TY  - THES
A1  - Hess, Petra
T1  - Genetische und molekularbiologische Analyse von fim Determinanten bei Citrobacter freundii und Escherichia coli
T1  - Genetical and molecular biological analysis of fim determinants from Citrobacter freundii and Escherichia coli
N2  - Citrobacter freundii sind Gram-negative, bewegliche, stäbchenförmige Bakterien aus der Familie der Enterobacteriaceae. Als opportunistischer Erreger kann C. freundii beispielsweise Harnwegsinfektionen und Neugeborenen-Meningitis verursachen. Die Internalisierung von C. freundii 3009 in das Endosom von Harnblasenepithelzellen (T24) erfolgt in vitro über einen ausschließlich Mikrotubuli-abhängigen Mechanismus. Als genetische Grundlage der Invasionskompetenz von C. freundii 3009 wurde in Vorarbeiten eine im Chromosom lokalisierte Invasionsdeterminante identifiziert, die eine hohe Identität zum Typ 1 Fimbrien Gencluster (fim) von Salmonella enterica serovar Typhimurium aufweist. Diese in Plasmid pTO3 klonierte Invasionsdeterminante vermittelt nicht-invasiven E. coli K12 Stämmen Invasivität. Im Gegensatz dazu sind rekombinante E. coli K12 Klone, die das fim Operon aus S. enterica serovar Typhimurium bzw. E. coli oder andere E. coli Adhäsindeterminanten tragen, nicht invasiv. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die für die Invasionsfähigkeit von C. freundii 3009 essentiellen Gene der klonierten Invasionsdeterminante ermittelt. Dies geschah zum einen durch Subklonierung von Teilen des Plasmids pTO3. In anschließenden Invasionsassays wurden die entsprechenden E. coli K12 Klone hinsichtlich ihrer Fähigkeit zur Invasion untersucht. Die Internalisierung des Wildtyps C. freundii 3009 sowie der invasiven rekombinanten E. coli K12 Stämme konnte nicht nur, wie erwartet, mittels Mannose, sondern auch mittels Chitinhydrolysat [(GlcNAc)n] inhibiert werden. Zum anderen wurden C. freundii Wildtypmutanten konstruiert, in denen der zentrale Teil der Invasionsdeterminante deletiert ist. Diese chromosomalen Deletionsmutanten weisen im Vergleich zum Wildtyp 3009 eine deutlich reduzierte Invasionsrate in die humane Harnblasenepithelzellinie T24 auf. Für die Komplementante wurde die Wiederherstellung des invasiven Phänotyps demonstriert. Darüber hinaus ist bekannt, dass C. freundii 3009 in humane mikrovaskuläre Endothelzellen aus dem Gehirn (HBMEC) eindringen und dort replizieren kann. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass sowohl C. freundii 3009 als auch der, die fimCf Determinante tragende, rekombinante E. coli Stamm HB101pPH1 in der Lage sind, im Tiermodell mit neugeborenen Ratten die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Neben der Analyse der Funktion der klonierten C. freundii 3009 fim Determinante in Invasionsassays und mittels Mannose-sensitiver Hefeagglutination, wurden die Genprodukte selbst ebenfalls nachgewiesen. Durch radioaktive Markierung der für die Invasivität essentiellen Proteine nach induzierter Transkription in einem T7 Phagenexpressionssystem konnten die Molekulargewichte von FimCfA, FimCfD, FimCfF und FimCfH ermittelt werden. Diese stimmen mit den von der DNA Sequenz abgeleiteten Molekulargewichten gut überein. Sowohl mit C. freundii 3009 als auch mit entsprechenden rekombinanten E. coli K12 Stämmen gelang es in Westernblots, das Adhäsin FimCfH an der Bakterienoberfläche nachzuweisen. Dies konnte auch für FimCfF in denselben rekombinanten E. coli K12 Stämmen gezeigt werden. Allerdings scheinen die FimCf Proteine nicht zu einem Pilus assembliert zu werden, da in elektronenmikroskopischen Untersuchungen von C. freundii 3009 oder die fimCf Determinante tragenden E. coli K12 Stämmen niemals Fimbrien beobachtet werden konnten. Da auch bestimmte Typ 1 Fimbrien Varianten aus E. coli über das Adhäsin FimEcH die Internalisierung der Bakterien in Blasenepithelzellen zu induzieren vermögen, wurden die fimEc Gencluster aus den beiden human pathogenen E. coli Stämmen 536 (uropathogenes Isolat) und IHE3034 (Neugeborenen-Meningitis Isolat) kloniert. Zudem wurde die Invasionsfähigkeit des E. coli K1 Stamms IHE3034 und der fim negativen Insertionsmutante IHE3034-2 charakterisiert. Typ 1 Fimbrien werden als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli (UPEC) angesehen. Trotzdem konnte eine Reihe von klinischen UPEC Isolaten identifiziert werden, die diesen Adhäsintyp nicht mehr exprimieren. Genetische Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit ergaben, dass in 11 Isolaten das fimEc Operon vollständig aus dem Chromosom der Bakterien deletiert ist. In den übrigen 6 Isolaten ist noch ein Teil des 3´-Endes des Gens fimECH vorhanden. Außerdem ist in die Deletionsstelle dieser 6 Isolate ein IS1 Element von E. coli inseriert. In den übrigen uropathogenen Isolaten sind auch angrenzende DNA Bereiche von der Deletion betroffen. Abschließend kann festgestellt werden, dass eine fim ähnliche Determinante in C. freundii 3009 als Invasionssystem fungiert. Die Typ 1 Fimbrien der E. coli Stämme 536 und IHE3034 sind zwar notwendig, aber nicht hinreichend für die Invasivität. Obwohl Typ 1 Fimbrien als wichtige Virulenzfaktoren von uropathogenen E. coli gelten, ist dennoch in einer Reihe von klinischen UPEC Isolaten das fimEc Operon deletiert.
N2  - Citrobacter freundii, which belong to the family of Enterobacteriaceae, are Gram-negative, motile and rod shaped bacteria. As an opportunistic pathogen they are known to be involved in urinary tract infections as well as in newborn meningitis. In vitro, the internalization of C. freundii 3009 into the endosomes of the urinary bladder epithelial cell line T24 exclusively follows a microtubule dependent mechanism. Previously, a chromosomal invasion determinant of C. freundii 3009 has been identified and cloned in plasmid pTO3. This invasion determinant shows high identity to the type 1 fimbrial gene cluster (fim) of Salmonella enterica serovar Typhimurium. Interestingly, non-invasive E. coli K12 strains become invasive, when they are transformed with plasmid pTO3. In contrast, recombinant E. coli K12 strains harbouring the fim operon of either S. enterica serovar Typhimurium and E. coli, respectively, or other E. coli adhesin determinants were not invasive. In this work the genes of this chromosomal determinant, which are essential for invasiveness, were identified. This was achieved on one hand by subcloning parts of the invasion determinant of plasmid pTO3. Subsequently, the ability of the resulting plasmids to confer invasiveness to E. coli K12 strains was examined by gentamicin protection assays. Interestingly, the internalization of those recombinant E. coli K12 strains is not only inhibited by an analogue of the natural receptor of the adhesin FimCfH, namely mannose, but also by chitin hydrolysate [(GlcNAc)n]. On the other hand, mutants of wild type C. freundii 3009 were constructed by deleting the central part of this particular invasion determinant. These chromosomal deletion mutants showed a considerable lower invasion rate of the human epithelial cell line T24 in comparison to the wild type. Complementation of one of these mutants fully restored the wild type phenotype. Furthermore, it is known that C. freundii 3009 is capable to invade and replicate in human brain microvascular endothelial cells (HBMEC). The results presented here demonstrate that not only C. freundii 3009 is capable to breach the blood-brain-barrier in a newborn rat animal model, but also recombinant E. coli strain HB101pPH1 which carries the chromosomal fimCf determinant. In addition to the functional analysis of the C. freundii 3009 fim determinant by performing gentamicin protection assays and mannose sensitive yeast agglutination, the expression of the corresponding gene products was shown. Proteins essential for invasion, namely FimCfA, FimCfD, FimCfF and FimCfH, were specifically radio labelled using a T7 phage expression system and their molecular weight was determined. The observed molecular weights are in agreement with the calculated ones from deduced amino acid sequences. Furthermore, the presence of the fimbrial adhesin minor subunit FimCfH on the outer surface of C. freundii 3009 as well as appropriate recombinant E. coli K12 strains was shown using Westernblot technique. Expression of the minor subunit FimCfF on the outer surface was also shown for the recombinant E. coli K12 strains using the same technique. However, electron microscopic studies of C. freundii 3009 or E. coli K12 strains harbouring the fimCf determinant indicate that FimCf protein subunits are not assembled in hair like appendages called fimbriae. Since certain type 1 fimbrial variants of E. coli are able to induce bacterial internalization by bladder epithelial cells via the adhesin FimEcH, the fimEc gene cluster from human pathogenic E. coli strains 536 (uropathogenic isolate) and IHE3034 (newborn meningitis isolate) were cloned in order to examine the role of type 1 fimbriae of these strains in invasiveness. In addition, E. coli K1 strain IHE3034 and the isogenic fim negative insertion mutant IHE3034-2 were characterized for their invasion capability. Although type 1 fimbriae are known to be an indispensable virulence factor of uropathogenic E. coli (UPEC), several clinical UPEC strains, which are incapable of expressing this particular adhesin, were isolated and identified. By performing genetic analysis, it could be demonstrated that the fimEc operon is completely deleted from the chromosome in 11 of those isolates. In another 6 isolates the presence of only the 3´-end of the gene fimECH could be found. Furthermore, an IS1 element inserted in the fim deletion was identified in these 6 strains. In the remaining 11 isolates also the DNA region adjacent to the fimEc cluster was affected by this deletion process. In conclusion, it was ascertained that in C. freundii 3009 a fim like determinant functions as an invasion system. Type 1 fimbriae of E. coli strains 536 and IHE3034 are necessary but not sufficient to confer invasiveness. Although type 1 fimbriae of uropathogenic E. coli are known to be an important virulence factor, in several clinical uropathogenic E. coli strains the fimEc operon was deleted.
KW  - Citrobacter freundii
KW  - Virulenzfaktor
KW  - Molekulargenetik
KW  - Citrobacter freundii
KW  - UPEC
KW  - Invasion
KW  - Typ 1 Fimbrien
KW  - Harnwegsinfektionen
KW  - Citrobacter freundii
KW  - UPEC
KW  - invasion
KW  - type 1 fimbriae
KW  - urinary tract infection
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7635
ER  - 
TY  - THES
A1  - Katoglou, Athanasios
T1  - Harnwegskolonisationen und -Infektionen auf der operativen Intensivstation
T1  - Urinary tract colonizations and infections in the operative Intensive Care Unit
N2  - Die Angaben über harnableitungsassoziierte Harnwegsinfektionen bei operativen Intensivpatienten sind in der Literatur nicht einheitlich. Daher wurden 259 Patienten im Studienzeitraum auf eine harnableitungsassoziierte Harnwegskolonisation und - infektion untersucht. 58 Patienten (22,4%) wurden mit einer harnableitungsassoziierten Harnwegsinfektion und 44 Patienten (17%) mit einer harnableitungsassoziierten Harnwegskolonisation ermittelt. Die Inzidenz der harnableitungsassoziierten Harnwegsinfektion lag bei 18,6/1000 Tagen und die der harnableitungsassoziierten Harnwegskolonisation bei 20/1000 Tagen. Dies liegt im Bereich der Literaturangaben für harnableitungsassoziierte Harnwegsinfektionen bei Patienten auf der operativen Intensivstation. Die Patientenliegedauer konnte unter den patientenbezogenen Risikofaktoren als signifikant unabhängiger Risikofaktor für eine Infektion ermittelt werden. Als behandlungsbezogene Risikofaktoren für eine harnableitungsassoziierte Harnwegsinfektion fanden sich der Verzicht auf Antibiotikagabe, die transurethrale Harnableitung und eine Liegedauer der Harnableitung von über 5 Tagen. E.Coli mit 41,2% gefolgt von Enterokokken mit 21,6% und Proteus mirabilis mit 10,2% waren die am häufigsten nachgewiesene Keime bei harnableitungsassoziierten Harnwegsinfektionen auf der operativen Intensivstation. Diese Ergebnisse sind im Einklang mit den Literaturangaben. Die Craniotomie als Eingriffsart war ein signifikant abhängiger Risikofaktor für eine Harnwegsinfektion, da hier signifikant häufiger eine transurethrale Harnableitung verwendet wurde, und der Einsatz einer gleichzeitigen Antibiotikagabe signifikant geringer war. Bei gleicher Kolonisationsrate zwischen der transurethralen und suprapubischen Harnableitung ist die Zahl der harnableitungsassoziierten Harnwegsinfektion bei transurethraler Harnableitung signifikant deutlich höher, was durch die Irritation der Harnröhre durch die transurethrale Harnableitung zu erklären sein dürfte. Bei einer längerfristigen Harndrainage ( > 5 Tage) sollten mittels bakteriologischer Urinuntersuchungen, Harnwegsinfektionen frühzeitig erkannt werden. Zur Prävention einer Harnwegsinfektion sollte auch die Anlage einer suprapubischen Harnableitung in Betracht gezogen werden. Eine routinemäßige Gabe von Antibiotika zur Prävention harnableitungsassoziierter Harnwegsinfektionen ist jedoch, angesichts einer drohenden Resistenzentwicklung, nicht indiziert.
N2  - The data concerning catheter-associated urinary tract infections in an operative intensive care unit are not uniform in the literature. Therefore 259 patients have been examined on a catheter-associated urinary tract Colonization and Infection. 58 patients (22.4%) were determined with an catheter-associated urinary tract infection and 44 patients (17%) with an catheter-associated urinary tract colonization. The incidence of the catheter-associated urinary tract infection was about 18,6/1000 days and with an catheter-associated urinary tract colonization 20/1000 days. This is within the range of catheter-associated urinary tract infections in the literature data for patients in the operative intensive care unit. The patient couch duration could be determined under the patient-referred factors of risk as significantly independent factor of risk for an infection. As treatment-referred factors of risk for an catheter-associated urinary tract infection were the renouncement of antibiotics, the transurethral urinary device and a duration of the catheter over 5 days. E.Coli with 41,2% followed of Enterococcus sp. with 21,6% and Proteus mirabilis with 10,2% were the most frequently proven germs within catheter-associated urinary tract infections in the operative intensive care unit. These results are in conformity with the literature data. The Craniotomie as kind of interference was a significantly dependent factor of risk for a urinary tract infection, since here significantly more frequently a transurethrale urine device was used, and the employment of simultaneous antibiotics was significantly smaller. With same rates of colonizations between the transurethral and suprapubic urine device the number of the catheter-associated urinary tract infections is significantly clearly higher using a transurethral catheter, which might have to be explained by the irritation of the urethra by the transurethral urine device. With a long-term urine drainage (> 5 days) urinary tract infections should be promptly recognized by using urincultures. For the prevention of a urinary tract infection also the use of a suprapubic catheter should be considered. A routine employment of antibiotics to the prevention of urinary tract infections is not indicated however, in view of a threatening resistance development.
KW  - Harnwegsinfektionen
KW  - Harnwegskolonisationen
KW  - operative
KW  - Intensivstation
KW  - urinary
KW  - tract
KW  - infections
KW  - colonizations
KW  - ICU
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22598
ER  - 
TY  - THES
A1  - Hoffmann-Wolz, Alexander
T1  - Molekularbiologische Untersuchungen von Escherichia-coli-Stuhl- und Urin-Isolaten von Patientinnen mit chronisch-rezidivierenden Harnwegsinfektionen hinsichtlich ihrer Persistenz und Genomstruktur
N2  - Harnwegsinfektionen (HWI) gehören zu den häufigsten bakteriell bedingten Erkrankungen; vor allem Frauen sind sehr häufig betroffen. Harnwegsinfektionen kommt große medizinische und volkswirtschaftliche Bedeutung zu. Bei akuten unkomplizierten Infekten ist allein Escherichia coli in über 70 % der Fälle die Ursache. Auch bei komplizierten chronischen Infektionen spielt Escherichia coli in über 40 % aller Fälle eine große Rolle. E. coli Stämme, die die Nieren und ableitenden Harnwege inklusive Harnblase infizieren, werden als uropathogene E. coli (UPEC) bezeichnet. Sie unterscheiden sich von anderen, apathogenen E. coli Stämmen dadurch, daß sie bestimmte Virulenzfaktoren (VF) und Fitnessfaktoren besitzen, die ihnen besondere Virulenz verleihen. Solche Virulenzfaktoren sind vor allem Kapseln, Adhäsine, Toxine und Eisenaufnahmesysteme. In dieser Arbeit wurden Stuhl- und Urinproben von acht Patientinnen untersucht, die in der nephrologischen Abteilung der Universitätsklinik Jena betreut wurden und alle an chronisch rezidivierenden Harnwegsinfektionen leiden. Die gewonnenen Isolate wurden mittels Multiplex-PCR auf Virulenzfaktoren getestet, die für UPEC typisch sind. Des Weiteren wurden mit Hilfe der „Repetitive Extragenic Palindromic“ (Rep)-PCR und den Ergebnissen aus der Multiplex-PCR-Analyse Klone definiert. Ausgewählte Isolate wurden mittels Pulsfeldgelelektrophorese (PFGE) untersucht. Die Rep-PCR- und PFGE-Ergebnisse aus vorangegangenen Arbeiten (L. Brauchle, 2002 und M. Maibaum, 2003) wurden in diese Arbeit mit integriert und nomenklatorisch angeglichen. Die 167 Stuhl- und 186 Urinisolate dieser Arbeit konnten 81 Stuhl- und 64 Urinklonen zugeordnet werden. In der vorliegenden Studie scheinen die Häufigkeiten UPEC-typischer Virulenzfaktoren nach längerer chronischer Harnwegsinfektion wieder etwas anzusteigen. Insbesondere aber nahmen die Häufigkeiten der Virulenzfaktoren innerhalb der Stuhlstämme zu und entsprachen oftmals nahezu den Häufigkeiten bei Urinstämmen. Kapselgene, die bei Urinstämmen deutlich häufiger gefunden wurden, scheinen bei Chronizität eine Rolle zu spielen. Auch innerhalb der Urinklone häufiger zu finden waren die für Hämolysin, P-Fimbrien, S- bzw. F1C-Fimbrien codierenden Gencluster. Als Erregerreservoir scheint auch bei chronischen Harnwegsinfektionen der Darm festzustehen. Im Gesamtstudienzeitraum von 38 Monaten (1997-2000) koexistierten 18 Stämme in Stuhl und Urin gleichzeitig. Zehn dieser Koexistenzen wurden nochmals zu anderen Zeitpunkten gefunden (Persistenzen). Über den Vergleich der PFGE-Muster von Stuhl- und Urinklonen konnten bei Probandin Pat. 2 (HF) Klone mit dem PFGE-Muster IV und XV identifiziert werden, deren Bandenmuster sich so ähnlich sind (nur ein einziger Bandenshift), daß hier vermutlich eine DNA-Umlagerung stattgefunden hat. Innerhalb von 51 Untersuchungsterminen konnte lediglich vier Mal eine akute Exazerbation erfaßt werden. Tendenziell läßt sich über den gesamten Studienzeitraum ein Rückgang an erneuten Ausbrüchen bei ähnlicher Verteilung des Virulenzfaktorspektrums in den gefundenen Stuhl- und Urinstämmen beobachten. Eine prophylaktische Gabe von L-Methionin (Acimethin®) verminderte die Häufigkeit der untersuchten Virulenzfaktoren innerhalb der Stuhlstämme, kann aber bei chronischen Harnwegsinfektionen eine Exazerbation nicht sicher verhindern, möglicherweise jedoch deren Anzahl verringern.
KW  - Escherichia coli
KW  - Harnwegsinfektionen
KW  - Pathogenitätsfaktoren
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27338
ER  -