TY - THES A1 - Widmaier, Louis T1 - Die Regulation des Chemokinrezeptors CXCR4 durch Chemotherapeutika in Myelomzelllinien T1 - The regulation of chemokinreceptor CXCR4 by chemotherapeutics in myeloma cell lines N2 - Untersucht wurde der Einfluss mehrerer Chemotherapeutika auf den Chemokinrezeptor CXCR4 in Myelomzelllinien auf Ebene des Promotors, der mRNA und der Rezeptorverteilung, wobei drei Substanzen (Etoposid, Bortezomib und Dexamethason) als potenzielle Suppressoren des Promotors ausgemacht werden konnten. Abhängig vom Myelom-Zelltyp und der Dosierung können so evtl. Rückschlüsse auf die beobachtete Suppression von CXCR4 bei erkrankten Patienten mit hoher CXCR4-Aktivität (hier: Malignes Myelom) durch die begleitende Chemotherapie gezogen werden, welche eine Diagnostik und Therapie bei diesen Patienten erschwert. Hintergrund: Hintergrund für diese Arbeit waren Beobachtungen in klinischen Fallstudien von Lapa et al. am Universitätsklinikum Würzburg, die sich auf CXCR4 bezogen, welches u.a. bei Patienten mit Multiplem Myelom überexprimiert wird und dadurch bereits als Target für Diagnostik und Therapie in der Klinik Anwendung findet. Dabei konnte bei PET-CT Untersuchungen in der Nuklearmedizin beobachtet werden, dass es durch die begleitende Chemotherapie der Patienten zu einer Suppression des markierten CXCR4-Signals kam, so dass es nicht mehr zur Verlaufsbeobachtung und vor allem nicht mehr zur Radiotherapie und Therapiekontrolle verwendet werden konnte. Um den Einfluss und mögliche Interaktionen der Chemotherapeutika auf CXCR4 zu untersuchen, war es Ziel dieser Arbeit, ein vergleichbares Szenario in-vitro nachzustellen und Einflüsse messbar zu machen, um so mögliche Ansätze und Verbesserungsvorschläge für die klinische Anwendung zu liefern. Methoden/Ergebnisse: Hierfür wurden im ersten Teil INA-6 (Myelomzellen) und Mesenchymale Stammzellen (MSC) kultiviert, in Ko-Kultur gebracht und nach einer bestimmten Zeit wieder getrennt, um anschließend den gegenseitigen Einfluss in Bezug auf CXCR4 zu messen. Zudem wurde der Einfluss von Dexamethason untersucht. Es zeigte sich eine enge Bindung zwischen INA-6 und MSC sowie eine hohe CXCR4-Aktivität bei INA-6, jedoch konnte keine Induktion der CXCR4-Aktivität in MSC durch INA-6-Kontakt oder Dexamethason quantifiziert werden. Die Immunzytologie erwies sich aufgrund einer schweren Anfärbbarkeit von CXCR4 – auch mit verschiedensten Antikörpern und sogar Liganden-gekoppeltem Farbstoff– als kaum auswertbar, wobei eine Darstellung von CXCR4 generell aber gelang. Der CXCR4-Promotor wurde mittels Software genauer analysiert, wobei einige relevante Bindestellen, u.a. für Glukokortikoide und NFkB gefunden wurden. Die Herstellung eines CXCR4- pGl4.14-Promotor-Konstrukts war erfolgreich, ebenso dessen Einschleusung in Myelomzellen. Auch gelang die Herstellung stabiler transfizierter INA-6, sodass mit diesen anschließend konstantere Ergebnisse erzielt werden konnten. Im größten Teil der Arbeit wurden geeignete Chemotherapeutika-Konzentrationen ermittelt und in Viabilitäts- und Apoptose-Versuchen überprüft. Die Stimulationsversuche mit diesen zeigten variable Effekte abhängig vom Zelltyp (INA-6, MM1S), jedoch konnten Bortezomib, Etoposid und Dexamethason konzentrationsabhängig als starke Suppressoren der CXCR4-Aktivität ausgemacht werden, was sich v.a. auf Ebene der Promotoraktivität – gemessen mittels Luciferase - zeigte. Interpretation: In-vitro konnten somit drei potenzielle Suppressoren der CXCR4-Aktivität ausgemacht werden: Etoposid, Bortezomib und Dexamethason. Zumindest beim INA-6-Zelltyp fiel dieser Effekt deutlich aus, wobei in der Klinik der entsprechende Zelltyp sowie die Dosierung der Medikamente berücksichtigt werden müssen. Hinzu kommen weitere Einflussfaktoren des menschlichen Körpers, die nicht berücksichtig werden konnten. Die genauen Mechanismen der Suppression könnten sich aus den Bindestellen des Promotors erklären, die von uns analysiert wurden, aber auf die in weiteren Arbeiten noch näher eingegangen werden muss. N2 - The influence of several chemotherapeutic agents on the chemokine receptor CXCR4 in myeloma cell lines at the level of the promoter, the mRNA and the receptor distribution was examined, whereby three substances (etoposide, bortezomib and dexamethasone) could be identified as potential suppressors of the promoter. Depending on the cell type and the dosage, conclusions can be drawn about the observed suppression of CXCR4 in patients with diseases with high CXCR4 activity (here: multiple myeloma) due to the accompanying chemotherapy, which impairs theranostic applications like diagnostic imaging using PET/CT and may in particular abolish the chances of radiotherapeutic intervention in these patients. Background: The background for this work were observations in clinical case studies by Lapa et al. at the University Hospital Würzburg, which referred to CXCR4, which is overexpressed in patients with multiple myeloma and is therefore already used as a target for diagnostics and therapy in the clinic. During PET-CT examinations in nuclear medicine, it could be observed that the accompanying chemotherapy of the patients led to a suppression of the marked CXCR4 signal, which is why it could no longer be used for monitoring the follow-up, but also was lost as a radiotherapeutic target. In order to investigate the influence and possible interactions of chemotherapeutic agents on CXCR4, the aim of this work was to simulate a comparable scenario in vitro and to make influences measurable in order to provide possible approaches and suggestions for improvement for clinical application. Methods/Conclusions: For this purpose, INA-6 (myeloma cells) and mesenchymal stem cells (MSC) were cultivated in the first part, brought into co-culture and separated again after a certain time in order to then measure the mutual influence with regard to CXCR4 expression. The influence of dexamethasone was also examined. There were intensive contacts between INA-6 and MSC and high CXCR4 activity in INA-6, but no induction of CXCR4 activity in MSC by INA-6 or dexamethasone could be quantified. The immunocytology turned out to be difficult due to the difficulty of staining CXCR4 - even with a wide variety of antibodies and ligand-coupled dyes - although CXCR4 was generally able to be represented. The CXCR4 promoter was analyzed in more detail using the Genomatix software, and some relevant binding sites, including response elements for glucocorticoids and NFkB, were found. The production of a CXCR4-pGl4.14 luciferase-reporter construct was successful, as was its introduction into myeloma cells. The production of stably transfected INA-6 was also successful, so that more constant results could then be achieved. In a large part of the work, suitable chemotherapeutic concentrations were determined and checked in viability and apoptosis tests. The stimulation experiments with these showed variable effects depending on the cell type (INA-6, MM1S). However, depending on the concentration, bortezomib, etoposide and dexamethasone could be identified as strong suppressors of CXCR4 activity, which was particularly evident at the level of activity of our luciferase-reporter construct. Interpretation: Overall, three potential suppressors of CXCR4 activity could be identified in-vitro: etoposide, bortezomib and dexamethasone. At least with the INA-6 cell type, this effect was clear, although the corresponding cell type and the dosage of the medication must be taken into account in the clinic. In addition, there may be other influencing factors of the human organism in vivo that could not be considered. The exact mechanisms of suppression could be explained by the binding sites of the promoter, which we analyzed, but which will have to be discussed in more detail in further work. KW - Bortezomib KW - Plasmozytom KW - Chemokin CXCL12 KW - Multiples Myelom KW - Chemotherapie KW - Promotor KW - CXCR4 KW - Stimulationsversuche Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-345682 ER - TY - THES A1 - Schüpferling, Anne Marie Heidi T1 - Der Einfluss der Proteasomhemmung durch Bortezomib auf die Aktivierbarkeit humaner Thrombozyten T1 - The role of proteasom activity for activating signaling in human platelets N2 - Bortezomib, ein selektiver und potenter Proteasominhibitor, wird experimentell in der Tumorzellforschung sowie therapeutisch in der Therapie des Multiplen Myeloms eingesetzt. Die Wirkung auf die Thrombozytenfunktion war bislang unzureichend untersucht. Daher evaluiert diese Studie die dosisabhängige Wirkung von Bortezomib auf die Viabilität, die Aggregation von gewaschenen Thrombozyten und auf aktivierende Signalwege in gewaschenen Thrombozyten. Die Thrombozytenviabilität war bei hohen Bortezomibkonzentrationen von 100 - 200 µM vermindert. Passend dazu verminderten 100 - 200 µM Bortezomib die Phosphorylierung der ERK1/2 und der Akt/PKB in humanen Thrombozyten. Im Gegensatz dazu hatten diese hohen Bortezomibkonzentrationen keinen Einfluss auf das Niveau der p38 MAP Kinase-Phosphorylierung in aktivierten Thrombozyten. Die Thrombozytenaggregation, induziert durch hohe Konzentrationen von Kollagen oder TRAP-6, blieb unter 0,1 nM - 200 µM Bortezomib unverändert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass Bortezomib weder die essenziellen, aktivierenden Signalwege noch die Initialisierung der Aggregation relevant beeinflusst. Das zeigt, dass diese Prozesse in Thrombozyten nicht abhängig von der Proteasomaktivität sind. Supramaximale Inhibierung des Proteasomsystems mit Bortezomibkonzentrationen von 100 µM oder mehr führen möglicherweise zu veränderter Thrombozytenreaktionsfähigkeit, welche unter Umständen durch unspezifische und potenziell toxische Effekte mit erniedrigter Zellviabilität verursacht werden. N2 - Bortezomib, a selective and potent proteasome inhibitor, is used experimentally in tumor cell research and therapeutically in the treatment of multiple myeloma. Its effect on platelet function has been insufficiently studied. Therefore, this study evaluates the dose-dependent effects of bortezomib on viability, aggregation of washed platelets and activating signaling pathways in washed platelets. Platelet viability was tampered after incubation with high bortezomib concentrations of 100 - 200 µM. Fittingly, 100 - 200 µM bortezomib decreased phosphorylation of ERK1/2 and Akt/PKB in human platelets. In contrast, these high concentrations of bortezomib had no effect on the level of p38 MAP kinase phosphorylation in activated platelets. Furthermore platelet aggregation induced by high concentrations of collagen or TRAP-6 remained unchanged under the influence 0.1 nM - 200 µM bortezomib. In conclusion, bortezomib does not relevantly affect essential activating signaling pathways or the initialization of aggregation. This indicates that these processes in platelets are not dependent on proteasome activity. Supramaximal inhibition of the proteasome system with bortezomib concentrations of 100 µM or above may lead to altered platelet responsiveness, which may be accompanied by nonspecific and potentially toxic effects associated with decreasing cell viability. KW - Thrombozyt KW - Proteasom KW - Bortezomib KW - Thrombozytenaggregation KW - Thrombozyten KW - Proteasomsystem KW - Thrombozytenaktivierung KW - Viabilität KW - Proteasomhemmung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-327551 ER -