TY - THES A1 - Urlaub, Jonas T1 - Development of analytical methods for the quality assessment of mineral oil based excipients and mechanochemically stressed active pharmaceutical ingredients T1 - Entwicklung analytischer Methoden für die Qualitätsbeurteilung mineralölbasierter Hilfsstoffe und mechanochemisch gestresster Arzneistoffe N2 - For the quality assurance of substances for pharmaceutical use, a variety of analytical techniques are available to address specific analytical problems. In this field of application, liquid chromatography (LC) stands out as the gold standard in the pharmaceutical industry. Various detectors can be employed, which are e.g. based on UV/Vis spectroscopy for the examination of molecules with a chromophore, or mass spectrometry (MS) for structural elucidation of analytes. For the separation of enantiomers, the use of capillary electrophoresis (CE) may be more favorable due to the high separation efficiency and easy-to-use and comparatively inexpensive chiral selectors, in contrast to chiral columns for LC, which are usually very expensive and limited to a restricted number of analytes. For structure elucidation in impurity profiling, one- and multidimensional 1H NMR spectroscopy is a valuable tool as long as the analyte molecule has got nuclei that can be detected, which applies for the magnitude of organic pharmaceutical substances. For the evaluation of the amount of mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH) in various paraffin samples from different suppliers, a straightforward method based on 1H NMR spectroscopy was elaborated. The MOAH/MOSH ratio was used to indicate the amount of MOAH of paraffins and to evaluate the extent of refining. In addition, a representative paraffin sample was measured without sample solvent at high temperatures (about 340 K) to avoid the interfering residual solvent signals in the spectral regions of interest. The results of both methods were in good accordance. Moreover, the 1H NMR results were complemented with the UV measurements from the purity testing of paraffins according to the DAB 8. Correlations of the NMR and UV spectroscopic data indicated a linear relationship of both methods for the determination of MOAH in paraffins. Finally, the 1H NMR data was evaluated by principal component analysis (PCA) to explore differences within the paraffin samples and the spectral regions in the 1H NMR spectrum which are responsible for the formation of groups. It could be found that most variation is due to the MOSH of the paraffins. The PCA model was capable of differentiating between soft, liquid and solid paraffins on the one hand and between natural and synthetic liquid paraffins on the other hand. The impurity profiling of L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium (A2PMg) was performed by means of one- and two-dimensional NMR spectroscopy. Several ethylated impurities could be detected, which were likely to be formed during synthesis of A2PMg. The structures of two of the ethylated impurities were identified as ascorbic acid 2-phosphate ethyl ester and ethanol, (residual solvent from synthesis). NMR spectroscopic studies of the fractions obtained from preparative HPLC of A2PMg revealed two additional impurities, which were identified as phosphorylated derivatives of ascorbic acid, ascorbic acid 3,5-phosphate and ascorbic acid 5-phosphate. Solid state mechanochemistry as an alternative approach for stress testing was applied on the drug substances S-Ibuprofen (Ibu) and Clopidogrel (CLP) using a ball mill, in order to study their degradation profile: First, the isomerization of S-Ibu was investigated, which was stressed in the solid state applying several milling frequencies and durations under basic, acidic and neutral conditions. For the separation of Ibu enantiomers, a chiral CE method was developed and validated according to ICH Q2(R1). It was found that S-Ibu is overall very stable to isomerization; it shows minor conversion into the R-enantiomer under basic environment applying long milling times and high frequencies. Last, the degradation profile of clopidogrel hydrogen sulfate (CLP) was investigated, which was stressed in the solid state under various oxidative conditions. An already existing HPLC-UV method was adjusted to sufficiently separate the degradation products, which were characterized by means of UV and MS/(MS) detection. Most of the degradation products identified were already reported to result from conventional CLP stress tests. The degradation profile of CLP was mainly influenced by the material of the milling jar and the type of catalyst used. N2 - Für die Qualitätssicherung von Arznei- und Hilfsstoffen steht eine Vielzahl von analytischen Techniken für spezifische analytische Fragestellungen zur Verfügung. In der pharmazeutischen Industrie hat sich dabei die Flüssigkeitschromatographie als Goldstandard etabliert. Es können verschiedene Detektoren eingesetzt werden, die z. B. auf UV/Vis-Spektroskopie zur Untersuchung von Molekülen mit einem Chromophor oder auf Massenspektrometrie zur Strukturaufklärung von Analyten basieren. Für die Trennung von Enantiomeren kann die Verwendung von Kapillarelektrophorese aufgrund der hohen Trenneffizienz und der einfach zu handhabenden und vergleichsweise preiswerten chiralen Selektoren gegenüber chiralen Säulen in der Flüssigchromatographie bevorzugt sein, die in der Regel sehr teuer und auf eine begrenzte Anzahl von Analyten beschränkt sind. Für die Strukturaufklärung im Rahmen der Erstellung von Verunreinigungsprofilen ist die ein- und mehrdimensionale 1H-NMR-Spektroskopie eine sehr wertvolle Methode, solange das Analytmolekül Kerne besitzt, die der NMR-Spektroskopie zugänglich sind, was für den Großteil der organischen Arznei- und Hilfsstoffe zutrifft. Um die Menge an „mineral oil aromatic hydrocarbons (MOAH)“ in verschiedenen Paraffinproben von unterschiedlichen Herstellern zu bestimmen, wurde eine einfache 1H-NMR-Spektroskopie-Methode erarbeitet. Das Verhältnis von MOAH zu „mineral oil saturated hydrocarbons (MOSH)“ wurde dazu verwendet, um die Menge der MOAH in Paraffinen zu bestimmen und ihren Raffinationsgrad zu beurteilen. Zusätzlich wurde eine repräsentative Paraffinprobe ohne Probenlösungsmittel bei hohen Temperaturen (ca. 340 K) vermessen, um die interferierenden Restlösemittel Signale in den relevanten Spektralbereichen zu vermeiden. Die Ergebnisse beider Methoden stimmten gut überein. Weiterhin wurden die 1H-NMR-Ergebnisse durch die UV-Messungen aus der Reinheitsprüfung von Paraffinen gemäß DAB 8 ergänzt. Korrelationen der NMR- und UV-spektroskopischen Daten wiesen auf eine lineare Beziehung beider Methoden für die Bestimmung der MOAH in Paraffinen hin. Schließlich wurden die 1H-NMR-spektroskopischen Daten mittels Hauptkomponentenanalyse ausgewertet, um Unterschiede innerhalb der Paraffinproben und die für die Gruppenbildung verantwortlichen Spektralbereiche im 1H-NMR-Spektrum zu ermitteln. Es konnte festgestellt werden, dass der Hauptanteil der Varianz auf die MOSH zurückzuführen ist. Das PCA-Modell war dazu in der Lage, zwischen weichen, flüssigen und festen Paraffinen einerseits und zwischen natürlichen und synthetischen flüssigen Paraffinen andererseits zu unterscheiden. Das Verunreinigungsprofil von L-Ascorbinsäure-2-phosphat-Magnesium (A2PMg) wurde mittels ein- und zweidimensionaler NMR-Spektroskopie untersucht. Es konnten mehrere ethylierte Verunreinigungen nachgewiesen werden, die vermutlich während des Syntheseprozesses von A2PMg gebildet wurden. Die Strukturen von zwei der ethylierten Verunreinigungen wurden als Ascorbinsäure-2-phosphat ethylester und Ethanol (Restlösungsmittel aus der Synthese) identifiziert. NMR spektroskopische Untersuchungen der aus der präparativen HPLC von A2PMg erhaltenen Fraktionen ergab zwei weitere Verunreinigungen, die als phosphorylierte Derivate von Ascorbinsäure, Ascorbinsäure-3,5-phosphat und Ascorbinsäure-5-phosphat, identifiziert wurden. Die Festkörper-Mechanochemie als alternativer Ansatz für Stresstests wurde auf die Arzneistoffe S-Ibuprofen und Clopidogrel unter Einsatz einer Kugelmühle angewandt, um deren Abbauprofil zu analysieren: Zunächst wurde die Isomerisierung von S-Ibuprofen (Ibu) untersucht, das im festen Zustand unter Anwendung verschiedener Mahlfrequenzen und -dauern unter basischen, sauren und neutralen Bedingungen gestresst wurde. Für die Trennung der Ibu-Enantiomere wurde eine chirale Kapillarelektrophorese-Methode entwickelt und gemäß ICH Q2(R1) Leitlinie validiert. Es wurde festgestellt, dass S-Ibu insgesamt sehr stabil gegenüber Isomerisierung ist, jedoch unter basischen Bedingungen und hohen Mahldauern und -frequenzen eine geringe Umwandlung in das R-Enantiomer zeigt. Zuletzt wurde das Abbauprofil von Clopidogrelhydrogensulfat (CLP) untersucht, das im festen Zustand unter oxidativen Bedingungen gestresst wurde. Eine bereits bestehende HPLC-UV Methode wurde optimiert, um die Abbauprodukte ausreichend zu trennen und anschließend mittels UV- und MS/(MS)-Detektion zu charakterisieren. Die meisten der identifizierten Abbauprodukte waren bereits aus konventionellen CLP-Stresstests bekannt. Das Abbauprofil von CLP wurde hauptsächlich durch das Material der Kugelmühle und den Typ des verwendeten Katalysators beeinflusst. KW - HPLC KW - Kapillarelektrophorese KW - NMR-Spektroskopie KW - Paraffin KW - Verunreinigung KW - NMR spectroscopy KW - capillary electrophoresis KW - liquid chromatography KW - paraffins KW - mechanochemical degradation KW - impurities Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-243465 ER - TY - THES A1 - Volpp, Miriam T1 - Bestimmung der Plasmaproteinbindung von niedrig affinen Liganden am Beispiel der Ephedra-Alkaloide T1 - Determination of plasma protein binding of low-affinity ligands using Ephedra alkaloids as an example N2 - Zur Bestimmung der Bindungsaffinität von Liganden zu den Plasmaproteinen, insbesondere Albumin, wurden über die Jahre zahlreiche Methoden entwickelt. Die Grundlage dieser Arbeit war die Bestimmung der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide unter Verwendung einzelner dieser etablierten Methoden. Aufgrund ihres Anwendungsgebiets als Notfallmedikation bei Anästhesie-bedingter Hypotonie und den damit verbundenen Anforderungen an die Pharmakokinetik, sollten die Ephedra-Alkaloide niedrig-affine Liganden der Plasmaproteine darstellen. In der Literatur und in vorhergehenden Arbeiten wurden für die Ephedra-Alkaloide jedoch sehr unterschiedliche, teilweise der Indikation widersprechende Affinitäten bestimmt. Daher sollte im Rahmen dieser Arbeit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide weiter untersucht und die Affinität zu Albumin bzw. anderen Plasmaproteinen im humanen Serum bestimmt werden. Neben der Affinität sollte auch die Stereoselektivität der Bindung genauer betrachtet werden, die bei der Bindung vieler Wirkstoffe eine Rolle spielt. Als Referenzmethode diente die kontinuierliche Ultrafiltration, die auch schon bei Hörst verwendet wurde. Folgende Schlussfolgerungen konnten aus den Ergebnissen dieser Arbeit gezogen werden: 1) Die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration zeigten, dass die Ephedra-Alkaloide, Ephedrin und Pseudoephedrin, ein nur geringes Ausmaß an Plasmaprotein-bindung von 4 – 9 % gegenüber bovinem und humanem Serumalbumin zeigen. Eine deutlich höhere Plasmaproteinbindung von 19 – 37 % konnte hingegen bei der Verwendung von humanem Serum bestimmt werden. Die Affinität von Pseudoephedrin war dabei jeweils geringer als die von Ephedrin. 2) Diese Ergebnisse mit humanem Serum und die Tatsache, dass Albumin vorwiegend saure Stoffe bindet, legen nahe, dass die Ephedra-Alkaloide vermehrt an andere Plasmaproteine in Serum binden. Erste Messergebnisse mit saurem α1 Glykoprotein bestätigen diese Vermutung. 3) Eine Stereoselektivität konnte nur in geringem Maß bei (+) Ephedrin beobachtet werden, wobei der Unterschied nur im Serum signifikant ist. Pseudoephedrin dagegen zeigte keinerlei Stereoselektivität. Diese Beobachtung passt zu den Schlussfolgerungen der Pfeiffer‘schen Regel zur Stereoselektivität einer Bindung. 4) Andere Sympathomimetika mit einer zusätzlichen Phenolgruppe im Molekül zeigen eine ähnlich niedrige Affinität zu Albumin von ca. 10 %. Eine zusätzliche Phenolgruppe scheint die sauren Eigenschaften des Liganden nicht ausreichend zu erhöhen, um die Affinität zu Albumin signifikant zu steigern. 5) Das tertiäre Kohlenstoffatom am Stickstoff des Ephedrins scheint in gewisser Weise an der Bindung zu Albumin beteiligt zu sein. Sympathomimetika mit einer zusätzlichen Methylgruppe an diesem Kohlenstoffatom, wie Ephedrin, Pseudoephedrin und Oxilofrin, zeigen eine größere Streuung der Messergebnisse. Eine zusätzliche Methylgruppe in dieser Position scheint die Bindung daher sterisch zu hindern. 6) Die Ergebnisse der diskontinuierlichen Ultrafiltration bestätigen weitestgehend die Ergebnisse der kontinuierlichen Ultrafiltration 7) Eine Bestimmung des Ausmaßes der Plasmaproteinbindung von niedrig-affinen Stoffen ist mit den anderen orthogonalen Methoden ACE, NMR und iTC nicht möglich. Diese drei verwendeten Methoden trennen nicht wie die klassischen Methoden den gebundenen vom ungebundenen Wirkstoff, sondern beruhen auf einer Veränderung bestimmter Messparameter: bei der ACE die Migrationszeit, bei der NMR-Spektroskopie die chemische Verschiebung der Signale bzw. der Diffusionskoeffizient und bei der iTC die frei werdende Bindungswärme. Bei allen drei Methoden war die Änderung der Messgröße aufgrund der niedrigen Plasmaproteinbindung zu gering, um auswertbar zu sein. 8) Eine Störgröße bei die orthogonalen Methoden war vielfach auch das Albumin selbst bzw. dessen Eigenschaften. Bei der Affinitäts-Kapillarelektrophorese sind physiologische HSA-Konzentrationen wegen des starken Basislinienrauschens nicht messbar. Zudem bewirkt der Albuminzusatz im Trennpuffer eine Viskositätsänderung, die den EOF verlangsamt und so die Messung stört. Bei der NMR-Spektroskopie können wegen der Überlagerung der Signale durch die breiten Albuminbanden weder Veränderungen in der chemischen Verschiebung noch des Diffusionskoeffizienten zuverlässig bestimmt werden. In der iTC erschwerte die Schaumbildung der Lösung, die durch die Oberflächenaktivität des Albumins verursacht wird, die Messung. In dieser Arbeit konnte somit das Ausmaß der Plasmaproteinbindung der Ephedra-Alkaloide mit verschiedenen Methoden erfolgreich bestimmt werden. Damit bestätigte diese Arbeit, dass die Ephedra-Alkaloide, wie deren Indikation vermuten lässt, zu den niedrig affinen Liganden des Albumins zählen. Um genauer eingrenzen zu können durch welche Plasmaproteine im Blutserum die Ephedra-Alkaloide transportiert werden, sollten die Untersuchungen zum sauren α1-Glykoprotein fortgesetzt und gegebenenfalls durch weitere Bestimmungen mit anderen Plasmaproteinen ergänzt werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit haben auch gezeigt, dass viele der unzähligen Methoden zur Untersuchung der Plasmaproteinbindung bei der Bestimmung von niedrig affinen Liganden ihre Grenzen haben. Nach wie vor sind zur Bestimmung einer niedrigen Bindungsaffinität weiterhin die klassischen Methoden, wie die kontinuierliche Ultrafiltration, Mittel der Wahl. Nicht zuletzt deshalb erfreuen sich diese Methoden auch heute noch großer Beliebtheit. N2 - Over the years many methods have been developed to determine the binding affinity of ligands towards the plasma proteins, especially to albumin. The focus of this thesis was the determination of the plasma protein binding of the Ephedra alkaloids using several of those long established methods. Due to their application as emergency drugs for anaesthetic induced hypotension and the associated demands on pharmacokinetics, Ephedra alkaloids should display a low binding affinity towards plasma proteins. Yet in literature and in previous studies the Ephedra alkaloids showed a great variety of binding affinities, in parts even contradictory to their indication. Therefore the Ephedra alkaloids’ extent of plasma protein binding was further examined and the affinity towards albumin and other plasma proteins in human serum determined in the course of this study. Next to its affinity the bindings’ stereoselectivity was analysed as well, playing an important role in the binding of many drugs. The continuous ultrafiltration served as a reference method formerly also used by Hörst. The following conclusions can be drawn from the results of this study: 1. The results of the continuous ultrafiltration experiments show that the Ephedra alkaloids, ephedrine and pseudoephedrine, only have a low extent of 4 – 9 % of plasma protein binding towards bovine and human serum albumin. However using human serum a significantly higher plasma protein binding of 19 – 37 % can be measured. The affinity of pseudoephedrine was lower than ephedrine each time. 2. These results with human serum and the fact that albumin mainly binds acidic substances leads to the conclusion that Ephedra alkaloids principally bind to other plasma proteins in serum. First findings with α1 acid glycoprotein corroborate this hypothesis. 3. A minor stereoselectivity was observed only for (+) ephedrine, although the difference was merely significant in human serum. Pseudoephedrine on the other hand didn’t display any kind of stereoselectivity. These observations coincide with the reasoning of Pfeiffer’s rule regarding the stereoselectivity of binding. 4. Other sympathomimetics with an additional phenolic group in the molecule demonstrate a similar low binding affinity towards albumin of approx. 10 %. An additional phenolic group doesn’t seem to elevate the acidity of the ligand sufficiently in order to increase the affinity towards albumin significantly. 5. The tertiary carbon atom bound to the nitrogen in ephedrine appears to be involved in the binding to albumin in some way. Measured results display a higher variance for sympathomimetics with an additional methyl group in this position like ephedrine, pseudoephedrine and oxilofrine. The additional methyl group seems to hinder the binding sterically. 6. The results of the discontinuous ultrafiltration confirm the results of the continuous ultrafiltration experiments for most parts. 7. The determination of the extent of plasma protein binding is not feasible with the other orthogonal methods ACE, NMR and iTC for low affinity ligands. Those three methods don’t rely on the separation of bound and unbound drug as the classical methods do. Instead they are based on the alteration of certain measuring parameters: for the ACE it’s the migration time, in NMR spectroscopy it’s the chemical shift or the diffusion coefficient and using iTC it’s the released binding heat. For all three methods the change of those parameters was too low to be evaluable. 8. One disturbance with the orthogonal methods was often albumin itself or its properties. In affinity capillary electrophoresis physiological HSA concentrations are not measureable due to the high background noise caused by albumin. Furthermore the addition of albumin in the background electrolyte leads to a change in viscosity, slowing the EOF and thus falsifying the measurement. Using NMR spectroscopy neither changes in the chemical shift nor the diffusion coefficient can be reliably determined due to overlap of the albumin and ligand signals. During iTC experiments the foaming of the solution caused by the surface activity of albumin itself hinders the measurement. In summary the extent of plasma protein binding was successfully determined for the Ephedra alkaloids using different measuring techniques. Thereby this study confirmed that the Ephedra alkaloids are low affinity ligands of albumin as was suggested by their current use in drug therapy. To narrow down by which plasma proteins the Ephedra alkaloids are transported in serum further analysis with α1 acid glycoprotein and if applicable with other plasma proteins is necessary. The results of this study also show that countless methods for determining the extent of plasma protein binding fail to produce reliable results for low affinity ligands. After all the classical methods such as continuous ultrafiltration are still the methods of choice when it comes to determine low affinity binding. If nothing else this is the reason why those methods are still so popular to date. KW - Proteinbindung KW - Plasmaproteine KW - Serumalbumine KW - Ultrafiltration KW - Ephedrin KW - Kapillarelektrophorese Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219619 ER -