direct evidence for the sucrose/proton symport function of AtSUC4 in planta was provided after its transient overexpression in certain sugar-transporter knockout lines. Furthermore, the studies on wild type and sugar-transporter knockout lines regarding vacuolar glucose/sucrose loading and unloading also revealed that in addition to AtTMT1/2 and AtERDl6 further proton-coupled sugar transporters - of yet unknown molecular identity - must be present in mesophyll cells. KW - Ackerschmalwand KW - Vakuole KW - Saccharose KW - Glucose KW - Mesophyll KW - Protonenpumpe KW - AtTMT1/2 KW - AtSUC4 KW - AtERDl6 KW - V-ATPase KW - Mesophyllvakuole KW - Glucose/Saccharose Transport KW - Antiport KW - Symport KW - AtTMT1/2 KW - AtSUC4 KW - AtERDl6 KW - V-ATPase KW - mesophyll vacuole KW - glucose/sucrose transport KW - antiport KW - symport KW - Glucosetransport Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85596 ER - TY - THES A1 - Grebner, Wiebke T1 - Organspezifische Bildung und Funktion von Oxylipinen in Arabidopsis thaliana T1 - Organ specific synthesis and function of oxylipins in Arabidopsis thaliana N2 - Oxylipine sind Signalmoleküle, welche durch die enzymatische oder nicht-enzymatische Oxidation von Fettsäuren gebildet werden. Eine bedeutende Gruppe von Oxylipinen in Pflanzen sind die Jasmonate. Dazu zählen Jasmonsäure (JA), deren Vorstufe 12-Oxophytodiensäure (OPDA) sowie deren Metabolite. Ein bedeutender Metabolit von JA ist das Aminosäure-Konjugat JA-Isoleucin (JA-Ile), welches hohe biologische Aktivität besitzt. Besonders für die oberirdischen Organe von Pflanzen wurden bisher vielfältige Funktionen von Jasmonaten beschrieben. Sie sind beteiligt an verschiedenen Entwicklungsprozessen wie der Fertilität von Blüten, aber auch an der Abwehr von Pathogenen und Herbivoren und bei der Reaktion von Pflanzen auf abiotische Stressoren wie hohe Salzkonzentrationen oder Trockenheit. Über die Bildung und Funktion von Oxylipinen in Wurzeln ist bisher jedoch nur wenig bekannt. Aus diesem Grund wurden in der vorliegenden Arbeit die Gehalte von Galaktolipiden und Jasmonaten in Spross und Wurzel von Arabidopsis thaliana Pflanzen verglichen. Mit Hilfe verschiedener JA Biosynthese-Mutanten konnte zudem die Bildung von Jasmonaten in der Wurzel und deren biologische Funktion in diesem Pflanzenorgan untersucht werden. Um die Wurzeln der Arabidopsis Pflanzen einfach behandeln zu können und um schnell und stressfrei größere Mengen von Wurzelmaterial ernten zu können, wurde ein hydroponisches Anzuchtsystem etabliert. Die Analyse von Galaktolipiden zeigte, dass in der Wurzel deutlich geringere Galaktolipid Gehalte als im Spross vorhanden sind. Da Galaktolipide den Hauptbestandteil plastidärer Membranen ausmachen, in den Wurzeln insgesamt jedoch weniger Plastiden vorkommen als in Blättern, wäre dies ein möglicher Grund für den beobachteten Unterschied. Das Vorkommen von mit OPDA oder dnOPDA veresterten Galaktolipiden (Arabidopsiden) wird in der Literatur für die Thylakoidmembranen der Chloroplasten beschrieben. Die Analyse der Arabidopsid Gehalte von Wurzeln konnte diese Aussage stützen, da in Wurzeln, welche normalerweise keine Chloroplasten besitzen, nahezu keine Arabidopside detektiert werden konnten. Die Analyse der Jasmonate zeigte anhand von Pfropfungsexperimenten mit der Jasmonat-freien dde2 Mutante, dass die Wurzeln unabhängig vom Spross in der Lage sind Jasmonate zu bilden, obwohl die Expression vieler JA-Biosynthese-Gene in den Wurzeln sehr gering ist. Zudem zeigten diese Experimente, dass es keinen direkten Transport von Jasmonaten zwischen Spross und Wurzel gibt. Die Bildung von Jasmonaten in der Wurzel konnte durch verschiedene Stresse wie Verwundung, osmotischen Stress oder Trockenheit induziert werden. Kälte und Salzstress hatten hingegen keinen Jasmonat-Anstieg in den Wurzeln zur Folge. Anders als bei osmotischem Stress und Trockenheit, wo sowohl die Gehalte von OPDA als auch von JA und JA-Ile anstiegen, konnte bei Verwundung keine Zunahme der OPDA-Spiegel detektiert werden. Hier kam es zu einer deutlichen Abnahme, wohingegen die JA und JA-Ile Spiegel sehr stark anstiegen. Dies deutet darauf hin, dass es sehr komplexe und vielfältige Regulationsmechanismen hinsichtlich der Bildung von Jasmonaten gibt. Der erste Schritt der JA-Biosynthese, die Bildung von 13-Hydroperoxyfettsäuren (HPOTE), wird durch 13-Lipoxygenase (LOX) Enzyme katalysiert. In Arabidopsis sind vier unterschiedliche 13-LOX Isoformen bekannt. Die Untersuchung verschiedener 13-LOX-Mutanten ergab, dass nur die LOX6 an der Biosynthese von Jasmonaten in der Wurzel beteiligt ist. So konnten in Wurzeln der lox6 Mutante weder basal noch nach verschiedenen Stressen bedeutende Mengen von Jasmonaten gemessen werden. Im Spross dieser Mutante war basal kein OPDA vorhanden, nach Stresseinwirkung wurden jedoch ähnliche Jasmonat Gehalte wie im Wildtyp detektiert. Um Hinweise auf die biologische Funktion von Jasmonaten in Wurzeln zu erhalten, wurden Untersuchungen mit einer lox6 KO Mutante durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass abgeschnittene lox6 Wurzeln, welche keine Jasmonate bilden, im Vergleich zum Wildtyp von saprobiont lebenden Kellerasseln (Porcellio scaber) bevorzugt als Futter genutzt werden. Blätter dieser Mutante, welche nach Stress annähernd gleiche Jasmonat Gehalte wie der Wildtyp aufweisen, wurden nicht bevorzugt gefressen. Von der Jasmonat-freien dde2 Mutante wurden hingegen sowohl die Wurzeln als auch die Blätter bevorzugt gefressen. Neben den Experimenten mit Kellerasseln wurden auch Welke-Versuche mit lox6 und dde2 Pflanzen durchgeführt. Hierbei wiesen die lox6 Pflanzen, nicht aber die dde2 Pflanzen, eine erhöhte Suszeptibilität gegenüber Trockenheit auf. dde2 Pflanzen haben im Gegensatz zu LOX Mutanten unveränderte 13-HPOTE Gehalte, aus denen auch andere Oxylipine als Jasmonate gebildet werden können. Dies zeigt, dass durch LOX6 gebildete Oxylipine, im Falle von Trockenheit aber nicht Jasmonate, an der Reaktion von Arabidopsis Pflanzen auf biotische und abiotische Stresse beteiligt sind. N2 - Oxylipins are signaling molecules derived by enzymatic or non-enzymatic oxidation of fatty acids. Jasmonates are one important group of oxylipins in plant. This group includes jasmonic acid (JA), its precursor 12-oxophytodienoic acid, and all JA metabolites. The amino acid conjugate JA-isoleucine (JA-Ile) is one relevant metabolite of JA which shows high biological activity. For the aerial parts of plants, many different functions of jasmonates have been described. Jasmonates are involved in developmental processes like the flower fertility. Furthermore, these compounds function as signals in defense reactions against pathogens and herbivores and in the response to abiotic stress like high salt concentrations or drought. For roots, much less is known about the formation and function of jasmonates. Therefore, in this work the levels of galactolipids and jasmonates in roots of Arabidopsis thaliana in comparison to leaves were analyzed. Using mutants in different steps of jasmonate biosynthesis the formation and biological function of jasmonates in roots were investigated. For easy handling, treatment, and harvest of root material a hydroponic system was established. The analysis of galactolipids showed reduced contents of these compounds in roots in comparison to the shoots. These differences might occur due to the fact that galactolipids are the main compounds of plastid membranes and that roots in general contain less plastids than the leaves. In the literature it is described, that galactolipids esterified with OPDA or dnOPDA (arabidopsides) only occur in the thylakoid membranes of chloroplasts. The analysis of arabidopsid contents in roots supports this statement since nearly no arabidopsides were detectable in roots, which do normally not have chloroplasts. The analysis of jasmonates with different grafting experiments using the jasmonate free dde2 mutant showed that roots were able to synthesize jasmonates independently of the shoot although the expression of several JA biosynthesis genes is very low. These experiments also pointed out that there is no transport of jasmonates between the shoot and the root. Jasmonates accumulated in roots upon different stresses such as wounding, osmotic stress, or drought. Cold and salt stress did not lead to increased jasmonate levels in the roots. Osmotic and drought stress resulted in an increase of all three analyzed jasmonates whereas after wounding only JA and JA-Ile showed higher concentrations. OPDA levels strongly decreased after this type of stress. This suggests the existence of diverse and complex regulatory mechanisms of stress-induced jasmonate synthesis. 13-lipoxygenase (13-LOX) enzymes are involved in the first step of the JA biosynthesis, the formation of 13-hydroperoxy fatty acids (HPOTE), and four 13-LOX isoforms exist in Arabidopsis. Investigation of different 13-LOX mutants revealed that only the LOX6 enzyme is involved in the biosynthesis of jasmonates in roots. In roots of the lox6 mutant no jasmonate levels were detectable, neither basal nor after different stress treatments. In the shoot of this mutant no basal OPDA was measurable. However, after stress treatment nearly the same amounts of jasmonates were detected. To investigate the function of jasmonates in roots a lox6 KO mutant was used. The experiments showed that detached roots of the lox6 mutant which do not produce jasmonates were the preferred food of the detritivorous crustacean Porcellio scaber in comparison to roots of the wild type. Detached leaves of this mutant which show nearly the same amount of jasmonates after stress like the wild type were not eaten faster. However, detached roots and leaves of the jasmonate free dde2 mutant were both preferred in comparison to the wild type. Besides the investigations with P. scaber also drought experiments were carried out. The lox6 mutant but not dde2 was more susceptible to drought. In contrast to LOX mutants, dde2 plants show unaltered levels of 13-HPOTE which can also be converted to other oxylipins than jasmonates. This indicates that LOX6 derived oxylipins are important for the response to biotic and abiotic factors. However, concerning to drought this is not the case for jasmonates. KW - Oxylipine KW - Ackerschmalwand KW - Jasmonate KW - Wurzel KW - Kellerassel KW - Trockenheit KW - Lipoxygenase 6 KW - Arabidopsis thaliana KW - Jasmonatbiosynthese KW - oxylipins KW - Arabidopsis thaliana KW - jasmonates KW - root KW - drought stress KW - rough woodlouse KW - lox6 Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76730 ER - TY - THES A1 - Nazeer, Ahmed T1 - Physiological and molecular basis of Azospirillum-Arabidopsis Interaction T1 - Physiological and molecular basis of Azospirillum-Arabidopsis Interaction N2 - The present study was aimed at revealing the early signalling events during the interaction of the diazotrophic soil bacterium Azospirillum brasilense with its host plant Arabidopsis thaliana. Furthermore, taking advantage of the micro array technique, a comprehensive overview of Arabidopsis genes has been undertaken which are affected upon association with A. brasilense The characterization of the early responses of Arabidopsis plants upon inoculation with Azospirillum brasilense strain Sp7 clearly indicated parallels with the initial events in plant pathogen interaction. For instance, not only bacterial preprations (lysates) form Azospirillum elicited an apoplastic alkalinization of the culture medium, but also the live bacteria, which were even more effective. Besides, in a luminol based assay, the bacterial lysates triggered production of the reactive oxygen species (ROS) in the Arabidopsis leaf discs. Interestingly, the elongation factor receptor mutants (efr) were completely insensitive to Azospirillum, suggesting elongation factor Tu (EF-TU) recognition as elicitor by Arabidopsis. This hypothesis was further validated with a bioinformatic approach. The N terminus initial 26 amino acids from Azospirillum EF-TU gene (elf26) showed more similarity to the elf26 sequences of bacteria like Agrobacterium tumefaciens which elicit responses in the plants through EF-TU rather than Pseudomonas syringae where the potent elicitor is flagellin 22. Universal transcriptome profiling of Arabidopsis thaliana seedlings upon inoculation with Azospirillum brasilense over a time course of six, twenty four and ninty six hours revealed very little genetic responses in the early time points. However, a bulk of genes was differentially regulated in 96 hours post inoculation (96hpi). The nature of these genes indicated that the bacterial treatment, among others, greatly affect the processes like cell wall modification, hormone metabolism, stress and secondary metabolism. Additionally expression levels of a numer of transcription factors (TFs) related to basic helix loop helix (BHLH) and MYB domain containing TF families were altered with Azospirillum inoculation. Particularly the BHLH TFs were among the most highly regulated genes. The array results from Azospirillum treated plants were further compared with the already available data emnating from treatment with flagellin 22 (flg22), oligogalacturonides (OGs) and Agrobacterium tumefaciens. Noteworthy, very different set of genes were affected upon inoculation with Azospirillum in relation to other treatments. Secondly a cluster of proteins involved in the biosynthesis of aliphatic glucosinolates (GSL) were uniquely induced upon Sp7 exposure. Genes operating in flavonoid biosynthesis also showed a distinct regulation trend in the comparative analysis. Taken together, the study in question provides insights into the early signalling events in the context of Azospirillum-Arabidopsis association and the bacterial signals recognized by the plants. The array data, at the same time, elucidates the genetic factors of Arabidopsis triggered upon association with Azospirillum brasilense. N2 - Die vorliegende Arbeit befasst sich mit den physiologischen und genetischen Reaktionen im Zuge der Interaktion von Arabidopsis thaliana mit dem freilebenden, Stickstoff-fixierenden Bodenbakterium Azospirillum brasilense. Qualitativ konnten gemeinsame Mechanismen der frühen physiologischen Antworten von Arabidopsis auf Lysate von mutualistischen (Azospirillum brasilense) oder pathogenen (Pseudomonas syringae und Agrobacterium tumefaciens) Mikroorganismen festgestellt werden. So reagierten Arabidopsis (Col-0 ) Pflanzen auf Lysate dieser Bakterien mit einem Anstieg der cytosolischen Calcium-Konzentration sowie des extrazellulären pH Werts, mit der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und einer Depolarisierung des Membranpotentials. Diese Antworten untschieden sich jedoch zum Teil erheblich in ihrer Amplitude. Weitere Untersuchungen konnten zeigen, dass Flagellenproteine von Azospirillum nicht durch Arabidopsis erkannt werden. Somit unterscheidet sich der Erkennungsmechanismus der Azospirillen von dem der Pseudomonaden, welche aufgrund ihrer Flagellenproteine durch den FLAGELLINSENSING-2 (FLS2) Rezeptor in Arabidopsis perzipiert werden. Die Arabidopsis Mutante ELONGATIONFACTOR RECEPTOR (efr) war insensitiv gegenüber Azospirillumlysaten. Dies legte nahe, dass die Erkennung von Azosprillum über eine Erkennung des bakteriellen Elongationsfaktors (EF-Tu) durch den EFR Rezeptor verläuft. Die anschließende Klonierung des Azospirillum EF-Tu Gens zeigte positionspezifische Unterschiede in der abgeleiteten Aminosäuresequenz gegenüber Referenzsequenzen aus Escherichia coli oder Agrobacterium tumefaciens und erklärt somit die „imperfekte“ Erkennung durch den EFR Rezeptor. Der zeitliche Verlauf der genetischen Antwort von Arabidopsis im Zuge der Interaktion mit Azospirillum wurde mit Hilfe „Micro-Array“ basierter Transkriptionansanalysen 6, 24 und 96 Stunden nach Inokulation (hpi) der Pflanzen untersucht. Dabei wurden nach 6 und 24 hpi lediglich 30 bzw. 60 differenziell regulierte Transkripte gefunden. Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu Studien pathogener Elizitoren wie Flagellinen, in welchen bereits nach wenigen Stunden mehr als eintausend differenziell regulierte Transkripte in Arabidopsis gefunden wurden. Dieser Effekt konnte in den Interaktionsstudien mit Azospirillum erst nach 96 hpi beobachtet werden. Die Analyse der genetischen Antwort ergab, dass 96 hpi insbesondere Gene in ihrer Expression verändert waren, deren Produkte im Zusammenhang mit Zellwandmodifikationen, dem Hormonmetabolismus, der Stressanpassung sowie der sekundären Metabolismus stehen. Darüber hinaus konnten Gene aus der Familie der sog. „basic-helix-loop-helix“ und „MYB“ Transkriptionsfaktoren identifiziert werden, die einer spezifischen Regulation durch Azospirillum unterlagen. Die vergleichende Analyse der Araydaten mit Datensätzen, die im Zuge von Pathogen-Arabidopsis Interaktionen gewonnen wurden zeigte, dass insbesondere die Biosynthese von aliphatischen Glykosiden und Flavonolen eine typische Antwort der Pflanze auf die mutualistischen Azospirillum Bakterien darstellt. Die vorgestellte Arbeit liefert somit erste Erkenntnisse zur physiologischen und genetischen Antwort von Arabidopsis auf Azospirillum und ermöglicht die vergleichende Betrachtung dieser Antworten im Kontext der Interaktion von Pflanzen mit pathogenen Mikroorganismen. Die im Rahmen dieser Arbeit identifizierten, differenziell regulierten Gene bieten neue Ansatzpunkte zum vertieften Studium der Wechselwirkung von mutualistischen, wachstumsfördernden Bakterien mit höheren Pflanzen. KW - Azospirillum brasilense KW - Ackerschmalwand KW - Wechselwirkung KW - Molekularbiologie KW - Azospirillum brasilense KW - PAMPS KW - ROS KW - EF-TU KW - aliphatic glucosinolates KW - Azospirillum brasilense KW - PAMPS KW - ROS KW - EF-TU KW - aliphatic glucosinolates Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51673 ER - TY - THES A1 - Klinkenberg, Jörn T1 - Physiological Role of Fatty Acid Desaturation in Agrobacterium-induced Arabidopsis Crown Galls T1 - Physiologische Rolle der Fettsäure-Desaturierung in der durch Agrobacterium ausgelösten Wurzelhalsgalle von Arabidopsis N2 - Crown gall development is accompanied by hypoxia, drought and oxidative stress. These abiotic stress factors are known to have an impact on fatty acid (FA) desaturation. Thus, an alteration in the lipid profile of plant tumors was expected. A comprehensive lipid analysis of Arabidopsis thaliana crown galls induced by Agrobacterium tumefaciens showed an increase in the degree of FA desaturation. The poly unsaturated fatty acid (PUFA) linolenic acid (18:3) of endoplasmic reticulum (ER) derived phospholipids was especially affected. The increased levels of desaturated FAs were reflected by a strong induction of two genes encoding desaturases, FAD3 and SAD6. In contrast to FAD3, which encodes the ER membrane bound fatty acid desaturase enzyme that synthesizes 18:3 PUFAs in the ER, the function of SAD6 is unknown. The ability of SAD6 to complement the extreme dwarf growth phenotype of the ssi2-2 mutant allele suggests that SAD6 is a functional stearoyl-acyl-carrier-protein delta-9 desaturase (SAD) which catalyzes the first step in FA desaturation and forms stearic acid (18:1). Overexpression of the SAD6 gene in Arabidopsis (SAD6-OE) to a similar degree as in tumors resulted in a light-dependent chlorosis phenotype and caused a similar shift in the lipid profile towards unsaturated phospholipids. Posttranscriptional down-regulation of SAD6 overexpression by RNA reverted the chlorosis phenotype and the changes in the lipid profile, showing that SAD6 overexpression forms the unsaturated FA profile and the phenotype in SAD6-OE. The subcellular localization of the SAD6 protein in chloroplasts, which is obligatory for SAD function was demonstrated. SSI2, which encodes the major contributor to the 18:1 FA levels in Arabidopsis is down-regulated in crown galls pointing to a replacement of SSI2 function by SAD6 in the tumor. SAD6 transcripts were almost undetectable in Arabidopsis under normal growth condition, whereas under hypoxia the gene was strongly activated. In the tumor hypoxia most likely caused the very high transcription of SAD6. Hypoxia is known to limit FA desaturation and it is associated with an elevated reactive oxygen species (ROS) production which is detrimental for unsaturated FAs. Thus, up-regulation of SAD6 in the crown gall, most likely serves as an adaptive mechanism to activate desaturation under low oxygen concentrations and to maintain the levels of unsaturated FA under oxidative stress. The ER localized FAD3 most likely is responsible for the rise in 18:3 of the phospholipid class to cope with drought stress in crown galls. This hypothesis was supported by the loss of function mutant, fad3-2, which developed significantly smaller tumors as the wild type under low relative humidity.Taken together, this study suggests that the induction of SAD6 and FAD3 shapes the tumor lipid profile by increasing the levels of unsaturated FAs. Unsaturated fatty acids prepare the crown gall to cope with ongoing hypoxia, drought and oxidative stress during growth and development. N2 - Die Physiologie der durch Agrobacterium tumefaciens hervorgerufenen Wurzelhalsgallen ist geprägt von Sauerstoffmangel, Trocken- und oxidativen Stress. Diese Stressfaktoren beeinflussen die Umwandlung gesättigter zu ungesättigten Fettsäuren (Desaturierung). Somit sind Änderungen im Lipidmuster des durch Agrobacterium tumefaciens ausgelösten Pflanzentumors wahrscheinlich. Eine umfassende Analyse des Wurzelhalsgallenlipidmusters ergab, dass der Anteil an ungesättigten Fettsäuren erhöht war. Am auffälligsten war vor allem die Erhöhung der mehrfach ungesättigten Fettsäure Linolensäure (18:3) in den mit dem endoplasmatischen Retikulum (ER) assoziierten Phospholipiden. Dieser Anstieg ging einher mit der stark erhöhten transkriptionellen Aktivität des FAD3-Gens, das eine membrangebundene Fettsäure-Desaturase kodiert, die Linolensäure (18:3) im ER synthetisiert. Darüber hinaus war ein weiteres funktionell unbekanntes Desaturase-Gen, SAD6, stark aktiviert. Das SAD6 Protein war in Chloroplasten lokalisiert und in der Lage den extremen Zwergwuchs-Phänotyp der ssi2-2 Mutante zum Wildtyp zu komplementieren. Damit wurde nahegelegt, dass SAD6, wie SSI2, eine funktionelle „delta-9 Stearoyl-Acyl-Carrier-Protein-Desaturase“ (SAD) ist. Die Überexpression des SAD6-Gens in Arabidopsis (SAD6-OE), vergleichbar der in Wurzelhalsgallen, führte zu einem Anstieg ungesättigter Phospholipide und einem lichtabhängigen chlorotischen Phänotyp. Eine posttranskriptionelle Reduzierung der SAD6 Überexpression durch RNAi revertierte den Chlorosephänotyp und die Veränderungen im Lipidprofil zum Phänotyp des Wildtyps. Da SSI2, welches das SAD-Enzym für die Ölsäure (18:1)-Produktion in Arabidopsis kodiert, in Wurzelhalsgallen stark herunterreguliert ist, übernimmt hier sehr wahrscheinlich SAD6 die Funktion von SSI2. Insbesondere deshalb, weil der im Tumor vorherrschende Sauerstoffmangel zu einer starken Aktivierung des SAD6-Gens führt. Die Produktion ungesättigter Fettsäuren wird unter hypoxischen Bedingungen limitiert, weshalb eine erhöhte Expression von SAD6 die reduzierte Synthese ungesättigter Fettsäuren kompensieren könnte. Hypoxie und vor allem die posthypoxische Phase führen zur Produktion reaktiver Sauerstoffspezies (ROS), die ungesättigte Fettsäuren peroxidieren, so dass das Hypoxie-sensitive SAD6-Gen darüber hinaus das Niveau ungesättigter Fettsäuren unter oxidativem Stress zu erhalten scheint. Die ER lokalisierte Desaturase FAD3 ist ursächlich für die spezifische Erhöhung von Linolensäure (18:3) in den ER assoziierten Phospholipiden und führt somit zu einer Anpassung an den Trockenstress im Tumor. Dies wird dadurch unterstützt, dass an fad3-2 Mutanten unter erhöhtem Trockenstress deutlich kleinere Tumore wachsen. Diese Studie hat gezeigt, dass die Induktion von SAD6 und FAD3 in der Wurzelhalsgalle mit einer erhöhten Produktion ungesättigter Fettsäuren einhergeht und somit die Entwicklung und das Wachstum von Wurzelhalsgallen unter Sauerstoffmangel, oxidativem Stress und Wasserverlust ermöglicht wird. KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Wurzelhalsgalle KW - Lipidstoffwechsel KW - Ungesättigte Fettsäuren KW - Ackerschmalwand KW - Hypoxie KW - Agrobacterium tumefaciens KW - Crown Gall KW - Lipid Metabolism KW - unsaturated Fatty Acids KW - Arabidopsis thaliana KW - Hypoxia Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75262 ER - TY - THES A1 - Müller, Stephanie T1 - Plant thermotolerance: The role of heat stress-induced triacylglycerols in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Thermotoleranz in Pflanzen: Die Rolle von Hitzestress induzierten Triacylglycerolen in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Plants are exposed to high temperature, especially during hot summer days. Temperatures are typically lowest in the morning and reach a maximum in the afternoon. Plants can tolerate and survive short-term heat stress even on hot summer days. A. thaliana seedlings have been reported to tolerate higher temperatures for different time periods, a phenomenon that has been termed basal thermotolerance. In addition, plants have the inherent capacity to acclimate to otherwise lethal temperatures. Arabidopsis thaliana seedlings acclimate at moderately elevated temperatures between 32–38° C. During heat acclimation, a genetically programmed heat shock response (HSR) is triggered that is characterized by a rapid activation of heat shock transcription factors (HSFs), which trigger a massive accumulation of heat shock proteins that are chiefly involved in protein folding and protection. Although the HSF-triggered heat-shock response is well characterized, little is known about the metabolic adjustments during heat stress. The aim of this work was to get more insight into heat-responsive metabolism and its importance for thermotolerance. In order to identify the response of metabolites to elevated temperatures, global metabolite profiles of heat-acclimated and control seedlings were compared. Untargeted metabolite analyses revealed that levels of polyunsaturated triacylglycerols (TG) rapidly increase during heat acclimation. TG accumulation was found to be temperature-dependent in a temperature range from 32–50° C (optimum at 42° C). Heat-induced TG accumulation was localized in extra-chloroplastic compartments by chloroplast isolation as well as by fluorescence microscopy of A. thaliana cell cultures. Analysis of mutants deficient in all four HSFA1 master regulator genes or the HSFA2 gene revealed that TG accumulation occurred independently to HSF. Moreover, the TG response was not limited to heat stress since drought and salt stress (but not short-term osmotic, cold and high light stress) also triggered an accumulation of TGs. In order to reveal the origin of TG synthesis, lipid analysis was carried out. Heat-induced accumulation of TGs does not derive from massive de novo fatty acid (FA) synthesis. On the other hand, lipidomic analyses of A. thaliana seedlings indicated that polyunsaturated FA from thylakoid galactolipids are incorporated into cytosolic TGs during heat stress. This was verified by lipidomic analyses of A. thaliana fad7/8 transgenic seedlings, which displayed altered FA compositions of plastidic lipids. In addition, wild type A. thaliana seedlings displayed a rapid conversion of plastidic monogalactosyldiacylglycerols (MGDGs) into oligogalactolipids, acylated MGDGs and diacylglycerols (DGs). For TG synthesis, DG requires a FA from the acyl CoA pool or phosphatidylcholine (PC). Seedlings deficient in phospholipid:diacylglycerol acyltransferase1 (PDAT1) were unable to accumulate TGs following heat stress; thus PC appears to be the major FA donor for TGs during heat treatment. These results suggest that TG and oligogalactolipid accumulation during heat stress is driven by post-translationally regulated plastid lipid metabolism. TG accumulation following heat stress was found to increase basal thermotolerance. Pdat1 mutant seedlings were more sensitive to severe heat stress without prior acclimatization, as revealed by a more dramatic decline of the maximum efficiency of PSII and lower survival rate compared to wild type seedlings. In contrast, tgd1 mutants over-accumulating TGs and oligogalactolipids displayed a higher basal thermotolerance compared to wild type seedlings. These results therefore suggest that accumulation of TGs increases thermotolerance in addition to the genetically encoded heat shock response. N2 - Pflanzen sind besonders während der Sommerzeit hohen Temperaturschwankungen ausgesetzt. Temperaturen sind am Morgen meist niedrig und erreichen ihr Maximum während des Nachmittags. Pflanzen können Hitzestress im Sommer jedoch für eine kurze Zeit tolerieren. Arabidopsis thaliana Keimlinge können höhere Temperaturen für verschiedene Zeitspannen tolerieren, was als Basale Thermotoleranz beschrieben wird. Zusätzlich können Pflanzen durch Akklimatisierung eine Toleranz zu andernfalls letalen Temperaturen erwerben. A. thaliana Keimlinge beginnen sich bereits bei moderat erhöhten Temperaturen zwischen 32–38° C zu akklimatisieren. Während der Hitzeakklimatisierung wird eine genetisch programmierte Hitzeschockantwort (HSR) ausgelöst, welche durch eine rasche Aktivierung von Hitzeschock-Transkriptionsfaktoren (HSF) eingeleitet wird. Dies führt wiederum zu einem enormen Anstieg von einer Reihe von Hitzeschockproteinen (HSP), welche an der Faltung und dem Schutz der Proteine beteiligt sind. Obwohl die HSF-induzierte Hitzeschockantwort bereits gut charakterisiert ist, ist über die metabolomische Anpassung während des Hitzestress nur wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war es mehr Kenntnisse von hitze-respondierenden Metaboliten zu erhalten sowie deren Bedeutung für die Thermotoleranz. Zur Identifizierung von thermosensitiven Metaboliten, wurden die Metabolitprofile von Hitze akklimatisierten und Kontrollkeimlingen miteinander verglichen. Mittels ungerichteter Metabolit Analyse wurde ein rascher Anstieg von vielfach ungesättigten Triacylglycerolen (TG) während der Hitzeakklimatisierung nachgewiesen. Der TG Anstieg ist temperaturabhängig in einem Bereich von 32–50° C (Optimum bei 42° C). Der hitzeinduzierte TG Anstieg konnte mittels Chloroplastenisolierung sowie der separaten Analyse von Wurzel und Spross in den extrachloroplastidären Kompartimenten lokalisiert werden. Dies konnte durch Fluoreszenz Mikroskopie in Zellkulturen von A. thaliana bestätigt werden. Die Analyse von Mutanten, die einen Defekt in allen vier HSFA1 Masterregulatoren oder in dem HSFA2 Gen besitzen, zeigte, dass der Anstieg der TGs keine Abhängigkeit von den HSFs aufweist. Zudem ist der TG Anstieg nicht nur auf die Hitzestressantwort begrenzt, sondern auch durch Trockenheit und Salzstress induzierbar, jedoch nicht durch kurzzeitigen osmotischen-, Kälte- und Hochlichtstress. Zur Aufklärung des Ursprungs der TG Synthese wurde eine Lipidanalyse durchgeführt. Die hitzeinduzierte TG Akkumulation durch eine massive De Novo Fettsäuresynthese konnte ausgeschlossen werden. Die Untersuchung des Lipidoms von A. thaliana Keimlingen nach Hitze bot jedoch Hinweise auf einen Einbau von vielfach ungesättigten Fettsäuren aus thylakoiden Galaktolipiden in zytosolische TGs. Dies konnte durch die Untersuchung des Lipidoms von fad7/8 transgenen A. thaliana Keimlingen mit veränderter Fettsäure Komposition der plastidären Lipide bestätigt werden. Der Wildtyp von A. thaliana wies zudem eine rasche Umwandlung von plastidärem Monogalactosyldiacylglycerolen (MGDGs) zu Oligogalaktolipiden, acylierten MGDGs und Diacylglycerolen (DGs) auf. Für die TG Biosynthese wird eine Fettsäure aus dem Acyl-CoA Pool oder von Phosphatidylcholin (PC) auf ein DG übertragen. Keimlinge, die einen Defekt in der Phosolipid:Diacylglycerol Acyltransferase (PDAT1) aufweisen, waren nicht in der Lage TGs nach Hitzestress zu akkumulieren, auf PC als der wesentliche Fettsäure-Donor für TGs nach Hitzestress hinweist. Die Ergebnisse deuten auf einen TG und Oligogalaktolipid Anstieg durch einen posttranskriptionell regulierten Lipidumbau während des Hitzestress hin. Es konnte gezeigt werden, dass der TG Anstieg nach Hitzestress zu einer erhöhten Thermotoleranz führt. Keimlinge der pdat1 Mutanten waren ohne Akklimatisierung empfindlicher gegenüber massiven Hitzestress, da sowohl ein dramatischer Abfall der maximalen Effizienz des Photosystems II und eine niedrigere Überlebensrate im Vergleich zu Keimlingen des Wildtyps nachgewiesen wurden. Im Gegensatz dazu zeigten tgd1 Mutanten, welche eine Überakkumulation von TGs und Oligogalaktolipiden aufweisen, eine höhere Thermotoleranz auf als Keimlinge des Wildtyps. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die TG Akkumulation die Thermotoleranz zusätzlich zu der genetisch kodierten Hitzeschockantwort erhöht. KW - Triglyceride KW - Ackerschmalwand KW - Hitzestress KW - thermotolerance KW - Thermotoleranz KW - lipid remodeling KW - Lipidumbau Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-152829 ER - TY - THES A1 - Stingl, Nadja T1 - Regulation der Jasmonatbiosynthese durch Lipasen in Arabidopsis thaliana T1 - Regulation of the biosynthesis of jasmonates by lipases in Arabidopsis thaliana N2 - Lipasen regulieren die Biosynthese von Jasmonaten, die eine elementare Signalfunktion bei der Entwicklung von Pflanzen und der Abwehr von Pathogenen haben. Entsprechend dem klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ dienen die aus Galaktolipiden freigesetzten Fettsäuren α-18:3 und 16:3 als Substrate der Jasmonsäure (JA)-Synthese. In den letzen zehn Jahren wurden jedoch die Intermediate der JA-Biosynthese 12-Oxo-Phytodiensäure (OPDA, ausgehend von α-18:3) und Dinor-12-Oxo-Phytodiensäure (dnOPDA, ausgehend von 16:3) verestert in Galaktolipiden der Art Arabidopsis thaliana nachgewiesen. Die Biosynthese und die mögiche Speicherfunktion dieser komplexen, als Arabidopside bezeichneten, Lipide war jedoch noch unklar. In der Literatur wird ein alternativer Syntheseweg postuliert, in dem analog zum klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ die Biosynthese von veresterter OPDA/dnOPDA ausgehend von veresterter α-18:3/16:3 vollständig in Galaktolipiden der Pastidenmembran stattfindet. Nach Freisetzung von OPDA/dnOPDA durch eine Lipase könnten OPDA/dnOPDA dann als Intermediate in die JA-Biosynthese einfliessen. Sowohl im klassischen „Vick-Zimmerman-Pathway“ als auch im postulierten alternativen Syntheseweg ist die Aktivität von Lipasen von essentieller Bedeutung für die JA-Biosynthese. Für zwei plastidäre sn1-spezifische Acyl-Hydrolasen, DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) und DONGLE (DGL), wurde eine zentrale Funktion innerhalb der Jasmonat-Biosynthese in Blättern von A. thaliana beschrieben. Dem zufolge ist DGL für die basalen und die frühen wundinduzierten JA-Gehalte und DAD1 für die Aufrechterhaltung der erhöhten JA-Konzentrationen in der späteren Verwundungsantwort verantwortlich. In der vorliegenden Arbeit wiesen drei unabhängige DGL-RNAi-Linien sowie DAD1-Knock-out-Mutanten sowohl unter basalen Bedingungen als auch zu frühen Zeitpunkten nach Verwundung sowie nach Infektion mit dem Bakterienstamm P. syringae DC3000 (avrRPM1) mit dem Wildtyp vergleichbare Konzentrationen an OPDA/JA auf. Dies steht im klaren Widerspruch zu den publizierten Daten. Die Beteiligung von DAD1 an der OPDA/JA-Biosynthese zu späten Zeitpunkten nach Verwundung konnte jedoch bestätigt werden. Ferner konnte eine dramatische Über-Akkumulation von Arabidopsiden in DAD1-defizienten Mutanten nach Verwundung nachgewiesen werden, was auf eine Beteiligung von DAD1 bei der Freisetzung von membrangebundener OPDA/dnOPDA hinweist. Die Analyse der Einzelmutanten 16 weiterer plastidärer Lipasen unter basalen Bedingungen, nach Verwundung und nach Infektion mit P. syringae DC3000 (avrRPM1) zeigte, dass keine der analysierten Mutanten eine essentielle Rolle in der JA-Biosynthese spielt. Jedoch wiesen Mutanten der sn1-spezifischen Lipasen AtPLA1-Iγ1 (At1g06800) signifikant niedrigere Konzentrationen an dnOPDA, OPDA und JA nach Verwundung auf, was eine indirekte Beteiligung an der JA-Biosynthese vermuten lässt. Blattgewebe einer Quadrupel-Mutanten, welche defizient in vier DAD1-ähnlichen Lipasen (AtPLA1-Iβ2, AtPLA1-Iγ1, AtPLA1-Iγ2, AtPLA1-Iγ3) ist, wies nach Verwundung mit der AtPLA1-Iγ1-Mutante vergleichbar niedrige Gehalte an dnOPDA, OPDA sowie JA auf. Da stets in sn2-Position vorliegende 16:3/dnOPDA ebenfalls Substrat der JA-Biosynthese sein kann, müssen zusätzlich zu DAD1 und AtPLA1-Iγ1 noch weitere nicht identifizierte sn1- und sn2-spezifische Acyl-Hydrolasen an der JA-Biosynthese nach Verwundung und Pathogeninfektion beteiligt sein. Dies bedeutet, dass entgegen der in der Literatur vertretenen Meinung, nicht eine sondern mehrere Lipasen in redundanter Weise die Biosynthese von Jasmonaten regulieren. Zur Aufklärung der Biosynthese und möglichen Speicherfunktion der ausschließlich in Arabidopsis vorkommenden Arabidopside wurden A. thaliana Keimlinge mit D5-Linolensäure-Ethylester inkubiert, um eine D5-Markierung der komplexen Lipide zu erzielen. Durch einen anschließenden Stressstimulus mittels Zugabe von Silbernitrat wurde die Jasmonat-Synthese induziert. Die vergleichende Analyse der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide MGDG, DGDG, PC sowie der freien OPDA und JA vor und nach Zugabe des Silbernitrats zeigte, eine hohe Übereinstimmung der Markierungsgrade der komplexen Membranlipide 18:3-18:3-MGDG, 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B (MGDG-OPDA-OPDA) und Arabidopsid G (OPDA-MGDG-OPDA-OPDA) vor der Silbernitratbehandlung mit denjenigen der durch Silbernitratbehandlung neu gebildeten OPDA/JA. Dagegen wird die hochmarkierte freie Linolensäure nicht direkt zu freier OPDA umgesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G direkte Vorstufen von freier OPDA sein können. Damit übereinstimmend konnte gezeigt werden, dass nach Silbernitratstress die Spiege der Vorstufe 18:3-18:3-MGDG abnehmen und zeitgleich die entsprechenden unmittelbaren Metabolite 18:3-OPDA-MGDG, Arabidopsid B und Arabidopsid G akkumulieren. N2 - Lipases regulate the biosynthesis of jasmonates. Jasmonates have an essential role in the development and defense of plants. According to the classical „Vick-Zimmerman-Pathway“ α-18:3/16:3 released by hydrolases out of galactolipids serve as substrate for the biosynthesis of jasmonic acid. In the last ten years also the metabolites of the biosynthesis of jasmonic acid OPDA (derived from α-18:3) and dnOPDA (derived from 16:3) were found to be esterified in galactolipids of arabidopsis. The synthesis and function of these complex lipids, named arabidopsides, is yet not known. An alternative Pathway is postulated in the literature. According to this the synthesis of dnOPDA/OPDA takes place in galactolipids. Free dnOPDA/OPDA released by hydrolases may then serve as substrates for the biosynthesis of jasmonic acid. In the classical „Vick-Zimmerman-Pathway“ as well as in the alternative Pathway the activity of lipases have an essential impact on the biosynthesis of jasmonates. Two plastidic acyl-hydrolases with sn1-substrate specificity, DEFECTIVE IN ANTHER DEHISCENCE1 (DAD1) and DONGLE (DGL), were published to have a essential role in the biosynthesis of jasmonates in leaves of Arabidopsis thaliana. DGL should be responsible for the formation of jasmonic acid under basal conditions and at early timepoints after wounding, DAD1 should maintain the elevated concentrations of jasmonic acid at later timepoints after wounding. In this work the involvement of DAD1 in the biosynthesis of OPDA/JA at later timepoints after wounding was confirmed. However, no differences could be detected in three independent DGL-RNAi-lines and DAD1-knock-out-mutants in comparison to the wild type under basal conditions and at early timepoints after wounding which is contradictory to the published data. In addition, in these mutants wild type oxylipin levels were found after infection with an avirulent bacterial strain of Pseudomonas syringae. Furthermore DAD1-deficient mutants displayed dramatic accumulation of arabidopsides at later timepoints after wounding. Therefore it is suspected that DAD1 is responsible for the release of OPDA esterified in galactolipids. The analysis of single mutants of 16 additional lipases localised in plastids showed no strong differences in comparison to the wildtype under basal conditions, after wounding as well as after infection with P. syringae. Hence, none of the tested lipases plays an essential role in the biosynthesis of jasmonates. However mutants of the sn1-specific acyl-hydrolase AtPLA1-Iγ1 (At1g06800) showed significant lower concentrations of dnOPDA, OPDA and JA after wounding in comparison to the wildtype. This indicates an involvement of AtPLA1-Iγ1 in the biosynthesis of jasmontes. A quadruple mutant defective in four DAD1-like lipases (AtPLA1-Iβ2, AtPLA1-Iγ1, AtPLA1-Iγ2, AtPLA1-Iγ3) displayed jasmonate levels similar to the mutant line of AtPLA1-Iγ1 after wounding. The lipids 16:3/dnOPDA are always esterified in sn2 position of glycerolipids. Furthermore 16:3/dnOPDA may also serve as substrates for the biosynthesis of jasmonic acid. The results suggest that, in addition to DAD1 and AtPLA1-Iγ1, still unidentified enzymes with sn1- and sn2-hydrolase activity are involved in wound- and pathogen-induced jasmonate formation, indicating functional redundancy within the lipase family. To clarify the biosynthesis and storage function of arabidopsides, seedlings of A.thaliana were incubated with D5-linolenic acid ethyl ester to produce labelling of complex membrane lipids. Subsequent application of silver nitrate induced the biosynthesis of jasmonates. The analysis of the complex lipids MGDG, DGDG, PC as well as OPDA/JA before and after treatment with silver nitrate showed a high consistency of labelling of the complex lipids 18:3-18:3-MGDG, 18:3-OPDA-MGDG, arabidopside B (OPDA-OPDA-MGDG) as well as arabidopside G (OPDA-OPDA-MGDG-OPDA) before application of silver nitrate with labelling of the newly synthesised OPDA/JA induced by treatment with silver nitrate. The results suggest, that MGDG-18:3-18:3, 18:3-OPDA-MGDG, arabidopsid B and arabidopsid G are precursors or metabolites of free OPDA, which is a precursor of JA. Furthermore, simultaneous decrease of 18:3-18:3-MGDG and concomitant increase of arabidopsid B and arabidopsid G after application of silver nitrate could be shown. This suggests synthesis of OPDA/dnOPDA in-situ via the alternative pathway. KW - Lipasen KW - Jasmonate KW - Stoffwechselweg KW - Regulation KW - Ackerschmalwand KW - Jasmonatbiosynthese KW - Arabidopsis thaliana KW - Arabidopside KW - Lipases KW - Jasmonates KW - Biosynthesis of Jasmonates KW - Arabidopsis thaliana KW - Arabidopsides Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56393 ER - TY - THES A1 - Förster, Sabrina T1 - Regulation des Kaliumausstroms im ABA- und Jasmonatvermittelten Stomaschluss T1 - Regulation of Potassium Efflux in the ABA- and Jasmonate-controlled Stomatal Closure N2 - Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden. N2 - Stomata are microscopically small pores in the leaf surface of land plants, through which the leaf tissue is supplied with CO2. To protect the plant from both desiccation and infection by pathogens, a mechanism evolved to adjust the pore width to the plant’s needs by movement of the surrounding guard cells. A dense signaling network controls these movements and is able to integrate external as well as internal stimuli. Stomatal closure is osmotically driven by the loss of turgor in guard cells caused by efflux of ions such as K+. In this work, we investigated the regulation by phosphorylation of the main K+ efflux channel for stomatal closure, GORK. The following results were obtained with electrophysiological measurements via the DEVC- technique: GORK is phosphorylated by OST1 in a Ca2+- independent and by CBL1/9-CIPK5 as well as CBL1-CIPK23 in a Ca2+-dependent manner. CBL1 anchors CIPK5 at the plasma membrane and must bind Ca2+ for activation of CIPK5. CIPK5 requires both ATP binding and a conformational change for phosphorylation of GORK. For the first time it was shown that the PP2C phosphatase ABI2 interacts directly with an ion channel and inhibits its activity. ABI2 also interacts with the kinases OST1, CIPK5 and CIPK23, implying a control by ABI2 over channel activity in multiple ways. OST1 and ABI2 link GORK regulation with the ABA signaling pathway. Guard cells of gork1-2, cbl1/cbl9 and cipk5-2 are insensitive to MeJA, but not to ABA. This represents a direct connection between JA signal transduction and Ca2+ signaling. In this work, further hints could be found for the complex interplay of the phytohormones ABA, JA and the effector Coronatine of Pseudomonas. Here it was shown for the first time that guard cells respond differently to MeJA and the phytotoxin Coronatine, based on incubation time. Depending on the temporal sequence of perception, ABA and Coronatine act antagonistically on the pore width. Jasmonate signal transduction in guard cells leads to a minor synthesis of ABA as well as protein degradation via the ubiquitin/ 26S proteasome system and initiates stomatal closure requiring ABA receptors (PYR/PYLs). This work describes the JA-controlled regulation of the potassium efflux channel GORK as well as some differential aspects of ABA, JA and Coronatine triggered stomatal movements. KW - Ackerschmalwand KW - Stomata KW - Arabidopsis thaliana KW - Phophorylierung KW - Phytohormon KW - Spaltöffnung KW - Kaliumkanal KW - Abscisinsäure KW - Jasmonsäure KW - Pflanzenhormon Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-115455 ER - TY - THES A1 - Attaran, Elham T1 - Regulation of pathogen-inducible volatile compounds in Arabidopsis and their role in plant defense N2 - Plants are constantly attacked by pathogenic microbes. As a result, they have evolved a plethora of constitutive and inducible defense responses to defend against attempted pathogen infection. Although volatile organic compounds have been implicated in plant defense, direct evidence of their function in plant resistance is still lacking. I have examined the role of VOCs in Arabidopsis defense against the hemibiotrophic bacterial pathogen Pseudomonas syringae pv. maculicola. The obtained results show that the vegetative parts of Arabidopsis produces and emits the volatile phenylpropanoid MeSA and three kinds of terpenoids, (E,E)-4,8,12-trimethyltrideca-1,3,7,11-tetraene (TMTT), alpha-ionon and beta-farnesen, upon avirulent and virulent P. syringae inoculation. Whereas the most abundant volatiles, MeSA and TMTT, are already produced at early stages of infection in the compatible and incompatible interaction, enhanced emission of alpha-ionon and beta-farnesen can only be detected in later stages of the compatible interaction. It was revealed that pathogen-induced synthesis of TMTT in Arabidopsis requires the JA signaling pathway but occurs independently of SA defense signaling. Similarly, the production of MeSA is dependent on JA signaling but not on the SA defense signaling pathway. Furthermore, production of MeSA is dependent on the function of ISOCHORISMATE SYNTHASE1, which produces its precursor SA. Upon inoculation with avirulent P. syringae, endogenously produced JA activates the JA signalling pathway to mediate MeSA and TMTT synthesis. By contrast, in the compatible Arabidopsis-Psm interaction, production of MeSA predominantly depends on the P. syringea the virulence factor coronatine, which activates JA downstream signaling. To learn more about the role of inducible VOCs in plant defense responses, I have identified an Arabidopsis T-DNA insertions line with a defect in the TERPENE SYNTHASE4 (TPS4) gene. Emission profiles from this mutant revealed that the induced production of TMTT but not of alpha-ionone, beta-farnesene or MeSA are abolished, demonstrating that TPS4 specifically regulates the P. syringae-induced synthesis of TMTT in Arabidopsis. The lack of TMTT in tps4 mutants, however, does not affect plant defense responses and resistance induction against P. syringae. This excludes a role of the terpenoid as an effective phytoalexin in Arabidopsis leaves against the bacterial pathogen. Moreover, tps4 mutant plants are still able to mount a SAR response, excluding a signaling function of TMTT during SAR. An important aim of our studies was to address the defensive role of MeSA, the major VOC emitted from P. syringae-inoculated Arabidopsis leaves. MeSA has been recently proposed as a critical long distance signal in the development of SAR. I found that two independent T-DNA insertions lines with defects in expression of the pathogen-inducible SA methyl transferase gene BSMT1 are completely devoid of pathogen-induced production of MeSA. However, bsmt1 mutant plants are capable to increase the level of SA in systemic, non-infected leaves of Arabodopsis and develop SAR like wild-type plants upon local P. syringae-inoculation. Thus, MeSA does not function as a critical SAR signal in Arabidopsis. Further experiments showed that SA accumulation in distant leaves occurs due to de novo synthesis through isochorismate synthase. In addition, we also ruled out a critical defensive role of MeSA at inoculation sites, because bsmt1 mutants are able to build up SA-dependent defense responses and local resistance in a wild-type-like manner. The conversion of SA to MeSA and subsequently emission of MeSA from the plant might help the plant to detoxify an excess of SA. This process is regulated by the JA pathway and might be one means to mediate negative crosstalk between JA and SA signaling. Moreover, the COR-triggered conversion of SA to MeSA and emission of the volatile methyl ester could be a way by which virulent P. syringae is able to attenuate the SA-defense pathway. N2 - Pflanzen sind einer ständigen Bedrohung durch phytopathogene Mikroorganismen ausgesetzt und haben deshalb eine Vielzahl von konstitutiven und induzierbaren Abwehrstrategien entwickelt. Die Phytohormone Salicylsäure (SA), Jasmonsäure (JA) und Ethylen sind zum Beispiel entscheidende Regulatoren von induzierten Abwehrmechanismen. Eine Antwort der Pflanze auf mikrobielle Angriffe beinhaltet auch die Emission volatiler organischer Verbindungen (volatile organic compounds - VOCs). Antimikrobielle Wirkungen von VOCs wurden bisher jedoch nur in in-vitro-Assay beobachtet. Ein direkter Beweis für eine mögliche Rolle der VOCs in der Pflanzenabwehr wurde bisher nicht erbracht. Die Rolle pflanzlicher VOCs und deren Bedeutung für die Pathogenabwehr im Modellsystems Arabidopsis thaliana – Pseudomonas syringae ist das zentrale Element dieser Arbeit. Zunächst wurden Terpenoide, die die größte Gruppe der VOCs bilden, untersucht. Vegetative Teile von Arabidopsis emittieren nach Inokulation mit virulenten und avirulenten Stämmen von P. syringae pv. maculicola (Psm) vor allem drei Terpene: das Homoterpen (E,E)-4,8,12-Trimethyl-1,3,7,11-tridecatetraen (TMTT), alpha-Ionon und beta-Farnesen, welches zur Gruppe der Sesquiterpene gehört. Als Hauptkomponente des pathogen-induzierten VOC-Profils wurde das Phenylpropansäurederivat Methylsalicylsäure (MeSA) identifiziert. Um einen besseren Einblick in die Rolle der VOCs in der Pflanzenabwehr zu erhalten, wurden Arabidopsis T-DNA-Insertionslinien des Terpensynthase-gens TPS4 isoliert. Die Emissionsmuster zeigten, dass die induzierbare Freisetzung von TMTT, aber nicht von alpha-Ionon und beta-Farnesen oder MeSA reduziert war. Dies zeigt, dass TPS4 spezifisch die Psm-induzierte TMTT-Synthese in A. thaliana reguliert. Die verringerte Menge TMTT in den tps4-Mutanten hat jedoch keinen Einfluss auf die pflanzlichen Abwehrreaktionen und die Resistenzinduktion gegen P. syringae, was eine Rolle von TMTT als effektives Phytoalexin in A. thaliana gegen bakterielle Pathogene ausschließt. Ebenso hat TMTT keine Signalfunktion bei der Ausbildung der Systemisch erworbenen Resistenz (SAR), da tps4-Mutanten weiterhin in der Lage sind eine SAR-Antwort zu induzieren (Attaran et al. 2008). Als weiteres Teilprojekt wurde die Regulation von pathogen-induzierten VOCs in A. thaliana untersucht. Viele induzierte Abwehrmechanismen beinhalten Signaltransduktionsnetzwerke an denen Salicyl- oder Jasmonsäure beteiligt sind. Mit A. thaliana-Mutanten, die in der SA- oder JA- Synthese oder den jeweiligen Signalwegen beeinträchtigt sind, konnte gezeigt werden, dass die pathogen-induzierte TMTT-Produktion in A. thaliana über den JA-Signalweg, aber unabhängig von Salicylsäure verläuft. Auch die MeSA-Produktion ist JA-abhängig. Für die Biosynthese von SA, genauso wie für deren Derivat MeSA, wird ISOCHORISMAT SYNTHASE1 benötigt, die den MeSA-Vorläufer SA bildet. Im Rahmen einer inkompatiblen Interaktion wird die Bildung von MeSA in Abhängigkeit von der JA-Biosynthese gesteuert. Im Gegensatz dazu ist in der kompatiblen Interaktion die MeSA-Produktion vom bakteriellen Virulenzfaktor Coronatin abhängig. Coronatin-defiziente Stämme von P. syringae sind nicht fähig, eine MeSA-Emission zu induzieren (Attaran et al., 2009). Desweiteren wurde in der vorliegenden Arbeit die Rolle von MeSA in der Pflanzenabwehr untersucht. MeSA ist das VOC, welches von P. syringae-inokulierten A. thaliana-Blättern vorwiegend abgegeben wird. Kürzlich wurde für MeSA eine Signaleigenschaft als Langstreckensignal in der Etablierung der SAR postuliert (Park et al., 2007). Wir konnten zeigen, dass T-DNA Insertionslinien, bei denen keine Expression der pathogeninduzierten SA-Methyltransferase BSMT1 nachgewiesen werden konnte und die somit keine pathogen-induzierte MeSA-Produktion aufwiesen, auch in systemischen, nicht infizierten Blättern nach P. syringae-Inokulation einen erhöhten SA-Spiegel, eine verstärte Expression von Abwehrgenen und eine erhöhte Pathogenresistenz aufwiesen. Diese Mutantenlinien können also die SAR genauso und in demselben Maß wie Wildtyp-Pflanzen entwickeln. Damit konnte gezeigt werden, dass MeSA nicht als zentrales Signal für die Ausbildung der SAR in Arabidopsis wirken kann. Weitere Experimente machten deutlich, dass die SA-Akkumulation in distalen Blättern auf eine de-novo-Synthese durch die Isochorismat-Synthase zurückzuführen ist. Schließlich konnte auch eine wichtige Rolle von MeSA in der Pflanzenabwehr an den Infektionsstellen ausgeschlossen werden, da bsmt1-Mutanten SA-abhängige Abwehrreaktionen und lokale Resistenzantworten in gleicher Weise wie Wildtyp-Pflanzen zeigen (Attaran et al., 2009). Produktion und anschließende Emission von MeSA könnte daher in der Pflanze dazu beitragen, einen toxischen Überschuss an SA abzubauen. Reguliert wird dieser Prozess durch den JA-Signalweg, der dadurch einen negativen Einfluss auf den SAHaushalt der Pflanze innehat. Die Auslösung der MeSA-Produktion von dem bakteriellen Virulenzfaktor COR in der kompatiblen Wechselwirkung könnte eine Strategie von P. syringae sein, die Effizienz der SA-basierenden Abwehr zu verzögern. KW - Ackerschmalwand KW - Pathogener Mikroorganismus KW - Abwehrreaktion KW - VOC <Ökologische Chemie> KW - Volatiler oraganischer Verbindungen KW - Abwehrmechanismen KW - Systemisch erworbenen Resistenz KW - Volatiole Compounds KW - disease resistance KW - Systemic acquired resistance Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-46715 ER - TY - THES A1 - Lambour, Benjamin T1 - Regulation of sphingolipid long-chain bases during cell death reactions and abiotic stress in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) T1 - Regulation von Sphingobasen während der Zelltodreaktion und abiotischem Stress in \(Arabidopsis\) \(thaliana\) N2 - Sphingobasen (LCBs) sind die Bausteine der Biosynthese von Sphingolipiden. Sie werden als Strukturelemente der pflanzlichen Zellmembran definiert und spielen eine wichtige Rolle für das Schicksal der Zellen. Komplexe Ceramide machen einen wesentlichen Teil der gesamten Sphingolipide aus, die einen großen Teil der eukaryotischen Membranen bilden. Gleichzeitig sind LCBs bekannte Signalmoleküle für zelluläre Prozesse in Eukaryonten und sind an Signalübertragungswegen in Pflanzen beteiligt. Es hat sich gezeigt, dass hohe LCB-Konzentrationen mit der Induktion des programmierten Zelltods sowie mit dem durch Pathogene ausgelösten Zelltod in Verbindung stehen. Mehrere Studien haben die regulierende Funktion der Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen bestätigt: (i) Spontaner PCD und veränderte Zelltodreaktionen, die durch mutierte verwandte Gene des Sphingobasen-Stoffwechsels verursacht werden. (ii) Zelltodbedingungen erhöhen den Gehalt an LCBs. (iii) PCD aufgrund eines gestörten Sphingolipid-Stoffwechsels, der durch von nekrotrophen Krankheitserregern produzierte Toxine wie Fumonisin B1 (FB1) hervorgerufen wird. Um den Zelltod zu verhindern und die Zelltodreaktion zu kontrollieren, kann daher die Regulierung des Gehalts an freien LCBs entscheidend sein. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie stellten das Verständnis der Sphingobasen und Sphingolipidspiegel während der PCD in Frage. Wir lieferten eine detaillierte Analyse der Sphingolipidspiegel, die Zusammenhänge zwischen bestimmten Sphingolipidarten und dem Zelltod aufzeigte. Darüber hinaus ermöglichte uns die Untersuchung der Sphingolipid-Biosynthese ein Verständnis des Fluxes nach Akkumulation hoher LCB-Konzentrationen. Weitere Analysen von Abbauprodukten oder Sphingolipid-Mutantenlinien wären jedoch erforderlich, um vollständig zu verstehen, wie die Pflanze mit hohen Mengen an Sphingobasen umgeht. N2 - Sphingolipid long-chain bases (LCBs) are the building blocks of the biosynthesis of sphingolipids. They are defined as structural elements of the plant cell membrane and play an important role determining the fate of the cells. Complex ceramides represent a substantial fraction of total sphingolipids which form a major part of eukaryotic membranes. At the same time, LCBs are well known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes and are involved in signal transduction pathways in plants. High levels of LCBS have been shown to be associated with the induction of programmed cell death as well as pathogen-derived toxin-induced cell death. Indeed, several studies confirmed the regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Spontaneous PCD and altered cell death reaction caused by mutated related genes of sphingobase metabolism. (ii) Cell death conditions increases levels of LCBs. (iii) PCD due to interfered sphingolipid metabolism provoked by toxins produced from necrotrophic pathogens, such as Fumonisin B1 (FB1). Therefore, to prevent cell death and control cell death reaction, the regulation of levels of free LCBs can be crucial. The results of the present study challenged the comprehension of sphingobases and sphingolipid levels during PCD. We provided detailed analysis of sphingolipids levels that revealed correlations of certain sphingolipid species with cell death. Moreover, the investigation of sphingolipid biosynthesis allowed us to understand the flux after the accumulation of high LCB levels. However, further analysis of degradation products or sphingolipid mutant lines, would be required to fully understand how high levels of sphingobases are being treated by the plant. KW - PCD KW - Sphingolipids KW - LCB KW - Ackerschmalwand KW - programmed cell death KW - arabidopsis thaliana KW - abiotic stress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-325916 ER - TY - THES A1 - Peer, Markus T1 - Sphingolipide – Analytik, Biosynthese und Funktion in der Arabidopsis thaliana Pathogenantwort T1 - Sphingolipids – Analytics, Biosynthesis and Functions in the Arabidopsis thaliana Pathogen Interaction N2 - Sphingolipide (SPL) sind wichtige und ubiquitar verbreitete Bestandteile von Biomembranen. Aufgrund der enormen Vielfalt, der komplexen Struktur und diverser physiko-chemischer Eigenschaften der Sphingolipide gestaltet sich die qualitative und quantitative Untersuchung der Sphingolipide allerdings schwierig. In dieser Arbeit konnten, basierend auf publizierten Methoden, analytische Verfahren entwickelt werden, mit deren Hilfe sich die Gehalte spezifischer Sphingolipide in A. thaliana quantitativ nachweisen lassen. Unter Einsatz eines targeted metabolite profiling-Ansatzes wurde die Rolle spezifischer Sphingolipide in der Pflanzen-Pathogen Interaktion charakterisiert. Infiltration von avirulenten P. syringae pv. tomato (Pst) in Blätter von A. thaliana führte zu schnell und transient erhöhten Gehalten der freien Sphingobase Phytosphingosin (t18:0). Im Gegensatz zu avirulenten Pst kam es nach Infiltration von virulenten Pst zu einer schnellen Rückkehr auf Basalniveau und nicht zu einer hypersensitiven Antwort (HR), was auf eine positiv regulatorische Rolle von t18:0 in Abwehrreaktionen von Pflanzen hinwies, z.B. bei der HR. Damit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Spiegel freier Sphingobasen der Pflanze, insbesondere von t18:0, in Antwort auf bakterielle Pathogene reguliert werden. Diese spezifische Regulation korreliert, in Abhängigkeit von der Pathogeninfektion, mit dem Verlauf der HR. Im Unterschied zu avirulenten Stämmen sind virulente Pst in der Lage, Abwehrreaktionen des Wirtsorganismus zu unterdrücken. Daher tritt keine HR auf, welche die Ausbreitung des Pathogens stoppen könnte. Die unterschiedliche Beeinflussung der t18:0 Gehalte virulenter und avirulenter Stämme zeigte sich auch in Experimenten mit einem anderen P. syringae Stamm. Freie Sphingobasen zeigten in dieser Arbeit typische Merkmale von Signalmolekulen: geringe basale Spiegel, schnelle und transiente Gehaltsanderungen, präzise Regulation sowie spezifische Wirkeffekte. Sphingolipide stellen somit, neben den etwa durch PAMPs ausgelösten und durch Phytohormone vermittelten, weitere Signalwege in der Pflanzen Pathogen Interaktion dar. Die Infiltration von Pst in Blätter der A. thaliana Mutante sbh1-1 führte zu transient erhöhten d18:0 Spiegeln. In dieser Mutante ist die Funktion von einer der zwei Sphingobasen-Hydroxylasen gestört. Wie sich nach Totalhydrolyse zeigte, sind die Gesamtgehalte von t18:0 in der Mutante allerdings nicht reduziert. Dies spricht dafür, dass der pathogenabhängige transiente Anstieg von t18:0 durch de novo Synthese aus d18:0 entsteht und nicht durch Freisetzung aus komplexen Sphingolipiden mittels spezifischer Lipasen. Somit ist die Hydroxylase SBH1 für den schnellen signalvermittelten Anstieg von t18:0 verantwortlich. Neben t18:0 lösen auch strukturell ähnliche freie Sphingobasen, z.B. d18:1 und d18:0, Abwehrreaktionen und Zelltod aus, während andere Sphingobasen (d20:0 und d20:1) sowie Ceramide keine Reaktionen auslösten. Dies weist auch direkt auf die Spezifität der beteiligten Mechanismen hin. N2 - Sphingolipids (SPL) are important and ubiquitously distributed constituents of biological membranes. Due to the tremendous variety, complex structure and diverse physicochemical properties of sphingolipids, qualitative and quantitative analysis has only recently been possible due to newly developed methods in mass spectrometry and chromatography. In this work, analytical methods to quantitatively detect the SPL content in A. thaliana leaves were established based on published literature. Using a targeted metabolic profiling approach, the role of specific SPL in the plant‐pathogen interaction was characterized. In line with the production of reactive oxygen species (ROS), a hallmark of biotic stress, infiltration of the avirulent form of the phytopathogen P. syringae pv. tomato (Pst) led to a fast and transient increase of the free long chain base Phytosphingosine (t18:0). Virulent Pst showed also a fast and transient, but clearly less prolonged elevation of t18:0 levels. Also, no HR was elicited in response to the infiltration, pointing to a positive regulatory role of t18:0 in this plant defense response. This work shows, for the first time, that SPL, namely t18:0, were regulated in response to bacterial pathogens. The t18:0 kinetics showed a strong correlation with the course of the pathogen‐elicited HR. There was also evidence, that virulent Pst influences the plants own biosynthetic and regulatory mechanisms to inhibit the SPL mediated defense response. This was also the case with another tested Pseudomonas syringae strain. In this work, free long chain bases showed characteristics typical for signaling molecules: low basal levels, a fast and transient increase in response to pathogens and a tight regulation. Hence, SPL may represent members of signaling pathways in plant‐pathogen interactions in addition to or besides PAMP‐triggered and hormonal mediated signaling pathways. Infiltration of Pst into leaves of the A. thaliana hydroxylase mutant sbh1-1 led to transiently increased d18:0 levels in leaves. In this mutant, one of the two functional sphingobase hydroxylases of A. thaliana is impaired. As the total pool of t18:0 was not significantly reduced in the mutant after total hydrolysis, we argue that the pathogen‐dependent transient increase of t18:0 was due to de novo synthesis from d18:0 and not to the action of specific lipases. Furthermore SBH1 was responsible for the fast increase of t18:0 levels. In addition to t18:0, also other free long chain bases, e.g. d18:0, elicited plant reactions and cell death, whereas other long chain bases (d20:0 and d20:1) or ceramides elicited no response. Apparently, the specific lipid structure plays a major role for the efficiency in different signaling pathways. KW - Sphingolipide KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae tomato KW - Abwehrreaktion KW - Pathogeninteraktion KW - Sphingolipidstoffwechsel KW - Pseudomonas syringae KW - Schmalwand KW - Sphingolipids KW - Pathogens KW - Pseudomonas KW - HPLC-MS KW - Arabidopsis Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-55034 ER - TY - THES A1 - Pedrotti, Lorenzo T1 - The SnRK1-C/S1-bZIPs network: a signaling hub in Arabidopsis energy metabolism regulation T1 - Das SnRK1-C/S1-bZIP-Netzwerk: ein Signalknoten in der Regulation des Arabidopsis Energie-Metabolismus N2 - The control of energy homeostasis is of pivotal importance for all living organisms. In the last years emerged the idea that many stress responses that are apparently unrelated, are actually united by a common increase of the cellular energy demand. Therefore, the so called energy signaling is activated by many kind of stresses and is responsible for the activation of the general stress response. In Arabidopsis thaliana the protein family SnF1- related protein kinases (SnRK1) is involved in the regulation of many physiological processes but is more known for its involvement in the regulation of the energy homeostasis in response to various stresses. To the SnRK1 protein family belong SnRK1.1 (also known as KIN10), SnRK1.2 (KIN11), and SnRK1.3 (KIN12). SnRK1 exerts its function regulating directly the activity of metabolic enzymes or those of key transcription factors (TFs). The only TFs regulated by SnRK1 identified so far is the basic leucine zipper (bZIP) 63. bZIP63 belongs to the C group of bZIPs (C-bZIPs) protein family together with bZIP9, bZIP10, and bZIP25. SnRK1.1 phosphorylates bZIP63 on three amino acids residues, serine (S) 29, S294, and S300. The phosphorylation of tbZIP63 is strongly related to the energy status of the plant, shifting from almost absent during the normal growth to strongly phosphorylated when the plant is exposed to extended dark. bZIPs normally bind the DNA as dimer in order to regulate the expression of their target genes. C-bZIPs preferentially form dimers with S1-bZIPs, constituting the so called C/S1- bZIPs network. The SnRk1 dependent phosphorylation of bZIP63 regulates its activation potential and its dimerization properties. In particular bZIP63 shift its dimerization preferences according to its phosphorylation status. The non-phosphorylated form of bZIP63 dimerize bZIP1, the phosphorylates ones, instead, forms dimer with bZIP1, bZIP11, and bZIP63 its self. Together with bZIP63, S1-bZIPs are important mediator of part of the huge transcriptional reprogramming induced by SnRK1 in response to extended dark. S1-bZIPs regulate, indeed, the expression of 4'000 of the 10'000 SnRK1-regulated genes in response to energy deprivation. In particular S1-bZIPs are very important for the regulation of many genes encoding for enzymes involved in the amino acid metabolism and for their use as alternative energy source. After the exposition for some hours to extended dark, indeed, the plant make use of every energy substrate and amino acids are considered an important energy source together with lipids and proteins. Interestingly, S1- bZIPs regulate the expression of ETFQO. ETFQO is a unique protein that convoglia the electrons provenienti from the branch chain amino acids catabolism into the mitochondrial electron transport chain. The dimer formed between bZIP63 and bZIP2 recruits SnRK1.1 directly on the chromatin of ETFQO promoter. The recruitment of SnRK1 on ETFQO promoter is associated with its acetylation on the lysine 14 of the histone protein 3 (K14H3). This chromatin modification is normally asociated with an euchromatic status of the DNA and therefore with its transcriptional activation. Beside the particular case of the regulation of ETFQO gene, S1-bZIPs are involved in the regulation of many other genes activated in response of different stresses. bZIP1 is for example an important mediator of the salt stress response. In particular bZIP1 regulates the primary C- and N-metabolism. The expression of bZIP1, in response of both salt ans energy stress seems to be regulated by SnRK1, as it is the expression of bZIP53 and bZIP63. Beside its involvement in the regulation of the energy stress response and salt response, SnRK1 is the primary activators of the lipids metabolism during see germination. SnRK1, indeed, controls the expression of CALEOSINs and OLEOSINs. Those proteins are very important for lipids remobilization from oil droplets. Without their expression seed germination and subsequent establishment do not take place because of the absence of fuel to sustain these highly energy costly processes, which entirely depend on the catabolism of seed storages. N2 - Die Kontrolle der Energiehomöostase ist für alle lebenden Organismen von großer Bedeutung. In den letzten Jahren kam die Idee auf, dass viele Stressantworten, die scheinbar unabhängig voneinander sind, durch den Energiebedarf doch miteinander verbunden sind. Das sogenannte Energie-Signaling wird von vielen verschiedenen Stress- Arten aktiviert und ist verantwortlich für die Aktivierung der allgemeinen Stressantwort. In Arabidopsis thaliana ist die Proteinfamilie der SnF1-verwandten Proteinkinasen (SnRK1) an der Regulation vieler physiologischer Prozesse beteiligt. Auch bei der Regulation der Energiehomöostase als Folge von Stress spielen SnRK1-Kinasen eine wichtige Rolle. Proteine aus der SnRK1-Familie sind SnRK1.1, auch als KIN10 bezeichnet, SnRK1.2 (KIN11) und SnRK1.3 (KIN12). SnRK1-Proteine können die Aktivität von metabolischen Enzyme oder bestimmten Transkriptionsfaktoren (TF) direkt regulieren. Bislang wurde nur für den basischen Leucin-Zipper (bZIP) TF bZIP63 die Regulation durch SnRK1 gezeigt. bZIP63 gehört zur Gruppe C der bZIP Proteinfamilie (C-bZIP). Ebenfalls zu Gruppe C werden bZIP9, bZIP10 und bZIP25 zugeordnet. SnRK1.1 phosphoryliert das bZIP63- Protein an Serin (S) 29, S294 und S300. Der Grad der Phosphorylierung von bZIP63 steht in direktem Zusammenhang mit dem Energiehaushalt der Pflanze. Unter normalen Bedingungen wird bZIP63 kaum phosphoryliert, während bei verlängerter Nacht bZIP63 stark phosphoryliert wird. bZIP TF bilden untereinander Dimere aus und binden so an die DNA um die Expression ihrer Zielgene zu regulieren. C-bZIP TF bilden bevorzugt Dimere mit bZIP TF der Gruppe S1, bekannt als das C/S1-bZIP-Netzwerk. Die SnRK1-abhängige Phosphorylierung von bZIP63 steuert das Aktivierungspotential und die Dimerisierungseigenschaften. Besonders bei bZIP63 ändern sich die Dimerisierungspartner in Abhängigkeit des Phosphorylierungsgrads. Nicht-phosphoryliert dimerisiert bZIP61 mit bZIP1, im phosphorylierten Zustand dagegen bildet bZIP63 Dimere neben bZIP1 auch mit bZIP11 und bZIP63. S1-bZIP TF sowie bZIP63 sind wichtige Regulatoren der transkriptionellen Reprogrammierung, die durch SnRK1 bei verlängerter Dunkelheit induziert wird. S1-bZIP TF regulieren die Expression von 4'000 der 10'000 durch SnRK1 regulierten Gene in der Energieverarmungsantwort. Besonders S1-bZIP TF sind sehr wichtig für die Regulation vieler Gene, die für Enzyme aus dem Aminosäuremetabolismus codieren und als alternative Energiequelle der Pflanze bekannt sind. Wird die Nacht für einige Stunden verlängert, greift die Pflanze auf jede mögliche Energiequelle zurück. Als Energiequelle werden besonders Aminosäuren, aber auch Lipiden und Proteinen herangezogen. Interessanterweise regulieren S1-bZIP TF die Expression von ETFQO. ETFQO ist ein besonderes Protein, das die Elektronen aus dem Metabolismus verzweigter Aminosäuren in die mitochondriale Elektronentransportkette steuert. Das Dimer aus bZIP63 und bZIP2 rekrutiert SnRK1.1 direkt an das Chromatin des ETFQO-Promotors. Dieser Rekrutierung folgt die Acetylierung des Histonproteins 3 (K14H3) am Lysin 14. Diese Modifikation des Chromatins führt normalerweise zu einem euchromatischen Status der DNA und der nachfolgenden transkriptionellen Aktivierung. Neben der Regulation des ETFQO-Gens sind S1-bZIP TF auch an der Regulation von vielen anderen Genen in Folge von verschiedenen Stressen beteiligt. bZIP1 ist beispielsweise ein wichtiger Regulator der Antwort auf Salz-Stress. Auch der primäre Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus werden von bZIP1 reguliert. Es wird angenommen, dass die Expression von bZIP1 wie auch von bZIP53 und bZIP63 in der Antwort auf Salzstress und Energieverarmung durch SnRK1 gesteuert wird. Abgesehen von der Regulation der Antwort auf Energieverarmung und Salzstress spielen SnRK1-Proteine auch bei der Aktivierung des Lipidmetabolismus während der Keimung eine Rolle. SnRK1 kontrolliert die Expression von CALEOSINs und OLEOSINs. Diese beiden Proteine sind sehr wichtig für die Mobilisierung von Lipiden aus Öltröpfchen. In Abwesenheit von SnRK1 finden aufgrund von Energiemangel weder die Keimung noch die nachfolgende Entwicklung statt. KW - Ackerschmalwand KW - Homöostase KW - Proteinkinasen KW - Stress-Syndrom KW - SnRK1 KW - bZIPs KW - mitochondria KW - energy metabolism Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-116080 ER - TY - THES A1 - Ferber, Elena T1 - Transkriptionelle, metabolische und physiologische Anpassung nach Selbstintoxikation mit reaktiven Sekundärstoffen: die Glukosinolat-Bombe in Arabidopsis thaliana T1 - Transcriptional, metabolic and physiological adaptation after self-intoxication with reactive secondary substances: the glucosinolate bomb in Arabidopsis thaliana N2 - In Brassicaceae werden bei einer Gewebszerstörung unreaktive Glukosinolate durch das Enzym Myrosinase hydrolysiert. Es entstehen reaktive Substanzen wie Isothiocyanate (ITCs). Da diese Reaktion sehr schnell erfolgt wird sie auch als Senföl-Glukosid-Bombe bezeichnet. In Arabidopsis thaliana erfolgt nach Verwundung und Pathogeninfektion eine massive Akkumulation des ITCs Sulforaphan (SF), welches eine reaktive elektophile Spezies (RES) darstellt. Zu der Gruppe der RES zählen auch einige Oxylipine mit einer α,β-ungesättigten Carbonylgruppen wie 12-oxo-Phytodiensäure (OPDA) oder Phytoprostan A1 (PPA1). Die Fähigkeit der kovalenten Modifikation von Peptiden und Proteinen gilt als essentiell sowohl für die toxischen als auch die Gen-induzierenden Eigenschaften der RES. Neben ihrer Reaktivität spielt auch die Lipophilie eine Rolle für die Fähigkeit über Membranen zu diffundieren und unspezifisch an Proteine zu binden. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Transkriptomanalysen an Arabidopsis-Keimlingen mit sub-toxischen Konzentrationen von SF, Benzylisothiocyanat (BITC) und dem Oxylipin Prostaglandin A1 (PGA1) zeigten, dass strukturell sehr verschiedene RES einen gemeinsamen Satz von 55 Genen induzieren. Unter diesen befanden sich verschiedene Hitzeschock-, Stressassoziierte- und Detoxifizierungsgene. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Aktivierung über eine Muster-spezifische Erkennung der RES erfolgt. Als einen möglichen Mechanismus der RES-vermittelten Geninduktion wird die Regulation durch die Veränderung des zellulären Redox-Potentials als Folge kovalenter Modifikation von GSH durch RES diskutiert. Die Untersuchung der GSH-Gehalte sowie des Redox-Potential nach Behandlung mit sub-toxischen RES-Konzentrationen in Arabidopsis-Keimlingen zeigte jedoch unter den getesteten Bedingungen keine Veränderung. Neben dem Erkennungs- und Signaltransduktionsmechanismus ist auch die biologische Bedeutung von RES für die Vermittlung einer Stresstoleranz noch weitgehend unklar. Durch die Untersuchung der Genexpression in Arabidopsis-Pflanzen nach Verwundung konnte gezeigt werden, dass eine wundinduzierte Akkumulation von SF zur Induktion einiger Gene der Hitzeschockreaktion (HSR) im Wildtyp, jedoch nicht in der myrosinase-defiziten tgg1tgg2-Mutante führte. Auch in der Transkriptomanalyse war nach RES-Gabe ebenfalls eine starke Induktion hitze-responsiver Gene, deren Regulation über den Masterregulator dem Hitzeschock-TF A1 vermittelt wird, zu beobachten. Besonders die Induktion der HSPs, welche als Chaperone fungieren und damit Thiolgruppen von Proteinen vor Modifikation schützen können, haben vermutlich bei chemischer Intoxikation protektive Eigenschaften für die Zellen. Tatsächlich zeigte sich unter den gewählten Bedingungen die hsfa1a,b,d,e-Mutante empfindlicher gegenüber ITCs als der Wildtyp. Die Fähigkeit, eine HSR ausbilden zu können, scheint in Arabidopsis bei chemischer Intoxikation eine bedeutende Rolle zu spielen. Eine Vorbehandlung mit RES wie SF, BITC oder dem HSP90-Inhibitor Radicicol in Arabidopsis-Keimlingen konnte eine Schutzwirkung vor chemischer Intoxikation vermitteln. Dies erfolgte jedoch nicht nach Behandlung mit moderater Hitze (zwei Stunden, 37 °C). Somit scheint die HSR alleine nicht ausreichend für den Aufbau eines effektiven Schutzes vor BITC-Intoxikation zu sein. Als metabolische Antwort von Arabidopsis-Keimlingen auf Intoxikation mit RES konnte eine konzentrationsabhängige Senkung der maximalen Quantenausbeute am Photosystem II (PSII), sowie gleichzeitig eine Akkumulation an TAG-Spezies beobachtet werden. Diese metabolische Reaktion ist in der Literatur bereits als Schutz gegen Hitzestress beschrieben. Die Bedeutung der TAG-Akkumulation nach chemischem ITC-Stress ist noch unklar. N2 - In Brassicaceae, unreactive glucosinolates are hydrolyzed by the enzyme myrosinase during tissue destruction. Reactive substances such as isothiocyanates (ITCs) are formed. Since this reaction takes place very quickly, it is also called mustard oil bomb. In Arabidopsis thaliana, after wounding and pathogen infection, a massive accumulation of the ITC Sulforaphan (SF) occurs, which is a reactive electophilic species (RES). The group of RES also includes some oxylipins with a α,β-unsaturated carbonyl group such as 12-oxo-phytodienoic acid (OPDA) or phytoprotane A1 (PPA1). The ability to covalently modify peptides and proteins is considered essential for the toxic and gene inducing properties of RES. In addition to their reactivity, lipophilia also plays a role in the ability to diffuse across membranes and bind unspecifically to proteins. The transcriptome analyses performed on Arabidopsis-seedlings with sub-toxic concentrations of SF, benzylisothiocyanate (BITC) and oxylipin prostaglandin A1 (PGA1) showed that structurally very different RES induce a common set of 55 genes. Among the induced genes were several heat shock, stress associated and detoxification genes. These observations suggest that activation is via pattern-specific recognition of RES. As a possible mechanism of RES-mediated gene induction, regulation by alteration of the cellular redox potential as result of covalent modification of GSH by RES is discussed. However, the study of GSH levels and redox potential after treatment with sub-toxic RES concentrations in Arabidopsis-seedlings showed no change under the tested conditions. In addition to the recognition and signal transduction mechanism for RES, the biological significance of RES for the mediation of stress tolerance is still largely unclear. By studying the gene expression of Arabidopsis-plants after wounding, it was shown that wound induced accumulation of SF led to the induction of some genes of heat shock response (HSR) in the wild type, but not in the myrosinase-deficient tgg1tgg2-mutant. Also in transcriptome analysis a strong induction of heat-responsive genes could be observed after RES administration, whose regulation is mediated by the master regulator of the heatshock-TF A1 (HSFA1). In particular, the induction of HSPs, which act as chaperones and can thus protect thiol groups of proteins from modification, presumably have protective properties for the cells during chemical intoxication. In fact, under the conditions tested, the hsfa1a,b,d,e-mutants were more sensitive to ITCs than the wild type. The ability to form HSR seems to play an important role in chemical intoxication in Arabidopsis. Pretreatment with RES such as SF, BITC or the HSP90 inhibitor radicicol in Arabidopsis-seedlings could mediate a protective effect against chemical intoxication. However, this was not done after treatment with moderate heat (two hours, 37 °C). Thus, HSR alone does not seem to be sufficient to provide effective protection against BITC intoxication. As a metabolic response of Arabidopsis-seedlings to intoxication with RES, a concentration-dependent reduction of the maximum quantum yield at the photosystem II (PSII), as well as an accumulation of TAG species could be observed. This metabolic reaction is already described in the literature as protection against heat stress. The significance of TAG accumulation after chemical stress in the form of ITC intoxication is still unclear. KW - Ackerschmalwand KW - Glucosinolate KW - Isothiocyanate KW - reaktive elektrophile Spezies KW - Sulforaphan KW - Schmalwand Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-185116 ER - TY - THES A1 - Krause, Diana T1 - Transport der Hauptosmotika an der vakuolären Membran von Schließzellen T1 - Transport of the main osmotic substances on the vacuolar membrane of guard cells N2 - Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden neue Einblicke bezüglich des Transport-prozesses vakuolärer Protonenpumpen, Zuckertransporter und des SV-Kanals von Arabidopsis thaliana gewonnen: 1. Mittels Patch-clamp-Technik wurden ATP- und Pyrophosphat-induzierte Pump-ströme an Mesophyllvakuolen des Wildtyps gemessen. Die durch ATP hervor-gerufenen Pumpströme konnten durch den spezifischen V-ATPase-Inhibitor Concanamycin A vollständig inhibiert werden. Messungen an der V-ATPase-Doppelmutante vha-a2-vha-a3 hingegen zeigten eine kaum vorhandene ATPase-Aktivität auf. Die vakuoläre Pyrophosphatase-Aktivität der vha-a2-vha-a3-Mutante war mit dem WT vergleichbar und konnte die verminderten Pumpströme der V-ATPase nicht kompensieren. Zudem wurde an A. thaliana WT-Pflanzen die Expressionsrate und Pumpstromdichte der V-ATPase von Schließzellen und Mesophyllzellen untersucht. Dabei konnte bei Schließzellen eine höhere Expressionsrate sowie Pumpleistung im Vergleich zu Mesophyllzellen detektiert werden, wodurch an der vakuolären Membran von Schließzellen eine starke protonenmotorische Kraft generiert werden kann. 2. Des Weiteren wurden die Transporteigenschaften des im Tonoplasten lokalisierten Transportproteins AtINT1 an Arabidopsis Mesophyllzellen des Wildtyps näher untersucht. Unter inversen pH-Wert-Bedingungen konnte AtINT1 als Symporter identifiziert werden, welcher myo-Inositol H+-gekoppelt aus der Vakuole in das Cytosol transportiert. 3. Überdies wurde eine elektrophysiologische Charakterisierung des AtSUC4-Transporters durchgeführt. Unter einem physiologischen Protonengradienten konnte bei WT- und Atsuc4.1-Vakuolen ausschließlich ein Saccharose/H+ ge-triebener Antiportmechanismus detektiert werden. Im Gegensatz dazu zeigten 60 % der AtSUC4-ÜE unter inversen pH-Gradienten während Saccharose-Applikation Ströme, die auf einen Saccharose/H+-Symportmechanismus hinweisen. Bei der Atsuc4.1-Verlustmutante hingegen konnten unter gleichen Lösungsbedingungen ausschließlich Ströme detektiert werden, die mit einem Saccharose/H+-gekoppelten Antiportmechanismus in Einklang zu bringen sind. Durch die Erkenntnisse der Arbeitsgruppe unter Norbert Sauer, Universität Erlangen, wird die Vermutung untermauert, dass AtSUC4 Saccharose im Symport mit H+ aus der Vakuole in das Cytosol transportiert und somit eine Rolle bei der Remobilisierung der in der Vakuole gespeicherten Saccharose übernimmt. 4. Darüber hinaus konnten Studien am nichtselektiven spannungsabhängigen „slow-vacuolar-channel“ (SV-Kanal) von Arabidopsis Mesophyllvakuolen durchgeführt werden. Dabei wurde das 14-3-3-Protein GRF6 als regulatorisches Protein identifiziert, welches die SV-Kanalaktivität stark verringert. Die gain-of-function Mutante fou2 mit der Punktmutation D454N im TPC1-Kanalprotein zeigt abweichende Kanaleigenschaften zum WT auf. Das Aktivie-rungspotential des fou2-SV-Kanals liegt bei 30 mV negativeren Membranspan-nungen, was die Offenwahrscheinlichkeit des SV-Kanals unter physiologischen Membranspannungen erhöht. Die fou2-Mutation beeinflusst außerdem die luminale Ca2+-Bindestelle des SV-Kanals, wodurch die Affinität bzgl. luminalem Ca2+ geringer ist und die fou2-SV-Kanalaktivität bei hohen luminalen Ca2+-Konzentrationen bestehen bleibt. Die absolute Offenwahrscheinlichkeit des WT-SV-Kanals nimmt mit Ansäuern des vakuolären Lumens im Gegensatz zum fou2-SV-Kanal stark ab, die Einzelkanalleitfähigkeit des WT- als auch des fou2-SV-Kanals dagegen zu. Anhand der durchgeführten Messungen konnte eine regulatorische, vakuolär gelegene Ca2+-Bindestelle des TPC1-kodierten Kanals lokalisiert und charakterisiert werden, welche sich vermutlich nahe am Spannungssensor befindet und unter physiologischen Membranspannungen einen einwärtsgerichteten Kationenstrom ermöglicht. 5. Ferner wurden SV-Kanäle von Schließzellen untersucht und deren spezifische Eigenschaften mit Mesophyll-SV-Kanälen verglichen. In Schließzellen liegt neben einer erhöhten Transkriptmenge des single-copy Gens TPC1 eine höhere Stromdichte des SV-Kanals vor. Unter einwärtsgerichtetem K+-Gradienten liegt das Aktivierungspotential von Schließzell-SV-Kanäle um 30 mV negativer als bei Mesophyllvakuolen, was unter physiologischen Membranspannungen zu einem ausgeprägtem K+-Einstrom führt. Darüber hinaus zeigte der Schließzell-SV-Kanal eine höhere Permeabilität von Na+- gegenüber K+-Ionen (1,3:1) auf. Während Schließzell- und Mesophyll-SV-Kanäle eine vergleichbare luminale Ca2+-Sensitivität aufweisen, zeigen Schließzell-SV-Kanäle eine höhere cytosoli-sche Ca2+- und vakuoläre pH-Sensitivität auf. Sequenzanalysen der TPC1-cDNA zeigten, dass die Zelltypspezifischen Unterschiede des SV-Kanals nicht durch posttranskriptionale Modifikation hervorgerufen werden. N2 - As an output of this dissertation, the following new insights into vacuolar transport pro-cesses of proton pumps, sugar transporters and slow vacuolar channels (SV-channels) via the patch clamp technique were gained: 1. The vacuolar V-ATPase of A. thaliana mesophyll cells of the WT as well as of the double mutant vha-a2-vha-a3 were analyzed. The specific V-ATPase-inhibitor concanamycin A inhibits the WT V-ATPase activity completely. In vha-a2-vha-a3 mutant the V-ATPase activity was completely absent and shows no ATP induced H+ currents. However, the vacuolar vha-a2-vha-a3 pyrophosphatase current density was indistinguishable from the WT and could not compensate the missing V-ATPase pump currents. Additionally, the V-ATPase expression rate and H+ currents of A. thaliana guard cells and mesophyll cells were examined. In guard cells the expression rate as well as the pump currents were higher compared to mesophyll cells which resulted in a stronger proton motive force. 2. Furthermore, the transport mechanism of the vacuolar membrane protein AtINT1 was studied on Arabidopsis WT mesophyll cells. At high vacuolar and low cytoplasmic pH values AtINT1 could be identified as an H+/inositol symporter. These data was confirmed by further measurements of the mutant lines Atint1.1 and Atint1.2. After application of myo-inositol the currents were completely absent in Atint1.1 and strongly reduced in the Atint1.2 mutant. 3. Besides transport characteristics of the tonoplast localized AtSUC4 protein was analyzed. After application of cytosolic sucrose, WT as well as Atsuc4.1 vacuoles showed an H+/sucrose driven Antiport mechanism in presence of physiological H+-gradient. However, in the presence of an inverse pH gradient, 60 % of the AtSUC4-overexpressing mutant showed sucrose induced currents indicating an H+/sucrose Symport mechanism of the AtSUC4 transport protein. Corresponding currents could not be detected in AtSUC4 less vacuoles (Atsuc4.1). In the inverse system sucrose induced currents of the Atsuc4.1 mutant were in accordance with an H+/sucrose coupled antiport mechanism. These patch clamp measurements confirm the findings of the working group of Norbert Sauer, University of Erlangen. AtSUC4 acts as a symporter by transporting sucrose coupled with H+ out of the vacuole into the cytosol and therefore plays a role in the remobilization of stored vacuolar sucrose. 4. Additionally the non-selective voltage dependent slow vacuolar channel (SV channel) of Arabidopsis mesophyll vacuoles was electrophysiologically characterized. Thereby the 14-3-3 protein GRF6 could be identified as a regulatory protein of the SV channel, which down-regulates the SV channel activity. The gain-of-function mutant fou2 containing the point mutation D454N on the vacuolar lumen side of the SV channel protein, shows different channel proper-ties compared to WT. The fou2 channel activation was shifted to 30 mV more negative membrane potentials which resulted in higher open probability than WT SV channels. The fou2 mutation also affected the luminal Ca2+ binding site of the SV channel and lowered the affinity to vacuolar Ca2+. fou2 channel activity remained high even at inhibitory vacuolar Ca2+ concentrations. The WT SV channel open probability decreased strongly with luminal acidification in contrast to fou2. However, the single channel conductance of WT and fou2 SV channels increased. The regulatory vacuolar Ca2+ binding site of the TPC1 channel seems to be located nearby the voltage sensor and enables a pronounced fou2 inward current under physiological membrane voltages. 5. The A. thaliana guard cell SV channel features were compared with mesophyll cells. In guard cells the transcript number of the single copy gene TPC1 was elevated which resulted in a higher SV current density than in mesophyll cells. When the K+ gradient was directed out of the vacuolar lumen the guard cell SV channel activated at about 30 mV less negative voltages compared to mesophyll cells and mediated distinct inward currents. The guard cell SV channel showed permeability for Na+ over K+ (1,3:1). SV channels from guard cells and mesophyll cells exhibited comparable luminal Ca2+ sensitivities. However, the guard cell SV channel is more sensitive to cytosolic Ca2+ and vacuolar pH. Sequence analyses of the TPC1 cDNA showed that the varying features of the guard cell and mesophyll cell SV channels are not related to posttranscriptional modifications. KW - Ackerschmalwand KW - Schließzelle KW - Vakuole KW - Saccharose KW - Inosite KW - Spannungskontrollierter Ionenkanal KW - Protonenpumpe KW - AtTPC1 KW - AtSUC4 KW - Protonenpumpe KW - Vakuole KW - Schließzelle KW - AtTPC1 KW - AtSUC4 KW - proton pump KW - vacuole KW - guard cell Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-75043 ER - TY - THES A1 - Rienmüller, Florian Christian T1 - Untersuchung der oxidativen und pH-abhängigen Regulation der vakuolären Protonen-ATPase und calciumabhängigen vakuolären Membranleitfähigkeiten von Arabidopsis thaliana T1 - Investigation of the oxidative and pH dependent regulation of vacuolar proton-ATPase and calcium dependent vacuolar membrane conductance of Arabidopsis thaliana N2 - Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten neue Erkenntnisse zur oxidativen, pH- und ATP-abhängigen Regulation der V-ATPase-Funktion in Mesophyllvakuolen von A. thaliana erarbeitet werden. Dazu wurden Patch-Clamp-Experimente an der vakuolären Protonen-ATPase durchgeführt, die eine elektrophysiologische Untersuchung der Protonentransporteigenschaften und deren Regulation ermöglichten. Zusätzlich gestattete die Anwendung von intrazellulären Mikroelektroden zusammen mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren an intakten Wurzelrhizodermiszellen von A. thaliana Keimlingen die in vivo Untersuchung von vakuolären Membranleitfähigkeiten und deren Regulation durch cytosolisches Calcium. Durch die Patch-Clamp-Technik konnte die Spannungsabhängigkeit der V-ATPase bei verschiedenen luminalen pH-Werten erfasst werden. Mit Hilfe thermodynamischer Berechnungen konnte daraus eine Abnahme der Protonentransportrate pro hydrolysiertem ATP-Molekül bei gleichzeitigem Anstieg der vakuolären Protonenkonzentration berechnet werden. Durch die Kombination verschiedener pH-Werte in Cytosol bzw. Vakuole und zusätzlich ansteigenden ATP-Konzentrationen konnten tiefere Einblicke in die pH-abhängige Regulation der V-ATPase-Aktivität erlangt werden. Es konnte aufgezeigt werden, dass eine Abweichung des vakuolären pH-Wertes wesentlich stärker auf die ATP-Bindungsaffinität und Transportkapazität des Enzyms wirkt, als Änderungen der Protonenkonzentration auf cytosolischer Seite. Daraus konnte abgeleitet werden, dass cytosolische bzw. luminale pH-Änderungen auf das gesamte Membran-durchquerende Enzym wirken und jeweils auf die andere Membranseite der V-ATPase weitergegeben werden. Zusätzlich wurden die in dieser Arbeit erhobenen Daten zur V-ATPase im Rahmen einer Zusammenarbeit von Prof. Dr. Ingo Dreyer (Universidad Politecnica, Madrid, Spanien) für die Erstellung eines mathematischen Modells genutzt. Es untermauert einen Rückkopplungsmechanismus der Protonenkonzentration auf die maximale Protonentransportrate (vmax) und die ATP-Affinität (Km) und schlägt eine pH-abhängige Dissoziation der Protonen von der V-ATPase, auch unter ungünstigen intrazellulären Bedingungen, vor. Die Ausweitung der Regulationsstudien unter Einbeziehung verschiedener Mutanten konnte in Zusammenarbeit mit Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel und Mitarbeitern (Universität Bielefeld, Deutschland) eine oxidative Inhibierung der V-ATPase-Aktivität durch den Wegfall von Disulfidbrücken innerhalb des Pumpproteins erfassen und mögliche Auswirkungen von Disulfidbindungen auf die Protonenkopplungsrate aufzeigen. Mit Hilfe von intrazellulären Mikroelektroden konnte im zweiten Teil der vorliegenden Arbeit der Nachweis erbracht werden, dass vakuoläre Leitfähigkeiten von Atrichoblasten in A. thaliana durch Stressfaktoren – verursacht durch den Einstich von intrazellulären Mikroelektroden – deutliche Veränderungen zeigen. Durch die Kombination der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme mit einem Fluoreszenz-Bildgebungsverfahren konnte eine Methode zur simultanen Aufzeichnung von Calciumänderungen und elektrischen Membranleitfähigkeiten an Trichoblastenvakuolen entwickelt werden. Dadurch konnte in weiterführenden Untersuchungen in vivo nachgewiesen werden, dass ein transienter Anstieg der cytosolischen Calciumkonzentration zu einer reversiblen Zunahme der Ströme von vakuolären Membranleitfähigkeiten führt, deren unbekannter Ursprung allerdings bereits bekannten Transportproteinen noch zugeordnet werden muss. N2 - This dissertation provides new insights into the oxidative, pH- and ATP-dependent regulation of the V-ATPase function in A. thaliana. For this purpose the proton transport and its regulation was examined electrophysiologically by patch-clamp experiments on mesophyll cells. Additionally intracellular microelectrodes combined with the application of fluorescence imaging on intact root epidermal cells of A. thaliana seedlings allowed investigation of vacuolar membrane conductance and their regulation via cytosolic calcium in vivo. The voltage dependency of the V-ATPase was recorded at various luminal pH values by the patch-clamp technique. Furthermore thermodynamic calculations showed a decrease of the proton transport rate per hydrolyzed ATP molecule due to an increase of the vacuolar proton concentration. Different cytosolic and vacuolar pH-values combined with increasing ATP-concentrations also provided deeper insights into the principles of the pH dependent regulation of the V-ATPase activity. Changes in the cytosolic and luminal pH values on either side of the membrane were found to affect the entire function of the enzyme and thus seem to be transferred to the other side within the V-ATPase. Additionally the data of this dissertation was used by Prof. Dr. Ingo Dreyer (University Politecnica, Madrid, Spain) in the context of cooperation to create a mathematic model. It confirms a feedback system of the proton concentration on the maximum proton transport rate (vmax) and the ATP binding affinity (Km). This model proposes a pH-dependent dissociation of the protons from the V-ATPase also under unfavorable intracellular conditions. Further examinations of the V-ATPase regulation with different mutants in collaboration with Jun. Prof. Dr. Thorsten Seidel and co-workers (University of Bielefeld, Germany) revealed oxidative inhibition of V-ATPase activity due to the removal of disulfide-bond formation within the pump protein. Additionally a possible effect of disulfide-bridge formation on proton coupling rate was shown. The intracellular microelectrode measurements on intact root cells in the second part demonstrate that changes in the vacuolar membrane conductance of A. thaliana atrichoblasts are related to stress factors caused by the impalement of the electrodes. Further studies by a new method combining the application of fluorescence imaging with the two-electrode voltage-clamp allowed recording of calcium changes and electric membrane conductance within trichoblasts simultaneously. As a result it could be shown that a transient rise of cytosolic calcium is linked to increasing currents of vacuolar membrane conductances in vivo. The unknown origin of these conductances however has to be dedicated to known transport proteins. KW - Ackerschmalwand KW - oxidative and pH dependent regulation KW - Biomembran KW - V-ATPasen KW - Leitfähigkeit KW - vacuolar proton-ATPase KW - calcium dependent membrane conductance KW - oxidative and pH dependent regulation KW - oxidative und pH-abhängige Regulation KW - calciumabhängige Membranleitfähigkeiten KW - Arabidopsis thaliana Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104891 ER - TY - THES A1 - Grun, Christoph T1 - Untersuchung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine in Arabidopsis thaliana in der kompatiblen und der inkompatiblen Interaktion mit Pseudomonas syringae T1 - Encymatically and not encymatically formed oxylipins in Arabidopsis thaliana in compatible und not compatible interaction with Pseudomonas syringae N2 - 1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. Für die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu können. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der nicht-enzymatisch entstandenen Oxylipine, 9- und 13-OH-FS, sowohl als enzymatisch als auch nicht-enzymatisch entstandene Oxylipine, sowie JA und deren Vorstufe OPDA als enzymatisch gebildete Phytohormone untersucht. Es wurden monophasische Konzentrationsanstiege, bei allen untersuchten Substanzen, in der kompatiblen Interaktion ermittelt, wohingegen die Konzentrationsanstiege in der inkompatiblen Interaktion biphasisch waren. In beiden Interaktionen wurden nach 48 bis 60 h Konzentrationsmaxima der freien sowie der veresterten OH-FS und PPF1 nachgewiesen, ein früher Konzentrationsanstieg nach 5 bis 10 h konnte ausschließlich in der inkompatiblen Interaktion ermittelt werden. Die gleichzeitige Akkumulation von 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS und PPF1 deutet auf eine parallel ablaufende Oxylipin-Synthese durch enzymatische, Photo-oxidative und über freie Radikale vermittelte Prozesse hin. Die Akkumulation veresterter OH-FS und PPF1 erfolgte in beiden Interaktionen 5 bis 12 h früher als die Konzentrationsanstiege der freien OH-FS und PPF1. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass nicht-enzymatische Oxylipine in Membranen gebildet werden können und anschließend vermutlich durch eine Lipase frei gesetzt werden. In der inkompatiblen Interaktion konnte ein erstes frühes Konzentrationsmaximum von JA und OPDA nach 5 h beobachtet werden, während späte Maxima in beiden Interaktionen nach 24 bis 36 h erfolgten. Somit akkumulierten die OH-FS und PPF1 in der inkompatiblen Interaktion zeitgleich mit den Jasmonaten nach 5 h. 3. Bei einer Kälteexposition von A. thaliana bei 4°C über 2 h wurde jeweils ein 3,3-facher Konzentrationsanstieg der freien und der veresterten enzymatisch gebildeten 13-OH-FS nachgewiesen. Darüberhinaus wurde ein 4,6-facher Anstieg der enzymatisch entstandenen 9-OH-FS ermittelt. Die nicht-enzymatisch gebildeten 12- und 16-OH-FS zeigten dagegen keine signifikanten Konzentrationsanstiege über die basalen Konzentrationen hinaus. Die angewendeten Stressbedingungen bewirken demnach ausschließlich eine enzymatische Bildung von OH-FS in A. thaliana. 4. Zur Untersuchung der OH-FS-Synthese in der inkompatiblen Interaktion in Abhängigkeit von der bei der Pflanzenanzucht eingesetzten Lichtstärke wurden A. thaliana bei Licht und in Dunkelheit mit Pst avrRPM1 infiziert. Nach 10 h wurde eine 1,1- bis 3,7-fach stärkere Bildung der freien sowie eine 2,0- bis 3,4-fach stärkere Akkumulation der veresterten 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS bei den Pflanzen ermittelt, die bei Licht angezogen wurden. Die Lichtintensität, der Pflanzen während der Infektion mit Pst ausgesetzt sind, hat demnach große Bedeutung für die Entstehung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter OH-FS. Ein 4,9-facher Anstieg veresterter 15-OH-FS, ein Marker für eine photooxidative OH-FS-Entstehung, auch bei Dunkelheit widersprach der Hypothese, dass 15-OH-FS ohne Lichteinwirkung nicht gebildet werden können und deutet auf eine bisher unbekannte Licht-unabhängige Entstehung von 1O2 bzw. von 15-OH-FS hin. 5. Die Bestimmung von OH-FS in Blättern und Wurzeln von unbehandelten A. thaliana-Pflanzen ergab eine 13- bis 31-fach höhere Konzentration veresterter 9-, 10-, 12-, 13- und 16-OH-FS in den Blättern. Darüberhinaus wurde eine 111-fach höhere Konzentration von veresterten 15-OH-FS in Blättern im Vergleich zu Wurzeln nachgewiesen. 15-OH-FS wurden als selektiver Marker für eine Photo-oxidative OH-FS-Bildung durch 1O2 verwendet. Mit 0,57 µg/g TG kommt 15-OH-FS allerdings auch im Wurzelgewebe vor, was einen Hinweis darauf darstellt, dass neben einem Licht-abhängigen Hauptweg auch ein Licht-unabhängiger Entstehungsmechanismus von 15-OH-FS bzw. 1O2 existiert. Alternativ wäre es denkbar, dass ein Transport von 15-OH-FS von den Blättern in die Wurzeln stattfindet. 6. Eine Untersuchung der Gehalte an OH-FS und PPF1 in NahG-, lsd1-, atrbohD- und atrbohF-Mutanten ergab 48 h nach Infiltration von Pst avrRPM1 keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den Pflanzen des jeweiligen Wildtyps Col-0 und WS. Unter den gewählten Versuchsbedingungen bewirken die genetischen Defekte der untersuchten Mutanten keine veränderte Akkumulation enzymatisch sowie nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine. N2 - 1. To obtain reference-substances for the identification of OH-FA in plant material by GC-MS, OH-FA were made in vitro. 9- and 13-hydroxy-octadecadienoic acids were formed from linoleic acid, 9- and 13-hydroxy-octadecatrienoic acids from -linolenic acid by LOX-catalized reaction. 2. In order to compare the concentrations of oxylipins in A. thaliana during compatible and incompatible interaction, a virulent Pst-strain DC3000 and an avirulent strain avrRPM1 were utilized. The concentrations of oxylipins and salicylic acid were investigated within 60 h after inoculation. F1-phytoprostanes, 12- and 16-OH-FA were used as markers for non-enzymatically formed oxylipins. Concentrations of 9- and 13-OH-FA, either enzymatically or non-enzymatically formed, were measured as well as phytohormones, jasmonic acid and its precursor 12-oxo-phytodienoic acid. Within the compatible interaction an increase of the amount of all measured compounds was observed. In contrast, during incompatible interaction the increases of all measured substances was seperated into two phases. In both interactions, free and esterified OH-FA- and PPF1-concentrations exhibited maxima after 48 to 60 h, an early increase after 5 to 10 h was exclusively found in the incompatible interaction. The concurrent accumulation of 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FA und PPF1 indicates that enzymatically, Photo-oxidative, and free-radical catalyzed synthesis of oxylipins takes place simultaneously. In both interactions the accumulation of esterified OH-FA and PPF1 occurred 5 - 12 h earlier than the increase of the concentrations of free OH-FA and PPF1. These results confirm the hypothesis that oxylipins are formed non-enzymatically from lipids inside cell membranes and are subsequently released by lipases. An early increase of JA- and OPDA-concentrations after 5 h was found in the incompatible interaction, while late maxima occurred in both interactions after 24 to 36 h. Therefore, OH-FA- and PPF1-accumulation took place at the same time as the increase of jasmonates after 5 h. 3. When A. thaliana plants were chilled for 2 h at 4°C an 3,3-fold incrceased formation of both, the enzymatically formed free and esterified 13-OH-FA was detected. The amount of enzymatically formed free 9-OH-FA increased 4,6-fold. In contrast, the amount of non-enzymatically formed 12- and 16-OH-FA did not increase significantly indicating that the applied mild stress conditions triggered exclusively enzymatical OH-FA-formation. 4. In order to get information about OH-FA-formation with regard to light intensity A. thaliana was infected by Pst avrRPM1 and cultivated either in the dark or in the light. When plants were cultivated in the light after 10 h an 1,1- to 3,7- fold increased formation of free and an 2,0- to 3,4-fold increased accumulation of esterified 9-, 10-, 12-, 13-, 15- und 16-OH-FA could be detected. Therefore, the light intensity during an infection with Pst avrRPM1 is an important factor for the formation of enzymatically as well as non-enzymatically formed OH-FA in planta. The 4,9-fold increase of esterified 15-OH-FA (a marker for photooxidative formation of OH-FA) in the dark contradicted the hypothesis that its formation is impossible without the impact of light. In contrast the accumulation of 15-OH-FA in the dark points to a light-independent 1O2- and subsequent 15-OH-FA-formation by a so far unknown mechanism. 5. Determination of the concentrations of OH-FA in leaves and roots of untreated plants of A. thaliana showed 13- to 31-fold higher amounts of esterified 9-,10-, 12-, 13 und 16-OH-FA in the leaves. Moreover, the amounts of esterified 15-OH-FA exceeded in leaves by the factor 111 in comparison to roots. 15-OH-FA was used as a selective marker for Photo-oxidative formation of OH-FA by 1O2. Though, 15-OH-FA occurred to an amount of 0,57 µg/g (dry weight) in roots as well. This indicates that, apart from an primarily used light depending mechanism, a second path for the formation of 15-OH-FA respectively 1O2 exists which does not depend on light strength. An alternative explanation could be the transport of 15-OH-FA from leaves to roots. 6. Compared to the wildtype plants no significant differences in the increase of OH-FA and PPF1 could be detected in NahG-, lsd1-, atrbohD and atrbohF-mutants 48 h after infiltration of Pst avrRPM1. Under the utilized conditions the genetic defects of the analyzed mutants did not cause a modified accumulation of both, enzymatically and not enzymatically formed oxylipins. KW - Lipid-Peroxide KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Oxylipine KW - Arabidopsis KW - thaliana KW - Pseudomonas KW - syringae KW - Oxylipines KW - Arabidopsis KW - thaliana KW - Pseudomonas KW - syringae Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20804 ER - TY - THES A1 - Steinmeyer, Ralf T1 - Untersuchungen und Simulationen zur Koordination der Ionenflüsse bei der Schließzellbewegung in Vicia faba und Arabidopsis thaliana T1 - Studies and Simulations about the Coordination of Ion Fluxes during the Guard Cell Movement in Vicia faba and Arabidopsis thaliana N2 - Trotz der bereits lange gut bekannten Funktion der Stomata und der einzelnen, an der Funktion beteiligten Transportproteine, fehlen Funktionsmodelle, die diese schließzellspezifsch in einen Zusammenhang bringen und ihre Koordination untersuchen. Ergebnisse - Der einwärts gleichrichtende Kaliumkanal aus Arabidopsis thaliana, KAT1 ist sowohl molekularbiologisch, als auch elektrophysiologisch gut charakterisiert. Ein „ausschalten“ dieses Kanals sollte die Stomaöffnung deutlich verlangsamen oder vermindern. Es wurde aber unter verschiedenen Bedingungen, weder mit Licht als Öffungsreiz, noch mit Fusicoccin, kein Unterschied zwischen Wildtyp und KAT1::En-1 Mutante gefunden. - Einige Publikationen schlagen Zucker, vornehmlich Glukose als osmotisch aktive Substanz zur Stomaöffnung vor, da im Tagesgang bei längerer Stomaöffnung auch die Zuckerkonzentration zunimmt. Die Zuckeraufnahme wurde mit einem fluoreszierenden Glukose-Derivat gemessen und als lichtabhängig gefunden. Weiterhin wurde die Aufnahme besonders durch CCCP gehemmt, was auf eine Abhängigkeit von einem Protonengradienten hindeutet. - Die Aufnahme von Glukose wurde weiterhin mit einer Knockout-Mutante des AtSTP1 Protonen/Zucker-Kotransporters getestet. Die deutliche Verminderung des Anteils der fluoreszierenden Zellen gegenüber dem Wildtyp unter den gleichen Bedingungen zeigt eine Beteiligung dieses Kotransporters an der Glukose-Aufnahme. - Schließzellen in der intakten Pflanze wurden auf den Verlauf ihres Membranpotentials in CO2-freier Luft bei Licht/Dunkel Wechseln untersucht. Ein großer Teil dieser Zellen zeigte eine wiederholbare Hyperpolarisation im Licht und Depolarisation im Dunklen. Als Auslöser dieser Änderung in der Membranspannung wurde hauptsächlich die (In-)Aktivierung eines instantanen positiven Stromes in der Größÿe von etwa 35 pA festgestellt, vermutlich die H+-ATPase. - Die Abhängigkeiten des Anionenkanals, der einwärts und auswärts gleichrichtenden Kaliumkanäle und der Protonenpumpe von internen und externen Ionenkonzentrationen, dem pH-Wert und der Membranspannung wurden in einer biophysikalischen Simulation vereint. Zusammen mit den jeweiligen Leitfähigkeiten und Literaturdaten der Konzentrationsverläufe ergibt sich ein realistisches Modell der Flüsse zur Stomabewegung. - Aus dem Modell ergeben sich zwei wesentliche Voraussagen für das Zusammenwirken der Transportproteine: 1. Bei der Stomaöffnung muss die H+-ATPase zur Beendigung der Öffnung wieder deaktiviert werden, anderenfalls steigt die interne Kaliumkonzentration und das Membranpotential fällt auf Werte, die in Messungen nie gefunden wurden. Eine Desensitisierung der H+-ATPase wurde zwar nach Blaulicht-Pulsen bereits gemessen, jedoch nicht bei andauernder Beleuchtung. 2. Der bisher in Schließzellen noch nicht elektrophysiologisch nachgewiesene Protonen/Chlorid Kotransporter zum Import von Chlorid muss nicht nur während der Stomaöffnung aktiv sein, sondern erhält auch eine Rolle beim Stomaschluss. Da die cytosolische Chloridkonzentration deutlich unter der von Kalium liegt, würde die für den Efflux der beiden Ionen nötige Depolarisation bereits enden, wenn die Chloridkonzentration deutlich sinkt, also bevor auch die Konzentration von Kalium soweit abgenommen hätte, dass die Spaltöffnung geschlossen wäre. - Zur Messung interner Ionenkonzentrationen in intakten Schlieÿzellen wurden verschiedene Methoden der Beladung mit fluoreszierenden Indikatorfarbsto#en getestet. Die Beladung durch niedrigen pH, niedrige Temperatur oder der Farbstoffe als Acetoxymethyl-Ester kann bei Schließzellen von Vicia faba als nicht praktikabel angesehen werden. Lediglich eine Detergenz unterstützte Farbstoffbeladung wurde in der Literatur gefunden. - Zur parallelen Anwendung elektrophysiologischer Messungen und fluoreszenzbasierter Bestimmung von Ionenkonzentrationen wurde eine Technik der Druckinjektion über einen Kanal einer Doppel-Elektrode getestet. Diese Methode erlaubt die Farbstoffinjektion, allerdings hat sich die Spannungs-Klemm-Technik mit der für einen einzelnen Kanal einer Einstichelektrode notwendigen gepulsten Technik als nicht praktikabel erwiesen, da die Membranspannung vermutlich aufgrund nicht kompensierbarer Kapazitäten nicht die vorgegebenen Werte erreichte. N2 - While the function of stomata as well as of the different proteins involved in ion fluxes across the plasma membrane are well understood, a guard cell specific model for the concerted function and coordination is still missing. Results - KAT1, the inward rectifying potassium channel from Arabidopsis thaliana is well characterized in terms of structure and electrophysiological function. A knock-out mutant of this channel should be restrained in stomatal opening. Nevertheless under different conditions, with light or fusicoccin as opening stimulus, no difference could be found between wild type and KAT1::En-1 mutant plants. - Glucose is found to accumulate in guard cells during the day when stomata are opened and it is thus suggested to contribute to the osmotical pressure for opening. The uptake of a fluorescent glucose derivative was found to be light dependent and impaired by addition of CCCP which eliminates the proton gradient across the plasma membrane. - A knock-out mutant of the proton/sugar cotransporter protein AtSTP1 showed a significant reduction of cells showing 2-NBDG fluorescence as compared to the wild type. This shows a prominent contribution of this transporter to the uptake of glucose. - Changes of the free running membrane potential upon light/dark transitions were measured in guard cells of intact Vicia faba plants. A majority of these cells showed repeatable hyperpolarizations in light and depolarizations in darkness. These changes in potential were mainly driven by the (in-)activation of an instantaneous positive current of about 35 mA, most probably the H+-ATPase. - In a biophysical simulation, the dependence of anion channel, inward as well as outward rectifying potassium channels and proton pump on cytosolic and apoplastic ion concentrations, pH and membrane potential were included to build a model of ion fluxes for stomatal movements. Also included were literature values for channel conductance and the kinetics of concentrations during stomatal movements. - From this model, two main predictions were made for the cooperation of transport proteins in stomatal movements: 1. At the end of the opening phase of stomata, the H+-ATPase must be deactivated, since otherwise the cytosolic potassium concentration would rise and the membrane potential would decrease both to values that were never reproduced in measurements. A desensitization of the H+-ATPase was already found after pulses of blue light, but never upon permanent white light. 2. The proton/chloride cotransporter not only needs to be active during stomal opening for chloride uptake, but also during closure. Since in guard cells of open stomata, the concentration of potassium is higher than that of chloride, a 1:1 efflux of both ions would soon end the depolarization needed for further potassium efflux. To overcome this, a chloride cycle is suggested, where the cotransporter is active and keeps the net efflux of chloride small. - Different loading techniques were tested for fluorescent calcium indicator dyes. Incubation at low pH, for the free acid form as well as low temperature for the acetoxymethyl-ester forms of the dyes were shown to be impossible in Vicia faba guard cells. During the work on this thesis, one example for a detergent-aided loading of free acid dyes was published. - For parallel recording of electrophyiological parameters and cytosolic ion concentrations, an injection technique was tested that operates by regulated air pressure on one barrel of a double-barreled pipette. The other barrel was used for measurements of the membrane potential. Experiments with a discontinuous voltage clamp amplifier failed, since the target voltage was not reached probably due to non-compensable, variable pipette capacities. KW - Ackerbohne KW - Schließzelle KW - Ionenkanal KW - Ackerschmalwand KW - Schließzelle KW - Ionenkanal KW - Apoplast KW - Membranpotential KW - guard cell KW - ion channel KW - apoplast KW - membrane potential Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17098 ER - TY - THES A1 - Blachutzik, Jörg O. T1 - Visualisierung von Plasmamembran-Domänen in Arabidopsis thaliana T1 - Visualization of plasma membrane domains in Arabidopsis thaliana N2 - Unter Verwendung fluoreszenzmarkierter Remorine der taxonomischen Gruppe 1b wurden Nanodomänen in Arabidopsis Plasmamembranen (PM) unter Verwendung hoch auflösender Laser Scanning-Systeme sichtbar gemacht. In diesen kompartimentierten Membranbereichen lagerten sich Sterol-abhängige Remorine aus verschiedenen Pflanzen-familien zusammen und zeigten dort Kolokalisation. Dies wurde statistisch belegt durch hohe Pearson und Spearman Korrelationskoeffizienten. Remorine konnten schließlich als pflanzliche Markerproteine für kompartimentierte Membranbereiche etabliert werden. Die Nanodomänen zeigten zu keinem Zeitpunkt laterale Bewegungen in der PM und scheinen sowohl von zytoskelettären Strukturen als auch von Komponenten der Zellwand stabilisiert zu werden. Möglicherweise spielen transmembrane Tetraspanine sowie GPI-verankerte SKU5-Proteine eine Rolle bei der stabilen Verankerung. Für zwei native Arabidopsis Remorine wurden posttranslationale Modifikationsstellen aufgedeckt, die der Anheftung dieser hydrophilen Proteine an die PM dienen. Weiterhin scheinen gleichartige Remorine miteinander zu interagieren. Beispielsweise waren im Zytosol lokalisierte Remorin-Mutanten bei einer gleichzeitigen Expression der entsprechenden Vollängenproteine erneut an der PM zu finden. Für die Remorine wurde postuliert, dass sie mit anderen Proteinen interagieren und dabei makromolekulare Strukturen ausbilden. Den Remorinen könnte daher eine Aufgabe bei der molekularen Organisation pflanzlicher Membrandomänen zukommen, indem sie ein filamentartiges Netzwerk innerhalb distinkter Domänen ausbilden, das möglicherweise zur Stabilität und Aufrechterhaltung dieser spezialisierten Bereiche beiträgt. Unter Einbeziehung der STED-Mikroskopie wurde eine empirische Größenverteilung von 97±4nm Durchmesser für PM-ständige Domänen in Arabidopsis ermittelt. Hinsichtlich der physiologischen Relevanz konnte gezeigt werden, dass die Domänen eine Rolle bei der ABA-vermittelten, kalziumabhängigen Regulation des Anionenkanals SLAH3 einnehmen. SLAH3 wird durch kalziumabhängige Kinasen aus der CDPK-Familie aktiviert, im Speziellen durch CPK21 und CPK23. Beide Kinasen werden durch die ABA-sensitiven Phosphatasen ABI1 und ABI2 reguliert. Die spezifisch stattfindenden Interaktionen zwischen SLAH3 und CPK21, sowie zwischen CPK21 und ABI1 waren auf Nanodomänen beschränkt und wurden durch die Methodik der bimolekularen Fluoreszenzkomplementation erstmals in planta nachgewiesen, mit Remorinen der taxonomischen Gruppe 1b als etablierte Markerproteine für Membrandomänen. N2 - In this work, membrane nanodomains have been visualized in planta via confocal microscopy of group 1b Remorin proteins fused to fluorescent proteins. Within these nanodomains, sterol-dependent Remorins originating from different plant species accumulated as shown by multiple color colocalization microscopy, and through which it was statistically verified by high Spearman and Pearson correlation coefficients. Thus, group 1b Remorins were established here as reliable marker proteins for plasma membrane (PM) nanodomains in plants. Since individual domains did not exhibit any kind of lateral movement within the plane of the membrane, a stabilization of them from cytoskeletal components as well as from components of the cell wall was presumed. Other proteins such as trans-membrane Tetraspanins and GPI-anchored proteins like SKU5 were ruled out as possible candidates being involved in the maintenance of domains´ lateral stability. For two Remorins originating from Arabidopsis thaliana, sites of posttranslational lipid modifications, which allow the proteins to anchor to the plasma membrane, were revealed. In experiments using truncated Remorins with these modification sites deleted, the mutant Remorins appeared to be no longer located at the PM but rather within the cytosol. Truncated Remorins re-appeared at the PM as soon as the full length Remorin proteins were co-expressed. In close proximity to the sites of lipid modifications a highly conserved C-terminal region, whose likely role is to facilitate homo-Remorin protein interactions, was uncovered. Therefore Remorins could possibly be involved in the molecular organization of a filamentous protein structure that could help mediate the stability and maintenance of individual domains. As well, the sizes of individual nanodomains were empirically measured in Arabidopsis thaliana mesophyll cells with STED microscopy, which allowed for optical measurements of domains with 60nm resolution, and were narrowly distributed in a histogram of domain diameters with an average diameter of 97 ± 4nm. One possible physiological role of PM-based nanodomains was demonstrated to be the ABA-mediated, calcium-dependent regulation of the SLAH3 anion channel. At the inception of the regulation, SLAH3 becomes activated upon phosphorylation by calcium-dependent protein kinases of the CDPK-family, CPK21 and CPK23. Both CPK´s in turn are regulated by the ABA-dependent phosphatases ABI1 and ABI2. As visualized by fluorescence colocalization microscopy for the first time, the interactions between SLAH3 and CPK21, as well as interactions between CPK21 and ABI1 were restricted to PM compartments. As well, these protein interactions were corroborated by also imaging them in planta using the bimolecular fluorescence complementation technique - involving group 1b Remorins as the established marker proteins for PM nanodomains. KW - Plasmamembran KW - Fluoreszmikroskopie KW - Ackerschmalwand KW - plasma membrane KW - fluorescence microscopy KW - Remorin KW - protoplasts KW - Protoplasten Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71925 ER - TY - THES A1 - Raacke, Ines Christine T1 - Wirkmechanismen von Hefe-Elicitoren sowie die Rolle von Jasmonaten in Pflanze-Pathogen-Interaktionen T1 - Mechanisms of defense activation by yeast elicitors and function of jasmonates in plant-pathologen-interactions N2 - Die Anwendung von Hefe (Saccharomyces cerevisiae) als Elicitor wurde bisher in Zellkulturen, ebenso in Sojabohne und Gerste beschrieben. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Elicitorwirkung von Hefe auf A. thaliana untersucht. Das Sprühen mit autoklavierter Bäckerhefe führte zu einem Anstieg des Phytoalexins Camalexin mit einem Maximum (54 nmol/g FG) am 5. Tag nach der Behandlung mit dem Elicitor. Bei nachfolgenden Infektionen am 5. Tag nach Hefebehandlung mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 wurde eine Schutzwirkung detektiert, die beim Wildtyp Col-0 zu einer 3 bis 4fachen Verringerung des Bakterienwachstums im Vergleich zur Wasserbehandlung führte. Die Schutzwirkung setzte mit dem 5. Tag nach Hefebehandlung ein und hielt bis einschließlich dem 11. Tag an. Ein Schutz gegen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 war auch systemisch in nicht mit Hefe behandelten Blättern zu detektieren. Infektionen mit Botrytis cinerea 5 Tage nach Hefebehandlung führten beim Wildtyp Col-0 zu Nekrosengröße, die nur 17 % der Nekrosengröße der mit Wasser behandelten Kontrolle betrugen. Veränderungen in der Genexpression 48 Stunden nach Hefebehandlung wurden in einer Microarray-Analyse (in Kooperation mit der GSF Neuherberg) ermittelt. Von rund 1400 Stress-responsiven Genen konnte eine Induktion von 6 Genen nachgewiesen werden. Dabei handelte es sich um Salicylsäure-abhängige Gene (Pr1, Pr2 und Pr5), Gluthation-S-Transferasen (Gst2 und Gst11) und eine UDP Glucosyltransferase. Die Erhöhung der Gene Pr1 und Pr2 deutet auf eine Aktivierung des Salicylsäure-Weges hin. Die Induktion der anderen Gene deutet auf eine Aktivierung der Detoxifizierung hin. Gene aus dem Jasmonsäure (JA)- und Ethylen-Weg wurden nicht induziert. Reprimiert wurde das Gen Asa1, das für eine JA-induzierte Antranilatsynthase kodiert. In Northernblot-Analysen wurden Gene auch zu früheren Zeitpunkten als in der Microarray-Analyse untersucht. Für die Untersuchung, welche Signalwege für die Resistenz durch Hefebehandlung verantwortlich sind, wurden verschiedene Mutanten mit den korrespondierenden Wildtypen von Arabidopsis thaliana aus dem JA-Weg (dde2, opr3 und jin1), aus dem Salicylsäure-Weg (nahG und npr1) und aus dem Camalexin-Weg (cyp79B2/B3 und pad3) mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 oder Botrytis cinerea infiziert. Nach Infektionen mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 konnte nur in den Salicylsäure-Mutanten keine erhöhte Hefe-vermittelte Resistenz festgestellt werden. Das deutet darauf hin, dass Salicylsäure für den Schutzeffekt der Hefe gegenüber Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 notwendig ist. Bei den getesteten Wildtypen und den Mutanten aus dem JA- und Camalexin-Weg wurden in den mit Hefe vorbehandelten Pflanzen Schutzfaktoren gegen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 zwischen 2 und 5fach nachgewiesen. Bei Infektionen mit Botrytis cinerea wurde in allen getesteten Mutanten nach Hefebehandlung eine Schutzwirkung aufgezeigt (Schutzfaktoren von 3 bis 7). Das deutet darauf hin, dass weder JA, noch Salicylsäure oder Camalexin für die Schutzwirkung gegen Botrytis cinerea verantwortlich ist. Eine direkte hemmende Wirkung der Hefe auf das Wachstum des nekrotrophen Pilzes konnte durch Wachstumsversuche auf unterschiedlichen Medien ausgeschlossen werden. In Versuchen mit den Mutanten dde2 und opr3 konnte nachgewiesen werden, dass dde2, die weder 12-Oxo-Phytodiensäure noch JA bilden kann, größere Läsionen nach Botrytis cinerea Infektionen ausbildet als der Wildtyp. Größere Läsionen zeigte auch opr3, die 12-Oxo-Phytodiensäure, aber keine JA bildet, die sich aber nicht signifikant vom Wildtyp unterschieden. Daraus lässt sich schließen, dass 12-Oxo-Phytodiensäure eine wichtige Rolle für die Abwehr gegenüber dem nekrotrophen Pilz Botrytis cinerea spielt, wobei JA vermutlich zusätzlich zur Abwehr beiträgt. Infektionen mit Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 führten bei beiden Mutanten zu einer geringeren Symptomausprägung als in den Wildtypen. Übereinstimmend mit den makroskopisch sichtbaren Symptomen zeigte die Mutante dde2 ein mehr als 20fach geringeres Bakterienwachstum als der Wildtyp. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass sich die Anwesenheit von 12-Oxo-Phytodiensäure und JA im Wildtyp negativ auf die Abwehr gegen das biotrophe Pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 auswirkt. In Fusarium graminearum konnte JA nachgewiesen werden. Ob es sich bei der JA um einen Pathogenitätsfaktor des Pilzes handelt, sollte durch Mutanten mit einem Defekt im Lipoxygenasegen untersucht werden. Infektionsversuche mit Lipoxygenase-Knockout-Mutanten und Stämmen mit komplementierter Lipoxygenase-Expression zeigten keine Unterschiede in der Symptomausprägung an Blüten und jungen Schoten von Arabidopsis thaliana im Vergleich zum Wildtyp-Pilz. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Lipoxygenase in Fusarium graminearum keine Rolle in der Pathogenität gegenüber Arabidopsis thaliana spielt. N2 - In previous studies yeast-elicitors (Saccaromyces cerevisiae) were described as defense inducers in different cell cultures as well as in plants of soybean and barley. In this work a possible elicitor effect on Arabidopsis thaliana was analysed. After spraying with autoclaved bakers yeast, the phytoalexin camalexin increased in the plants and reached maximum level of 54 nmol/g fw five days after treatment. Infection with Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 five days after yeast treatment showed a protection effect which resulted in 3 to 4 fold less bacterial growth in the wild type Col-0. A protection was detectable between five and eleven days after yeast treatment. Protection was also systemic. Infection with Botrytis cinerea five days after yeast spraying showed a reduction in necrotic lesions to 17 % of water pre-treated plants. Regulation of gene expression 48 hours after yeast treatment was assessed. In a cDNA array comprising 1,400 stress responsive genes (in cooperation with GSF Neuherberg) six genes were induced. Induction was evident for salicylic acid-responsive genes (Pr1, Pr2 and Pr5), glutathion-S-transferases (Gst1 and Gst2), and an UDP-glucosyl transferase. This regulation of gene expression indicated an activation of the salicylic acid pathway and of the detoxification system by yeast. Genes of the jasmonic acid (JA)- and ethylene pathway were not induced. The gene Asa1 which encodes a JA-inducible antranilate synthase was down regulated. With Northern blot analysis the results of the array analyses were verified and in addition earlier time points were analysed. To investigate which signaling pathways are involved in the resistance after yeast treatment different Arabidopsis thaliana mutants were analysed. In the jasmonic acid pathway the mutant’s dde2, opr3 and jin1 were examined, in the salicylic acid pathway nahG and npr1 and in the camalexin biosynthesis cyp79B2/B3 and pad3. The mutants in the salicylic acid pathway showed no yeast-mediated resistance against Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. This indicates that the salicylic acid pathway is necessary for the protection by yeast against Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. In contrast, yeast pre-treatment resulted in a protection in mutants in the jasmonic acid and Camalexin pathways which was similar to the wild type. Upon infection with Botrytis cinerea after yeast pre-treatment a protection effect was detectable in all explored mutants (three to seven fold). This indicates that neither JA, nor salicylic acid nor camalexin is necessary for the protection against Botrytis cinerea. A direct inhibitory effect of yeast on the growth of the necrotrophic fungus can be excluded from growth tests on different plates. Experiments with the dde2 mutant which is not able to synthesize 12-oxo-phytodienoic acid and JA, and the opr3 mutant which is able to accumulate 12-oxo-phytodienoic acid but not JA showed that after Botrytis cinerea infection dde2 developed bigger lesions as the wild type. Lesion sizes were also bigger in opr3 but not significant. These results suggest that 12-oxo-phytodienoic acid is important for the defense against the necrotrophic fungus Botrytis cinerea while JA might additionally contribute. Both mutants showed fewer symptoms after Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 infection as the corresponding wild typs. In agreement with the symptom development, the bacterial growth of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 in the mutant dde2 was more than 20-fold lower than in the wild type. This result indicates that in the wild type 12-oxo-phytodienoic acid and JA negatively affect the defense against the biotrophic pathogen Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000. JA was detected in Fusarium graminearum. In order to investigate if JA is important for pathogenicity of this fungus, mutants with a defect in the lipoxygenase gene were analysed. No difference in the symptom development after infection of flowers and young siliques of Arabidopsis thaliana with lipoxygenase-knockout-mutants or strains with complemented lipoxygenase expression in comparison to the wild type were detectable. These results indicated that the lipoxygenase gene in Fusarium graminearum is not necessary for the pathogenicity in Arabidopsis thaliana. KW - Ackerschmalwand KW - Phytopathogene Pilze KW - Saccharomyces cerevisiae KW - Resistenzfaktor KW - Jasmonate KW - Jasmonate KW - Hefe-Elicitor KW - Pflanze-Pathogen-Interaktion KW - OPDA KW - jasmonates KW - yeast-elicitor KW - plant-pathogen-interaction KW - OPDA Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22255 ER -