TY - THES A1 - Derrer, Carmen T1 - Biophysikalische Aufschlüsselung des Transportzyklus von ZmSUT1, einem H+/Saccharose Symporter aus Mais T1 - Biophysical analysis of the transport cycle of ZmSUT1, a H+/sucrose symporter from maize N2 - Die Mesophyllzellen vollentwickelter Blätter stellen den Hauptort der Photosynthese höherer Pflanzen dar. Diese autotrophen Zellen (source-Gewebe) produzieren einen Überschuss an Kohlenstoff-Assimilaten, die für die Versorgung anderer heterotropher Gewebe und Organe, wie z.B. Früchten oder Wurzeln (sink-Gewebe), genutzt werden. Das Langstrecken-Transportsystem höherer Pflanzen, das Phloem, transportiert die Photoassimilate durch den gesamten Pflanzenkörper. Der zwischen source- und sink-Geweben herrschende hydrostatische Druckunterschied wird von osmotisch aktiven Substanzen generiert und treibt den Massenstrom in diesem Gefäßsystem an. Der nicht-reduzierende Zucker Saccharose stellt in den meisten höheren Pflanzen die Haupttransportform der photosynthetisch hergestellten Kohlenstoffverbindungen im Phloem dar. Protonen-gekoppelte Saccharosetransporter reichern Saccharose im Phloemgewebe mit einer 1000-fach höheren Konzentration (bis zu 1M), verglichen zum extrazellulären Raum, an. Aufgrund dieser einzigartigen Fähigkeit üben diese Carrier eine essentielle Rolle in der Phloembeladung aus und gewährleisten so die Versorgung der gesamten Pflanze mit Photoassimilaten. Saccharosetransporter können diese Energie-aufwändige Aufgabe nur durch eine enge Kopplung des zeitgleichen Transports von Saccharose und Protonen bewerkstelligen. Molekulare Einblicke in diesen physiologisch außerordentlich wichtigen Prozess der Zuckertranslokation sind jedoch bis heute immer noch sehr lückenhaft. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Saccharosetransporter ZmSUT1 aus Mais im heterologen Expressionssystem der Xenopus Oozyten exprimiert. ZmSUT1 generiert in Oozyten ungewöhnlich hohe Ströme im µA-Bereich, was diesen Zuckertransporter für präzise elektrophysiologische Messungen geradezu prädestiniert. Erste elektrophysiologische Messungen zur Substratspezifität zeigten, dass der synthetische Süßstoff Sucralose kein Substrat für ZmSUT1 darstellt. Darüber hinaus gelang es, Sucralose als kompetitiven Inhibitor der Saccharose-induzierten Transportströme von ZmSUT1 zu identifizieren. Die Verwendung dieses Saccharose-Derivats ermöglichte es, den Transportmechanismus in einzelne Schritte zu zerlegen und diese zu quantifizieren. Durch hochauflösende elektrophysiologische Messungen konnten transiente Ströme in der Abwesenheit jeglichen Substrats detektiert werden, die jedoch in der Anwesenheit sättigender Saccharosekonzentrationen erloschen. Diese sogenannten presteady-state Ströme (Ipre) zeichneten sich durch eine schnelle und eine langsame Komponente in der Relaxationskinetik der Ströme aus. Ipre konnten mit dem Binden der Protonen an den Transporter innerhalb des elektrischen Feldes der Membran in Verbindung gebracht werden. Somit führte die Analyse der presteady-state Ströme zur Aufklärung des ersten Schritts - dem Binden der Protonen - im Transportzyklus von ZmSUT1. Interessanterweise reduzierte der kompetitive Inhibitor Sucralose die langsame Komponente der presteady-state Ströme in Abhängigkeit von der Sucralosekonzentration, während die schnelle Komponente von Ipre unbeeinflusst blieb. Um dieses Verhalten erklären zu können und einen weiteren Schritt im Transportzyklus von ZmSUT1 zu studieren, wurde die Methode der Spannungsklemmen-Fluorometrie zur Untersuchung der Konformationsänderung von ZmSUT1 etabliert. Tatsächlich gelang es, zum ersten Mal die intramolekulare Bewegung eines pflanzlichen Transportproteins zu visualisieren. Detaillierte Analysen zeigten, dass die Konformationsänderungen von ZmSUT1, unabhängig von Saccharose, mit einer schwachen pH-Abhängigkeit auftraten. Interessanterweise wurde die Beweglichkeit des Transporters durch die Applikation des kompetitiven Inhibitors Sucralose deutlich reduziert. Dieser Effekt deutet, zusammen mit dem Sucralose-induzierten Verschwinden der langsamen Komponente der Ipre darauf hin, dass Sucralose den Transporter in seiner auswärts-gerichteten Konformation arretiert. Somit repräsentiert die Zugänglichkeit der extrazellulären Protonenbindestelle und folglich die Konformationsänderung den Geschwindigkeits-bestimmenden Schritt im Reaktionszyklus von ZmSUT1. Zusammenfassend gelang es in dieser Arbeit, das Binden der Protonen und den Zusammenhang mit der Bewegung des Proteins, von einer auswärts-gerichteten in eine einwärts-gerichtete Konformation, aufzuklären. Mit der Hilfe der Erkenntnisse aus dieser Arbeit konnte ein mechanistisches Modell für den Transportzyklus von ZmSUT1 entwickelt werden, anhand dessen alle Ergebnisse schlüssig erklärt und diskutiert werden konnten. N2 - Higher plants produce carbohydrates via photosynthesis in mesophyll cells of their leaves. These autotrophic cells export the excess of photoassimilates (source-tissue) to supply heterotrophic tissues, such as fruits and roots (sink-tissues), with carbon compounds. According to the Munch hypothesis, osmolytes generate the hydrostatic pressure difference between the source- and sink-tissues that drives the mass flow within the phloem vasculature. In most higher plants the non-reducing disaccharide sucrose represents the main mobile carbohydrate. Proton-driven sucrose transporter play a pivotal role in loading the phloem vessels for long distance transport of sucrose throughout the entire plant body. The strongly hyperpolarized plant membrane potential and the exceptional ability of sucrose carriers to accumulate sucrose quantities of more than 1 M in phloem cells, indicate that plants evolved transporters with unique functional properties. The transporter protein can achieve this task only because proton and sucrose transport are tightly coupled to each other. The knowledge about individual steps in the transport cycle of sucrose carriers is, however, still fragmentary. Within the scope of this work, the sucrose transporter ZmSUT1 from maize was expressed in the heterologous expression system of Xenopus oocytes. ZmSUT1 was found to mediate sucrose-induced proton currents in the µA range, predestinating this carrier for precise electrophysiological measurements of kinetic parameters in Xenopus oocytes. A basic electrophysiological characterization revealed that ZmSUT1 do not transport the synthetic sweetener sucralose but is competitively inhibited by this sucrose derivate. Having this tool in hands, individual steps of the ZmSUT1 transport cycle were dissected and quantified with sophisticated electrophysiological and fluorescence-based methods. Thereby transient currents in the absence of any substrate, which disappeared in the presence of saturating sucrose quantities, could be measured. These so-called presteady-state currents were composed of a fast and a slowly decaying current component and could be associated with the binding of protons to a binding site at the transporter within the electrical field of the membrane. Thus, the study of presteady-state currents allowed us to individually characterize the first step in the transport cycle of ZmSUT1 – the binding of protons to ZmSUT1. Interestingly, the slow current component disappeared in the presence of the competitive inhibitor sucralose. To understand this behavior and to elucidate conformational rearrangements within the carrier associated with the transport of sucrose, we visualized movements of ZmSUT1 using the voltage clamp fluorometry technique. Indeed, we for the first time were able to monitor conformational changes of a plant transport protein. Detailed analysis revealed that conformational changes of ZmSUT1 occur in the absence as well as in the presence of its substrate. However, upon application of the inhibitor sucralose the movements of the ZmSUT1 proteins were markedly reduced. This fact, taken together with the disappearance of the slow presteady-state component, let us conclude that sucralose seem to lock ZmSUT1 in its outward-facing conformation. The rate-limiting step of the reaction cycle is determined by the accessibility of the extracellular proton binding site and thus by conformational changes of the ZmSUT1 protein. Taken together our studies resolved the first step in the reaction cycle of a plant sucrose transporter - the binding of protons to the carrier - and its interrelationship with the alternating movement of the protein. Based on these results a mechanistic transport model of plant sucrose transporters was drawn and discussed. KW - Mais KW - Saccharose KW - Symport KW - ZmSUT1 KW - Transport KW - Saccharose KW - Spannungsklemmen-Fluorometrie KW - VCF KW - presteady-state Ströme KW - sucrose KW - transport KW - voltage clamp fluorometry KW - presteady-state Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78949 ER - TY - THES A1 - Wittek, Anke T1 - Vergleichende elektrophysiologische Untersuchungen zweier Saccharose/H +-Symporter, ZmSUT1 (Zea mays) und UmSrt1 (Ustilago maydis) T1 - Comparative electrophysiological studies of two suc/H+-symporter ZmSUT1 (Zea mays) and UmSrt1 (Ustilago maydis) N2 - Bei der Betrachtung des Pathosystems Ustilago maydis/Zea mays kommen sich Proteine unterschiedlicher Organismen sehr nahe. Die derzeitige Hypothese zur lokalen Szenerie in der ausgebildeten Interaktionszone von Pflanze und Pilz spricht zwei SUC-Transportern dabei wichtige Rollen in der Pflanze/Pilz Interaktion zu. UmSrt1, der erste beschriebene pilzliche SUC-Transporter aus dem Maispathogen Ustilago maydis (Wahl et al., 2010) und ZmSUT1, der aus Zea mays stammende low affinity SUC-Transporter (Carpaneto et al., 2005) werden als Gegenspieler im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC beschrieben (Wahl et al., 2010). ZmSUT1 ist in der Plasmamembran der Geleitzellen lokalisiert und dort für die Beladung des Phloems mit SUC aus dem Apoplasten zuständig. UmSrt1, für den eine Lokalisation in der Plasmamembran in Hefen gezeigt werden konnte, sorgt als „high affinity“ Transporter mit dem Import extrazellulärer SUC für die Kohlenhydratversorgung der pilzlichen Entwicklung und Ernährung (Wahl et al., 2010). Gegenstand der vorliegenden Arbeit waren vergleichende elektrophysiologische Charakterisierungen der SUC-Transporteigenschaften von ZmSUT1 und UmSrt1. Durch heterologe Expression der Proteine in Xenopus Oozyten und anschließende Messungen unter Verwendung der DEVC-Technik wurden die Eigenschaften des SUC-Transports beider SUC-Transporter im Hinblick auf ihre Konzentrations-, pH-, Spannungsabhängigkeit, sowie auf die Substratspezifität hin untersucht. Diese vergleichenden Studien zur Charakterisierung beider Transportproteine ergaben ihren physiologischen Aufgaben entsprechende Unterschiede. ZmSUT1 konnte ein Verhalten als „low affinity/high capacity“ Transporter mit Affinitäten gegenüber SUC im millimolaren Bereich mit einer spannungsunabhängigen Transportaktivität bestätigt werden. Zudem konnte die Transportaktivität als stark H+-abhängig beschrieben werden (Carpaneto et al., 2005), deren Optimum nahe des physiologischen Bereichs des Apoplasten bestimmt werden konnte. Des Weiteren wurden Untersuchungen zur Substratspezifität angefertigt, die ZmSUT1 eindeutig eine Typ-II SUT Zugehörigkeit (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010) mit einem engen Substratspektrum belegen. Für UmSrt1 dagegen wurde ein Transportverhalten als „high affinity/low capacity“ Transporter mit höheren Affinitäten gegenüber SUC im mikromolaren Bereich ermittelt (Wahl et al., 2010). Darüber hinaus beschreiben die Ergebnisse dieser Arbeit eine weitestgehend H+-unabhängige Transportaktivität in einem weiten pH-Wert Bereich. Im Profil der Substratspezifität zeigte sich neben SUC als primärem Substrat ein eher unspezifischer Transport weiterer Mono-, Di- und Trisaccharide. Die postulierte SUC-Spezifität von UmSrt1 (Wahl et al., 2010) konnte mit den vorliegenden Ergebnissen nicht bestätigt werden. Mit einem effektivem Import von SUC mittels UmSrt1 in den Pilz umgeht U. maydis die Hydrolyse von SUC im pflanzlichen Apoplasten und damit die Bildung extrazellulärer Glukose, die ein Signal in der pflanzlichen Pathogenabwehr darstellt (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). Somit scheint es für Ustillago maydis möglich zu sein, eine von der Wirtspflanze Zea mays weitestgehend „unbemerkte“ Aufnahme von Kohlenhydraten über einen breiten pH-Wert Bereich bewerkstelligen zu können. Die vielfach höheren Affinitäten gegenüber SUC und H+ verschaffen UmSrt1 im Konkurrenzkampf um die extrazelluläre SUC einen klaren Vorteil gegenüber ZmSUT1. Diese Daten deuten darauf hin, dass U. maydis auch unter Stressbedingungen der Pflanze und damit resultierenden Schwankungen der H+-Konzentrationen in der Lage ist, den SUC-Import für seine eigene Ernährung sicher zu stellen. Das Gebiet posttranslationaler Modifikationen von SUC-Transportern ist weitestgehend unerforscht. In planta Versuche deuteten darauf hin, dass Redox-aktive Substanzen den Zuckertransport beeinflussen. Im Oozytensystem wurde deshalb die Aktivität von ZmSUT1 in Anwesenheit der Redox-aktiven Substanzen GSH, GSSG, H2O2 und DTT getestet. Der geringfügige Einfluss dieser Substanzen auf SUC-induzierte Ströme von ZmSUT1 deuten jedoch darauf hin, dass SUC-Transporter nicht ein direktes Ziel von Redox-Veränderungen darstellen. Um die Struktur des pflanzlichen SUC-Transporters ZmSUT1 näher zu beleuchten und die an der Bindung von SUC involvierten Aminosäuren zu identifizieren, wurde auf der Basis der bereits bekannten Struktur von LacY aus E.coli, ebenfalls einem Vertreter der MFS, ein 3D-Modell für ZmSUT1 erstellt. Die AS, die in LacY an der Bindung des Substrats beteiligt sind, wurden bereits identifiziert (Vadyvaloo et al., 2006). Darauf aufbauend wurden im Rahmen einer Mutagenesestudie gezielt AS im Protein ZmSUT1 ausgewählt, die in verwandten SUC-Transportern konserviert und in homolgen Positionen zu den in LacY bereits identifizierten AS vorliegen. In diesen ausgewählten Positionen wurden mittels gerichteter Mutagenese acht Mutanten generiert. Die elektrophysiologische Charakterisierung dieser ZmSUT1-Mutanten identifizierte zwei Mutanten, die in der SUC-/H+-Translokation gestört waren sowie zwei WT-ähnliche. Es konnten vier Mutanten mit erniedrigten Affinitäten gegenüber SUC identifiziert werden, von denen zwei zusätzlich Veränderungen in ihrer Substratspezifität aufweisen. Diese vier AS werden als mögliche Kandidaten angesehen, an der Bindung und/oder Translokation von SUC beteiligt zu sein. N2 - Within the Ustilago maydis/Zea mays pathosystem suc transport proteins of different organisms are coming close to each other and compete for sugar in the plant apoplast. It could be shown that two suc transport proteins play an important role in the plant/fungal interaction-zone. UmSrt1, the first described fungal suc-transporter of Ustilago maydis (Wahl et al., 2010), and ZmSUT1, a low affinity transporter from Zea mays (Carpaneto et al., 2005) are thought to have the role of opposing players in extracellular suc-transport (Wahl et al., 2010). ZmSUT1 is localized in the plasma membrane of companion cells and there it is responsible for loading the phloem with suc from the apoplast. The high affinity transporter UmSrt1, whose localization in the yeast plasma membrane has been shown, ensures the carbohydrate supply needed for fungal growth and development by importing extracellular suc (Wahl et al., 2010). The topic of this dissertation is an electrophysiological characterization of the suc-transport performance of ZmSUT1 and UmSrt1 in terms of concentration-, pH- and voltage-dependence as well as substrate specificity. These characterizations have been measured by the heterologous expression of the proteins in Xenopus oocytes and subsequent measurements via DEVC-technique. The results of these comparative studies characterize both transport proteins and present differences originating from their physiological responsibilities. ZmSUT1 was shown to be a „low affinity/high capacity“ transporter with affinities for suc and H+ in millimolar ranges and a voltage-independent transport activity. A strong H+-dependent transport activity had been shown by Carpaneto et al. (2005). This dissertation adds the finding that the optimum corresponds with the physiological environment of the apoplast. Further experiments regarding substrate specificity of ZmSUT1 have been conducted and show clearly that this protein belongs to the type-II SUT`s (Sivitz et al., 2005; Reinders et al., 2006; Sun et al., 2010; Sun et al., 2012) with a narrow spectrum of selectivity. On the other hand, for UmSrt1 a „high affinity/low capacity“ performance with values for suc affinity in micromolar ranges could be confirmed (Wahl et al., 2010). Furthermore the results of this dissertation show a H+-independent transport activity over a broad pH range. In addition to suc as the primary substrate, a broad substrate specificity involving mono-, di, and trisaccharides was shown for UmSrt1. The postulated high suc specificity for UmSrt1 (Wahl et al.) could not be confirmed. Efficient import of suc into the fungus, U. maydis seem to avoid extracellular glucose production by suc hydrolysis and therewith plant defence responses (Herbers et al., 1996b; Ehness et al., 1997; Kocal et al., 2008). For U. maydis it seems to be possible to import carbohydrates in an undetected way by UmSrt1 over a broad pH range. UmSrt1 exhibits high affinities for suc and H+, which leads to a more efficient transport of sugar compared to ZmSUT1. Thus U. maydis is able to import suc for its own feeding even under stress conditions when oscillating apoplastic H+-concentrations may occur. Up to now the posttranslational modifications of suc-transporters are nearly unexplored. In planta it was shown that redox-active substances reduce the sugar import markedly. To test whether suc-transporters are regulated by redox-active substances, such as GSH, GSSG, H2O2 and DTT, we expressed ZmSUT1 in oocytes and monitored its activity in response to the latter substances. Since ZmSUT1 activity was only weakly influenced by redox-active substances, the redox-status of plant cells seem not to regulate SUC-transporter directly. In order to examine the structure of the plant suc-transporter ZmSUT1 and further characterize the suc bindingsite by identification of involved amino acids, a 3-D model was prepared. The basis of the 3-D model was the known structure of LacY from E. coli, which also is an MFS-member. The amino acids, which in LacY are responsible for substrate binding, have already been identified (Vadyvaloo et al., 2006). According to the model, amino acids in homologous positions to those identified in LacY were selected for a mutagenesis study of ZmSUT1. Mutations were introduced in selected positions by targeted mutagenesis and eight mutants were generated. The results of electrophysiological characterization of the mutants showed two mutants with disturbance in suc-/H+-translocation and two others with a WT-like transport profile. Furthermore four mutants with modified affinity for suc have been identified. Whilst all of these four mutants show a lower affinity for suc, two of them additionally showed a modified profile in their substrate specificity. These four mutants are considered to be possible candidates regarding the involvement of theses amino acids in binding and translocation of suc. KW - Saccharose KW - corn KW - Mais KW - Ustilago zeae KW - sucrose KW - transporter KW - Stofftransport Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85279 ER - TY - THES A1 - Mumm, Patrick T1 - Elektrophysiologische Untersuchungen der Ionenflüsse und ihrer Regulation in Stomakomplex-bildenden Zellen von Zea mays und Schließzellen von Arabidopsis thaliana T1 - Electrophysiological analysis of ion fluxes and their regulation in stomatal cell of Zea mays and guard cells of Arabidopsis thaliana N2 - 1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenomme-nen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays gewonnen werden: a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-ähnliche Anionenkanäle identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkanäle der Schließzellen wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert. b. Darüber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-Elektroden-Technik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenläufige Polarisation des Membranpotentials während der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein zu Mais ähnliches Verhalten während der Stomabewegung zeigte und gegenläu-fig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein ähnli-ches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend. c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkali-sierung während der Licht-induzierten Stomaöffnung beobachtet, die bei Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zurückkehrte. d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen konnte ein Volumenverhältnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw. 1:4 bei geöffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden. Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewon-nenen Erkenntnisse schlüssig in ein Modell zur Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Neben- und Schließzellen während der Licht-induzierten Stomabewegung eingebunden werden. 2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließ-zellen in Patch-Clamp-Experimenten näher untersucht. Dabei waren die S-Typ-Anionenströme bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1-Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universität Würzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-Typ-Anionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 ko-diert für einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-ähnliche Anionenströme generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion dar-stellte oder den Chlorid-basierten Lösungen externes Nitrat zugegeben wurde, scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg für die Ent-lassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen. 3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkanäle in A. thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal ähnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsab¬hängigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabhängigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana nicht durch externes Malat beeinflusst. Jedoch war unter externen Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, während unter externen Sulfatbe¬dingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszu¬machen waren. ALMT12 scheint demnach für den Malat-aktivierten Teil des R-Typ-Anionenkanals verantwortlich zu sein. N2 - 1. Within this dissertation the following new insights into the coordinated ion transport between guard and subsidiary cells of Zea mays were gained: a. Using the patch clamp technique on subsidiary and guard cell protoplasts, S-type-like anion channels were identified in both cell types. In subsidiary cells they were inhibited by elevated cytosolic calcium con-centrations and stimulated by ABA and cytosolic alkalinization. In con-trast, the S-type-like guard cell anion channels were hardly influenced by alkalinization and stimulated upon a rise in the cytosolic free calcium level. b. Impaling of subsidiary cells in intact Zea mays plants with microeletrodes revealed a reversed membrane polarization during light-/darkness-induced stomatal movement. Since the membrane potential of Hordeum vulgare subsidiary cells showed a similar behavior that was, however, reversed in the surrounding guard cells during stomatal movement, a similar change in the membrane potential of Zea mays guard cells is most likely. c. Furthermore an alkalinization in Zea mays subsidiary cell could be moni-tored during light-induced stomatal opening, which returned to original values after stomatal closure. d. Based on reconstructed 3D-models of intact maize stomatal complexes, a volume ratio between guard cells and subsidiary cells of 1:6 and 1:4 of open and closed stomata, respectively, were estimated. The obtained results could be conclusively embedded in a model that decribes the shuttle transport of ions between guard and subsidiary cells during light-induced stomatal movement. 2. Patch clamp studies on guard cells of A. thaliana CPK23- and OST1-loss-of-function mutants showed strongly reduced S-type anion currents after stimula-tion through Ca2+ or ABA compared to wild type. These in vivo data support the results of the working group of Prof. R. Hedrich (University Würzburg), that OST1 and CPK23 are directly interacting with the S-type anion channel in A. thaliana. The SLAC1-homologue gene SLAH3 is encoding for a nitrate perme-able S-type anion channel in guard cells. Since SLAC1-loss-of-funtion mutants generate S type anion currents when nitrate is the dominating anion or nitrate is present in chloride-based solutions, SLAH3 seems to represent an alternative pathway for anion efflux in guard cells. 3. The R-type anion channels from Arabidopsis thaliana guard cells were electro-physiologically characterized and revealed similar electrical characteristics as those known from Vicia faba guard cells: strong voltage dependence, fast activa-tion- and deactivation kinetics. In contrast to Vicia faba, however, the voltage dependence was not modulated by external malate. But in the presence of exter-nal malate the current response in ALMT12-loss-of-function mutants was strongly reduced, while similar anion currents were monitored in wild type and almt12 mutant plants in the absence of external malate. These results indicate that ALMT12 is likely responsible for the malate-activating component of the R-type anion channel. KW - Schließzelle KW - Spaltöffnung KW - Anionentranslokator KW - Ackerschmalwand KW - Mais KW - Schließzellen KW - Stomata KW - Anionenkanäle KW - Arabidopsis KW - anion channel KW - guard cell KW - maize KW - arabidopsis KW - stomata Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49267 ER - TY - THES A1 - Kaufmann, Ilja T1 - Funktionelle NMR-Mikroskopie an Pflanzenwurzeln T1 - Functional MR imaging of plant roots N2 - Als nicht-invasive Methode bietet die magnetische Kernspinresonanztomographie durch ihre Vielzahl an messbaren Größen wie Wassergehalt und Flussgeschwindigkeiten gute Voraussetzungen, um funktionelle Abläufe in Pflanzen und insbesondere Pflanzenwurzeln zu untersuchen. Für funktionelle NMR-Mikroskopie notwendige Hardware und Methoden wurden in dieser Arbeit entwickelt und angewendet. Aufgrund der starken Suszeptibilitätsunterschiede in den Proben und der notwendigen Zeitauflösung für funktionelle Studien, lag das Hauptaugenmerk dabei auf Turbospinechomethoden (auch als RARE bekannt). Im Rahmen des Hardwareaufbaus wurde ein neuartiges, modulares Probenkopfkonzept entwickelt. Außerdem war es notwendig geeignete Probengefäße und Pflanzenhandlingsysteme zu entwerfen, die die Anbringung einer HF-Spule im Wurzelbereich erlauben. Für die Auswertung gemessener Parameterkarten wurde eine Software geschrieben, mit der interaktiv Mittelwerte entlang geschlossener Pfade berechnet werden können, angepasst an den grob radialsymmetrische Aufbau der Pflanzenwurzeln. Als Grundlage für biologische Aussagen anhand von T1-, T2- und Spindichtekarten wurden aus einer umfangreichen Literaturrecherche die bekannten Zusammenhänge zwischen diesen Parametern und physiologischen Größen zusammengestellt. Ergänzend wurde das Verhalten einer monoexponentiellen Beschreibung der Relaxation von mehr-Kompartimentsystemen und von deren Durchmischung untersucht. Eine Computersimulation der Diffusion zwischen Volumenschichten mit unterschiedlichen Relaxationszeiten wurde implementiert. Damit konnte gezeigt werden, dass die Reichweite der Durchmischung der messbaren Relaxationszeiten bei freier Diffusion abhängig ist von der Diffusionsweite, die nach der Einstein-Smoluchowski-Gleichung aus der jeweils lokalen Relaxationszeit resultiert. Damit ergibt sich eine grundsätzliche Limitierung der räumlichen Auflösung von Relaxationszeitkarten und auch des jeweiligen Relaxationszeitkontrastes in NMR-Bildern. Daneben erklärt der Effekt der durch Diffusion vermittelten Relaxation auch den hellen Ring, der in NMR-Bildern die Wurzeln in Nährlösung umgibt. Die hauptsächliche Anwendung der entwickelten Methodik auf biologische Fragestellungen bestand in der Untersuchung der Reaktion von Maiswurzeln auf Trockenstress. Erstmals konnten dabei im Rahmen dieser Arbeit Kavitationen der Wassersäule im Xylem von Wurzeln sowie deren Wiederbefüllung nach Wiederbewässerung der Pflanzen direkt beobachtet werden. Bei der weiteren systematischen Untersuchung zu Kavitationen gelang es auch, die bislang unbekannte Geschwindigkeit zu bestimmen (Größenordnung 1mm/min) mit der die kavitierten Bereiche von unten mit einer neuen Wassersäule gefüllt werden. Außerdem konnte mit Hilfe von Flussgeschwindigkeitskarten nachgewiesen werden, dass Gefäße mit Kavitationen nach der Wiederbefüllung ihre volle Funktionalität wiedererlangen können. Aus solchen Flusskarten konnte auch der Volumenfluss berechnet und z.B. mit der Transpirationsrate verglichen werden. Die gemessenen T1- und Spindichtekarten bieten viele Hinweise auf die Funktion der unterschiedlichen Gewebetypen der Wurzel während des Trockenstresses und bei der Wiederbefüllung. Insbesondere T1 erwies sich als aussagekräftiger Parameter für die Beurteilung von aufgetretenen Gewebeschäden. Als Grundlage für zukünftige Studien wurden verschiedene Messungen mit Kontrastmittel im Umgebungsmedium der Wurzeln durchgeführt, sowie eine 3D-Turbospinechosequenz implementiert, mit der auch die interne Struktur der Wurzeln und ihrer Verzweigungen dargestellt werden konnte. N2 - MR imaging methods allow the non-invasive determination of values such as flow velocity and water content. Therefore, these methods provide a perfect means for the in-vivo examination of plants together with their surrounding medium. It was the aim of this PhD thesis to develop necessary hardware and software methods for functional studies on plant roots. Because of the large susceptibility differences of these samples and to provide a sufficient time resolution for functional studies especially RARE sequences were used and optimized for the examination of roots. Corn plants were grown in specially designed glass tubes which provided a narrow part for the inclusion of an RF Helmholtz coil. A new, patented concept for modular MR probes was designed. It allows the construction of probes that are adapted to the needs of certain samples like climate chamber probes for plants, without the limitation caused by fixed frequencies for the RF channels. A method to average values of tissues that are composed of concentric layers, like corn roots, or exhibit radial value gradients was implemented. An intense literature research about the known dependency of T1 and T2 on physiologic aspects of plant tissue was performed, resulting in a compilation of relaxation influencing effects. This compilation serves as a basis for the interpretation of the biological experiments. Further theoretical considerations dealt with the effect of a mono exponential description of the relaxation within multi compartment systems and after mixing the contents of these compartments. A computer algorithm was implemented to simulate the free diffusion between volumes that exhibit different relaxation values. It could be shown that transition regions of "mixed" relaxation values occur on the edges of those volume regions. The width of these transition regions can be determined by the Einstein-Smoluchowski-Equation for the diffusion displacement, using the underlying relaxation values as the diffusion time. This effect is a fundamental limitation to the spatial resolution of relaxation maps and to the contrast that those relaxation values create in MR images. Based on this finding, the cause for the bright ring that surrounds roots within nutrient solution in MR images could be explained. It results from the diffusion driven in-flow of quickly relaxing magnetisation from the outer part of the roots into the free solution. The most important biological results of this PhD thesis concern the reaction of plant roots to drought stress and rewatering. In the context of these drought stress experiments, cavitations of the sap in the xylem vessels on the roots could be observed for the first time using MR. In addition, the refilling of these cavitated vessels was monitored systematically. It was possible to measure the velocity of the newly ascending sap level, which was calculated to be in the order of 1mm/min. Using flow imaging, it was also possible to confirm the regained functionality of the refilled vessels for the first time. Based on flow maps, also the volume flow could be calculated and e.g. could be compared to the transpiration rate of the plants. The T1 and spin density maps acquired during the stress experiments give information about the function of the different tissues during desiccation and rewatering. Especially a strong decrease in T1 in the cortex of certain roots could be correlated with an irreversible damage to the tissue. To provide a further basis for future studies, experiments on the uptake of the MR contrast agent Gd-DTPA by the roots were performed. Also a 3D RARE microscopy sequence was implemented and used to follow the inner structure of the branching of a side root. KW - Magnetresonanzmikroskopie KW - Wurzel KW - Diffusion KW - Kavitation KW - Spin-Gitter-Relaxation KW - Spin-Spin-Relaxation KW - Mais KW - Xylem KW - Pflanzengewebe KW - MR microscopy KW - plant roots KW - xylem cavitation KW - spin relaxation KW - diffusion Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-34150 ER - TY - THES A1 - Fuchs, Ines T1 - Die Rolle von Kaliumkanälen der AKT1-Unterfamilie für Kaliumaufnahme und gerichtetes Wachstum T1 - The role of potassium channels of the AKT1-subfamily for potassium uptake and directional growth N2 - In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Transkription des Kaliumaufnahmekanals ZMK1 durch IAA stimuliert wird und dass dieser eine wichtige Rolle für das differentielle Zellstreckungswachstum während der gravitropen Krümmung spielt. Dieser Annahme folgend wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht, ob ZMK1 auch in phototrop stimulierten Maiskeimlingen am differentiellen Wachstum der Koleoptile beteiligt ist. Im Hinblick auf diese Fragestellung wurden folgende Erkenntnisse gewonnen: i. Auch in photostimulierten Keimlingen folgt die Transkription von ZMK1 dem endogenen IAA-Gradienten. Vor allem in der Koleoptilenspitze, wo die Umverteilung der freien IAA in die unbelichtete Flanke stattfindet, wurde der größte ZMK1-mRNA Gradient gemessen. ii. Der Krümmungswinkel photostimulierter Koleoptilen war erheblich kleiner als der ebenso lange gravitrop gereizter Keimlinge. Pflanzen, die auf einem Klinostaten einseitig mit Blaulicht bestrahlt worden waren, zeigten jedoch eine ähnlich starke Krümmung wie gravistimulierte Pflanzen. Der Einfluss der Schwerkraft verhinderte demzufolge eine stärkere Krümmung photostimulierter Koleoptilen. iii. Die ausgeprägtere Krümmungsreaktion von auf dem Klinostaten photostimulierten Maiskeimlingen war mit einer drastischen Auxinverschiebung in der Koleoptilenspitze und einer länger anhaltenden differentiellen Expression von ZMK1 verbunden. Die Wachstumsantwort der Keimlinge konnte daher direkt mit der Verteilung freier IAA und der daraus resultierenden Regulation von ZMK1 korreliert werden. iv. Die Wahrnehmung zweier verschiedener Reize (Schwerkraft, Blaulicht) mündet in einen gemeinsamen Signalweg, welcher zur Umverteilung endogenen Auxins innerhalb der Koleoptile und zur differentiellen Kaliumaufnahme über ZMK1 in den gegenüberliegenden Flanken führt. Die hierdurch bedingte stärker ausgeprägte Zellstreckung in der unbelichteten Koleoptilenhälfte hat schließlich die Krümmung des Keimlings zur Folge. Mit dem Ziel, auch den ZMK1-orthologen Kaliumkanal in einer der wichtigsten Nutzpflanzen, Reis, zu charakterisieren, wurden molekularbiologische und biophysikalische Analysen durchgeführt. Im Bezug auf die verfolgten Ziele dieser Arbeit lassen sich die gewonnenen Ergebnisse wie folgt zusammenfassen: v. Aus Oryza sativa-Keimlingsgewebe konnte das cDNA-Molekül OsAKT1 isoliert und anhand der abgeleiteten Aminosäuresequenz der AKT1-Unterfamilie des Shaker- Typs pflanzlicher Kaliumkanäle zugeordnet werden. vi. Die Transkripte von OsAKT1 wurden in Koleoptile und Wurzel 5 Tage alter Reiskeimlinge lokalisiert. Im Gegensatz zur Expression des AKT1-orthologen Kanals in Mais ZMK1 blieb die Transkription von OsAKT1 durch die Erhöhung exogenen Auxins in Koleoptilsegmenten unbeeinflusst. Demzufolge ist es unwahrscheinlich, dass OsAKT1 ähnlich wie ZMK1 eine wichtige Rolle während des auxininduzierten Streckungswachstums spielt. vii. Nach heterologer Expression in HEK293-Zellen wurde OsAKT1 als spannungsabhängiger, kaliumselektiver Einwärtsgleichrichter charakterisiert, der durch Ca2+ und Cs+ geblockt und durch extrazelluläre Protonen aktiviert wird. Ähnliche Eigenschaften konnten in Protoplasten beobachtet werden, die aus Keimlingswurzeln isoliert worden waren. Diese Ergebnisse legten den Schluss nahe, dass OsAKT1 der dominante Kaliumaufnahmekanal in Reiswurzeln ist. Keimlinge des verwendeten Reiskultivars waren in Reaktion auf Salzstress im Vergleich zu Kontrollpflanzen erheblich im Wachstum verzögert und wiesen einen geringeren Kaliumgehalt auf. Dieser Phänotyp wurde von einer Abnahme der OsAKT1-Transkripte und der Verringerung der durch OsAKT1 getragenen Kaliumströme in Wurzelprotoplasten salzbehandelter Keimlinge begleitet. Dieser Zusammenhang deutet darauf hin, dass die OsAKT1-vermittelte Aufnahme von Kalium über die Wurzel essentiell für das pflanzliche Wachstum und die Ionenhomöostase salzgestresster Pflanzen ist. N2 - Previous experiments from our lab had already demonstrated that the inward-rectifying K+ channel ZMK1 plays an important role for potassium uptake during cell elongation growth of gravistimulated maize coleoptiles. To investigate if this channel is involved in other auxin-regulated processes as well, the current work focused on the role of ZMK1 for phototropic bending. i. Alike with gravistimulated plants, ZMK1 expression also follows the IAA-redistribution in photostimulated maize seedlings. The gradient in ZMK1-mRNA was most pronounced in the coleoptile tip, where free IAA is translocated into the shaded coleoptile half. ii. The bending angle of photostimulated maize seedlings was much smaller than that reached after gravistimulation. Plants photostimulated on a clinostat, however, displayed a similar bending angle as seedlings responding to a gravistimulus, indicating that gravity restricts further bending of the coleoptile. iii. Stronger phototropic bending of plants illuminated on a clinostat was accompanied by dramatic translocation of free IAA in the coleoptile tip and prolonged differential expression of ZMK1. Thus, the growth response of maize seedlings could be directly correlated with IAA-redistribution in the coleoptile and the resulting differential regulation of ZMK1 transcription. iv. The perception of two different stimuli (gravity, blue light) thus merges into a common signaling pathway, leading to IAA-redistribution and differential K+ uptake in the two flanks of the coleoptile. As a consequence, enhanced cell elongation growth in one half of the organ gives rise to gravi- or phototropic bending. To investigate the role of the ZMK1-ortholog in one of the most important food crops, rice, the respective gene was isolated. Based on molecular and biophysical approaches the gene activity and the function of the gene product were analyzed. v. The cDNA of OsAKT1 was isolated from rice seedlings. Based on the derived amino acid-sequence, OsAKT1 could be grouped into the AKT1-family of plant Shaker-K+-channels. vi. Transcripts of OsAKT1 were localized in root and coleoptile of 5-days-old rice seedlings. In contrast to ZMK1, OsAKT1-expression was not affected by changes in IAA concentration. OsAKT1 therefore does not seem to play a major role in auxin-induced cell elongation processes. vii. Following heterologous expression in HEK293 cells, OsAKT1 was characterized as a voltage-dependent, K+-selective inward rectifier activated by extracellular protons and blocked by Ca2+ and Cs+. The K+ uptake channel measured in protoplast of root epidermal cells showed almost the same functional properties, indicating that OsAKT1 represents the dominant K+-uptake channel in rice roots. viii. Rice seedlings subjected to salt stress displayed severe growth reduction and reduced K+-concentrations both in roots and shoots. This phenotype was accompanied by decreased OsAKT1-expression and diminished K+in currents in root protoplasts. Therefore, OsAKT1-mediated K+-uptake of root cells seems to be essential for plant growth and ion homeostasis during salt stress. KW - Mais KW - Reis KW - Kaliumkanal KW - Salzstress KW - Tropismus KW - Kaliumkanäle KW - Mais KW - Reis KW - Tropismen KW - Salzstress KW - potassium channels KW - maize KW - rice KW - tropisms KW - salt stress Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15875 ER - TY - THES A1 - Büchsenschütz, Kai T1 - Struktur und räumlich-zeitliches Expressionsverhalten von Kaliumkanälen bei Zea mays T1 - Structure and expressionpattern of potassium channels of Zea mays N2 - Bei Zea mays wurden neue Kaliumkanäle der Shaker-Familie isoliert, charakterisiert und zusammen mit bereits bekannten Vertretern dieser Familie hinsichtlich möglicher Aufgaben und Interaktionen untersucht. N2 - New potassium channels of Zea mays that belong to the Shaker-family were isolated and characterized. Their partial role and interaction with other channel members of the same family was focused on. KW - Mais KW - Kaliumkanal KW - Gen shaker KW - Genexpression KW - Kalium KW - Zea KW - Mais KW - Shaker KW - potassium KW - Zea KW - corn KW - Shaker Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17522 ER - TY - THES A1 - Schraut, Daniela T1 - Auswirkungen von externen Stressbedingungen auf die radialen Wasser- und ABA-Flüsse und den endogenen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes von Maiskeimlingen (Zea mays L.) T1 - Consequences of external stress conditions for the radial ABA- and water-flows and for the endogenous ABA content in root tissues of maize seedlings (Zea mays L.) N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es den Zusammenhang zwischen dem endogenen und internen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem radialen ABA- und Wasserfluss zu untersuchen und zu überprüfen ob diese Faktoren durch unterschiedliche Nährstoffbedingungen beeinflusst werden. Der radiale Transportweg von ABA wurde ebenfalls untersucht. • In dieser Arbeit konnte das erste Mal gezeigt werden, dass ein direkter Zusammenhang zwischen dem endogenen und internen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem radialen Wasser- und ABA-Transport besteht. Unter vergleichbaren Bedingungen können aus einem gegebenen ABA-Gehalt Rückschlüsse auf die radialen Wasser- und ABA-Flüsse gezogen werden. • Während Kalium- und Calciummangel und die Kultur in CaSO4 den radialen Wasserfluss von Maiskeimlingen stimulierten, war Jv unter Nitratmangel reduziert. Phosphat- und Sulfatmangel wirkten sich nicht auf den Wasserhaushalt von Maiskeimlingen aus, trotz einem deutlich reduzierten P- bzw. S-Gehalt konnten keine klaren Defizienzsymptome festgestellt werden. • Der endogene ABA-Gehalt im Wurzelgewebe von Maiskeimlingen war nur unter Kalium- und Nitratmangel erhöht. • Der radiale ABA-Transport wurde unter Kalium-, Nitrat-, Calciummangel und in CaSO4-Kultur gesteigert. Der erhöhte ABA-Fluss in Kaliumdefizienten Keimlingen resultiert aus einer gesteigerten ABA-Biosynthese und dem erhöhten Wassertransport. Unter Nitratmangelbedingungen lässt sich der gesteigerte ABA-Fluss anhand des erhöhten ABA-Gehaltes im Wurzelgewebe erklären. Die erhöhte ABA-Konzentration im Xylemsaft von Keimlingen aus Calciummangel- und CaSO4-Kultur ist das Ergebnis des gesteigerten Wassertransportes. Phosphat- und Sulfatmangel hatten keine Auswirkungen auf den ABA-Fluss. • Salzstress (50 mM) reduzierte den radialen Wasserfluss deutlich. Der erhöhte endogene ABA-Gehalt im Wurzelgewebe hatte keinen Einfluss auf Jv und JABA. Die Auswirkungen von Salzstress waren voll reversibel. • 100 nM externe ABA wirkte sich unter allen untersuchten Nährstoffbedingungen gleichermaßen stimulierend auf Jv und JABA aus. In NaCl-gestressten Keimlingen zeigte externe ABA keinen Effekt. • Eine Möglichkeit zur Immunolokalisation von ABA in Wurzelquerschnitten von Maiskeimlingen wurde entwickelt und optimiert. • Die Visualisierung des radialen ABA-Transportes anhand der Immunolokalisation mit monoclonalen Antikörpern zeigte, dass Endo- und Exodermis eine apoplastische Barriere für den ABA-Transport darstellen. Die Ergebnisse lassen den Rückschluss zu, dass die Exodermis die wirksamere Barriere für den ABA-Transport ist. • Wurzeln von Maiskeimlingen bildeten unter Nitratmangelbedingungen eine Exodermis aus und verstärkten die Suberinisierung der Endodermis. Unter Kaliummangel konnten keine verstärkten Barriereeigenschaften beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte zum ersten Mal aufgezeigt werden, dass eine signifikant hohe Korrelation zwischen dem endogenen ABA-Gehalt des Wurzelgewebes und dem ABA- bzw. Wassertransport besteht. Die ebenfalls positiv signifikant hohe Korrelation zwischen dem radialen Wasser- und ABA-Transport zeigt einen apoplastischen ABA-Transport an. Mit zunehmendem Wasserfluss steigt auch die ABA-Konzentration im Xylem. Ein apoplastischer radialer bypass der ABA konnte auch mit Hilfe der Immunolokalisation nachgewiesen werden. N2 - The objective of this study has been to investigate the relations between the endogenous and internal ABA content in root tissues and the radial ABA- and water-flows and how these individual factors can be affected by different conditions of nutrient deficiency. The radial transport paths also have been studied. • The experiments of this study, for the first time, show a direct correlation between endogenous and internal ABA content in root tissue and radial water- and ABA-transport. From differences of the endogenous ABA content, conclusions can be drawn about changes of the radial water- and ABA-flows under comparable transpiring conditions. • Whereas potassium and calcium deficiencies and CaSO4-culture are stimulating the radial water flow of maize seedlings, nitrate-deficiency will reduce Jv. Phosphorus and sulphur deficiencies do not have an effect on the water balance of maize seedlings because, despite clearly reduced internal P- and S-content no serious deficiency symptoms developed. • The endogenous ABA-content of maize root tissues is enhanced by potassium and nitrate deficiencies only. • Radial ABA-transport is enhanced by potassium, nitrate, calcium deficiencies and in CaSO4-culture. The increased ABA-flow in potassium deficient seedlings is a result of the enhanced ABA-biosynthesis and the increased water-transport. Under conditions of nitrate deficiency the enhanced ABA-content in root tissue results in an increased ABA-flow. In maize seedlings cultivated under calcium deficiency or in CaSO4 the enhanced ABA-concentration of xylem sap is a result of the stimulated water-flow. No effect can be seen under phosphate and sulphate deficiencies. • Salt stress (50 mM) reduces the radial water flow drastically. Although endogenous ABA is accumulated under salt stress Jv remains unaffected. The salt effect is fully reversible. • Under all nutrient deficient and hypoxic conditions, 100 nM external ABA stimulates water and ABA-flows in a comparable way. In NaCl-stressed seedlings external ABA proved to be ineffective. • A technique of immunolocalisation of ABA in cross sections of maize roots has been developed and optimised. • Visualisation of the radial ABA-transport by immunolocalisation with monoclonal antibodies demonstrated the barrier properties of endodermis and exodermis for radial ABA-transport. From the results of immunolocalisation it is concluded that the exodermis only is a significant barrier for radial ABA transport. • Roots of maize seedling build up an exodermis and enhance the suberinisation of the endodermis under nitrogen deficiency, whereas under potassium deficiency no increased barrier properties could be observed. The presented work, for the first time, shows the tight and significant correlation between the endogenous and internal ABA-content of root tissue and the radial ABA- respectively water-transport. Likewise, there is a positive highly significant correlation between the radial water- and ABA-transport, indicating an apoplastic bypass of ABA. With increasing water flow, the ABA-concentration in xylem-sap is increasing as well. A radial apoplastic ABA-flow could also be demonstrated by immunolocalisation. KW - Mais KW - Keimling KW - Abscisinsäure KW - Wasser KW - Nährstoffmangel KW - Abscisinsäure KW - Wasserfluss KW - Nährstoffmangel KW - Salz KW - Immunolokalisation KW - Suberin KW - Abscisic acid KW - water flow KW - nutrient deficiency KW - salt KW - immunolocalisation KW - suberin Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13163 ER - TY - THES A1 - Degenhardt, Birgit T1 - Wachstum und physiologisches Verhalten von Zea mays bei multiplem Streß unter besonderer Berücksichtigung des Wurzelsystems T1 - Growth and physiological behaviour of Zea mays under multiple stress with special focus on the root system N2 - In der vorgestellten Arbeit wurden das Wachstum und das physiologische Verhalten von Zea mays auf Müllheizkraftwerk (MHKW) -Schlacke im Vergleich zu Gartenerde als Kulturmedium untersucht. Dabei stand das Wurzelsystem der Maispflanzen im Mittelpunkt des Interesses. Da feste Bodensubstrate verwendet wurden, mußten diese zu Beginn der Experimente chemisch, physikalisch und bodenbiologisch charakterisiert werden. Die Analyse der Schlacke zeigte, daß Schlacke ein multifaktorielles Streßsystem darstellt: Sie enthält einen hohen Gehalt an leicht löslichen Salzen, v.a. NaCl (bis zu 220 mM in der Bodenlösung). MHKW-Schlacke ist dagegen arm an Stickstoff und pflanzenverfügbarem Phosphat. Der pH-Wert der Bodenlösung von Schlacke ist stark alkalisch (pH 8.4 - 9.0). Darüber hinaus besitzt Schlacke einen hohen Gehalt an potentiell toxischen Schwermetallen und weist im Vergleich zum Kontrollsubstrat Gartenerde eine verdichtete Bodenstruktur mit erhöhtem mechanischen Widerstand auf. Im Vergleich zu der Kontroll-Anzucht auf Gartenerde reagierten die auf Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen mit vermindertem Wachstum: Sproß und Wurzel erreichten nur die Hälfte der Länge der Kontrollpflanzen. Ein Vergleich der Biomassen von Sproß und Wurzel zeigte, daß das Sproßwachstum der Schlacke-Pflanzen stärker eingeschränkt ist als das Wurzelwachstum, woraus ein vergrößertes Wurzel / Sproß-Verhältnis resultiert. Das Wachstum von jungen Mais-Pflanzen auf Schlacke ist jedoch nicht in dem Maß eingeschränkt, wie es aufgrund der hohen Salzbelastung zu erwarten wäre. In einem Vergleichsexperiment mit Mais-Pflanzen, die in einer Nährlösung mit Zusatz von 100 mM NaCl kultiviert wurden, war das Wachstum erheblich schlechter und in den Blättern akkumulierte weitaus mehr Natrium als in Schlacke-Pflanzen. Hier wird der positive Einfluß des hohen Calciumgehaltes der Schlacke deutlich. Die Beeinträchtigung des Wachstums von Mais bei Kultur auf Schlacke wird hauptsächlich auf Phosphatmangel zurückgeführt, da durch Düngung eine beträchtliche Wachstumsverbesserung erzielt werden kann. Zudem wurden keine toxischen Konzentrationen an Schwermetallen im Blattgewebe von auf Schlacke kultivierten Pflanzen gefunden. Der Photosynthese-Apparat der Schlacke-kultivierten Pflanzen war sehr leistungsfähig: Es bestand keine Beeinträchtigung in der Energieverfügbarkeit (Quantenausbeute des Photosystems II) und die Lichtsättigung der photo-synthetischen Elektronentransportrate lag sogar höher als bei den Kontrollpflanzen. Die Bestimmung des „adenylate energy charge“ bestätigte diesen Sachverhalt. Das Wurzelsystem von Zea mays auf Schlacke wies strukturelle Veränderungen auf. Neben der verkürzten Wurzellänge und dem vergrößerten Wurzeldurchmesser der Schlacke-Pflanzen ergaben mikroskopische Untersuchungen, daß die Wurzeln durch Kultur auf Schlacke mit einer mechanischen Verstärkung reagieren: Stärker ausgeprägte tangentiale Zellwandverdickungen der Endodermis im tertiären Zustand und Zellwandmodifikationen in den radialen Zellwänden der Rhizodermis (Phi-Verdickungen). Für monokotyle Arten, insbesondere für Mais, gibt es bisher keine Beschreibung von Phi-Verdickungen in der Literatur. Gaschromatographische und massenspektrometrische Untersuchungen belegen, daß sich die Zellwände von auf Erde und Schlacke kultivierten Maiswurzeln im Hinblick auf den Gesamtgehalt an Lignin (endodermale Zellwandisolate) und in der Ligninzusammensetzung (hypodermale Zellwandisolate) unterscheiden: In Schlacke-kultivierten Maiswurzeln wurde ein höherer Anteil an dem Lignin-Monomer p Hydroxyphenyl gefunden, was zu einem höher verdichteten Lignin führt (Streßlignin). Die endodermalen Zellwände von auf Schlacke-kulivierten Pflanzen hatten dagegen einen höheren Gesamtlignin-Gehalt als die entsprechenden Kontrollen, was ebenfalls eine mechanische Verstärkung der Wurzel bewirkt. In Bezug auf Suberin konnten keine Unterschiede zwischen den verschiedenen Anzuchten gefunden werden, weder in den hypodermalen noch in den endodermalen Zellwandisolaten. Die verschiedenen Streßfaktoren führen demnach nicht zu einer verstärkten Imprägnierung der Zellwände mit lipophilem Material. Die Zellwände von Mais spielen eine wichtige Rolle bei der Immobilisierung von Schwermetallen. Die Zellwandisolate von auf Erde und Schlacke kultivierten Mais-Pflanzen wiesen je nach Schwermetall-Element 43 - 100 % des Gesamtgehaltes auf. Die absoluten Gehalte in den Zellwandisolaten von auf Schlacke angezogenen Pflanzen waren dabei höher als die entsprechenden Werte der Kontrolle. Eine Anreicherung in den Zellwänden wurde hauptsächlich für die Schwermetalle Zink, Blei, Nickel und Chrom beobachtet. Als unspezifische Streßantwort reagierten Maispflanzen auf die Kultur in Schlacke mit einer erhöhten Peroxidaseaktivität in der interzellulären Waschflüssigkeit. Die Peroxidaseaktivität des Symplastens der Wurzel unterscheidet sich zwischen den beiden Anzuchten dagegen nicht. Die Konzentration des Phytohormons Abscisinsäure (ABA) war in Blättern von auf Schlacke kultivierten Pflanzen von Zea mays und Vicia faba im Vergleich zu den Kontrollpflanzen erhöht. Dieser Anstieg ist eine Folge der erhöhten Salzbelastung der Schlacke, da die ABA-Gehalte entsprechender Blätter von auf gewaschener Schlacke kultivierten Pflanzen annähernd den Kontrollwerten entsprachen. Bei der Verteilung von ABA zwischen der Wurzel und der Bodenlösung der umliegenden Rhizosphäre konnte das als Anionenfalle bekannte Prinzip bestätigt werden. Nach diesem Modell reichert sich ABA im alkalischten Kompartiment an (hier: Schlacke-Bodenlösung). In den Wurzeln konnte nur in der Maiskultur auf Schlacke ein erhöhter Gehalt gefunden werden, nicht dagegen in der Vicia faba-Kultur. Dieser Unterschied liegt daran, daß Mais im Gegensatz zu Vicia faba eine exodermale Spezies ist und die Exodermis für ABA eine Barriere darstellt, was den ABA-Efflux in die Rhizosphäre verhindert. Im Wurzelgewebe von auf Schlacke kultivierten Maispflanzen wurde ein im Vergleich zur Kontrolle 15-facher Gehalt an wasserlöslichen, nicht proteingebundenen Sulfhydrylgruppen nachgewiesen. Diese auf Schwermetallstreß zurückzuführende Reaktion impliziert, daß die in der Schlacke-Bodenlösung vorhandenen Schwermetalle nicht ausreichend im Apoplasten zurückgehalten werden und bis in den Symplasten vordringen können. N2 - In the present thesis the growth and physiological behaviour of Zea mays cultivated on municipal solid waste incinerator bottom slag and garden mould were investigated. Thereby the root system of the maize plants was of main interest. Since solid soil substrates were used, experiments started with the chemical, physical and microbiological characterisation. The analysis represents the bottom incinerator slag as a multifactorial stress system: Slag contains a considerable amount of highly soluble salts, mainly sodium chloride (up to 220 mM in the soil solution). However, slag is poor in nitrogen and plant available phosphate. The pH-value of the slag soil solution is very alkaline (pH 8.4 – 9.0). Furthermore, slag exhibits high levels of potential toxic heavy metals and presents a condensed soil matrix with strong mechanical impedance. Compared to the control culture on garden mould, maize plants cultivated on slag showed a reduced growth: shoot and root of slag cultivated plants reached only one half of the length of the control plants. On the other hand the comparison of the shoot and root biomass revealed, that the shoot growth of the slag plants was more reduced than the root growth, resulting in an increased root to shoot ratio. Observing young corn plants on slag, the growth is not decreased as such extensively as it would be expected by this high salt burden. In a comparative experiment maize plants were cultivated in hydroponic culture supplemented by 100 mM NaCl. Here the plant growth was considerable inferior and the maize leaves accumulated sodium in much higher amounts. This emphasises the positive influence of the high calcium content of the slag. The long lasting impaired growth from corn plants cultivated on slag is mainly due to phosphate deficiency, because a substantial amendment of growth can be obtained by fertilising. Furthermore, no toxic concentration of heavy metals was detected in the leaves of slag grown plants. The photosynthetic performance of slag cultivated plants is very efficient: the energy availability (quantum yield of the photosystem II) was not reduced and the light saturation of the photosynthetic electron transport rate was even higher than for the control plants. The determination of the adenylate energy charge confirms that fact. Cultivating corn on slag, structural modifications can be observed in the root system. Besides the reduced root length and the enlargement of the root diameter microscopic examinations revealed, that roots response with a mechanical strengthening. They form more intensive tangential cell wall thickenings of the endodermis in the tertiary state of development and cell wall modifications in the radial cell walls of the rhizodermis (phi thickenings). Phi thickenings in monocotyledons species especially for maize haven’t been reported in the literature to date. Gaschromatographic and mass spectrometric investigations showed, that cell walls of maize roots cultivated on garden mould and slag differ in the total amount of lignin (endodermal cell wall isolates) and in lignin composition (hypodermal cell wall isolates): In slag cultivated corn roots a larger proportion of the lignin monomer p hydroxyphenyl was detected, which results in higher condensed lignin. The higher amount of total lignin of the endodermal cell walls from slag grown plants also causes a mechanical strengthening of the root. With regard to suberin no differences were found between the cultures, neither in hypodermal nor in endodermal cell wall isolates. Therefore the various stress factors do not induce a stronger impregnation of the cell walls with lipophilic material. The cell walls of maize play an important role by immobilisation of heavy metals. Depending on the metal species, 43 - 100 % of the total amount of the metals was recovered in cell wall isolates of garden mould and slag cultivated maize plants. The absolute amounts in the cell wall isolates of slag cultivated plants were higher than the corresponding control values. An accumulation in the cell walls were found for the heavy metals zinc, lead, nickel and chrome. As a non specific answer to stress, roots of maize plants react on slag cultivation with a rise in activity of peroxidase. This increase was only manifested in the intercellular wash fluid but not in the symplast. The investigation of the phytohormone abscisic acid (ABA) revealed a higher concentration of ABA in leaves of Zea mays and Vicia faba plants cultivated on slag than for the control plants. That increase is due to the high salt burden of slag, because the ABA values of leaves of plants cultivated on washed slag correspond approximately to the control values. The distribution of ABA between roots and the soil solution of the rhizosphere match to the anion trap concept. In accordance with that model ABA is enriched in alkaline compartments (here slag-soil solution). However, in roots an increased amount of ABA was only detected for maize cultivated on slag, but not for Vicia faba. The reason for that difference between the two plant species is, that Zea mays is an exodermal species and its exodermis represents a barrier for ABA, reducing the ABA efflux into the rhizosphere. In the root tissue of slag cultivated maize plants a 15-fold amount of water soluble, non-proteinogen sulfhydrylgroups was detected. This may be an indication for heavy metal stress and implies, that heavy metal ions in slag soil solution can not be retained sufficiently by the apoplast and enter the symplast. KW - Mais KW - Wurzel KW - Stressreaktion KW - Schlacke KW - Pflanzenwachstum KW - Gartenerde KW - Zea mays KW - Wachstum KW - Physiologie KW - Stress KW - Wurzelsystem KW - Zea mays KW - growth KW - physiology KW - stress KW - rootsystem Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-16964 ER - TY - THES A1 - Hose, Eleonore T1 - Untersuchungen zum radialen Abscisinsäure- und Wassertransport in Wurzeln von Helianthus annuus L. und Zea mays L. N2 - Mit den Experimenten dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass ein Phytohormon wie Abscisinsäure mit dem "Solvent-drag" des Wasserflusses apoplastisch durch den Wurzelzellwandbereich in die Xylemgefäße transportiert werden kann. Es konnte ein Bypass-Fluss für ABA durch den gesamten Zellwandapoplasten, auch durch lipophile Barrieren wie Exo- und Endodermis nachgewiesen werden. Dies ist durch die speziellen Moleküleigenschaften von Abscisinsäure möglich: (i) der geringe Durchmesser des Moleküls (8 - 11 nm) und (ii) die hohe Lipophilie von ABA bei schwach sauren pH-Werte. Mit einer Penetration apoplastischer Barrieren ist demnach zu rechnen. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Ausbildung solcher lipophilen Zellwandnetze einen signifikanten Einfluss auf den apoplastischen ABA-Transport besitzt. Die Ausbildung einer Exodermis in Mais, wie sie unter natürlichen Bedingungen zu beobachten ist, konnte den ABA-Fluss in das Xylem um die Faktoren 2 bis 4 reduzieren. Da gleichzeitig eine Verminderung der hydraulischen Wurzelleitfähigkeit um denselben Betrag auftrat, blieb das Wurzel-Spross-ABA-Signal, die Phytohormonkonzentration, im Xylem gleich. Die zu den Stomata geleitete Information über den Wasserzustand der Wurzel änderte sich also nicht. Im natürlichen System ist sogar eine Verstärkung des Signals zu erwarten, da eine Exodermis nicht als Aufnahme-Barriere für gewebeproduzierte ABA wirkt. Gleichzeitig verringert sie den Verlust von apoplastischer ABA an die Rhizosphäre. Außerdem wird der Wasserverlust aus dem Gewebe durch eine Exodermis signifikant reduziert wird. Somit sind solche Wurzeln gut an die Bedingungen eines eintrocknenden Bodens angepasst. Apoplastische Barrieren sind demnach, neben membran-lokalisierten Tranportern, wichtige Parameter für die Beurteilung von Wurzeltransporteigenschaften für Wasser und darin gelöste Substanzen. Der Beitrag der apoplastischen Komponente zum Gesamt-ABA-Transport ist abhängig von der untersuchten Pflanzenart, der aktuellen Transpirations- oder Wasserflussrate und von Umwelteinflüssen wie erhöhter ABA-Konzentration im Wurzelgewebe (z.B. durch Trockenstress), pH-Wert der Rhizosphäre und den Ernährungsbedingungen der Pflanze. Erhöhter radialer Wasserfluss, erhöhte ABA-Wurzelgewebegehalte und niedriger pH-Wert der Rhizosphäre verstärken den apoplastischen Bypass-Fluss unter physiologischen Bedingungen. Geringe Wassertransportraten, niedrige ABA-Konzentrationen im Gewebe, alkalische pH-Werte der Rhizosphäre und Ammoniumernährung verstärken dagegen den symplastischen Beitrag zum ABA-Transport. In der vorliegenden Arbeit konnten die sich widersprechenden Theorien bezüglich des ABA-Effektes auf die hydraulische Leitfähigkeit von Wurzeln erklärt werden. ABA erhöht über einen Zeitraum von 2 Stunden die Zellleitfähigkeit (Lp) mit einem Maximum 1 Stunde nach ABA-Inkubation. Dies wirkt sich in einem verstärktem Lpr von intakten Wurzelsystemen aus, das einem ähnlichen Zeitmuster folgt. Pflanzen sind demnach in der Lage, mittels ABA den zellulären Wassertransportweg reversibel zu optimieren, um so unter mildem Trockenstress, wie er in einem gerade eintrocknenden Boden auftritt, die Pflanze mit ausreichend Wasser zu versorgen. Tritt ein länger andauernder Wassermangel ein, versperrt die Pflanze diesen Weg wieder. Dieser transiente Effekt erklärt auch die aus der Literatur bekannten stimulierenden und inhibierenden ABA-Wirkungen. Durch den verstärkten Wasserfluss zu Beginn der Stresssituation erzeugt ABA auf diese Weise ein sich selbst verstärkendes, wurzelbürtiges Hormonsignal in den Spross. Das Blatt erreicht in effektiver Weise eine ABA-Menge, die ausreichend ist, um die Stomata zu schließen. Es folgt eine Reduktion der Transpiration. Eine weiter andauernde Erhöhung des symplastischen Wassertransportweges wäre ohne physiologische Bedeutung. Regulierende Membranstrukturen für diesen Vorgang könnten ABA-sensitive Wasserkanäle (Aquaporine) der Plasmamembran sein. Es wurde gezeigt, dass der Rezeptor für diesen Vorgang innerhalb von corticalen Maiswurzelzellen lokalisiert und hochspezifisch für (+)-cis-trans-ABA ist. Die Signaltransduktion für diesen Kurzzeiteffekt erfolgt nicht mittels verstärkter Aquaporintranskription, könnte aber über ABA-induzierte Aktivierung (Phosphorylierung), oder Einbau von Aquaporinen in die Zellmembran ablaufen. Der Abscisinsäure-Transport ist ein komplexer Vorgang. Er wird beeinflusst durch Umwelteinflüsse, Wurzelanatomie, ist gekoppelt mit dem Wasserfluss und durch sich selbst variierbar. Herkömmliche Vorstellungen einer simplen Hormondiffusion können diesen regulierbaren Vorgang nicht mehr beschreiben. Pflanzen besitzen ein ABA-Transportsystem, das schnell, effektiv und an sich verändernde Umweltbedingungen adaptierbar ist. N2 - The experimental work of the presented study has been able to show, for the first time, that a phytohormone like ABA can be transported apoplastically into xylem vessels by solvent-drag of the water flow. For ABA, a bypass-flow throughout the whole cell wall apoplast, including lipophilic barriers like exo-and endodermis, could be demonstrated. This may be due to the particular properties of the 264 Da ABA-molecule: (i) the small diameter of the molecule (8 to 11 nm) and (ii) the high lipophily of the uncharged ABA under physiological conditions. Conclusively, a penetration of apoplastic barriers is supposed to be possible. Furthermore, this study shows the development of such lipophilic cell wall-nets should have significant influence on apoplastic ABA-transport-properties. The formation of an exodermis in maize, as it occurs under natural conditions, was able to reduce the ABA-flow into the xylem by factors of 2 up to 4. As, simultaneously, the root-hydraulic conductivity was decreased by the same rate, the root-to-shoot ABA-signal, the phytohormone concentration in the xylem, remained constant. The information about the root-water-status addressed to the guard cells has not changed, therefore. In the natural environment even an increase of this signal is to be expected, as exodermal layers are no uptake-barriers for the tissue-produced ABA. On the contrary, an exodermis will retard the leakage of ABA to the rhizosphere. At the same time, roots are more effectively adapted to drought because water loss from exodermal roots is also reduced significantly. Apoplastic barriers are, therefore, beside membrane-located transport-proteins, the important parameters for determining root-transport-properties for water and solutes. The contribution of the apoplastic component to the entire ABA-transport depends on the plant species investigated, the actual transpiration- or water-flow rate and on external conditions like high ABA-concentrations in the root tissue (e.g. after drought), pH of the rhizosphere, and the nutrient status of the plant. Increased radial water-flow, raised ABA-contents of the root tissue, and a low pH of the rhizosphere intensified the apoplastic bypass-flow under physiological conditions. Low water-transport rates, low ABA tissue-contents, alkaline pH-values in the rhizosphere and ammonium as the only N-source, on the other hand, increased the symplastic contribution to the ABA-transport. In the presented study, the controversal dispute concerning the ABA-effect on root hydraulic conductivity could be settled. ABA raises cell hydraulic conductivity (Lp) for 2 h with a maximum after 1 h of ABA-application. This results in an increased Lpr (hydraulic conductivity of intact root systems), directed by a similar time-pattern. So, by ABA plants are able to reversibly optimise the cellular transport path of water to support the plant under mild drought stress with sufficient water. However, if water deficiency continues, plants again close this additional symplastic pathway. This transient ABA-effect explains both stimulating and inhibiting ABA-actions, as known from literature. At the beginning of a stress situation ABA induces by an increased water flow a self-intensifying root-to-shoot-signal. Thus, in an effective way the leaf achieves a sufficient amount of ABA in order to close the stomata. A reduction in transpiration follows. Further continuous stimulation of the symplastic water transport path would be without any physiological meaning. Membrane structures, responsible for regulating this mechanism may be ABA-responsive water channels (aquaporins) in the plasma membrane. It has been shown that the receptor for regulating these channels is localised inside the cortical cells of maize roots and highly specific for (+)-cis-trans-ABA. Signal transduction for this short-time effect is not mediated by intensified aquaporin-transcription, but there may be evidence of ABA-induced regulation by channel activation (phosphorylation) or by incorporation of aquaporins into cell membranes. The transport of abscisic acid is a complex process modified by environmental conditions, root anatomy, coupled with the water flow, and variable by itself. Customary ideas about a simple hormone diffusion are not apt to describe this complex process anymore. Plants possess an ABA-transport system, which is fast, effective, and adaptable to changing environmental conditions. KW - Sonnenblume KW - Wurzel KW - Wassertransport KW - Abscisinsäure KW - Stofftransport KW - Mais KW - Abscisinsäure KW - ABA KW - Aquaporin KW - Exodermis KW - Hydraulische Leitfähigkeit KW - Wassertransport KW - Wurzel KW - Helianthus annuus KW - Zea mays KW - Abscisic acid KW - ABA KW - aquaporin KW - exodermis KW - hydraulic conductivity KW - water transport root KW - Helianthus annuus KW - Zea mays KW - Nicotiana tabacum Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1421 ER -