TY  - THES
A1  - Schnitzer, Johannes K.
T1  - Mechanism of dendritic cell-based vaccination against Leishmania major
T1  - Mechanismus der auf dendritischen Zellen beruhenden Impfung gegen Leishmania major
N2  - Die Impfung mittels Antigen-beladener dendritischer Zellen [DZ] ist mittlerweile eine gut etablierte Technik, die dann zum Einsatz kommt, wenn Standard-Impftechniken versagen, vor Krankheiten zu schützen beziehungsweise diese zu heilen. Die Effizienz dieser Technik konnte bereits für diverse Infektionskrankheiten und Krebserkrankungen in experimentellen Tiermodellen sowie am Menschen gezeigt werden. Hierbei ist die Möglichkeit zur wohldefinierten Manipulation und Antigenbeladung der DZ ein großer Vorteil gegenüber den konventionellen Ansätzen. Jedoch ist vor allem bei der Anwendung im klinischen Bereich die Präparation, Herstellung und Manipulation dieser autologen DZ mit einem erheblichen technischen, zeitlichen sowie finanziellen Aufwand verbunden. Hinsichtlich einer Präventivimpfung gegen eine pandemische Infektionskrankheit, die in hauptsächlich unterentwickelten Ländern vorkommt, wird dieser Aufwand sicherlich ein Hindernis darstellen. Daher muss für solche Fälle ein maßgeschneiderter Impfstoff entwickelt werden, der sich am Vorbild des effektiven DZ-basierten Impfstoffs orientiert. Für die Impfung gegen die Leishmania Parasiten besteht so ein DZ-basierter Impfstoff bereits. Dessen Wirkung, eine T-Zell Antwort vom Typ Th1 zu induzieren, wurde bereits in mehreren Veröffentlichungen demonstriert. Zusätzlich hat aber eine unserer Studien gezeigt, dass das typische Th1-bezogene Zytokin IL-12 zur Differenzierung naiver T-Zellen nicht von den injizierten DZ bereitgestellt werden muss, sondern von der geimpften Maus. Dies gab erste Hinweise auf eine stärkere Beteiligung des Wirts-Immunsystems als zuvor angenommen. Daher sollte hier vertieft der Mechanismus dieser DZ-basierten Impfung untersucht werden, wobei modifizierte Impfstoff-Ansätze zum Einsatz kommen sollten. Dabei wurden die Fragen nach der vom Impfstoff transportierten Information und dem Empfänger dieser Information berücksichtigt. Das aktuelle Paradigma zur DZ-basierten Impfung besagt, dass transferierte DZ im direkten Kontakt mittels dreier Signale T-Zellen stimulieren und aktivieren. Dafür müssen diese DZ mit dem entsprechenden Antigen beladen und aktiviert worden sein um das Antigen-Peptide mittels MHC Molekül im Kontext der Co-Stimulation präsentieren zu können. Jedoch zeigt diese Studie hier, dass weder eine Aktivierung der DZ noch die Präsentation des Antigens mittels passender MHC Moleküle notwendig ist für die Induktion einer protektiven Immunantwort gegen Leishmania Parasiten. Aufgeschlossene, mit Antigen beladene DZ müssen nicht vor dem Transfer mit CpG ODN aktiviert worden sein, um entsprechende Immunität zu verleihen. Ebenso hat der MHC Typ in diesem Falle auch keinen Einfluss auf die Effektivität des Impfstoffs. Da im Weiteren aufgeschlossene mit Leishmania-Antigen beladene Makrophagen nach Impfung die gleiche Wirkung erzielen, wie vorangegangene DZ-basierte Impfstoffe, können keine DZ spezifischen Mechanismen Schlüsselkomponenten der Induktion einer protektiven Immunität sein. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die DZ der geimpften Mäuse, eine maßgebliche Rolle bei der Verarbeitung transferierter Signale spielen. Suspensionen aufgeschlossener DZ stellen eine Kombination aus freigesetzten löslichen Molekülen sowie Membranvesikeln dar, die sich nach dem Aufschluss gebildet haben. Nach Auftrennung dieser beiden Fraktionen konnte gezeigt werden, dass ausschließlich die Membran-Fraktion nach Verimpfung eine geeignete Immunantwort zum Schutz vor Leishmania Parasiten induzieren kann. Als Vorteil dieser Aufreinigung erweist sich zudem die stabile Lagermöglichkeit bei -80°C. Somit ist klar gezeigt, dass die Immunität-verleihende Einheit dieser Impfstoffvarianten in der Membran-Fraktion liegt. Verfolgt man die Induktion Th1-zugehöriger Zytokine in in vivo Experimenten so ergibt sich im Falle der Gesamtsuspension aufgeschlossener, mit Leishmania-Antigen beladener DZ ein klares Bild. Diese Suspension erzeugt das volle Spektrum der DZ-basierten Impfung gegen Leishmania Parasiten. Es kann sowohl Produktion von IL-12 und IL-2 als auch eine antigenspezifische T-Zell Proliferation nach Stimulation von Splenozyten mit der entsprechenden Suspension verzeichnet werden. Außerdem produzieren Splenozyten von entsprechend geimpften Mäusen nach Stimulation mit Leishmania-Antigen erhebliche Mengen des entscheidenden Zytokins IFNγ. Obwohl jedoch die Verimpfung aufgereinigter Membranvesikel dieses Ansatzes im Tierversuch zu biologisch sowie statistisch signifikanten Ergebnissen führt, lassen sich die entsprechend Th1-bezogenen Zytokine im in vivo Ansatz nur in geringen Maße nachweisen. Ob dies jedoch für einen in vivo unbemerkten Aktivitätsverlust des Vakzins oder für andere lymphatische Organe als Ort der T-Zell Instruktion spricht, ist noch unbekannt und muss noch geklärt werden.
N2  - Dendritic cell-based vaccination is a well established technique for preventive and therapeutic instruction of the immune system where conservative vaccine formulations fail to cure or prevent diseases, respectively. Efficiency of this technique already was demonstrated in infectious diseases as well as for cancer in animal or human studies. Well controlled manipulation and antigen-loading of immature DC is most beneficial to this technique. But, time-consuming and cost-extensive procedures for preparation of DC precursors, expansion and stimulation of DC and inpatient administration are big disadvantages regarding vaccine development for pandemic infectious diseases that occur mainly in underdeveloped countries. Therefore vaccines are needed that are pathogen-tailored and able to induce equal immune responses as their DC-based vaccine models. For vaccination against Leishmania parasites such a DC-based vaccine is feasible and its efficacy to induce protective Th1-based immune responses was already demonstrated in several animal studies. But, one of our own studies indicated supportive activity of host cells exceeding the allocation of T cells to become activated by transferred DC. IL-12, an important cytokine for the induction of Th1-related immune responses, has to be produced by host cells. Therefore, the aim of this study was to investigate the mechanism of BMDC-based vaccination with regard to simplification of the vaccine formulation. Key questions that have been addressed are: Which cells process the information that is transferred by the injected DC and what are the key components of this information? Further more, it was looked at whether altered vaccine formulations are able to induce protective immunity and whether they share equal molecular mechanisms. The current paradigm of BMDC-based vaccination proposes direct interaction of transferred BMDC with host T cells. These BMDC have to be antigen-loaded for stimulation via antigen-peptide-MHC molecule-complexes and they have to be activated for proper co-stimulation of T cells. Here, this study demonstrates that neither activation for co-stimulation nor direct interaction with adequate MHC molecules is needed for the induction of protective immunity against infection with Leishmania-parasites. Disrupted antigen-loaded BMDC are able to induce protective immunity in BALB/c mice without pre-stimulation via CpG ODN. Beyond, if BMDC were used with a different MHC-background than recipient mice then the vaccine still would be efficient in terms of reduction of footpad swelling and parasite load in draining lymph nodes. Even more, DC-specific features are no key component that leads to protective immunity as vaccination with disrupted antigen-loaded MΦ shows equal properties than before mentioned vaccine formulations. Further more, it was found that host DC play a major role in transforming the incoming signal, received from transferred antigen-loaded DC, into Th1-related stimuli and Leishmania-antigen-specific T cell activation. Suspensions of disrupted antigen-loaded DC resemble a combination of laid off soluble molecules together with exosome-like vesicles that formed after disruption of membranes. Here it was shown that separation of the membranous and soluble fractions and subsequent transfer into BALB/c mice will lead to protection of these mice against infection with L. major promastigotes only if the membranous fraction is used as vaccine. More, this vaccine formulation takes advantage of easy storage at -80°C with no need of fresh production. This clearly demonstrates that the immunity-inducing principle of disrupted DC-based vaccination lies within the membrane enclosed fraction. On a molecular level, disrupted antigen-loaded DC induce Th1-related cytokines during vaccination and as response on pathogen encounter. In vivo assays revealed IL-12 production and antigen-specific T cell proliferation among splenocytes that were stimulated with disrupted antigen-loaded DC. Splenocytes of accordingly vaccinated mice produce tremendous amounts of IFNγ after stimulation with Leishmania parasites. In summary, disrupted antigen-loaded BMDC fulfil all characteristics of DC-based vaccination against Leishmania major. But, while purification of membranes of antigen-loaded DC and subsequent transfer to BALB/c mice leads to control of the disease in the animal model, only slight levels of Th1-related cytokines are seen in the in vivo assays. Whether this points towards a loss of vaccine activity on unseen levels or unknown sites where Th1-related immunity is induced by both, complete solution and purified membranes, still has to be determined.
KW  - Leishmania major
KW  - Immunsystem
KW  - Impfung
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Makrophage
KW  - Interferon <gamma->
KW  - Interleukin 12
KW  - Leishmania
KW  - Immunologie
KW  - Dendritic cell
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74865
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reinhart, Michael Christian
T1  - Enhancing mucosal B cell responses with all-\(trans\) retinoic acid
T1  - Verstärkung der humoralen Immunantwort an mukosalen Oberflächen mittels all-\(trans\) Retinsäure
N2  - Diarrheal diseases are a major cause of death in developing countries. Vaccinating against the causative pathogens could reduce mortality and morbidity in these countries. Unfortunately, only for some of the most common enteral pathogens are vaccines available. Some of these available vaccines have limitations in terms of effectiveness and duration of protection. There is therefore an urgent need to develop new vaccine strategies that can generate protection against enteral pathogens. 
The presence of all-trans retinoic acid (ATRA) during lymphocyte maturation is known to imprint a phenotype on lymphocytes that enables them to home to the intestines. Additionally, ATRA is known to play a role in B cell class switch to IgA, which is the dominant immunoglobulin in the intestines. 
The aim of this study was therefore to investigate whether the addition of all-trans retinoic acid (ATRA) or a retinoic acid receptor agonist (AM80) to a parenteral vaccination could provide protection at the intestinal mucosa against enteric pathogens. 
C57BL/6 mice received s.c. priming and boosting immunizations with Ovalbumin followed by several s.c. injections with either ATRA, AM80 or the respective solvent as control substance. Feces, serum, saliva and vaginal lavage samples were collected and analyzed by ELISA for detection and relative quantification of antigen-specific antibodies. B cell populations in the draining lymph nodes were investigated after immunization using flow-cytometry. Antigen-specific antibodies producing cells were visualized in the small intestine of vaccinated animals using two-photon microscopy. 
Animals that were vaccinated and were exposed to AM80, and to a lesser extent ATRA exposed mice, had higher serum, fecal, saliva and vaginal lavage antigen-specific IgA titers when compared to animals that were vaccinated but did not receive ATRA/AM80. Antigen-specific IgG titers were not altered in any of the investigated tissues. In the draining lymph nodes, IgA+ and IgG+ B cells were increased after vaccination and AM80 exposure at several time points within 14 days after vaccination. Antigen-specific IgA+ cells were found in the small intestine of immunized and AM80-exposed but not control substance-exposed mice. 
These results suggest that the addition of ATRA or AM80 to parenteral vaccine formulations increases the abundance of antigen-specific antibodies at mucosal surfaces, and therefore have the potential to generate protective antibody titers at those mucosal surfaces.
N2  - In Entwicklungsländern sind Durchfallerkrankungen noch heute eine Haupttodesursache. Impfungen gegen die Erreger dieser Erkrankungen könnten dort Morbidität und Mortalität reduzieren. Jedoch sind nicht einmal für alle der häufigsten Erreger von Durchfallerkrankungen weltweit Impfstoffe verfügbar. Zudem gibt es bei einigen verfügbaren Impfstoffen Einschränkungen bezüglich Dauer des Impfschutzes und Effektivität der Impfung.
Es ist bekannt, dass die Anwesenheit von all-trans Retinsäure (auch Tretinoin oder ATRA) während der Lymphozytenreifung einen intestinalen Phänotyp vermittelt. Weiterhin spielt ATRA eine Rolle beim Ig-Klassenwechsel der B-Lymphozyten zu IgA, dem dominanten Immunglobulin im Gastrointestinaltrakt.
Ziel dieser Arbeit ist es, herauszufinden ob der Zusatz von ATRA oder eines Agonisten des Retinsäurerezeptors (AM80) zu parenteral applizierten Impfungen einen Impfschutz gegen Erreger im Verdauungstrakt aufbauen kann.
C57BL/6 Mäuse erhielten eine subkutane Impfung mit Ovalbumin sowie zeitlich versetzt eine subkutane Booster-Impfung. Außerdem wurden mehrere Injektionen mit ATRA oder AM80 oder den jeweiligen Lösungsmitteln als Kontrollsubstanzen durchgeführt. Kot-, Serum-, Speichelproben und Proben vaginaler Spülung wurden mittels ELISA auf Antigen-spezifische Antikörper untersucht. Außerdem wurden die die Impfstelle drainierenden Lymphknoten hinsichtlich Ihrer B-Lymphozyten Populationen mittels Durchflusszytometrie untersucht. Weiterhin wurden Zellen, die Impfantigen-spezifische Antikörper produzieren, im Dünndarm geimpfter Tiere mittels Zwei-Photonen-Mikroskopie dargestellt.
Es konnte gezeigt werden, dass die Tiere, die neben dem Impfantigen auch AM80 oder ATRA subkutan erhielten, sowohl in Kot-, Serum- und Speichelproben, als auch in Proben vaginaler Spülung höhere Impfantigen-spezifische IgA-Titer aufwiesen als Kontrolltiere, welche anstatt AM80 oder ATRA nur das jeweilige Lösungsmittel erhielten. Hingegen wurde zwischen den Experimentalgruppen kein Unterschied in den Impfantigen-spezifischen IgG-Titern festgestellt. In den die Impfstelle drainierenden Lymphknoten konnte ein relativer und absoluter Anstieg der IgA+ und IgG+ B-Lymphozyten nach Impfung und subkutanen Gaben von AM80 im Vergleich zu Kontrolltieren festgestellt werden. Im Dünndarm geimpfter Tiere, die auch subkutan AM80 erhielten, konnten Impfantigen-spezifische IgA+ Zellen festgestellt werden.
Die hier vorgestellten Ergebnisse weisen darauf hin, dass der Zusatz von AM80 oder ATRA zu parenteral applizierten Impfungen zu erhöhten Titern von Impfantigen-spezifischem IgA auf mukosalen Oberflächen führt. Diese Antikörper können potentiell eine protektive Funktion im Rahmen von Durchfallerkrankungen oder anderen Erkrankungen mit mukosalem Infektionsfokus ausüben.
KW  - Impfung
KW  - ATRA
KW  - mukosale Immunantwort
Y1  - 2022
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-292920
ER  -