TY - THES A1 - Brown, Helena Charlotte T1 - Investigating the role of the platelet receptor C-type lectin-like receptor 2 in models of thrombosis T1 - Untersuchungen zur Rolle des Thrombozytenrezeptors CLEC-2 (C- type lectin-like receptor 2) in Thrombosemodellen N2 - Platelets have a key physiological role in haemostasis however, inappropriate thrombus formation can lead to cardiovascular diseases such as myocardial infarction or stroke. Although, such diseases are common worldwide there are comparatively few anti-platelet drugs, and these are associated with an increased risk of bleeding. Platelets also have roles in thrombo-inflammation, immuno-thrombosis and cancer, in part via C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and its ligand podoplanin. Although CLEC-2 contributes to these diseases in mice, as well as to thrombus stability, it is unclear whether CLEC-2 has similar roles in humans, particularly as human CLEC-2 (hCLEC-2) cannot be investigated experimentally in vivo. To investigate hCLEC-2 in vivo, we generated a humanised CLEC-2 mouse (hCLEC-2KI) model, as well as a novel monoclonal antibody, HEL1, that binds to a different site than an existing antibody, AYP1. Using these antibodies, we have provided proof of principle for the use of hCLEC-2KI mice to test potential therapeutics targeting hCLEC-2, and shown for the first time that hCLEC-2 can be immunodepleted, with little effect on haemostasis. However, our results have also suggested that there are species differences in the role of CLEC-2 in arterial thrombosis. We further confirmed this using human blood where blocking CLEC-2 ligand binding had no effect on thrombosis, whereas we confirmed a minor role for mouse CLEC-2 in thrombus stability. We also investigated the effect of blocking CLEC-2 signalling using the Bruton’s tyrosine kinase inhibitor PRN473 on CLEC-2 mediated immuno-thrombosis in a Salmonella typhimurium infection model. However, no effect on thrombosis was observed suggesting that CLEC-2 signalling is not involved. Overall, our results suggest that there may be differences in the role of human and mouse CLEC-2, at least in arterial thrombosis, which could limit the potential of CLEC-2 as an anti-thrombotic target. However, it appears that the interaction between CLEC-2 and podoplanin is conserved and therefore CLEC-2 could still be a therapeutic target in immuno-thrombosis, thrombo-inflammation and cancer. Furthermore, any potential human specific therapeutics could be investigated in vivo using hCLEC-2KI mice. N2 - Thrombozyten sind ein wichtiger Bestandteil der Hämostase, können allerdings durch die Bildung eines Blutgerinnsels auch kardiovaskuläre Krankheitsbilder wie Myokardinfarkte oder Schlaganfälle hervorrufen. Obwohl diese Erkrankungen weltweit zu den führenden Todesursachen zählen, gibt es vergleichsweise wenig Thrombozyteninhibitoren und die bislang verfügbaren Wirkstoffe gehen mit einem erhöhten Blutungsrisiko einher. Darüber hinaus spielen Thrombozyten auch bei thrombo-inflammatorischen oder malignen Erkrankungen eine Rolle und sind maßgeblich an Entzündungs-vermittelten Thrombosen (Immunothrombosen) beteiligt. Daten aus Mausmodellen legen nahe, dass die Interaktion zwischen dem Thrombozytenrezeptor CLEC-2 (C-type lectin-like receptor 2) und seinem Liganden Podoplanin von Bedeutung für diese Krankheitsbilder, und die Thrombusstabilität ist. Allerdings ist bislang unklar, ob CLEC-2 im Menschen eine ähnliche Rolle spielt, da die Rolle des menschlichen CLEC-2 (hCLEC-2) in diesen Prozessen bislang nicht experimentell in vivo erforscht werden kann. Um hCLEC-2 in vivo zu erforschen, haben wir Mäuse generiert, die humanes CLEC-2 exprimieren (hCLEC-2KI), sowie einen neuen, monoklonalen Antikörper (HEL1) entwickelt, der an eine andere Bindungsstelle als der zuvor generierter Antikörper (AYP1) bindet. Mit Hilfe dieser Antikörper haben wir erstmalig gezeigt, dass hCLEC-2KI Mäuse geeignet sind, um potenzielle Therapeutika zu testen, die auf hCLEC-2 abzielen. Des Weiteren konnten wir erstmalig zeigen, dass auch hCLEC-2 immunodepletiert werden kann und dass der Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten die Hämostase nur minimal beeinträchtigt. Allerdings deuten unsere Ergebnisse auch darauf hin, dass es hinsichtlich der Bedeutung CLEC-2 für die arterielle Thrombose artspezifische Unterschiede gibt: Während Maus CLEC-2 zur Stabilität der Thromben beiträgt, hatte die Blockade der Ligandenbindungsstelle von hCLEC-2 keinen Einfluss auf Thrombose. Des Weiteren wurde mit Hilfe des Bruton’s tyrosine kinase Inhibitors PRN473 der Effekt einer Blockierung des CLEC-2 Signalwegs auf die durch CLEC-2 hervorgerufene Immuno-Thrombose in einem Salmonella typhimurium Infektionsmodel erforscht. Da jedoch keine Effekte nachgewiesen werde konnten, schlussfolgern wir, dass der CLEC-2 Signalweg nicht in diesen Prozess involviert ist. Insgesamt deuten unsere Ergebnisse darauf hin, dass es Unterschiede in der Rolle von CLEC-2 zwischen Mensch und Maus gibt, zumindest im Kontext der arteriellen Thrombose, was das Potenzial von CLEC-2 als antithrombotisches Ziel einschränken könnte. Da allem Anschein nach die Interaktion zwischen CLEC-2 und Podoplanin konserviert ist, könnte CLEC-2 dennoch als Therapeutikum für Thrombo-Inflammation, Immunothrombose und Krebsbildungen genutzt werden. Des Weiteren könnten für den Menschen entwickelte Therapieansätze mit Hilfe von hCLEC-2KI Mäusen in vivo untersucht werden. KW - Thrombozyt KW - Thrombose KW - Platelet KW - Thrombosis KW - Rezeptor Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-293108 ER - TY - THES A1 - Janzen, Dieter T1 - Functional analysis of ion channels and neuronal networks in 2D and 3D \(in\) \(vitro\) cell culture models T1 - Funktionelle Analyse von Ionenkanälen und neuronalen Netzwerken in 2D und 3D \(in\) \(vitro\) Zellkulturmodellen N2 - In the central nervous system, excitatory and inhibitory signal transduction processes are mediated by presynaptic release of neurotransmitters, which bind to postsynaptic receptors. Glycine receptors (GlyRs) and GABAA receptors (GABAARs) are ligand-gated ion channels that enable synaptic inhibition. One part of the present thesis elucidated the role of the GlyRα1 β8 β9 loop in receptor expression, localization, and function by means of amino acid substitutions at residue Q177. This residue is underlying a startle disease phenotype in the spontaneous mouse model shaky and affected homozygous animals are dying 4-6 weeks after birth. The residue is located in the β8 β9 loop and thus part of the signal transduction unit essential for proper ion channel function. Moreover, residue Q177 is involved in a hydrogen network important for ligand binding. We observed no difference in ion channel trafficking to the cellular membrane for GlyRα1Q177 variants. However, electrophysiological measurements demonstrated reduced glycine, taurine, and β alanine potency in comparison to the wildtype protein. Modeling revealed that some GlyRα1Q177 variants disrupt the hydrogen network around residue Q177. The largest alterations were observed for the Q177R variant, which displayed similar effects as the Q177K mutation present in shaky mice. Exchange with structurally related amino acids to the original glutamine preserved the hydrogen bond network. Our results underlined the importance of the GlyR β8 β9 loop for proper ion channel gating. GlyRs as well as GABAARs can be modulated by numerous allosteric substances. Recently, we focused on monoterpenes from plant extracts and showed positive allosteric modulation of GABAARs. Here, we focused on the effect of 11 sesquiterpenes and sesquiterpenoids (SQTs) on GABAARs. SQTs are compounds naturally occurring in plants. We tested SQTs of the volatile fractions of hop and chamomile, including their secondary metabolites generated during digestion. Using the patch-clamp technique on transfected cells and neurons, we were able to observe significant GABAAR modulation by some of the compounds analyzed. Furthermore, a possible binding mechanism of SQTs to the neurosteroid binding site of the GABAAR was revealed by modeling and docking studies. We successfully demonstrated GABAAR modulation by SQTs and their secondary metabolites. The second part of the thesis investigated three-dimensional (3D) in vitro cell culture models which are becoming more and more important in different part of natural sciences. The third dimension allows developing of complex models closer to the natural environment of cells, but also requires materials with mechanical and biological properties comparable to the native tissue of the encapsulated cells. This is especially challenging for 3D in vitro cultures of primary neurons and astrocytes as the brain is one of the softest tissues found in the body. Ultra-soft matrices that mimic the neuronal in vivo environment are difficult to handle. We have overcome these challenges using fiber scaffolds created by melt electrowriting to reinforce ultra-soft matrigel. Hence, the scaffolds enabled proper handling of the whole composites and thus structural and functional characterizations requiring movement of the composites to different experimental setups. Using these scaffold-matrigel composites, we successfully established methods necessary for the characterization of neuronal network formation. Before starting with neurons, a mouse fibroblast cell line was seeded in scaffold-matrigel composites and transfected with the GlyR. 3D cultured cells displayed high viability, could be immunocytochemically stained, and electrophysiologically analyzed. In a follow-up study, primary mouse cortical neurons in fiber-reinforced matrigel were grown for up to 21 days in vitro. Neurons displayed high viability, and quantification of neurite lengths and synapse density revealed a fully formed neuronal network already after 7 days in 3D culture. Calcium imaging and patch clamp experiments demonstrated spontaneous network activity, functional voltage-gated sodium channels as well as action potential firing. By combining ultra-soft hydrogels with fiber scaffolds, we successfully created a cell culture model suitable for future work in the context of cell-cell interactions between primary cells of the brain and tumor cells, which will help to elucidate the molecular pathology of aggressive brain tumors and possibly other disease mechanisms. N2 - Im zentralen Nervensystem wird die exzitatorische und inhibitorische Signaltransduktion durch die präsynaptische Ausschüttung von Neurotransmittern, die an postsynaptische Rezeptoren binden, gesteuert. Glycinrezeptoren (GlyRs) und GABAA-Rezeptoren (GABAARs) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle, die die synaptische Inhibition ermöglichen. Ein Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit dem Einfluss des GlyRα1 β8 β9-Loops auf Expression, Lokalisation und Funktion des Rezeptors. Dazu wurde ein Aminosäureaustausch an Position Q177 durchgeführt, welche dem Startle-Krankheit-Phänotyp des spontanen Mausmodells shaky zugrunde liegt. Betroffene homozygote Tiere versterben 4-6 Wochen nach Geburt. Die Position befindet sich im β8 β9-Loop und ist damit Teil einer Signaltransduktionseinheit, die essenziell für die korrekte Rezeptorfunktion ist. Zudem ist Position Q177 teil eines Wasserstoffbrückennetzwerks, welches für die Ligandenbindung erforderlich ist. Wir konnten keinen Einfluss der GlyRα1Q177-Varianten auf den Transport des Rezeptors zur Zellmembran feststellen. Allerdings zeigten elektrophysiologische Messungen eine verringerte Wirksamkeit von Glycin, Taurin und β Alanin verglichen mit dem Wildtyp-Protein. Mithilfe von Proteinmodellierung konnte gezeigt werden, dass manche der GlyRα1Q177-Varianten das Wasserstoffbrückennetzwerk im Umfeld von Position Q177 stören. Die größten Effekte wurden bei der Q177R-Variante beobachtet, die sich ähnlich zur Q177K-Mutation der shaky-Maus verhielt. Der Austausch zu einer Aminosäure, die strukturell ähnlich zum ursprünglichen Glutamin ist, störte das Wasserstoffbrückennetzwerk hingegen nicht. Unsere Ergebnisse zeigen, wie wichtig der GlyR β8 β9-Loop für die Aufrechterhaltung der Rezeptorfunktion ist. Sowohl GlyRs als auch GABAARs können durch verschiedenste allosterische Substanzen moduliert werden. Zuletzt zeigten wir positive allosterische Modulation von GABAARs durch Monoteperne aus Pflanzenextrakten. Hier haben wir uns auf den Effekt von 11 Sesquiterpenen und Sesquiterpenoiden (SQTs) auf GABAARs fokussiert. SQTs sind natürlich in Pflanzen vorkommende Stoffe. Wir testeten SQTs aus dem flüchtigen Anteil von Hopfen und Kamille, sowie deren sekundäre Metaboliten, die während der Verdauung entstehen. Mithilfe der Patch-Clamp-Methode konnten wir in transfizierten Zellenlinien und neuronalen Primärzellen signifikante Modulation von GABAARs durch einige der SQTs beobachten. Außerdem wurde mithilfe von Docking-Simulationen eine mögliche Bindung von SQTs in der Neurosteroid-Bindungstasche gezeigt. Zusammengefasst haben wir erfolgreich die Modulation von GABAARs durch SQTs und deren sekundäre Metaboliten demonstriert. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit dreidimensionalen (3D) in vitro Zellkulturmodellen, die zunehmend an Bedeutung gewinnen. Die dritte Dimension erlaubt die Entwicklungen von komplexen Modellen, die sich der natürlichen Umgebung von Zellen annähern. Dafür werden Materialien benötigt, deren mechanische und biologische Eigenschaften denen des ursprünglichen Gewebes der eingeschlossenen Zellen ähneln. Dies ist insbesondere eine Herausforderung bei 3D in vitro Kulturen von primären Neuronen und Astrozyten, da das Gehirn eines der weichsten Gewebe des Körpers ist. Ultraweiche Matrizen, welche die neuronale Umgebung nachahmen, sind schwer zu handhaben. Wir haben dieses Problem gelöst, indem wir ultraweiches Matrigel mit Fasergerüsten verstärkten, die mithilfe von Melt Electrowriting gedruckt wurden. Somit können diese Matrigel-Faser-Komposite für strukturelle und funktionelle Experimente benutzt werden, die häufige Bewegung und Transport der Proben voraussetzen. Mit diesen Matrigel-Faser-Kompositen haben wir Methoden etabliert, die für die Charakterisierung von neuronalen Netzwerken erforderlich sind. Anstelle von Neuronen haben wir dafür eine Mausfibroblasten-Zelllinie benutzt und mit dem GlyR transfiziert. Zellen in den Matrigel-Faser-Komposite zeigten eine hohe Viabilität, konnten immunocytochemisch angefärbt werden, und mithilfe von elektrophysiologischen Methoden gemessen werden. Darauf aufbauend haben wir primäre kortikale Mausneurone in faserverstärktem Matrigel für bis zu 21 Tage wachsen lassen. Die Neurone zeigten eine hohe Viabilität und durch Quantifikation von Neuritenlänge und Synapsendichte konnte ein vollständig ausgeformtes Netzwerk nach 7 Tagen in 3D-Kultur demonstriert werden. Mithilfe von Calcium-Imaging und Patch-Clamp-Experimenten wurden spontane Netzwerkaktivität, funktionelle spannungsgesteuerte Natriumkanäle, sowie Aktionspotentiale nachgewiesen. Somit konnten wir durch Kombination von einem ultraweichen Hydrogel mit Fasergerüsten erfolgreich ein Zellkulturmodell entwickeln, das zukünftig für die Erforschung von Zell-Zell-Interaktionen zwischen primären Gehirnzellen und Tumorzellen benutzt werden kann. Damit kann die molekulare Pathologie von aggressiven Hirntumoren und möglicherweise anderen Krankheitsmechanismen weiter aufgeklärt werden. KW - Zellkultur KW - Ionenkanal KW - Aminobuttersäure KW - Glycin KW - Rezeptor KW - 3D cell culture KW - neuronal network KW - ion channel KW - glycine receptor KW - GABA receptor KW - 3D-Zellkultur KW - Nervennetz KW - Glycinrezeptor KW - GABA-Rezeptor Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-251700 ER - TY - THES A1 - Hasse, Stephanie T1 - Funktionelle Charakterisierung von Parathormon-Rezeptor Mutanten im Xenopus Oozyten-Expressionssystem T1 - Functional characterisation of parathyroid hormone receptor mutants in the xenopus oocyte expression system N2 - G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) regulieren eine Vielzahl physiologischer als auch pathophysiologischer Prozesse im menschlichen Körper. Verankert in der Zellmembran vermitteln sie die Transduktion äußerer Stimuli zur Aktivierung nachgeschalteter Signalwege. Durch die Aktivierung Adenylatcyclasen-, Phosphlipasen C- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)- abhängiger Signalwege, vermittelt der zur Familie B der GPCRs gehörige Parathormon-Rezeptor PTH1R die endokrine und parakrine Wirkungen des Parathormons (PTH) und des Parathormon-verwandten Proteins (PTHrP). Diese sind die Regulation der Kalzium-Homöostase, des Knochenmetabolismus und der Skelettentwicklung. In dieser Arbeit wurden vier Mutationen im PTH1-Rezeptor untersucht, die durch Roth und Mitarbeiter (2014) in den Zusammenhang mit dem Krankheitsbild der primären Zahndurchbruchsstörung (PFE) gebracht wurden. Die vier untersuchten Mutanten sind PTH1R [P119L], PTH1R [H442D], PTH1R [L232R] und PTH1R [L292P]: Bei den durch Mutagenese herbeigeführten Punktmutationen handelt es sich jeweils um eine missense-Mutation, bei der der Austausch einer einzelnen Base in der DNA-Sequenz zum Einbau einer anderen Aminosäure im Protein führt. Es folgte die funktionelle Charakterisierung des Parathormon-Rezeptors und seiner Mutanten, welche auf einer indirekten Messung der Rezeptoraktivität basierte. Direkt gemessen wurden dabei die Kaliumströme der Tandemporen-Kaliumkanäle TASK-1 und TRESK, welche durch Gq-Protein gekoppelte Rezeptoren reguliert werden können: So werden TASK-Ströme durch GPCRs inhibiert, TRESK-Ströme dagegen aktiviert. TASK-1 Kanäle und Parathormon-Rezeptoren wurden zeitgleich heterolog in Xenopus laevis Oozyten exprimiert und anschließend mittels der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme (TEVC) elektrophysiologisch untersucht. Nach Zugabe von PTH (100 nM) ergab sich nach Kopplung an den TASK-1 Kanal für den PTH1R-Wildtyp eine durchschnittliche Stromamplitude von 52,11 % ± 3,60 % (n=28). Dagegen zeigten sich für die PTH1R-Mutanten keine signifikanten Änderungen der Stromamplituden nach Zugabe der PTH-haltigen Messlösung. Die Untersuchungen wurden mit dem TRESK-Kanal wiederholt. Hier zeigte sich eine deutliche TRESK-Aktivierung durch Kopplung an den PTH1R-Wildtyp beim Einwaschen von PTH. Bei den Mutanten kam es ebenfalls nicht zu einer signifikanten Änderung der Stromamplitude durch PTH-Zugabe. Ein Austausch dieser entsprechenden Aminosäuren führt somit zu einem Funktionsverlust des Parathormon-Rezeptors Typ 1. Bei den untersuchten Mutationen handelt es sich daher um Loss-of-function-Mutationen. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass die von Roth und Mitarbeitern in ihrer Pathogenität als „wahrscheinlich schädlich“ eingestuften Mutationen durch die vorliegende Arbeit nun als „pathogen“ und damit PFE-verursachend bezeichnet werden können. Die zahnmedizinische Relevanz dieser Ergebnisse liegt darin begründet, dass durch eine genetisch gesicherte Diagnose PFE, die korrekte und erfolgversprechendste Behandlungsoption gewählt werden kann. Von PFE betroffene Zähne ankylosieren nach Applikation kieferorthopädischer Kräfte und können nicht weiter bewegt werden. Somit kann nach der Diagnose PFE ein individuelles Behandlungskonzept erstellt werden, das sich nach dem Ausmaß der Durchbruchsstörung richtet. Langjährige und frustrierende kieferorthopädische Behandlungen bleiben dem Patienten, aber auch dem Kieferorthopäden erspart. N2 - Functional characterisation of parathyroid hormone receptor mutants in the xenopus oocyte expression system: Heterozygous mutations of the parathyroid hormone receptor (PTH1R) gene are causally linked to primary failure of tooth eruption (PFE). KW - Rezeptor KW - PTH1R KW - PFE Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178613 ER - TY - THES A1 - Schartner, Christoph T1 - The regulation of corticotropin releasing hormone receptor 1 gene expression and its role in panic disorder T1 - Die Regulation der Corticotropin Releasing Hormon Rezeptor 1 Genexpression und ihre Rolle bei der Panikstörung N2 - Panic Disorder (PD) is characterized by unexpected, recurrent panic attacks, which are not restricted to certain situations, medication or stimuli. Like other anxiety disorders, PD is a multifactorial disorder and develops through the interaction of genetic and environmental risk factors. Despite an estimated heritability of up to 48%, no distinct genetic mechanism could be revealed yet. A dysregulation of the stress response has been shown in patients with PD and several studies could find an association of components of the corticotropin-releasing factor (CRF) system with PD. The corticotropin releasing hormone receptor 1 (CRHR1) is the main receptor of CRF in the brain and thus a crucial regulator of cerebral CRF signaling. Recent genetic studies found an association of certain CRHR1 single nucleotide polymorphisms (SNPs) with PD and other anxiety disorders. Among the associated CRHR1 SNPs, rs17689918 showed further evidence in a multilevel study regulating CRHR1 gene expression in panic-relevant brain regions and affecting brain activation in fMRI experiments, as well as flight behavior in a behavioral avoidance task (Weber et al, 2015). Here, we aimed to investigate the underlying neurogenetic and neurobiological mechanisms, by which the rs17689918 risk allele affects CRHR1 gene expression and receptor function, and its putative function in the pathophysiology of PD. Due to its intronic position and the predicted change of splicing regulatory elements by the risk allele of rs17689918, the expression of alternative spliced CRHR1 isoforms was investigated using quantitative real-time PCR (qPCR) in a human post-mortem brain tissue sample. Of eight known CRHR1 isoforms, expression of three CRHR1 isoforms and the CRHR1-IT1-CRHR1 readthrough transcript variant 5 – all expressing the seven transmembrane domains needed for functional receptors – was analyzed. Subsequently, electrophysiological assays were developed to measure the receptor activity of differentially expressed CRHR1 isoforms via co-expressed Kir2.3 potassium channels in vitro. In a second approach, possible epigenetic regulation of CRHR1 expression by rs17689918 was investigated by analyses of DNA methylation patterns of a CpG Island within the CRHR1 promoter region, firstly in a case-control sample for PD and secondly in a healthy control sample, separated in high and low anxious individuals. To investigate a possible gene × epigene × environment interaction, the impact of early life stress by means of childhood trauma was evaluated via the childhood trauma questionnaire (CTQ). Finally, consequences of differential DNA methylation of the CRHR1 promoter region on gene expression were investigated by luciferase-based reporter gene assays in vitro. The expression of CRHR1β was significantly decreased in amygdalae and midbrains of risk allele carriers. The expression of CRHR1-IT1-CRHR1 readthrough transcript variant 5 was significantly increased in forebrains and midbrains of risk allele carriers. All other analyzed isoforms showed no differences in expression between non-risk and risk allele carriers of rs17689918. The electrophysiological recordings of membrane potential showed an activation of Kir2.3 channels by CRHR1β in contrast to an inconsistent mix of activation and inhibition of Kir2.3 by the main isoform CRHR1α. DNA methylation of the CRHR1 promoter region was significantly reduced in panic disorder patients, as well as in high anxious individuals of an independent healthy control sample, but no direct relation to the rs17689918 risk allele could be discerned. However, the combination of carrying the risk allele, low DNA methylation and high CTQ scores lead to increased sum scores in the Beck Anxiety Inventory (BAI) in healthy individuals. Functional analyses revealed an activation of gene expression by decreased DNA methylation of the promoter region in vitro. Our results revealed that rs17689918 regulates CRHR1 function by increasing the expression of alternative transcript variants with altered function. Our analyses of DNA methylation revealed decreased methylation as a new risk factor for panic disorder and high anxious behavior, which in combination with other risk factors like childhood trauma and the rs17689918 risk allele might further increase cognitive and somatic anxiety symptoms. This supports the role of CRHR1 as a plasticity gene of anxiety behavior, i.e. a gene that is highly regulated by epigenetic or post-transcriptional mechanisms in response to environmental stressors. By its role in CRF signaling, the dysregulation of CRHR1 might extensively affect the stress response and contribute to the pathophysiology of stress-related disorders like PD. The understanding of the underlying mechanisms, especially the genetic and epigenetic regulation, would however enhance CRHR1 as a target of improved future therapeutics for PD and other anxiety disorders. N2 - Die Panikstörung manifestiert sich durch unerwartete, wiederkehrende Panikattacken, welche sich nicht auf bestimmte Situationen, Medikationen oder Stimuli zurückführen lassen. Bei der Panikstörung handelt es sich, wie bei allen psychischen Erkrankungen, um eine sogenannte multifaktorielle Erkrankung, d.h. sie entwickelt sich aus einem Zusammenspiel von genetischen Faktoren und Umweltfaktoren. Trotz einer geschätzten Heritabilität von bis zu 48% ist bisher kein eindeutiger genetischer Mechanismus bekannt, der zur Entwicklung einer Panikstörung führt. Mehrere Studien konnten eine Fehlregulation der Stressantwort bei Patienten mit Panikstörung feststellen. Dabei konnten mehrfach Polymorphismen in Genen des Corticotropin-Releasing Faktor (CRF) Systems mit Panikstörung assoziiert werden. Insbesondere der Hauptrezeptor von CRF im Gehirn, der Corticotropin Releasing Hormon Rezeptor 1 (CRHR1), konnte in mehreren Studien mit Panikstörung und anderen Angsterkrankungen assoziiert werden. In einer kürzlich erschienenen Studie wurde gezeigt, dass der CRHR1 Einzelnukleotid-Polymorphismus rs17689918 die Genexpression von CRHR1 in Gehirnregionen reguliert, die auch in Angsterkrankungen eine Schlüsselrolle spielen. Zusätzlich zeigten Risikoallelträger eine veränderte Gehirnaktivierung in fMRT Experimenten und ein verändertes Fluchtverhalten in einem Verhaltenstest (Weber et al, 2015). In der vorliegenden Studie wurden die zugrundeliegenden neurogenetischen und neurobiologischen Mechanismen untersucht, anhand derer das Risikoallel von rs17689918 die CRHR1 Genexpression und Rezeptorfunktion beeinflusst, und welche Rolle diese in der Pathophysiologie der Panikstörung spielen. Aufgrund der Position von rs17689918 im Intron von CRHR1 und der in silico berechneten Änderung der Erkennungssequenz für Spleißregulatoren durch das Risikoallel von rs17689918 wurde die Expression alternativer Spleißformen von CRHR1 mittels quantitativer real-time PCR in humanen post-mortem Gehirnproben analysiert. Insgesamt wurde die Expression von vier CRHR1 Isoformen und die Expression der CRHR1-IT1-CRHR1 readthrough Transkriptvariante 5 analysiert. Für funktionelle Analysen wurden elektrophysiologische Assays entwickelt, um durch die Messung der Aktivität von ko-exprimierten Kir2.3 Kaliumkanälen die Rezeptoraktivität der CRHR1 Isoformen in vitro bestimmen zu können. Zusätzlich wurde eine mögliche epigenetische Regulation der CRHR1 Genexpression durch rs17689918 untersucht. Hierfür wurden DNA Methylierungsmuster eines Abschnittes einer CpG-Insel im Promoterbereich des CRHR1 Gens in einer Fall-Kontroll-Stichprobe für Panikstörung und einer weiteren gesunden Kontrollstichprobe – unterteilt in eine hoch-ängstliche und eine niedrig-ängstliche Gruppe – analysiert. Um mögliche Gen-Epigen-Umweltinteraktionen zu untersuchen, wurde zusätzlich der Einfluss belastender Lebensereignisse in frühen Lebensabschnitten mittels dem Childhood Trauma Questionnaire (CTQ) erfasst. Die Funktionalität von differenziell methylierten Abschnitten der CRHR1 Promoterregion wurde mittels Luziferase-basierten Reportergenassays in vitro untersucht. Die Ergebnisse der Expressionsanalyse zeigen eine signifikant verminderte Expression der Isoform CRHR1β in Amygdala- und Mittelhirnproben von Risikoallelträgern. Gleichzeitig war CRHR1-IT1-CRHR1 Transkriptvariante 5 in Vorderhirn- und Mittelhirnproben von Risikoallelträgern signifikant höher exprimiert. Alle anderen Isoformen zeigten keinen Expressionsunterschied zwischen Risiko- und Nicht-Risikoallelträgern von rs17689918. Elektrophysiologische Messungen des Membranpotentials fanden eine Aktivierung der ko-exprimierten Kir2.3 Kanäle durch Isoform CRHR1β, im Gegensatz zu einer inkonsistenten Regulation aus Aktivierung und Inhibition der Kanäle durch die Hauptvariante CRHR1α. Patienten mit Panikstörung zeigten eine geringere DNA-Methylierung der CRHR1 Promoterregion im Vergleich zu gesunden Kontrollen. Gleichzeitig haben hoch-ängstliche gesunde Probanden eine geringere DNA Methylierung der CRHR1 Promoterregion als weniger ängstlichen Probanden. Allerdings konnte kein Einfluss von rs17689918 auf die DNA-Methylierung gefunden werden. Probanden mit einer Akkumulation von Risikofaktoren wie dem Risikoallel von rs17689918, geringer DNA-Methylierung und hohen CTQ-Werten erreichen außerdem höhere Summenwerte im BAI. Die funktionellen Analysen zeigten eine Aktivierung der Genexpression infolge einer geringen DNA-Methylierung der differenziell methylierten CpG-Stellen. Die Ergebnisse zeigen, dass rs17689918 die Funktion von CRHR1 durch eine Verschiebung der Expression zu alternativen, weniger oder nicht-funktionellen Spleißvarianten steuert. Zusätzlich zeigen die Analysen, dass eine verringerte DNA-Methylierung der CRHR1 Promoterregion ein Risikofaktor für Panikstörung und erhöhtes Angstverhalten ist, welcher in Kombination mit weiteren Risikofaktoren wie Kindheitstraumata oder dem rs17689918 Risikoallel ängstliche Verhaltenszüge begünstigt. Dies unterstützt die Hypothese, dass CRHR1 die Funktion eines sogenannten „Plastizitätsgens“ für ängstliches Verhalten und Angsterkrankungen hat, d.h. ein Gen dessen Expression durch epigenetische und posttranskriptionale Modulation in Reaktion auf Umwelteinflüsse reguliert wird. Durch seine wichtige Funktion im CRF-Signalweg könnte eine Fehlregulation von CRHR1 einen weitreichenden Einfluss auf die humane Stressantwort haben und somit auch zur Pathophysiologie von stress-bedingten Erkrankungen wie Panikstörung beitragen. Das Verständnis der zugrundeliegenden Mechanismen, besonders der genetischen und epigenetischen Regulation, würde dazu beitragen CRHR1 als möglichen Ansatzpunkt zukünftiger Therapien für Panikstörung und anderen Angsterkrankungen zu erschließen. KW - Panic Disorder KW - CRHR1 KW - Corticoliberin KW - Rezeptor KW - Paniksyndrom Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-150586 ER - TY - THES A1 - Mambretti, Egle Maria T1 - Opioid receptors as therapeutic targets for nociceptor specific regional analgesia T1 - Opioidrezeptoren als therapeutisches Target einer nozizeptionsspezifischen Regionalanalgesie N2 - Opioids have been, since centuries, the gold standard for pain treatment and relief. They exert their effects after binding to opioid receptors (OP) that are expressed and functional in the central (CNS) and peripheral nervous system (PNS). As their systemic application has many side effects, including sedation and respiratory depression, a peripheral application of opioids and selective targeting of µ-OP (MOP) in nociceptive axons would be extremely beneficial. MOP presence and function has been conclusively demonstrated at nerve terminals; however it is still controversial whether functional MOPs are available on the membrane of peripheral nociceptive axons to mediate opioid-induced antinociception. While under pathologic conditions (i.e. nerve injury) exogenous as well as endogenous MOP agonists applied at the damaged nerve can elicit potent antinociception or anti-allodynia, under physiological conditions no antinociception was seen in rats. This could be caused by either a lack of functional opioid receptors in the axonal membranes or by the inability of injected opioids to cross the intact perineurial barrier and to reach nociceptors. Previous behavioral test results showed an antinociceptive effect (up to 5h) following perisciatic application of the hydrophilic DAMGO (MOP agonist) if coinjected with hypertonic saline solution (HTS; 10% NaCl), a treatment suited to open the perineural barrier. The effect was inhibited by naloxone, a MOP antagonist, documenting its specific action via MOP. Fentanyl, a lipophilic opioid, elicited an effect, which was enhanced by HTS treatment, indicating that HTS may act not only on the barrier but also directly on axonal MOP presence and/or functionality. To provide a basis for testing this hypothesis, the present work was designed to study the axonal localization of MOP in experimental animals under different conditions using molecular and morphological methods. Initially four different commercial antibodies were tested for MOP detection. Immunoreactions with these antibodies specifically detected MOP in the hippocampus and in amygdala, while in the peripheral nervous system the reactions showed varying labeling patterns pointing towards less specificity with low signal-to-noise ratio. Double labelling with calcitonin gene related peptide (CGRP), a neuropeptide expressed in sensory fibers, with the non-compacted myelin marker S100 or with the neuronal marker PGP9.5 documented significant immunoreaction signals outside sensory nerve fibers. Therefore, none of these antibodies appeared suitable. Taking advantage of a new commercial monoclonal rabbit antibody (RabMAb) and of genetically modified mice in which the fluorescent protein mcherry was inserted in the C-tail of MOP (MOP-mcherry knock-in mice), MOP fusion protein expression in rat and mouse CGRP+ sciatic nerve fibers and fiber bundles was confirmed by immunofluorescence labeling. Immunoelectron microscopic analysis indicated MOP/MOP-mcherry-localization in the cytoplasm and the membranes of unmyelinated axons organized in Remak bundles. Both antibodies detected bands of appropriate size in Western Blot in the CNS and additional larger bands in the PNS. Quantitative analyses 60 min after HTS-treatment revealed no change in MOP mRNA in the sciatic nerve and DRG as well as no change in MOP immunoreactivity in the sciatic nerve. Thus, the opioid-induced long lasting antinociception enhanced by perisciatic injection of HTS were not due to a sustained increased MOP expression or content in sensory, putative nociceptive axons. In summary, the current study succeeded to unequivocally document the presence of MOP protein in intact sensory axons of rat and mouse sciatic nerve. Thus, axonal MOPs may indeed mediate antinociceptive opioid effects observed in behavioral studies in naive animals possibly via activation of potassium or calcium channels. As HTS treatment does not lead to a sustained increase in axonal MOP protein or MOP mRNA expression, other mechanisms might enhance MOP function, including inhibition of MOP recycling or changes in functional coupling. Future studies should further explore the axonal mechanisms of antinociception by opioids and enhancing treatments. N2 - Opioide sind seit Jahrhunderten der Goldstandard für die Schmerzbehandlung. Sie entfalten ihre Wirkung nach der Bindung mit Opioidrezeptoren (OP), die im zentralen (ZNS) und peripheren (PNS) Nervensystem exprimiert und funktionell sind. Da die systemische Anwendung viele Nebenwirkungen hat, wie die Beruhigung und Atemdepression, wäre eine Anwendung von Opioiden und die gezielte Targeting von µ-OP (MOP) in nozizeptiven Axone in Rahmen einer Regionalanalgesie besser. Die Anwesenheit und die Funktionalität der MOP wurden zwar schon in Nervenendungen gezeigt, aber es ist noch strittig, ob funktionelle MOP in der Membran von peripheren nozizeptiven Axonen sind, um opioid-induzierte Antinozizeption zu vermitteln. Während bei Erkrankungen der Nerven (z.B. traumatische Nervenbeschädigung) exogene und endogene MOP-Agonisten Antinozizeption und Antiallodynie bewirken, konnte in gesunden Ratten kein Effekt bei perineuraler Injektion am Nerven beobachtet werden. Dies könnte entweder durch einen Mangel an funktionellen OP in axonalen Membranen verursacht sein. Alternativ könnte die mangelde Penetration der injizierten Opioide durch die Barriere des Perineuriums verantwortlich sein, die es verhindert, dass die Opioide die Nozizeptoren erreichen. Vorherige Ergebnisse aus Schmerzverhaltenstests zeigten eine Anhebung von mechanischen nozizeptiven Schwellen (bis 5 h) nach perineuraler Anwendung des hydrophilen MOP-Agonisten DAMGO, wenn dieser mit einer hypertonen Lösung (HTS; 10% NaCl) ko-injiziert war. Denn dies ist eine geeignete Behandlung, die die Barriere des Perineuriums öffnet. Der Effekt wurde von Naloxon, einem MOP-Antagonist, gehemmt, was eine spezifische Wirkung via MOP unterstützt. Die Wirkung von Fentanyl, einem lipophilen Opioid, wurde ebenfalls durch die HTS-Behandlung verbessert. Das führt zu unserer Hypothese, dass HTS nicht nur die Schranke öffnet, sondern auch direkt Expression und/oder Funktionalität von axonalen MOP verbessert. Um eine Grundlage für die Untersuchung dieser Hypothese zu schaffen, war das Ziel dieser Arbeit, die axonale MOP bei Versuchstieren unter verschiedenen Bedingungen mit molekularen und morphologischen Methoden zu charaktiersieren. Am Anfang wurden vier verschiedene kommerzielle Antikörper für die Erkennung der MOP getestet. Immunreaktionen mit diesen Antikörpern wiesen spezifisch MOP in dem Hippocampus und in der Amygdala nach, während im peripheren Nervensystem die Immunreaktion veränderliche Markierungsmuster und weniger Spezifität mit einem ungünstigeren Signal-zu-Hintergund Verhältnis zeigte. Die Doppelmarkierung mit calcitonin gene-related peptide (CGRP), einem Neuropeptid, das in sensorischen Fasern exprimiert ist, mit dem Marker für non-compacted Myelin S100 oder mit dem neuronalen Marker PGP9.5, bestätigte ein reproduzierbares Färbemuster außerhalb sensorischer Nervenfasern. Deshalb war keiner dieser Antikörper geeignet. Mit der Anwendung eines neuen kommerziell erhältlichen monoklonalen Kaninchen Antikörpers (RabMAb) gegen MOP sowie gentechnisch veränderten Mäusen, bei denen das fluoreszierende Protein mCherry in das C-terminale Ende von MOP eingefügt wurde (MOP-mcherry knock-in Mäusen), wurden MOP und das MOP-Fusionprotein im CGRP+ im Ischiasnerv und Fasernbündeln durch Immunfluoreszenzmarkierung von Ratten und Mäuse bestätigt. Die immunelectron-mikroscopische Analyse zeigte MOP/MOP-mcherry im Zytoplasma und der Membran unmyelinizierter Axone, die in Remak Bündlen organisiert sind. Beide Antikörper erkannten Banden in richtige Größe in Western Blot in ZNS und mehrere größere Banden in PNS. Quantitative Analysen 60 min nach HTS-Behandlung zeigten keine Veränderung in MOP mRNA in dem Ischiasnerv und Hinterwurzelganglion sowie keine Veränderung in der MOP-Immunreaktivität in dem Ischiasnerv. Daher müssen noch weitere Ursachen für die verbesserte Wirkung von Opioiden am Nerven nach HTS in Betracht gezogen werden. Zusammenfassend konnte diese Studie die MOP-Proteins in intakten sensorischen Axonen des N. ischiadicus der Ratte und Maus eindeutig nachweisen. Axonale MOPs könnten über Kaliumkanäle oder Calciumkanäle in den Verhaltenstests bei naiven Tiere antinozizeptiv wirken. Da die HTS Behandlung zu keiner deutlichen Steigerung von axonalem MOP-Protein führen kann, sollten anderen Mechanismen wie MOP-Recycling oder Veränderung der intrazellulären Singaltransduktion untersucht werden, die die Funktionalität von MOP erhöhen. Zukünftige Studien ferner den genauen Mechanismus klären, wie axonal Opioide antinozizeptiv wirken, um so die Behandlung von Schmerzen mit Regionalanalgesie weiter zu verbessert. KW - opioid receptors KW - nociceptors KW - regional analgesia KW - Opioide KW - Rezeptor KW - Nozizeptor KW - Lokalanästhesie Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-128866 ER - TY - THES A1 - Subbarayal, Prema T1 - The role of human Ephrin receptor tyrosine kinase A2 (EphA2) in Chlamydia trachomatis infection T1 - Die Rolle der humanen Rezeptor-Tyrosinkinase EphrinA2 (EphA2) in der Chlamydia trachomatis Infektion N2 - Chlamydia trachomatis (Ctr), an obligate intracellular gram negative human pathogen, causes sexually transmitted diseases and acquired blindness in developing countries. The infectious elementary bodies (EB) of Ctr involved in adherence and invasion processes are critical for chlamydial infectivity and subsequent pathogenesis which requires cooperative interaction of several host cell factors. Few receptors have been known for this early event, yet the molecular mechanism of these receptors involvement throughout Ctr infection is not known. Chlamydial inclusion membrane serves as a signaling platform that coordinates Chlamydia-host cell interaction which encouraged me to look for host cell factors that associates with the inclusion membrane, using proteome analysis. The role of these factors in chlamydial replication was analyzed by RNA interference (RNAi) (in collaboration with AG Thomas Meyer). Interestingly, EphrinA2 receptor (EphA2), a cell surface tyrosine kinase receptor, implicated in many cancers, was identified as one of the potential candidates. Due to the presence of EphA2 in the Ctr inclusion proteome data, I investigated the role of EphA2 in Ctr infection. EphA2 was identified as a direct interacting receptor for adherence and entry of C. trachomatis. Pre-incubation of Ctr-EB with recombinant human EphA2, knockdown of EphA2 by siRNA, pretreatment of cells with anti-EphA2 antibodies or the tyrosine kinase inhibitor dasatinib significantly reduced Ctr infection. This marked reduction of Ctr infection was seen with both epithelial and endothelial cells used in this study. Ctr activates EphA2 upon infection and invades the cell together with the activated EphA2 receptor that interacts and activates PI3K survival signal, promoting chlamydial replication. EphA2 upregulation during infection is associated with Ctr inclusion membrane inside the cell and are prevented being translocated to the cell surface. Ephrins are natural ligands for Ephrin receptors that repress the activation of the PI3K/Akt pathway in a process called reverse signaling. Purified Ephrin-A1, a ligand of EphA2, strongly interferes with chlamydial infection and normal development, supporting the central role of these receptors in Chlamydia infection. Overexpression of full length EphA2, but not the mutant form lacking the intracellular cytoplasmic domain, enhanced PI3K activation and Ctr infection. Ctr infection induces EphA2 upregulation and is mediated by activation of ERK signaling pathway. Interfering with EphA2 upregulation sensitizes Ctr-infected cells to apoptosis induced by tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) suggesting the importance of intracellular EphA2 signaling. Collectively, these results revealed the first Ephrin receptor “EphA2” that functions in promoting chlamydial infection. In addition, the engagement of a cell surface receptor at the inclusion membrane is a new mechanism how Chlamydia subverts the host cell and induces apoptosis resistance. By applying the natural ligand Ephrin-A1 and targeting EphA2 offers a promising new approach to interfere with Chlamydia infection. Thus, the work provides the evidence for a host cell surface tyrosine kinase receptor that is exploited for invasion as well as for receptor-mediated intracellular signaling to facilitate the chlamydial replication. N2 - Chlamydia trachomatis (Ctr) ist ein obligat intrazellulär lebendes Gram negatives Bakterium, das Geschlechtskrankheiten verursachen kann. In Entwicklungsländern führt es zudem häufig zu erworbener Blindheit. Die infektiösen Elementarkörper (EB) sind für die Anheftung an die Wirtszelle sowie die Aufnahme von Ctr in die Wirtzelle verantwortlich. Dies ist ein wichtiger Schritt, da nur so die sich anschließende Krankheitsentwicklung stattfinden kann. Diese ist auch abhängig vom engen Zusammenspiel der Ctr Proteine mit den Wirtszellfaktoren. Obgleich dieser Schritt so wichtig ist, wurden erst wenige Wirtszellrezeptoren gefunden und welche Rolle diese Rezeptoren im weiteren Verlauf der Infektion spielen, ist noch nicht richtig verstanden. Die chlamydiale Inklusionsmembran fungiert als Signalplattform, die das Zusammenspiel von Chlamydien und Wirtszelle koordiniert. In dieser Arbeit wurden die Wirtszellproteine, die an der Inklusionsmembran lokalisiert sind, mit Hilfe einer Proteomanalyse identifiziert. Anschließend wurde die Rolle dieser Proteine bei der Chlamydienvermehrung in einem RNAi screen untersucht (in Zusammenarbeit mit der AG Thomas Meyer). Hier wurde überraschenderweise der EphrinA2 Rezeptor, eine sich auf der Oberfläche der Zellen befindliche Rezeptor Tyrosin Kinase, die vor allem mit Krebs in Verbindung gebracht wird, als ein potentieller Kandidat identifiziert. Da die Proteomdaten gezeigt haben, dass EphrinA2 an der Inklusionsmembran lokalisiert ist, wurde die Rolle von EphrinA2 während der Ctr Infektion hier näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass EphrinA2 ein direkter Rezeptor für Ctr ist, der sowohl die Adhärenz als auch die Aufnahme von Ctr in die Wirtszelle bewerkstelligt. Vorinkubation von Ctr- EB mit rekombinantem menschlichen EphrinA2, das herunterregulieren von EphrinA2 mit Hilfe einer siRNA oder das Vorinkubieren der menschlichen Zelle mit Antikörpern gegen EphrinA2 oder dem Tyrosinkinase Inhibitor Dasatinib, reduzierten die Ctr Infektion signifikant. Diese drastische Reduktion der Ctr Infektion wurde sowohl in Epithelzellen als auch in Endothelzellen beobachtet. Ctr aktiviert EphrinA2 während der Infektion und invadiert die Wirtszelle zusammen mit dem aktivierten Rezeptor, dieser interagiert mit dem aktivierten PI3K Überlebenssignal, was die Replikation der Chlamydien ermöglicht. An der Inklusionsmembran akkumuliert EphrinA2, da der Transport von neuem Rezeptor zur Zellmembran unterbunden ist. Ephrine sind die natürlichen Liganden der Ephrinrezeptoren, sie unterdrücken die Aktivierung des PI3K/Akt Signalweges in einem Prozess, der reverse Signalübertragung genannt wird. Aufgereinigtes Ephrin-A1, ein Ligand des EphrinA2 Rezeptors, verhindert eine normale Chlamydieninfektion, was eine zentrale Rolle dieses Rezeptors weiterhin bestätigt. Die Überexpression von EphrinA2, erhöhte die PI3K Aktivierung und Ctr Infektion. Dies war nicht der Fall, wenn eine Mutante, der die intrazelluläre Domäne fehlt, überexprimiert wurde. Eine Ctr Infektion induziert die Hochregulierung von EphrinA2, welche durch die Aktivierung des ERK Signalwegs bewerkstelligt wird. Wenn die Hochregulierung von EphrinA2 verhindert wird, werden Ctr infizierte Zellen sensitiver für Apoptose induziert durch tumor necrosis factor-alpha (TNF-α), was ein weiter Hinweis für die Bedeutung der intrazellulären EphrinA2 Signalübermittlung ist. Insgesamt haben diese Ergebnisse den ersten Ephrin Rezeptor "EphA2" offenbart, der in der Förderung chlamydialer Infektionen fungiert. Hinzu kommt, dass die Bindung eines Oberflächenrezeptors an die Inklusionsmembran ein neuer Mechanismus ist, die Wirtszelle zu verändern und eine Apoptoseresistenz in der Zelle zu induzieren. Die Zugabe des natürlichen Liganden Ephrin-A1 eröffnet eine neue vielversprechende Möglichkeit Chlamydieninfektionen zu bekämpfen. Daher liefert diese Arbeit erste Hinweise, das eine Wirtszelltyrosinkinase, die sich an der Zelloberfläche befindet, notwendig ist für die Invasion und die intrazelluläre Signalübermittlung, welche für die chlamydiale Replikation notwendig ist, essentiell ist. KW - Chlamydia trachomatis KW - ctr KW - Ephrine KW - Rezeptor KW - endocytosis KW - Ephrin ligand KW - chlamydia KW - signalling KW - PI3K KW - EphA2 Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114778 ER - TY - THES A1 - Vögtle, Timo T1 - Studies on receptor signaling and regulation in platelets and T cells from genetically modified mice T1 - Studien zur Signaltransduktion und Regulierung von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen genetisch veränderter Mäuse N2 - Receptors with tyrosine-based signaling motifs control essential functions of hematopoietic cells, including lymphocytes and platelets. Downstream of the platelet receptor glycoprotein (GP) VI and the T cell receptor (TCR) the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) initiates a signaling cascade that involves kinases, adapter and effector proteins and finally leads to cellular activation. This thesis summarizes the results of three studies investigating different aspects of receptor signaling and regulation in platelets and T cells. In the first part, the impact of constitutive Ca2+ influx on TCR signaling and T cell physiology was investigated using a transgenic mouse line with a mutation in the Ca2+ sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1). The elevated cytoplasmic Ca2+ level resulted in an altered phosphorylation pattern of the key enzyme phospholipase (PL) Cγ1 in response to TCR stimulation, but without affecting its enzymatic activity. Withdrawal of extracellular Ca2+ or inhibition of the phosphatase calcineurin restored the normal phosphorylation pattern. In addition, there was a decrease in the release of Th2-type cytokines interleukin 4, 5 and 13 upon stimulation in vitro. The second part of the thesis deals with the role of the adapter protein growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in platelets using a megakaryocyte/platelet-specific knockout mouse line. Loss of Grb2 severely impaired signaling of GPVI and C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2), a related hemITAM receptor. This was attributed to defective stabilization of the linker for activation of T cells (LAT) signalosome and resulted in reduced adhesion, aggregation, Ca2+ mobilization and procoagulant activity downstream of (hem)ITAM-coupled receptors in vitro. In contrast, the signaling pathways of G protein-coupled receptors (GPCRs) and the integrin αIIbβ3, which do not utilize the LAT signalosome, were unaffected. In vivo, the defective (hem)ITAM signaling caused prolonged bleeding times, however, thrombus formation was only affected under conditions where GPCR signaling was impaired (upon acetylsalicylic acid treatment). These results establish Grb2 as an important adapter protein in the propagation of GPVI- and CLEC-2-induced signals. Finally, the proteolytic regulation of the immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM)-bearing receptor CD84 in platelets was investigated. This study demonstrated that in mice CD84 is cleaved by two distinct and independent proteolytic mechanisms upon platelet activation: shedding of the extracellular part, which is exclusively mediated by a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 and cleavage of the intracellular C-terminus by the protease calpain. Finally, the analysis of soluble CD84 levels in the plasma of transgenic mice revealed that shedding of CD84 by ADAM10 occurs constitutively in vivo. N2 - Rezeptoren mit Tyrosin-basierten Signaltransduktionsmotiven sind von fundamentaler Bedeutung für die Funktion hematopoietischer Zellen wie Lymphozyten und Thrombozyten. Unterhalb des Glykoproteins (GP) VI auf Thrombozyten und des T-Zell Rezeptors (TZR) auf T-Zellen initiiert das immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM) eine Signalkaskade, die Kinasen, Adapter- und Effektorproteine mit einbezieht und schlussendlich zur Aktivierung der Zelle führt. Die hier vorgelegte Arbeit fasst die Ergebnisse dreier Studien zusammen, die sich mit verschiedenen Aspekten der Signaltransduktion und Regulation von Rezeptoren in Thrombozyten und T-Zellen befasst. Im ersten Teil wurde der Einfluss eines konstitutiven Ca2+-Einstroms auf die TZR Signalkaskade und T-Zell Funktion untersucht. Hierzu wurde eine transgene Mauslinie mit einer Mutation im Ca2+-Sensor stromal interaction molecule 1 (STIM1) verwendet. Die erhöhte zytoplasmatische Ca2+-Konzentration veränderte das Phosphorylierungsmuster der Phospholipase (PL) Cγ1, ein Schlüsselenzym der Signalkaskade, nach Stimulation des TZRs. Die enzymatische Aktivität der PLCγ1 blieb hierbei jedoch unverändert. In der Abwesenheit von extrazellulärem Ca2+ oder bei Inhibition der Phosphatase Calcineurin war das Phosphorylierungsmuster hingegen wieder normal. Darüber hinaus zeigten die T Zellen nach Stimulation in vitro eine verringerte Produktion von Interleukinen des Th2-Typs (Interleukin-4, 5 und 13). Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit der Funktion des Adapterproteins growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) in Thrombozyten, die unter Zuhilfenahme einer Megakaryozyten- und Thrombozyten-spezifischen Knockout Mauslinie untersucht wurde. Hierbei zeigte es sich, dass der Verlust von Grb2 die Signaltransduktion von GPVI und des verwandten hemITAM-Rezeptors C type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) schwer beeinträchtigt. Dies konnte auf eine mangelnde Stabilisierung des linker for activation of T cells (LAT) Signalosoms zurückgeführt werden und resultierte in einer verminderten Adhäsion, Aggregation, Ca2+-Mobilisierung und prokoagulatorischen Aktivität nach Aktivierung (hem)ITAM gekoppelter Rezeptoren in vitro. Im Gegensatz hierzu blieben die Signaltransduktionswege G-protein-gekoppelter Rezeptoren (GPCRs) und des Integrins αIIbβ3, die das LAT Signalosom nicht nutzen, unbeeinflusst. In in vivo Studien verursachte die beeinträchtigte (hem)ITAM Signaltransduktion eine verlängerte Blutungszeit der Mäuse, während die Entstehung von Thromben nur bei gleichzeitiger Hemmung von GPCR-Signalwegen (durch Acetylsalicylsäuregabe) vermindert war. Diese Ergebnisse etablieren Grb2 als ein wichtiges Adapterprotein in der Signaltransduktionskaskade von GPVI und CLEC-2. Schließlich wurde im dritten Teil dieser Arbeit die proteolytische Regulation des Rezeptors CD84, der ein immunoreceptor tyrosine-based switch motif (ITSM) enthält, untersucht. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass CD84 in Mausthrombozyten durch zwei verschiedene und unabhängige proteolytische Mechanismen geschnitten wird: Zum einen durch Shedding des extrazellulären Teils, was ausschließlich durch die a disintegrin and metalloproteinase (ADAM) 10 bewerkstelligt wird, und zum anderen durch das Schneiden des intrazellulären C Terminus durch die Protease Calpain. Des Weiteren zeigte eine Untersuchung von Plasmaproben transgener Mäuse, dass das Shedding von CD84 durch ADAM10 konstitutiv in vivo erfolgt. KW - Thrombozyt KW - T-Lymphozyt KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Calcium KW - Platelet KW - Thrombose KW - T cell KW - receptor signaling KW - calcium KW - ITAM KW - Hämostase KW - Metalloproteinasen KW - Adapterprotein Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-97114 ER - TY - THES A1 - Sumski, Anna Magdalena T1 - Adenosinrezeptoren auf Zervix-, Uterus- und Mammakarzinomzellen T1 - Adenosine receptors in cervical, uterine and breast cancer cells N2 - Adenosinrezeptoren werden auf nahezu allen Körperzellen exprimiert und übernehmen dort vielfältige und wichtige Funktionen. Auch auf diversen Tumorzelllinien konnten bereits Adenosinrezeptoren nachgewiesen und – je nach Subtyp – mit Pro- oder Anti-tumor-Effekten in Zusammenhang gebracht werden. In dieser Arbeit wurden Gebärmutterhalskrebszellen sowie endometriale und triple-negative Brustkrebszellen auf Expression und mögliche Funktionen von Adenosinrezep-toren untersucht. Da spezifische Antikörper bis heute nicht verfügbar sind, wurde ein pharmakologischer Ansatz mit subtypspezifischen Agonisten und Antagonisten gewählt. In Radioliganden-Bindungsassays, konnte nachgewiesen werden, dass sich auf der Zer-vixkarzinom-Zelllinie SiHa und der Brustkrebs-Zelllinie HCC1806 Adenosinrezeptoren des Subtyps A1 befinden. Die endometrialen Krebszelllinien Ishikawa und HEC-1-A exprimieren Rezeptoren vom Subtyp A1 und A2A. A3-Adenosinrezeptoren wurden auf keiner der untersuchten Zelllinien gefunden. Der Nachweis von A2B-Rezeptoren kann mit dem Radioliganden-Bindungsassay nicht erbracht werden, da bislang kein Radioligand bekannt ist, der eine ausreichende Affini-tät besitzt, um diesen Subtyp zweifelsfrei nachweisen zu können. Obwohl die Mehrheit der untersuchten Zelllinien Adenosinrezeptoren exprimiert, konnte ein signifikanter Effekt auf die Adenylatcyclase bei Stimulation der auf den Zellen vorhandenen Adenosinrezeptoren nur bei den HEC-1-A-Zellen festgestellt werden. Auch auf funktionelle A2B-Rezeptoren fand sich im Adenylatcyclaseassy kein Hinweis. Im durchgeführten Kristallviolettassay zeigte sich ein proapoptotischer Effekt auf Ishi-kawa- und HEC-1-A-Zellen bei hohen Adenosin-Konzentrationen (100 µM). Die im BrdU-Assay gemessene Proliferationsrate hingegen änderte sich nach Vorbehandlung mit Adenosin nicht. Das metabolisch stabilere NECA (in Kombination mit ADA) hatte im Kristallviolettassay einen stärkeren Einfluss auf die Apoptoserate der jeweiligen Zelllinie als Adenosin und auch im BrdU-Assay sank die Menge an inkorporiertem BrdU. Ein Synergismus zwischen Stimulation von Adenosinrezeptoren und diversen Todesliganden bzw. Chemotherapeutika konnte nicht nachgewiesen werden. Freies extrazelluläres Adenosin kann auch aus dem Abbau von ATP generiert werden, wenn Zellen die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 exprimieren. Aufgrund der im-munsuppressiven Wirkung von Adenosin können diese Enzyme T-Zell- und NK-Zellantworten im Mikromilieu von Tumoren hemmen. Die durchflusszytometrische Analyse von HEC-1-A- und Ishikawa-Zellen zeigte zwar, dass die Expression von CD39 und CD73 nach Stimulation der Adenosinrezeptoren unverändert blieb. Die Ex-pression von Enzymen, lässt aber vermuten, dass die Zellen in vivo von Adenosin profi-tieren könnten. Angesichts der in vitro Daten, die allenfalls einen wachstumshemmen-den Effekt von Adenosin zeigten, könnte die vorrangige Wirkung von Adenosin im Tumormikromilieu tatsächlich auf der Inhibition von Immunantworten beruhen. Mög-licherweise würden die Rezeptoren dann in erster Linie als Sensoren dienen. Weitere Forschungsarbeit wird helfen, die Rolle der Adenosinrezeptoren im Tumorge-schehen vollständig zu verstehen und möglicherweise für die Krebstherapie nutzbar zu machen. N2 - In this thesis, cell lines from cervical, endometrial and triple-negative breast cancer were investigated for expression and putative functions of adenosine receptors. Due to the lack of specific antibodies, a pharmacological approach using subtype-specific agonists and antagonists was taken. Radio ligand binding assays showed that adenosine receptors of the A1 subtype are expressed by SiHa cervical cancer and by HCC1806 breast cancer cells. Receptors of the A1 and A2A subtype are expressed by the endometrial cancer cell lines Ishikawa and HEC-1-A. A3 adenosine receptors could not be detected in any of the 5 investigated cell lines and the presence of receptors of the A2B subtype cannot be assessed with the available ligands. However, while the majority of the cell lines expressed adenosine receptors, a significant effect of adenosine receptor stimulation on adenylylcyclase activity was only detected in HEC-1-A cells. In crystal violet assays, high concentrations (100 µM) of adenosine showed a proapoptotic effect in Ishikawa- and HEC-1-A cells. The proliferation rate as measured by BrdU uptake was not affected by adenosine. The metabolically more stable adenosine receptor agonist NECA (in combination with ADA) had, in contrast, a stronger impact on the rate of apoptosis in the respective cell lines. Moreover, NECA also reduced BrdU uptake. Using various chemotherapeutics and death ligands, no synergy was observed between stimulation of adenosine receptors and further death stimuli. Free extracellular adenosine can also be generated from ATP when cells express the ectonucleotidases CD39 and CD73. Due to the immunosuppressive effect of adenosine, these enzymes can inhibit T cell and NK cell responses in the tumor microenvironment. Flow cytometry, however, showed that expression of CD39 and/or CD73 remained unaltered after stimulation of adenosine receptors. Thus, further investigations will be required to reveal the functional role of adenosine receptor expression on the investigated tumor cell lines. KW - Adenosinrezeptor KW - Rezeptor KW - Adenosin KW - Gebärmutterhalskrebs KW - Brustkrebs KW - Liganden KW - Adenylatcyclaseassay KW - FACS KW - Bindungsassay KW - BrdU Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99332 ER - TY - THES A1 - Kottmair, Mathias T1 - Bambi – Charakterisierung eines inhibitorischen BMP-Pseudorezeptors T1 - Bambi - characterization of an inhibitoric BMP pseudoreceptor N2 - Die TGF-β-Proteinfamilie umfasst eine Vielzahl von zumeist homodimeren sezernierten Liganden in höheren Tieren, die viele Vorgänge und Entwicklungen im Embryo wie im adulten Lebewesen über absolute oder graduelle Einflussnahme steuern. Die Signalweiterleitung ins Zytoplasma und den Nukleus erfolgt über promisk paarig rekrutierte Typ-I- und Typ-II-Rezeptoren, ehe vorwiegend rezeptorabhängig verschiedene SMAD-Proteine von Typ-I-Kinasen der Rezeptoren aktiviert werden, in den Kern translozieren und die Transkription induzieren. Zu jedem Zeitpunkt dieser Signalweiterleitung kann mittels verschiedener endogener Inhibitoren regulatorisch eingegriffen werden. Dem bisher einzig bekannten membranständigen Pseudorezeptor Bambi (BMP and Activine membrane bound inhibitor) wurde in vorangegangenen Arbeiten inhibitorisches Potential gegenüber dem BMP- und Activin-vermittelten Signalweg über Bindung an distinkte ligandenadressierte Rezeptoren zugeschrieben, wobei die genaue Wirkweise bislang noch vollkommen unklar war. In der vorliegenden Arbeit wurde initial ein Homologiemodell der extrazellulären Domäne von hBambi anhand der gelösten Kristallstruktur der extrazellulären Domäne von BR1A im gebundenen Zustand (PDB-ID: 1REW) erstellt. Anhand dieses Modells wurde eine Arbeitshypothese entwickelt und es gelang in der Folge, biologisch aktives rekombinantes Protein zum einen aus transfizierten Insektenzellen sowie aus der Renaturierung aus bakteriellen Einschlusskörpern in hinreichender Menge herzustellen und chromatographisch aufzureinigen. Nach einer vergleichenden Qualitätskontrolle beider Exprimate wurden mittels CD-Spektroskopie und analytischer Gelfiltration der Anteil der Sekundärstrukturelemente sowie der Oligomerisierungsgrad erfolgreich bestimmt. In SPR-Bindestudien wurde der Beweis erbracht, dass hBambi-ECD Affinität zu annähernd allen getesteten Liganden der BMP-/GDF-Gruppe, die den SMAD-1/-5-/-8-Signalweg aktivieren, zeigt. Bekannte Typ-I- und Typ-II-Bindungsmutanten von BMP-2 wurden ebenfalls von hBambi-ECD quasi wildtypisch gebunden. Verschiedene Rezeptorektodomänen sowie ActivinA wurden, wie bisher in der Literatur fälschlich angenommen wurde, hingegen nicht gebunden. Die propagierte Homooligomerisierung von Bambi wird überdies nicht über die extrazelluläre Domäne vermittelt. Eingesetzt in Stimulationsversuche mit BMP-responsiven Zellen wurde eine konzentrationsabhängige inhibierende Wirkung von freier hBambi-ECD auf die BMP-2-vermittelte Signalweiterleitung mit unterschiedlichen Nachweismethoden ermittelt, welche die Ergebnisse aus den SPR-Versuchen erfolgreich bestätigten. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurden verschiedene chimäre Konstrukte aus für Bambi- und BR1A-Domänen kodierenden Sequenzen kloniert, in HEK Ad293-Zellen zusammen mit BMP- und Activin-responsiven Reportergenkonstrukten transient transfiziert und Stimulationsversuche mit BMP-2 und ActivinA durchgeführt. Wildtypisches Bambi zeigte hierbei ein ambivalentes Verhalten in Bezug auf die Regulation des BMP-2-Signals: geringe Mengen wirken agonistisch, höhere Mengen antagonistisch auf die Ausbildung des Reporters. Im Fall von ActivinA zeigte sich hingegen kein antagonistischer Einfluss von Bambi. In den Experimenten mit chimären Varianten erfolgte durch die erhaltenen Daten die Eingrenzung der Bindestelle von hBambi-ECD an BMP-2 auf den Bereich der Typ-I-Bindestelle. Ein direkter Einfluss der intrazellulären Domäne auf den BMP-2-Signalweg wurde ausgeschlossen. Weiterhin konnte gerade in Versuchen mit einem Antikörper gegen BR1A-ECD eine weitere Eigenheit der Bindung von Bambi an den Liganden offenbart werden: so bildet das Konstrukt aus hBambi-ECD und der intrazellulären BR1A-Domäne mit zugehöriger GS-Box und Typ-I-Kinase einen korrekt in den signalaktiven heterohexameren Komplex rekrutierten funktionellen Typ-I-Rezeptor. Mit den in dieser Arbeit erzielten Ergebnissen, nämlich der gelungenen Erstellung eines Herstellungsprotokolls der ECD, deren erfolgreich identifizierten Bindepartnern sowie der Charakterisierung der Bindung an BMP-2 ist der Grundstein für die Strukturaufklärung von hBambi-ECD gelegt, welche weitere Klarheit in die Funktionalität dieses Modulators der BMP-/GDF-vermittelten Signalweiterleitung bringen wird. Ebenso sind erste das Verständnis der ICD aufklärende Ergebnisse erzielt worden, die das Fundament für weitere Experimente und darauf folgende Kenntnisgewinne darstellen werden. N2 - The protein family of TGF-β-proteins consists of a huge number of predominantly homodimeric secreted ligands in higher animals, regulating many processes and developmental procedures in embryonic and adult forms via absolute or gradual influence. Signal transduction to cytoplasm and nucleus occurs by the aid of promiscuous, pairwisely recruited type-I- and type-II-receptors, usually activating a variety of receptor-dependent nucleus-permissive SMAD-proteins by an intracellular kinase-phosphorylation-cascade. After translocation they induce transcription of bre-promoted genes. Every signal transduction step may be interfered by endogenous inhibitors. So far the known membrane-bound pseudoreceptor Bambi (BMP and activine membrane-bound inhibitor) is hypothesized to have inhibitory potential against BMP- and activin-mediated signaling pathway via binding of distinct ligand-dependent receptors. However, its proper function still remains unclear. At the beginning of this work a homology model of the extracellular domain of hBambi was built based on a solved 3D-structure of BR1A-ECD bound to its ligand (PDB-ID: 1REW). Upon this model a work hypothesis was issued and biologically active recombinant protein was obtained successfully, both from transfected insect cells and from refolding ex bacterial inclusion bodies in sufficient amount and purified by chromatography, respectively. After comparative quality control of both samples the degree of oligomerisation and secondary structure composition was analyzed via CD spectroscopy and analytical gelfiltration runs. Binding affinity towards nearly all ligands of BMP-/GDF-group assigned to SMAD-1/-5-/-8-signaling was shown for hBambi-ECD by SPR experiments. Known BMP-2-mutants lacking affinity for type-I- or type-II-receptors exhibited wildtype-like binding to hBambi-ECD, respectively. Contrary to the current opinion, neither various ectodomains of receptors nor ActivinA did show any specific binding. Moreover, proposed homooligomerisation of Bambi is not mediated via ECD. Introduction of hBambi-ECD into stimulation experiments on several BMP-responsive cells with differing detection modes yielded in concentration-dependent inhibition of BMP-2-signalling, confirming the results of SPR-attempts well. In a further part of this work various chimeric constructs consisting of Bambi- and BR1A-coding sequence were cloned and effectively co-transfected into HEK Ad293 cells together with plasmids coding for BMP- and Activin-dependent reporters. Stimulation experiments with BMP-2 and ActivinA provided insights into Bambi participation within cellular processes. Full length Bambi exhibited ambivalent behaviour with respect to BMP-2-signaling: small amounts have an agonistic effect, while increasing levels revert it into an antagonistic one with respect to reporter formation. Regarding ActivinA no antagonistic effect was observed. Assays with chimeric constructs led to a containment for Bambi-epitope to the type-I-binding-site of BMP-2. Direct impact of Bambi-ICD on BMP-2-signaling could be blackballed. Furthermore, attempts with an antibody against BR1A-epitope revealed another feature of Bambi-binding to the ligand: a construct of Bambi-ECD fused to intracellular BR1A-domain including kinase and GS-Box forms a functional type-I-receptor correctly orientated and incorporated into heterohexameric signaling-complex. Upon gained results within this work, namely the successful establishment of a purification protocol for the extracellular domain of hBambi, the identification of its binding partners as well as the characterization of a prominent binding partner the basis for successful structure determination of hBambi-ECD aiming to unravel the function of this modulator of BMP-/GDF-signaling is laid. Likewise, first knowledge of the ICD was acquired that will be the basis for further experiments leading to continuative scientific findings. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - BMP KW - Rezeptor KW - Inhibitor KW - Activin KW - Transforming Growth Factor KW - Bambi KW - Inhibitor KW - Activin KW - TGF Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103530 ER - TY - THES A1 - Hellmann, Tina Verena T1 - Einfluss des Corezeptors Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) auf den Signalweg der Knochenwachstumsfaktoren T1 - Influence of the coreceptor Repulsive Guidance Molecule b (RGMb) on the Bone Morphogenetic Protein signaling pathway N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) bilden die größte Untergruppe der Transforming Growth Factor-β (TGF-β) Superfamilie sekretierter Wachstumsfaktoren. Sie haben Schlüsselfunktionen während der frühen Embryogenese inne und regulieren darüber hinaus die Organogenese sowie die Homöostase zahlreicher Organe und Gewebe. BMPs vermitteln ihre Signale über zwei Typen transmembranärer Serin-/Threoninkinaserezeptoren, die als Typ I und Typ II Rezeptoren bezeichnet werden. Den etwa zwanzig BMP-Liganden stehen dabei nach aktuellem Kenntnisstand nur fünf Typ I und drei Typ II Rezeptorkinasen gegenüber, wodurch sich insbesondere die BMP-Familie durch eine hohe Promiskuität der Ligand-Rezeptor-Interaktion auszeichnet. Damit dennoch Liganden-spezifische Signale vermittelt werden können, müssen die Signaleigenschaften dieser Faktoren komplex reguliert werden. Die Mehrzahl der Regulationsmechanismen beeinflusst die Signaltransduktion negativ. Kürzlich wurden jedoch die ersten, spezifisch auf die BMP-Familie wirkenden membranassoziierten Agonisten beschrieben – die Corezeptoren der Repulsive Guidance Molecule (RGM) Familie bestehend aus RGMa, RGMb und RGMc. Für das Familienmitglied RGMb werden neben pro-BMP-Prozessen allerdings auch hemmende Wirkungen auf die BMP-abhängige Signaltransduktion diskutiert. Um diese teils widersprüchlichen Funktionen zu beleuchten, wurde RGMb im Rahmen dieser Arbeit umfangreich biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zunächst konnte erfolgreich ein Verfahren zur Herstellung und Isolierung von hochreinem rekombinanten RGMb Corezeptorprotein etabliert werden. Dies ermöglichte die Entwicklung umfangreicher in vitro Interaktionsstudien mit verschiedenen Liganden sowie Rezeptorektodomänen der TGF-β Superfamilie basierend auf dem Verfahren der Oberflächen-Plasmonresonanz (Surface Plasmon Resonance, SPR). Dadurch konnte gezeigt werden, dass RGMb spezifisch und hochaffin mit Wachstumsfaktoren der BMP-Familie, nicht aber mit Vertretern anderer Untergruppen der TGF-β Superfamilie wechselwirkt. Im Widerspruch zu Literaturdaten konnten darüber hinaus keine direkten Interaktionen zwischen RGMb und den analysierten Typ I und Typ II Rezeptorektodomänen nachgewiesen werden. Zellbasierte Kompetitionsanalysen ergaben, dass der lösliche RGMb Corezeptor BMP-induzierte Signale dosisabhängig inhibiert, während die membranverankerte RGMb-Variante eine Verstärkung des BMP-Signals durch eine Erniedrigung der halbmaximalen Ligandenkonzentration hervorruft. Mittels Oberflächen-Plasmonresonanz konnte im Rahmen von Coinjektionsstudien außerdem beobachtet werden, dass RGMb die Bindung der untersuchten BMP-Liganden an die Typ I Rezeptorektodomänen hemmt. Daraus kann geschlossen werden, dass RGMb an das Typ I Rezeptorbindeepitop der BMP-Liganden bindet und dadurch deren Signalaktivität neutralisiert. Ein abweichendes Bild zeigt sich für die Beeinflussung der BMP/Typ II Rezeptorinteraktion durch RGMb. So wurde im Rahmen von SPR-basierten Coinjektionsstudien beobachtet, dass BMP-Liganden in Gegenwart des Corezeptors RGMb ausschließlich mit der Ektodomäne des Typ II Rezeptors ActR IIB, nicht aber mit den Rezeptoren ActR-II oder BMPR-II interagieren können. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass zwar der Kernbereich des Typ II Rezeptorepitops durch die Interaktion des Liganden mit RGMb unbeeinflusst bleibt, jedoch eine partielle periphere Überlagerung bei gleichzeitiger Bindung von RGMb und den Typ II Rezeptoren für die Ausbildung der beobachteten Selektivität verantwortlich sein muss. Um diese Wechselwirkungen auch auf zellulärer Ebene analysieren zu können, wurden fluoreszenzbasierte Fusionskonstrukte für BMP-Rezeptoren sowie für RGMb synthetisiert und ein funktionelles Färbeprotokoll für die konfokale Mikroskopie etabliert. Die biochemischen Analysen sowie die in dieser Arbeit präsentierten umfassenden Charakterisierungen der Corezeptorinteraktionen mit einer Vielzahl an BMP-Liganden sowie deren Rezeptoren grenzen das RGMb-Bindeepitop ein und bilden so einen idealen Ausgangspunkt für die genaue Identifizierung und Charakterisierung dieses Epitops mittels gerichteter Mutagenese. Darüber hinaus weisen die vorliegenden in vitro Bindungsstudien auf einen deutlich komplexeren als bisher in der Literatur angenommenen, möglicherweise völlig neuartigen Modulationsmechanismus des BMP-Signalweges durch den Corezeptor RGMb hin. So wird in Anwesenheit von RGMb die Typ II Rezeptorspezifität und vermutlich auch die Lokalisierung der BMP-Liganden in bestimmten Membrankompartimenten - etwa Lipid Rafts - selektiv reguliert, wodurch BMP-induzierte Signale fein moduliert werden könnten. Die in dieser Arbeit synthetisierten fluoreszenzbasierten Fusionskonstrukte stellen zudem zusammen mit den etablierten Protokollen zur konfokalen Mikroskopie effektive Werkzeuge für eine zukünftige detaillierte Aufklärung (z. B. durch FRET-Studien) der komplexen RGMb-abhängigen Regulation des BMP-Signalweges auf zellulärer Ebene dar. N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) comprise the largest subgroup of the Transforming Growth Factor-β (TGF-β) superfamily of secreted growth factors. They are key regulators of early embryogenesis and orchestrate the development as well as the homeostasis of several tissues and organs in adult organisms. BMPs transduce their signals through two types of transmembrane serine/threonine kinase receptors termed type I and type II receptors. An imbalance in BMP-ligand and receptor numbers - about twenty different BMP-ligands face only five type I and three type II receptors - causes a pronounced promiscuity in ligand/receptor interactions. Therefore, a complex regulatory network is necessary to enable specific signaling of each BMP ligand despite a temperospatial expression overlap. Most of the discovered regulatory processes inhibit BMP-signal transduction. Recently, the first membrane-associated BMP-specific agonists - the Repulsive Guidance Molecule (RGM) family of coreceptors comprised of RGMa, RGMb and RGMc - have been discovered. Aside from stimulatory effects, evidence for a potential inhibitory activity of the RGM family member RGMb on BMP-induced signal transduction has previously been described. To clarify these contradictory RGMb functions, extensive biochemical and biophysical characterizations were carried out. In the course of this work, an efficient expression and purification strategy was established resulting in great yields of highly pure recombinant RGMb coreceptor protein. Subsequent in vitro binding assays based on surface plasmon resonance (SPR) showed that RGMb specifically interacts with BMP ligands, while no binding to other subfamily members could be detected. Contradicting published data, no direct interactions of the RGMb coreceptor with type I and type II receptor ectodomains were determined. Furthermore, cell-based competition assays revealed that soluble RGMb protein lacking the glycosylphosphatidylinositol anchor dose-dependently inhibits BMP-induced signal transduction. Characterizing the influence of the membrane anchored RGMb coreceptor on BMP signaling pointed to a more complex situation. Hence, only minor deviations of the BMP-dependent signal transduction in RGMb-transfected compared to control cells could be detected. These differences could possibly indicate a sensitizing activity of the RGMb coreceptor on BMP-signaling as it has been described before. SPR-based co-injection experiments revealed that BMP ligands bound to RGMb lose their ability to interact with type I receptor ectodomains. Thus, the coreceptor blocks the type I receptor binding epitope, thereby neutralizing the signaling activity of BMP ligands. However, comparative experiments using BMP variants pointed out that the coreceptor/ligand interface involves other binding hot spot residues than the type I receptor/ligand interaction. Analyzing the influence of RGMb on the BMP/type II receptor interaction based on SPR measurements led to a different outcome: In the presence of the RGMb coreceptor, BMP ligands were solely able to interact with the extracellular domain of the type II receptor ActR IIB, while no binding could be detected with neither ActR II nor BMPR II ectodomains. Hence, binding of the coreceptor does not directly interfere with the BMP ligand/type II receptor core interface, whereas a partial peripheral overlap of RGMb with the type II receptor epitope may evoke the observed selectivity for ActR IIB. In order to clarify the observed interactions in the cellular context, RGMb and BMP receptor fusion constructs based on the SNAP-/CLIP-tag® technology as well as efficient labeling protocols and confocal microscopic procedures were established. The biochemical characterization of RGMb along with the extensive interaction studies of this coreceptor with a multiplicity of BMP-ligands and their receptors presented in this work, narrow down the location of the RGMb binding epitope, thus providing an ideal starting point for the subsequent determination of the coreceptor binding domain by site directed mutagenesis. Moreover, the presented in vitro binding studies point to a more complex and possibly novel regulatory mechanism of the BMP signal transduction by RGMb than previously assumed. Thus, the presence of the coreceptor selectively regulates the type II receptor specificity and potentially also the recruitment of BMP-ligands into certain membrane compartments (e.g. lipid raft-domains), herewith fine-tuning BMP-induced signals. The SNAP- and CLIP tag® fusion constructs produced in this work together with the established protocols for confocal microscopy analyses provide efficient tools for subsequent extensive examinations of theses regulatory processes in living cells (e.g. by FRET measurements). KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Rezeptor KW - Transforming Growth Factor KW - Bone morphogenetic protein KW - Transforming Growth Factor KW - coreceptor KW - BMP Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85568 ER - TY - THES A1 - Hubertus, Katharina T1 - Regulation des cAMP Spiegel und der Signaltransduktion in humanen Thrombozyten durch Prostanoid-Rezeptoren T1 - Regulation of cAMP level and signaltransduction in human platelets by prostanoid-receptors N2 - Prostanoide wirken über Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten. In dieser Arbeit wurde die Existenz und Funktionsweise der Prostanoid-Rezeptoren anhand synthetischer Agonisten und Antagonisten in humanen Thrombozyten nachgewiesen. Weiter wurde untersucht, über welche Prostanoid-Rezeptoren die Signaltransduktion der natürlichen Agonisten wie PGE2, PGE1 und PGA1 vermittelt wird, sowie das Zusammenspiel der Prostanoid-Rezeptoren auf die Aktivierung oder Hemmung der Thrombozyten gezeigt. Das Vorhandensein der Prostaglandin E2 Synthase 3 wurde nachgewiesen sowie erste Anhaltspunkte für die Existenz eines Komplexes aus Prostaglandin E2 Synthase 3, Hitzeschockprotein-90 sowie Casein Kinase 2 gezeigt. N2 - Prostanoids act to platelet activation or inhibition via prostanoid-receptors. In this work, the existence and function of prostanoid receptors in human platelets was shown by using sythetic agonists and antagonists. Further, the prostanoid receptors taking part at the signaltransduction induced by endogen prostanoids like PGE2, PGE1 and PGA1 were examinated. The interactions of the prostanoid receptors in platelet activation and inhibition were shown. The existence of prostaglandin E2 synthase 3 in human platelets was shown and first evidence for a complexe of prostaglandin E2 synthase 3, heat shock protein 90 and casein kinase 2 was given. KW - Prostaglandine KW - Rezeptor KW - Cyclo-AMP KW - Prostanoid-Rezeptor KW - cAMP KW - Prostanoide KW - Thrombozyt KW - prostanoid receptor KW - platelets KW - cAMP KW - prostanoids Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71996 ER - TY - THES A1 - Stock, Patrick Maria T1 - Binding site contribution in high resolution records of nicotinic receptor channel currents T1 - Beitrag der Bindungsstellen zum Öffnungsverhalten des nAChRs N2 - The nicotinic acetylcholine receptor of skeletal muscle is one of the best-investigated synaptic proteins and often serves as model for the entire family of pentameric ligand gated ion channels (pLGICs). Receptors of this superfamily share a common architecture. After binding the agonist the characteristic C-loop structure closes around the ligand-binding site and triggers a wave of conformational changes that spread through the protein and finally result in the opening of the channel gate. As shown before, high-resolution single channel data can hardly be described by simple kinetic mechanisms (Parzefall et al., 1998, Hallermann et al., 2005). Recent advances in the field of kinetic modelling on receptor currents demonstrate that the introduction of additional short lived shut states in kinetic schemes enhances the quality of estimates of reaction rates. The additional shut states that immediately follow ligand bound states in the mechanism are suggested to resemble the closing movement of the C-loop (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). It has not been described yet whether and how the structural differences of the 2 binding sites of the receptor influence the opening behaviour. To address this question, high-resolution single channel recordings, in combination with agonists that are known to exhibit different binding site selectivity, were performed. Thereby, a detailed description of the binding site dependent generation of channel currents is possible. At the embryonic mouse-muscle receptor used in this study the ligand binding sites are located at the α-γ and α-δ subunit interfaces. By allocation of opening characteristics to the α-δ and α-γ sites it is possible to show the binding site dependent activation of distinct kinetic states. Furthermore, it will be shown that the recently introduced short-lived shut states are sufficient to describe high-resolution single channel data. Finally an enhanced kinetic mechanism based on the ‘primed states’ model, published in 2009 by Mukhtasimova et al., will be presented. In this model the structurally diverse α-δ and α-γ binding sites elicit different kinetic channel characteristics. Thus the complex high-resolution kinetic characteristics of the embryonic receptor can be described coherently. N2 - Der nicotinische Acetylcholin-Rezeptorkanal des Skelettmuskels zählt zu den bestuntersuchten synaptischen Proteinen und gilt als Modell für die Familie der Liganden gesteuerten pentameren Ionenkanäle. Rezeptoren dieser Großfamilie besitzen als charakteristisches strukturelles Merkmal ein Cystein-Schleifen-Motiv (C-loop), welches sich nach Bindung eines Agonisten um die Bindungstasche herum schließt und eine Kette weiterer Konformationsänderungen nach sich zieht. Wie in früheren Publikationen festgestellt wurde, ist es nur schwer möglich hochaufgelöste Messdaten mit konservativen kinetischen Modellen ausreichend zu beschreiben (Parzefall et al., 1998; Hallermann et al., 2005). Aktuelle Fortschritte auf dem Gebiet der kinetischen Modellierung von mechanistischen Rezeptormodellen auf Rezeptorströme, zeigen, dass die Einführung zusätzlicher kurzlebiger Geschlossenzustände in den kinetischen Mechanismen die Qualität der Voraussagen der Modelle verbessert. Diese zusätzlichen Geschlossenzustände, welche Zuständen mit gebundenen Agonisten des Rezeptormodells folgen, spiegeln höchstwahrscheinlich die Schließung des Cystein-Schleifen-Motivs wider (Lape et al., 2008; Mukhtasimova et al., 2009). Trotz der jüngsten Fortschritte wurde bisher nicht beschrieben, wie und ob die strukturellen Unterschiede der 2 vorhandenen Bindungsstellen sich auf die Charakteristika des Öffnungsverhaltens auswirken. Die Bindungsstellen für Agonisten befinden sich am embryonalen nicotinischen Acetylcholinrezeptor des Muskels der Maus an den Schnittstellen der α-δ und der α-γ Untereinheiten. Um der Frage des Einflusses der Bindungsstellendiversität auf den Grund zu gehen, wurden hochaufgelöste Einzelkanalmessungen unter der Verwendung von unterschiedlichen Agonisten, für die bekannt ist, dass sie unterschiedliche Selektivitäten zu den Bindungsstellen besitzen, durchgeführt. Hierdurch ist es möglich ein detailliertes Bild der bindungsstellenbedingten Auslösung definierter Öffnungscharakteristika zu beschreiben. Durch die Zuweisung der Öffnungscharakteristika zu den α-δ und α-γ Bindungsstellen gelingt es die bindungsstellenabhängige Aktivierung von einzelnen kinetischen Zuständen zu zeigen. Darüber hinaus werden direkte Anhaltspunkte dafür gezeigt, dass es möglich ist mit den angeführten kurzlebigen Geschlossenzuständen hochaufgelöste Einzelkanaldaten kinetisch hinreichend zu beschreiben. Schließlich wird ein erweiterter kinetischer Mechanismus vorgestellt, welcher auf dem ‚primed-states’ Modell, das 2009 von Mukhtasimova veröffentlicht wurde, basiert. Zusätzlich ist dieser in der Lage die komplexen kinetischen Charakteristika des embryonalen nicotinischen Rezeptorkanals, unter hoher zeitlicher Auflösung der Messdaten, zu beschreiben. KW - Nicotinischer Acetylcholinrezeptor KW - Bindestelle KW - Ionenkanal KW - Kinetik KW - Neurobiologie KW - nAChR KW - Kanalkinetik KW - Bindungsstellen KW - Rezeptor KW - neurobiology KW - nAChR KW - receptor channel KW - binding sites KW - kinetics Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71769 ER - TY - THES A1 - May, Frauke T1 - The role of the (hem)ITAM-coupled receptors C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) and Glycoprotein (GP) VI for platelet function: in vitro and in vivo studies in mice T1 - Die Rolle der (hem)ITAM-gekoppelten Rezeptoren C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) und Glykoprotein (GP) VI in der Thrombozytenfunktion: in vitro- und in vivo-Studien in Mäusen N2 - Die Thrombozytenaktivierung und –adhäsion sowie die nachfolgende Thrombusbildung ist ein essentieller Prozess in der primären Hämostase, der aber auch irreversible Gefäßverschlüsse und damit Herzinfarkt oder Schlaganfall verursachen kann. Erst kürzlich wurde beschrieben, dass der C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) auf der Thrombozytenoberfläche exprimiert wird, jedoch wurde für diesen Rezeptor noch keine Funktion in den Prozessen der Hämostase und Thrombose gezeigt. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von CLEC-2 in der Thrombozytenfunktion und Thrombusbildung im Mausmodel untersucht. In dem ersten Teil dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Behandlung von Mäusen mit dem neu generierten monoklonalen Antikörper INU1, der gegen murines CLEC-2 gerichtet ist, zu dem vollständigen und hochspezifischen Verlust des Rezeptors in zirkulierenden Thrombozyten führte, ein Prozess, der als „Immundepletion“ bezeichnet wird. Die CLEC-2-defizienten Thrombozyten waren nicht mehr durch den CLEC-2-spezifischen Agonisten Rhodozytin aktivierbar, während die Aktivierung durch alle anderen getesteten Agonisten nicht beeinträchtigt war. Dieser selektive Defekt führte unter Flussbedingungen ex vivo zu stark verminderter Aggregatbildung der Thrombozyten. Außerdem zeigten in vivo-Thrombosestudien, dass die gebildeten Thromben instabil waren und vermehrt embolisierten. Infolgedessen war die CLEC-2 Defizienz mit einem deutlichen Schutz vor arterieller Thrombose verbunden. Außerdem ließ die in INU1-behandelten Mäusen beobachtete variable Verlängerung der Blutungszeit auf einen moderaten hämostatischen Defekt schließen. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass CLEC-2 in vitro und in vivo signifikant zur Thrombusstabilität beiträgt und eine essentielle Rolle in der Hämostase und arteriellen Thrombose spielt. Daher stellt CLEC-2 eine potentiell neue antithrombotische Zielstruktur dar, die in vivo inaktiviert werden kann. Diese in vivo-Herabregulierung von Thrombozytenoberflächenrezeptoren könnte einen vielversprechenden Ansatz für zukünftige antithrombotische Therapien darstellen. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelte den Effekt einer Doppelimmundepletion der immunoreceptor tyrosine-based activation motiv (ITAM)- und hemITAM-gekoppelten Rezeptoren Glykoprotein (GP) VI und CLEC-2 auf Hämostase und Thrombose mittels einer Kombination der GPVI- beziehungsweise CLEC-2-spezifischen Antikörper JAQ1 und INU1. Eine Einzeldepletion von GPVI oder CLEC-2 in vivo beeinträchtigte nicht die Expression und Funktion des jeweils anderen Rezeptors. Eine gleichzeitige Behandlung mit beiden Antikörpern führte jedoch zu dem nachhaltigen Verlust der GPVI- und CLEC-2-vermittelten Signale in Thrombozyten, während andere Signalwege nicht betroffen waren. Im Gegensatz zu den Einzeldefizienzen, wiesen die GPVI/CLEC-2 doppeldefizienten Mäuse einen schwerwiegenden Blutungsphänotyp auf. Außerdem führte die Behandlung zu einer starken Beeinträchtigung der arteriellen Thrombusbildung, die die Effekte der Einzeldefizienzen weit übertraf. Von Bedeutung ist auch, dass gleiche Ergebnisse in Gp6-/- Mäusen gefunden wurden, die mittels INU1-Behandlung CLEC-2-depletiert wurden. Dies veranschaulicht, dass der Blutungsphänotyp nicht durch Sekundäreffekte der kombinierten Antikörperbehandlung hervorgerufen wurde. Diese Daten deuten darauf hin, dass GPVI und CLEC-2 sowohl unabhängig voneinander als auch gleichzeitig in vivo von der Thrombozytenoberfläche herabreguliert werden können und lassen unerwartete redundante Funktionen der beiden Rezeptoren in Hämostase und Thrombose erkennen. Da beide Rezeptoren, GPVI und CLEC-2, als neue antithrombotische Zielstrukturen diskutiert werden, könnten diese Ergebnisse wichtige Auswirkungen auf die Entwicklung von anti-GPVI oder anti-CLEC-2-basierenden Antithrombotika haben. N2 - Platelet activation and adhesion results in thrombus formation that is essential for normal hemostasis, but can also cause irreversible vessel occlusion leading to myocardial infarction or stroke. The C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) was recently identified to be expressed on the platelet surface, however, a role for this receptor in hemostasis and thrombosis had not been demonstrated. In the current study, the involvement of CLEC-2 in platelet function and thrombus formation was investigated using mice as a model system. In the first part of the thesis, it was found that treatment of mice with a newly generated monoclonal antibody against murine CLEC-2 (INU1) led to the complete and highly specific loss of the receptor in circulating platelets (a process termed “immunodepletion”). CLEC-2-deficient platelets were completely unresponsive to the CLEC-2-specific agonist rhodocytin, whereas activation induced by all other tested agonists was unaltered. This selective defect translated into severely decreased platelet aggregate formation under flow ex vivo; and in vivo thrombosis models revealed impaired stabilization of formed thrombi with enhanced embolization. Consequently, CLEC-2 deficiency profoundly protected mice from occlusive arterial thrombus formation. Furthermore, variable bleeding times in INU1-treated mice indicated a moderate hemostatic defect. This reveals for the first time that CLEC-2 significantly contributes to thrombus stability in vitro and in vivo and plays a crucial role in hemostasis and arterial thrombosis. Thus, CLEC-2 represents a potential novel anti-thrombotic target that can be functionally inactivated in vivo. This in vivo down-regulation of platelet surface receptors might be a promising approach for future anti-thrombotic therapy. The second part of the work investigated the effect of double-immunodepletion of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)- and hemITAM-coupled receptors, platelet glycoprotein (GP) VI and CLEC-2, on hemostasis and thrombosis using a combination of the GPVI- and CLEC-2-specific antibodies, JAQ1 and INU1, respectively. Isolated targeting of either GPVI or CLEC-2 in vivo did not affect expression or function of the respective other receptor. However, simultaneous treatment with both antibodies resulted in the sustained loss of GPVI and CLEC-2 signaling in platelets, while leaving other activation pathways intact. In contrast to single deficiency of either receptor, GPVI/CLEC-2 double-deficient mice displayed a dramatic hemostatic defect. Furthermore, this treatment resulted in profound impairment of arterial thrombus formation that far exceeded the effects seen in single-depleted animals. Importantly, similar results were obtained in Gp6-/- mice that were depleted of CLEC-2 by INU1-treatment, demonstrating that this severe bleeding phenotype was not caused by secondary effects of combined antibody treatment. These data suggest that GPVI and CLEC-2 can be independently or simultaneously down-regulated in platelets in vivo and reveal an unexpected functional redundancy of the two receptors in hemostasis and thrombosis. Since GPVI and CLEC-2 have intensively been discussed as potential anti-thrombotic targets, these results may have important implications for the development of novel, yet save anti-GPVI or anti-CLEC-2-based therapies. KW - Thrombozyt KW - Rezeptor KW - Thrombose KW - Biologie KW - Zelle KW - Biology KW - Cell Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65383 ER - TY - THES A1 - Harth, Stefan T1 - Molecular Recognition in BMP Ligand-Receptor Interactions T1 - Molekulare Erkennung in BMP Ligand-Rezeptor Interaktionen N2 - Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) are secreted multifunctional signaling proteins that play an important role during development, maintenance and regeneration of tissues and organs in almost all vertebrates and invertebrates. BMPs transmit their signals by binding to two types of serine-/threonine-kinase receptors. BMPs bind first to their high affinity receptor, thereby recruiting their low affinity receptor into the complex. This receptor assembly starts a Smad (Small mothers against decapentaplegic) protein signaling cascade which regulates the transcription of responsive genes. Up to date, only seven type I and five type II receptors are known for more than 30 ligands. Therefore, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype. Vice versa, receptors can bind to several ligands, indicating a highly promiscuous ligand-receptor interaction. This raises the following questions: (i) How are BMPs able to induce ligand-specific signals, despite forming complexes with identical receptor composition and (ii) how are they able to recognize and bind various binding partners in a highly specific manner. From the ligand’s point of view, heterodimeric BMPs are valuable tools for studying the interplay between different sets of receptors, thereby providing new insights into how the various BMP signals can be generated. This study describes the expression and purification of the heterodimers BMP-2/6 and -2/7 from E.coli cells. BIAcore interaction studies and various in vitro cell activity assays revealed that the generated heterodimers are biologically active. Furthermore, BMP-2/6 and -2/7 exhibit a higher biological activity in most of the cell assays compared to their homodimeric counterparts. In addition, the BMP type I receptor BMPR-IA is involved in heterodimeric BMP signaling. However, the usage of other type I receptor subtypes (e.g. ActR-I) building a heteromeric ligand-receptor type I complex as indicated in previous works could not be determined conclusively. Furthermore, BMP heterodimers seem to require only one type I receptor for signaling. From the receptors’ point of view, the BMP type I receptor BMPR-IA is a prime example for its promiscuous binding to different BMP ligands. The extracellular binding interface of BMPR-IA is mainly unfolded in its unbound form, requiring a large induced fit to adopt the conformation when bound to its ligand BMP-2. In order to unravel whether the binding promiscuity of BMPR-IA is linked to structural plasticity of its binding interface, the interaction of BMPR-IA bound to an antibody Fab fragment was investigated. The Fab fragment was selected because of its ability to recognize the BMP-2 binding epitope on BMPR-IA, thus neutralizing the BMP-2 mediated receptor activation. This study describes the crystal structure of the complex of the extracellular domain of BMPR-IA bound to the antibody Fab fragment AbyD1556. The crystal structure revealed that the contact surface of BMPR-IA overlaps extensively with the contact surface of BMPR-IA for BMP-2 interaction. Although the contact epitopes of BMPR-IA to both binding partners coincide, the three-dimensional structures of BMPR-IA in both complexes differ significantly. In contrast to the structural differences, alanine-scanning mutagenesis of BMPR-IA showed that the functional determinants for binding to both the antibody and BMP-2 are almost identical. Comparing the structures of BMPR-IA bound to BMP-2 or to the Fab AbyD1556 with the structure of unbound BMPR-IA revealed that binding of BMPR-IA to its interaction partners follows a selection fit mechanism, possibly indicating that the ligand promiscuity of BMPR-IA is inherently encoded by structural adaptability. N2 - „Bone Morphogenetic Proteins” (BMPs) sind sezernierte multifunktionelle Signalproteine, die eine wichtige Rolle während der Entwicklung, Aufrechterhaltung und Regeneration von Geweben und Organen in fast allen Vertebraten und wirbellosen Tieren spielen. Die BMP-Signalgebung wird durch die Bindung an zwei Typen von Serin/Threonin Rezeptorkinasen eingeleitet. Hierbei binden BMPs zuerst an ihren hochaffinen Rezeptor, bevor der niederaffine Rezeptor in den Komplex eingefügt wird. Durch das Zusammenfügen beider Rezeptortypen wird eine von Smad (Small mothers against decapentaplegic)-Proteinen gesteuerte Signalkaskade gestartet, die letztendlich die Transkription responsiver Gene reguliert. Aktuell sind nur sieben Typ I und fünf Typ II Rezeptoren für mehr als 30 Liganden bekannt. Viele BMP-Liganden können demzufolge mehr als einen Rezeptorsubtyp rekrutieren. Umgekehrt jedoch können auch Rezeptoren an unterschiedliche Liganden binden, was auf eine im hohen Maße promiske Ligand-Rezeptor-Interaktion hinweist. Dabei stellen sich folgende Fragen: (i) Wie können BMPs ligandspezifische Signale erzeugen, obwohl sie dafür die gleichen Rezeptoren benutzen? (ii) Und wie können BMPs unterschiedliche Bindungspartner erkennen und trotzdem hochspezifisch an diese binden? Von Blickwinkel der Liganden aus betrachtet stellen heterodimere BMPs wertvolle Hilfsmittel dar, um das Zusammenspiel zwischen den verschiedenen Rezeptortypen zu studieren. Darüber hinaus können sie neue Einblicke in die Entstehung von unterschiedlichen BMP-Signalen gewähren. In dieser Doktorarbeit wird die Expression und Aufreinigung von heterodimeren BMP-2/6 und -2/7 aus E.coli Zellen beschrieben. Mittels BIAcore Interaktionsstudien und in vitro Aktivitätsassays in Säugerzellen konnte gezeigt werden, dass die hergestellten Heterodimere biologisch aktiv sind. Darüber hinaus zeigen BMP-2/6 and -2/7 in den meisten Zellassays eine höhere biologische Aktivität als ihre homodimeren Gegenstücke. Außerdem konnte nachgewiesen werden, dass der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA an der Signalgebung von heterodimeren BMPs involviert ist. Eine Beteiligung weiterer Typ I Rezeptoren (wie z.B. die von ActR-I), die einen heteromeren Ligand-Rezeptor Typ I Signalkomplex bilden, wie es bereits in früheren Studien gezeigt wurde, konnte jedoch experimentell nicht eindeutig belegt werden. Des Weiteren lassen die Ergebnisse darauf schließen, dass heterodimere BMPs für eine erfolgreiche Signalweiterleitung nur die Präsenz eines einzelnen Typ I Rezeptors benötigen. Von Blickwinkel der Rezeptoren aus betrachtet, ist der BMP Typ I Rezeptor BMPR-IA ein Paradebeispiel für promiskes Bindeverhalten an verschiedene BMP-Liganden. Das extra-zelluläre Kontaktepitop von BMPR-IA ist im Wesentlichen ungefaltet, wenn BMPR-IA in freier ungebundener Form vorliegt. Infolge dessen durchläuft die Binderegion in BMPR-IA weit reichende strukturelle Veränderungen, um die erforderliche Konformation auszubilden, die für die Bindung an BMP-2 essentiell ist. Um herauszufinden, ob das promiske Binde-verhalten von BMPR-IA mit einer strukturellen Plastizität seiner Binderegion einhergeht, wurde die Interaktion zwischen BMPR-IA und einem Antikörper Fab Fragment experimentell untersucht. Das Fab Fragment wurde aufgrund folgender Eigenschaft ausgewählt, nämlich an das BMP-2 Bindeepitop des Rezeptors anzudocken, um so eine BMP-2 vermittelte Rezeptoraktivierung zu verhindern. In dieser Doktorarbeit wird die Kristallstruktur des Komplexes, bestehend aus der extrazellulären Domäne von BMPR-IA und dem Antikörper Fab Fragment AbyD1556 beschrieben. Die Kristallstruktur zeigt, dass die Kontaktoberfläche von BMPR-IA zu einem sehr großen Teil mit der Kontaktoberfläche bei der Interaktion mit BMP-2 übereinstimmt. Obwohl das Kontaktepitop von BMPR-IA zu beiden Bindungspartnern weitestgehend deckungsgleich ist, unterscheiden sich die dreidimensionalen Strukturen von BMPR-IA in beiden Komplexen sehr stark voneinander. Im Gegensatz zu den strukturellen Differenzen zeigt jedoch eine Mutationsanalyse, bei der wichtige Aminosäuren mit Alanin ausgetauscht wurden, dass die funktionellen Determinanten, die die Bindung an den Antikörper und an BMP-2 bestimmen, beinahe die gleichen sind. Wenn man die Strukturen von BMPR-IA, das an BMP-2 bzw. an das Fab Fragment AbyD1556 gebunden ist, mit der Struktur von ungebundenem BMPR-IA vergleicht, so fällt auf, dass die Bindung von BMPR-IA an seine Bindungspartner einem sog. „Selektions-Anpassungsmechanismus“ folgt, was möglicherweise zeigt, dass das promiske Ligand-Bindeverhalten von BMPR-IA von Natur aus durch seine strukturelle Anpassungsfähigkeit festgelegt wird. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ligand KW - Molekulare Erkennung KW - Transforming Growth Factor beta KW - Strukturaufklärung KW - Proteinfaltung KW - Proteinkristallographie KW - Heterodimer KW - BMP-2/6 KW - BMP-2/7 KW - BMPR-IA KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - protein crystallography KW - signal transduction KW - heterodimer Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-52797 ER - TY - THES A1 - Rebhan, Benjamin T1 - Untersuchung des Blutdrucks und der Endothelfunktion ETB-Rezeptor-defizienter Mäuse unter Salz-angereicherter Diät T1 - Endothelin B receptor-deficient mice develop endothelial dysfunction independently of salt loading N2 - ETB-Rezeptoren nehmen innerhalb der endothelialen Regulationsprozesse eine zentrale Rolle ein. In der vorliegenden Arbeit wurde der Frage nachgegangen, welchen Einfluss eine Salzbelastung auf den Blutdruck und die vaskuläre Funktion von ETB-Rezeptor-Knockout-Mäusen hat. In diesem Zusammenhang wurden männliche ETB-Rezeptor-Knockout-Mäuse parallel mit Wildtyp-Kontroll-Mäusen 15 Tage lang mit Standard- bzw. salzreichem Futter gehalten. Der systolische Blutdruck wurde ebenfalls dokumentiert. Nach 15 Tagen wurde den narkotisierten Tieren die Aorta descendens entnommen. An isolierten Aortenringen wurden in der Organkammer die Endothel-abhängige und -unabhängige vaskuläre Funktion untersucht. Die ETB-Rezeptor defizienten Mäuse bleiben – unter einer Haltung mit Standardfutter – normotensiv. Eine Hypertonie entwickeln die Tiere erst bei Verabreichung von salzreichem Futter. Die Endothel-abhängige Gefäßfunktion ist jedoch nicht nur bei den hypertensiven Tieren verändert, sondern bei allen ETB-Rezeptor defizienten Mäusen – unabhängig von Salzgehalt der Nahrung und Blutdruck. N2 - The ETB receptor is involved in endothelial function. In the present study, we analysed whether salt alters endothelial function in rescued ETB receptor-deficient mice. Adult ETB-deficient mice were kept in parallel with wild-type control animals for 15 days on standard or salt-enriched chow, respectively. Systolic blood pressure was measured also and endothelium-dependent and endothelium-independent vascular function was assessed in isolated aortic rings. Systolic blood pressure increased on salt-enriched chow in ETB receptor-deficient mice, but neither in wild-type mice on high-salt diet nor in ETB receptor-deficient mice on standard chow. KW - Hypertonie KW - Rezeptor KW - Mäuse KW - Aorta KW - Endothelin KW - Salz KW - ETB-Rezeptor KW - knockout-Mäuse KW - salzinduziert KW - Herzfrequenz KW - normotensiv KW - Schwanmessmethode KW - ETB-receptor KW - knockout mice KW - salt-dependend KW - hearrate KW - normotensive KW - tail cuff method Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51972 ER - TY - THES A1 - Klenk, Johann Christoph T1 - Effekte von Parathormon auf die Struktur und Komplexierung des Parathormonrezeptors 1 T1 - Effects of parathyroid hormone on the structure and complexation of parathyroid hormone receptor 1 N2 - Der Parathormonrezeptor Typ 1 (PTHR) ist ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor der Gruppe 2 und wichtigster Regulator des Kalziumstoffwechsels. Im ersten Teil der Arbeit wurde eine neuartige posttranslationale Modifikation des PTHR in Form einer proteolytischen Spaltung der Ektodomäne identifiziert, charakterisiert und deren Regulation beschrieben. Nach langanhaltender Stimulation des Rezeptors mit Agonisten – aber nicht mit Antagonisten – wurde eine Massen- und Mengenzunahme des Rezeptorproteins beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass der Rezeptor unter basalen Bedingungen einer Spaltung unterliegt. Der Massenunterschied entsteht durch die proteolytische Spaltung der Ektodomäne des PTHR, was nachfolgend die Stabilität des Rezeptors beeinträchtigt. Die Spaltung erfolgte innerhalb einer unstrukturierten Schleife der Ektodomäne, welche die Bereiche für die Ligandenbindung miteinander verbindet. Hierbei handelt es sich um eine Region, die im Vergleich zu anderen Gruppe 2-Rezeptoren spezifisch für den PTHR ist. Das durch die Spaltung entstandene N-terminale Fragment bleibt durch eine Disulfidbrücke mit dem Transmembranteil des Rezeptors verbunden. Durch Versuche mit verschiedenen Proteaseinhibitoren konnte die verantwortliche Protease der Familie der zinkabhängigen extrazellulären Proteasen zugeordnet werden. Diese Ergebnisse beschreiben einen Mechanismus wie die Homoöstase des PTHR reguliert sein könnte. In einem zweiten Abschnitt wurde die Interaktion der Adapterproteine NHERF1 und beta-Arrestin2 mit dem PTHR untersucht. Beide Proteine interagierten unabhängig mit dem Rezeptor, wobei NHERF1 über eine PDZ-Domäne konstitutiv an den C-Terminus des Rezeptors bindet. beta-Arrestin2 hingegen bindet nach Aktivierung des Rezeptors und führt zur Desensitisierung des Rezeptors. Mittels biochemischer und mikroskopischer Methoden konnte gezeigt werden, dass beide Proteine gemeinsam einen ternären Komplex mit dem PTHR bilden, welcher durch die direkte Interaktion zwischen NHERF1 und beta-Arrestin2 vermittelt wird. Dies hat zur Folge, dass beta-Arrestin im basalen Zustand durch NHERF1 an den Rezeptor gekoppelt wird. Durch Analyse der Assoziationskinetik mittels Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer-Messungen zeigte sich, dass diese Kopplung zu einer zweifach erhöhten Rekrutierungsgeschwindigkeit von beta-Arrestin2 an den PTHR führt. Somit stellt unterstützt NHERF1 die beta-Arrestin2-vermittelte Desensitisierung des PTHR. N2 - The Parathyroid hormone receptor type 1 (PTHR) belongs to the class 2 of G-protein coupled receptors (GPCRs) and is the main regulator of calcium homeostasis of the body. The first part of the dissertation describes a novel mechanism of receptor regulation based on a proteolytic cleavage of the receptor’s extracellular domain. Prolonged stimulation with PTH led to an apparent increase in molecular mass and in stability of the PTHR. Biochemical analysis of the receptor protein revealed that the PTHR undergoes posttranslational cleavage. Agonistic but not antagonistic PTH-peptides prevented this cleavage, thereby stabilizing the molecular mass and also increasing the half life of the receptor. The cleavage was shown to occur within an unstructured stretch of the extracellular domain of the receptor, which connects two parts required for ligand binding and which is unique in the PTHR amongst all class 2 GPCRs. The cleaved N-terminal fragment was further connected by a disulfide bridge and could only be released by reducing agents. By testing a panel of different protease inhibitors, a protease belonging to the family of zinc-dependent metalloproteases could be identified to be responsible for the PTHR cleavage. Thus, these findings describe a new mechanism how PTHR homeostasis may be regulated. In the second part, the interaction between the adaptor proteins NHERF1 and beta-arrestin2 with the PTHR was assessed. Both proteins interacted independently with the receptor. While NHERF1 formed a constitutive interaction with the PTHR C-terminus, beta-arrestin2-binding required activation of the receptor. Using biochemical and microscopic methods it was shown that both proteins formed a ternary complex with the receptor. This complex was mediated by a direct interaction between NHERF1 and beta-arrestin2 which has been identified in this work. As a consequence, NHERF1 leads to a coupling of beta-arrestin2 close to the PTHR. Association kinetics of beta-arrestin2 with the PTHR measured by fluorescent resonance energy transfer were two-fold increased in the presence of NHERF, suggesting that the ternary complex facilitates the desensitization of the PTHR by beta-arrestin2. KW - Parathormon KW - Proteolyse KW - Endokrinologie KW - Calcium KW - Rezeptor KW - Retinales S-Antigen KW - GPCR KW - Matrix-Metalloprotease KW - NHERF KW - Signaltransduktion KW - G-Protein KW - GPCR KW - Matrix-Metalloproteinase KW - NHERF KW - signal transduction KW - G-protein Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-47288 ER - TY - THES A1 - Wortmann, Sebastian T1 - Das Tuberoinfundibuläre Peptid von 39 Aminosäuren (TIP39): Gen-Struktur und Expressionsmuster im Zebrafisch und Mäusehirn T1 - The tuberoinfundibular peptide of 39 amino acids (TIP39): Gene structure and expression scheme in zebrafish and mouse brain N2 - Das Tuberoinfundibuläre Peptid von 39 Aminosäuren (TIP39), ein kurzes Oligopeptid mit einer N-terminalen und einer C-terminalen alpha-Helix, wurde ursprünglich bei der Suche nach einem Liganden für den neu beschriebenen PTH2-Rezeptor aus einem Hypothalamus-Hypophysen-Extrakt isoliert. Aus der bisherigen Charakterisierung von TIP39 ist am meisten bekannt bezüglich der Expressions-Muster und der Interaktion am PTH2-Rezeptor. TIP39 ist der stärkste bekannte Aktivator des PTH2-Rezeptors und wirkt am PTH1-Rezeptor als funktioneller Antagonist. Inzwischen wurde auch das TIP39 Gen des Menschen und der Maus charakterisiert. Die physiologische Rolle von TIP39 ist dennoch bisher weitgehend ungeklärt, diskutiert werden Einflüsse auf den Kalzium-Phosphat-Haushalt, die Hypothalamus-Hypophysen-Achse oder die Nozizeption. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Untersuchung des TIP39 kodierenden Gens des Zebrafischs danio rerio. Die komplette cDNA konnte amplifiziert werden und wurde unter der Accession No. AF486190 in der GenBank veröffentlicht. Der Genlocus konnte mittels Radiation Hybrid Mapping auf Chromosom 17 lokalisiert werden. Die 3 charakterisierten Exons und 2 Introns umfassen zusammen ca. 3750 bp. Daneben wurde die Prozessierung des Genprodukts aufgeklärt: TIP39 wird beim Zebrafisch als Preprohormon translatiert, am N-terminalen Ende findet sich eine 25 Aminosäuren lange Signalsequenz, die für sezernierte Peptide typisch ist und welche für die Aufnahme in das Endoplasmatische Retikulum verantwortlich ist. In diesem Bereich finden sich eine weitgehende Übereinstimmungen zwischen den analysierten Spezies. Gefolgt wird die Zielsequenz von einem 93 Aminosäuren langen Zwischenpeptid, das sich als wenig konserviert zwischen den Spezies zeigt. Die eigentliche Sequenz von TIP39 beim Zebrafisch zeigte eine Sequenzhomologie von 59% zur humanen Sequenz und wurde mittels Blast Suche als hochkonserviert in allen 12 untersuchten Spezies wiedergefunden. Im genomischen Southern-Blot zeigte sich, dass TIP39 beim Zebrafisch im einfachen Chromosomensatz ein „single-copy“ Gen ist. Mittels RT-PCR konnte eine sehr frühe erste Expression von TIP39 bereits ab 16 Stunden nach Fertilisation gezeigt werden. Im Bereich des supraoptischen Trakts des Zebrafischhirn konnte eine scharf umschriebene Zellpopulation mit starker TIP39-Expression detektiert werden. Durch Knockdown-Experimente konnte beim Zebrafisch gezeigt werden, dass ein Fehlen von TIP39 Expression während der Embryogenese zu einer Fehlentwicklung des Frontalhirns führt und zudem mit einer Funktionsbeeinträchtigung der Schwanzmotorik einhergeht. Hierfür wurden gerade befruchteten Zebrafischeiern im Zwei-Zell-Stadium sogenannte „Morpholinos“ injiiziert, welche als Antisense-Nukleotide spezifisch die Translation von TIP39 hemmen. Ergänzend konnte im Mäusehirn die Expression von TIP39 mittels in-situ Hybridisierung bestimmt werden. Es zeigte sich eine Expression von TIP39 in einer Vielzahl von klar umschriebenen Neuronengruppen, so im Hypothalamus, dem limbischen System und in sensorischen Neuronen, ohne dass sich im Einzelfall jeweils sicher eine Funktion hieraus ableiten lässt. In der vorliegenden Arbeit konnte somit erstmals gezeigt werden, dass TIP39 zur korrekten Neurogenese bei der Entwicklung des Frontalhirns des Zebrafisches unabdingbar ist und auch die frühe Entwicklung der Motoneurone durch TIP39 beeinflusst wird. Die ermittelten Daten unterstützen die Vorstellung von TIP39 als ein sezerniertes Neuropeptid, das als Transmitter in der Sensorik, insbesondere der Nozizeption, wirkt. Auch eine Beeinflussung der zentralnervösen Steuerung der Motorik durch TIP39 wird angenommen. Die gute Lokalisations-Übereinstimmung der Expressionen von TIP39 mit seinem zugeordneten Rezeptor, dem PTH2-Rezeptor, lässt eine systemische endokrine Wirkung von TIP39 wenig wahrscheinlich erscheinen, sondern stärkt die Hypothese von TIP39 als einem para-, bzw. autokrin wirkenden Neurotransmitter. N2 - The tuberoinfundibular peptide of 39 aa (TIP39) is a short oligopeptide containing two alpha-helices. It was first detected in hypothalamic tissue while searching for a ligand of the new-described parathyroid hormone receptor 2 (PTH2R). So far only expression scheme and interaction with the PTH2R is investigated. TIP39 is the most potent activator of the PTH2R and a functional antagonist of the PTH1R. In contrast little is known about the physiological role of TIP39, influences on the calcium phosphate balance or on nociception are discussed. We focused on the analysis of the zebrafish gene encoding the TIP39. The complete cDNA was amplified and publish in PubMed (Accession No. AF486190). The gene locus was detected on chromosome 17 via radiation hybrid mapping. TIP39 consists of 3 exons and 2 introns, in total covering 3750 bp. Zebrafish TIP39 is translated as a preprohormone, containing a typical 25 aa signal sequence, responsible for uptake to the endoplasmatic reticulum. This signal sequence showed broad accordance among all 12 analysed species, but the following 93 aa intercalated peptide is only poorly conserved. The actual TIP39 peptide shows aa accordance of 59% between zebrafish and human. Via southern blotting zebrafish TIP39 was characterized as a single copy gene. The fist expression of TIP39 during embryogenesis was detected before 16 hpf by RT-PCR. Strong TIP39 expression was located in a distinct cell group of the supraoptic tract. Knockdown of TIP39 during embryogenesis showed TIP39 being indispensable for correct forebrain development. Furthermore we described the distribution of TIP39 expression in the mouse brain by in-situ hybridization. In this work the zebrafish TIP39 gene is described. We showed first the influence of TIP39 on correct forebrain development and motoneurone formation. This data confirm TIP39 being most likely a neurotransmitter involved in sensoric especially nociception. Because of the widely concordance of the TIP39 and PTH2R expression we estimate a paracrine or autocrine effect of TIP39. KW - Zebrabärbling KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - TIP39 KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - Zebrafisch KW - TIP39 KW - parathyroid hormone KW - receptor KW - zebrafish Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-32230 ER - TY - THES A1 - Kotzsch, Alexander T1 - BMP Ligand-Rezeptor-Komplexe: Molekulare Erkennung am Beispiel der Spezifischen Interaktion zwischen GDF-5 und BMPR-IB T1 - BMP ligand receptor complexes: Molecular recognition exemplified by the specific interaction between GDF-5 and BMPR-IB N2 - Knochenwachstumsfaktoren (Bone Morphogenetic Proteins, BMPs) sind ubiquitäre, sekretierte Proteine mit vielfältigen biologischen Funktionen. Die Vielfalt an zellulären Prozessen, die durch BMPs reguliert werden, von der Knochenentwicklung und Organhomöostase bis hin zur Neurogenese, erstaunt – und wirft angesichts von teils redundanten, teils spezifischen Funktionen der BMPs Fragen zu den Mechanismen ihrer Signalübermittlung auf. Die Signaltransduktion von BMPs erfolgt wie bei den strukturell verwandten TGF-βs und Activinen durch die ligandeninduzierte Oligomerisierung von transmembranen Serin/Threonin-Kinaserezeptoren, von denen zwei Typen – Typ I und Typ II – existieren. Einer Vielzahl von mehr als 18 BMP-Liganden stehen nach derzeitigem Erkenntnisstand nur vier Typ I und drei Typ II Rezeptorsubtypen für die Bildung von heteromeren Rezeptorkomplexen zur Verfügung. Ein BMP-Ligand kann hochspezifisch nur einen bestimmten Rezeptorsubtyp oder in einer promisken Art und Weise mehrere Rezeptorsubtypen binden. Trotz dieser Bindungspromiskuität üben BMPs ihre biologische Funktion überwiegend hochspezifisch aus, d.h. abhängig vom Liganden werden spezifische zelluläre Prozesse reguliert. Somit stellt sich die Frage, wie die Bildung von heteromeren Ligand-Rezeptor-Komplexen und die Aktivierung definierter intrazellulärer Signalkaskaden zusammenhängen und wie letztlich ein bestimmtes BMP-Signal durch einen „Flaschenhals“, repräsentiert durch die begrenzte Anzahl an Rezeptorsubtypen, in das Zellinnere übermittelt wird. Die Interaktionen zwischen BMP-2 / GDF-5 und den Typ I Rezeptoren BMPR-IA / BMPR-IB sind ein Paradebeispiel für Bindungspromiskuität und -spezifität. Während BMP-2 beide Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB mit gleicher Bindungsaffinität bindet („promiske Interaktion“), zeigt GDF-5 eine 15-20fach höhere Bindungsaffinität zu BMPR-IB („spezifische“ Interaktion). Dieser Unterschied ist scheinbar gering, aber physiologisch überaus relevant. Um Einblick in die Mechanismen der molekularen Erkennung zwischen den Bindungspartnern zu gewinnen, wurden binäre und ternäre Komplexe aus den Liganden BMP-2 oder GDF-5, den extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA oder BMPR-IB sowie der extrazellulären Domäne des Typ II Rezeptors ActR-IIB untersucht. Die hier vorliegende Arbeit beschreibt die strukturelle und funktionelle Analyse dieser Ligand-Rezeptor-Komplexe. Um den Einfluss struktureller Flexibilität auf die BMP Typ I Rezeptor Erkennung näher zu analysieren, wurde zudem die Struktur von BMPRIA in freiem Zustand mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt. Aus Mutagenesedaten und der Kristallstruktur des GDF-5•BMPR-IB-Komplexes lassen sich im Vergleich zu bekannten Kristallstrukturen Merkmale ableiten, mit denen die Ligand-Rezeptor-Bindung und -Erkennung charakterisiert werden kann: (1) Die Hauptbindungsdeterminanten in Komplexen von BMPR-IA und BMPR-IB mit ihren Liganden sind unterschiedlich. Während in Komplexen mit BMPR-IB ein hydrophobes Motiv die Bindungsaffinität bestimmt, trägt in Komplexen mit BMPR-IA eine polare Interaktion signifikant zur Bindungsenergie bei. Ein Vergleich der Strukturen von freien und gebundenen Liganden und Typ I Rezeptoren zeigt, dass interessanterweise diese Hauptbindemotive erst bei der Ligand-Rezeptor-Interaktion entstehen, sodass ein „induced fit“ vorliegt und die Moleküle entsprechend „aufeinander falten“. (2) Die Bindungsspezifität wird durch periphere Schleifen in den Typ I Rezeptoren bestimmt. Wie Untersuchungen von Punktmutationen in BMPR-IA zeigen, die einer krebsartigen Darmerkrankung (Juvenile Polyposis) zugrunde liegen, führt erst die „richtige“ Kombination aus Flexibilität in den Schleifen und Rigidität des Rezeptorgrundgerüsts zu signalaktiven Typ I Rezeptoren mit einer potentiell den Liganden komplementären Oberfläche. Die mangelnde sterische Komplementarität von Ligand- und Rezeptoroberflächen führt zu der niedrigeren Bindungsaffinität von GDF-5 zu BMPR-IA im Vergleich zu BMPR-IB. Interessanterweise zeigen die hier vorgestellten, hochaufgelösten Strukturdaten, dass die Orientierungen/Positionen der Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB in den Bindeepitopen der Liganden BMP-2 und GDF-5 variieren. Unter der Voraussetzung, dass die extrazelluläre Domäne, das Transmembransegment und die intrazelluläre Domäne der Typ I Rezeptoren ein starres Element bilden, sollte sich die unterschiedliche Orientierung der extrazellulären Domänen der Typ I Rezeptoren in der Anordnung der Kinasedomänen widerspiegeln und sich auf die Signaltransduktion auswirken. Möglicherweise ist eine bestimmte Anordnung der Kinasedomänen der Typ I und Typ II Rezeptoren für eine effiziente Phosphorylierung bzw. Signaltransduktion erforderlich. Der Vergleich mehrerer Ligand-Typ I Rezeptor-Komplexe zeigt, dass die unterschiedliche Orientierung dieser Rezeptoren möglicherweise vom Liganden abhängt. Angesichts der Bindungspromiskuität unter BMP-Liganden und -Rezeptoren könnten so spezifische Signale übermittelt und spezifische biologische Funktionen reguliert werden. Die in dieser Arbeit vorgestellten Erkenntnisse tragen wesentlich zur strukturellen Charakterisierung der Ligand-Rezeptor-Erkennung in der BMP-Familie bei. Die Frage, warum trotz strukturell hoch homologer Liganden und Rezeptoren und weitgehend konservierten Bindeepitopen eine teils promiske und teils spezifische Interaktion möglich ist, kann nun für die Liganden BMP-2 und GDF-5 sowie den beiden Typ I Rezeptoren BMPR-IA und BMPR-IB beantwortet werden. N2 - Bone morphogenetic proteins (BMPs) are ubiquitous, secreted cytokines involved in a manifold of biological functions. The diversity of cellular processes regulated by BMPs, from bone development to tissue homeostasis and neuronal processes, is amazing – and raises questions about the mechanisms of signal transduction in the light of redundant functions on the one hand, and specific functions on the other hand. Similar to structurally related activins and TGF-βs, the signal transduction of BMPs is accomplished by ligand-induced oligomerization of transmembrane BMP type I and type II serine/threonine receptor kinases. According to current knowledge, only four type I and three type II receptor subtypes are available for BMP signal transduction, facing a multitude of more than 18 BMP ligands. Binding of BMP ligands to their receptors can be highly specific meaning that only one specific receptor of either subtype is used for signaling. In contrast, many BMP ligands can recruit more than one receptor subtype, which results in binding promiscuity. However, even though receptor subtypes are bound in a promiscuous manner, only certain biological functions are triggered. Dependent on the BMP ligand, specific cellular processes are activated and regulated. This discrepancy between unspecific binding and specific signaling events and the biological response raises the question how the formation of heteromeric ligand-receptor complexes is linked to the activation of defined intracellular signaling cascades, and finally, how a certain BMP signal is transduced into the interior of the cell through a „bottleneck“ represented by the limited number of receptor subtypes. The interaction between BMP-2 / GDF-5 and the BMP type I receptors BMPR-IA / BMPR-IB is a prime example for binding promiscuity and binding specificity. BMP-2 binds BMPR-IA and BMPRIB with almost equal binding affinity („promiscuous interaction“) while GDF-5 exhibits a 15-20fold higher binding affinity to BMPR-IB („specific interaction“). Although this difference is seemingly small, it is however of considerable relevance for the physiological role of these ligands. To gain insight into the mechanisms of molecular recognition between the binding partners, binary and ternary ligand-receptor complexes consisting of BMP-2 or GDF-5, the extracellular domains of the type I receptors BMPR-IA or BMPR-IB, and the extracellular domain of the type II receptor ActRIIB were investigated. The thesis presented here describes the structural and functional analysis of these ligand-receptor complexes. To analyse the effect of structural flexibility on BMP type I receptor recognition in more detail, the structure of free BMPR-IA was determined using NMR spectroscopy. Based on data from a limited mutagenesis and the crystal structure of the GDF-5•BMPR-IB complex several characteristics concerning ligand-receptor binding and recognition can be deduced: (1) The main binding determinants in complexes of BMPR-IA and BMPR-IB with their ligands BMP-2 and GDF-5 differ. A hydrophobic binding motif determines binding affinity in complexes of BMPR-IB, whereas a polar interaction significantly contributes to binding energy in complexes of BMPR-IA. These main binding motifs are only formed during complex formation as demonstrated by a comparison between structures of free and bound ligands as well as type I receptors. Both ligand and receptor fold „onto each other“ which suggests an induced fit mechanism. (2) Binding specificity is encoded on loops at the periphery of the binding epitope of the type I receptors. Only the „appropriate“ combination between structural flexibility in the receptor loops and structural rigidity of the receptor backbone results in signal active type I receptors, as shown by analysis of single polymorphisms in BMPR-IA causing juvenile polyposis syndrome, a cancerous disease of the intestine. A lack of steric surface complementarity between GDF-5 and BMPR-IA, that cannot be overcome by structural flexibility, leads to the lower binding affinity in comparison to BMPR-IB. Interestingly, the high resolution structure of the GDF-5•BMPR-IB complex shows that the orientations/positions of BMPR-IA in the binding epitope of BMP-2 and of BMPR-IB in the binding epitope of GDF-5 vary. Assuming that the extracellular domain, the transmembrane segment, and the intracellular domain of the type I receptors form a rigid element, the different orientations of the extracellular domains should also reflect the assembly of the kinase domains and therefore, affect signal transduction. One can assume that a defined arrangement of the kinase domains of type I and type II receptors is required to allow for efficient phosphorylation and signal transduction, respectively. The comparison of several BMP ligand-type I receptor complexes suggests that the different orientations of these receptors are likely dependent on the ligand. Considering the binding promiscuity among BMP ligands and receptors such a mechanism would represent a possible way for the transmission of specific signals and regulation of specific biological functions. The insights into molecular structure and function of BMP ligands and receptors presented in this thesis contribute significantly to a more detailed understanding of their binding properties. The question why the interaction of BMP ligands and receptors is promiscuous on the one hand and specific on the other hand in spite of structurally highly homologous molecules can now be answered for BMP-2 and GDF-5 as well as BMPR-IA and BMPR-IB. KW - Cytokine KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Ligand KW - Proteinfaltung KW - Molekulare Erkennung KW - Rezeptor KW - Transforming Growth Factor beta KW - Wachstumsfaktor KW - Strukturaufklärung KW - Dreidimensionale NMR-Spektroskopie KW - Protein-Serin-Threonin-Ki KW - Proteinkristallographie KW - GDF-5 KW - BMPR-IB KW - Signaltransduktion KW - protein crystallography KW - molecular recognition KW - signal transduction KW - ligand KW - receptor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-31040 ER - TY - THES A1 - Herzog, Anna Laura T1 - Migräne und das serotonerge System T1 - Migraine and the serotonergic system N2 - Untersuchung zu single-nucleotid-polymorphismen (SNPs) der Serotoninrezeptoren 5-HT2A, 5-HT3A, des Neurotrophins BDNF und des Enzyms Tryptophanhydroxlase auf deren Korrelation mit Migräne mit und ohne Aura. N2 - Correlation between single nucleotide polymorphisms in genes of serotonergic 5-HT2A and 5-HT3A-receptors, brain derived neurotropic factor and Tryptophanhydroxylase with migraine with and without aura phenomenon. KW - Migräne KW - Serotonin KW - 5-HT2A KW - 5-HT3A KW - BDNF KW - TPH KW - Rezeptor KW - Migraine KW - serotonin KW - 5-HT2A KW - 5-HT3A KW - BDNF KW - TPH KW - receptor Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-29380 ER - TY - THES A1 - Kraich, Michael T1 - Strukturelle und funktionelle Untersuchungen der Interaktion zwischen Ligand und Rezeptor im Interleukin-4- und Interleukin-13-System T1 - Structural and functional studies of the interaction between ligand and receptor in the interleukin-4 and interleukin-13 system N2 - Interleukin-4 (IL-4) und Interleukin-13 (IL-13) sind bedeutende Regulatorproteine des Immunsystems. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung und dem Verlauf von allergischen Erkrankungen, wie z.B. Asthma. Um ihre Signale in die Zielzelle zu transduzieren, kann von beiden Zytokinen der gleiche Zelloberflächenrezeptor verwendet werden, wodurch sich die überlappenden, biologischen Funktionen erklären lassen. Dieser gemeinsam genutzte Rezeptor ist aus den beiden Untereinheiten IL-4Ralpha; und IL-13Ralpha1 aufgebaut. Da IL-4 und IL-13 auf Aminosäureebene nur etwa 25% Sequenzidentität besitzen und stark unterschiedliche Affinitäten zu den beiden Rezeptorketten besitzen, stellt sich die Frage, durch welchen molekularen Erkennungsmechanismus, die Affinität und die Spezifität der Ligand-Rezeptor-Interaktion unabhängig voneinander reguliert werden kann. In dieser Arbeit gelang es, rekombinante Expressions- und Aufreinigungsstrategien für IL-13 und die extrazellulären Domänen der Rezeptorketten IL-13Ralpha1 und IL-13Ralpha2 zu entwickeln. Dadurch war es mögliche, eine breite Mutations-/Interaktionsanalyse der IL-13Ralpha1-Kette durchzuführen.Es konnte gezeigt werden, dass die N-terminale FnIII-ähnliche Domäne von IL-13Ralpha1 sowohl an der Bindung von IL-13 als auch an der Interaktion mit IL-4 beteiligt ist. Im funktionellen Bindeepitop der IL-13Ralpha1-Kette wurden die Aminosäurereste Arg84, Phe253 und Tyr321 als Hauptbindungsdeterminanten für die Interaktion mit IL-13 identifiziert. Durch die Interaktionsstudien der IL-13Ralpha1-Varianten mit IL-4 wurde gezeigt, dass diese Hauptbindungsdeterminanten auch für die niederaffine Bindung von IL-4 von größter Bedeutung sind. Die funktionellen Bindeepitope für IL-4 und IL-13 auf der IL-13Ralpha1-Kette sind nahezu identisch und überlappen in einem großen Bereich. Aufgrund der Ergebnisse aus der Mutagenesestudie war es möglich, ein Strukturmodell der extrazellulären Domäne der IL-13Ralpha1-Kette zu erstellen. Darin wird eine neuartige Orientierung der N-terminalen FnIII-Domäne und deren Beteiligung an der Ligandeninteraktion dargestellt. Mit Hilfe des Strukturmodells gelang es, neue Aminosäurerest auf der Oberfläche von IL-13 zu identifizieren, die an der Bindung zu IL-13Ralpha1 beteiligt sind, was die Relevanz des Strukturmodells weiter unterstreicht. In einem weiteren Teil dieser Arbeit wurde versucht, den molekularen Mechanismus aufzuklären, durch den es den superagonistischen IL-4-Varianten T13D und F82D gelingt, mit dreifach höherer Affinität an die IL-4Ralpha-Kette zu binden, als wildtypischer Ligand. Durch strukturelle und funktionelle Untersuchungen wurde gezeigt, dass der Affinitätssteigerung ein indirekter Mechanismus zugrunde liegt, bei dem eine Konformationsänderung und die Fixierung der Arg85-Seitenkette von IL-4 zur Ausbildung von zusätzlichen Ligand-Rezeptor-Interaktionen führt. Das Bindeepitop zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette besitzt eine modulare Architektur aus drei unabhängig voneinander agierenden Interaktionsclustern. Bei der Interaktion von wildtypischem IL-4 mit IL-4Ralpha tragen nur zwei dieser Cluster in signifikanter Weise zur freien Bindeenergie bei. Im Falle der superagonistischen IL-4-Varianten ist jedoch auch das dritte Cluster an der Generierung von zusätzlicher, freier Bindeenergie beteiligt, wodurch die Affinität zwischen Ligand und Rezeptor erhöht wird. Damit stellt der modulare Aufbau der Interaktionsfläche zwischen IL-4 und der IL-4Ralpha-Kette möglicherweise einen Mechanismus dar, über den Proteine die Affinität von Wechselwirkungen über einen großen Bereicht variieren können, ohne dabei Spezifität einzubüssen. Da IL-4 und IL-13 als interessante Zielmoleküle für die Therapie von allergischen und asthmatischen Erkrankungen erkannt worden sind, können die in der vorliegenden Arbeit gewonnenen Informationen über den Bindemechanismus und die Einblicke in den molekularen Charakter der Interaktion zwischen den beiden Zytokinen und ihren spezifischen Rezeptorketten dabei helfen, neuartige und hoch spezifische, inhibitorische Moleküle zu entwickeln. N2 - Interleukin-4 (IL-4) and Interleukin-13 (IL-13) are important regulatory proteins of the immune system. They play a key role in the development and the progression of allergic diseases like asthma. For signal transduction into the target cell, both cytokines can use an identical cell surface receptor, which is an explanation for many overlapping biological functions of IL-4 and IL-13. This common receptor consists of the two subunits IL-4Ralpha and IL-13Ralpha1. Because IL-4 and IL-13 share only 25% sequence identity on the amino acid sequence level and because they show very different affinities to the two receptor chains, the question has to be raised, by which molecular recognition mechanism it is possible to regulate affinity and specificity of the ligand-receptor-interaction independently. In the course of this work recombinant expression and purification strategies for IL-13 and the extracellular domains of IL-13Ralpha1 and IL-13Ralpha2 were established. Therefore it was possible to perform a broad mutagenesis and interaction analysis of the IL-13Ralpha1 chain. It was shown, that the N-terminal FnIII-like domain of IL-13Ralpha1 participates in the binding of IL-13 as well as in the interaction with IL-4. As part of the functional epitope the amino acid residues Arg84, Phe253 and Tyr321 were identified to be main binding determinants for the interaction with IL-13. By carrying out interaction studies with IL-4 it could be demonstrated, that the same residues are also from great importance for the low affinity binding of IL-4. The functional epitopes for the binding of IL-4 and IL-13 are almost identical and are overlapping in a large area. Due to the results of the mutagenesis study it was possible to generate a structural model of the extracellular domain of the IL-13Ralpha1 chain. A key feature of this model is the novel orientation of the N-terminal FnIII-like domain and its involvement in ligand binding. According to the modelled structure new residues in IL-13 could be identified, that participate in the interaction with the IL-13Ralpha1. This further underlines the relevance of the shown structural model of the extracellulardomain of the IL-13Ralpha1 chain. In a different part of this work it was tried to elucidate the molecular mechanism, which enables the super-agonistic IL-4 variants T13D and F82D bind IL-4Ralpha with three times higher affinity than wildtype IL-4. With the help of structural und functional analysis it could be shown, that an indirect mechanism leads to the gain of affinity. A conformational change in and the fixation of the Arg85 side chain in IL-4 result in the formation of additional interactions between ligand and receptor. The binding interface between IL-4 and IL-4Ralpha exhibits a modular architecture consisting of three independently acting interaction clusters. For the binding of wild-type IL-4 to the IL-4Ralpha chain only two of the three clusters contribute a significant amount to the overall free binding energy. In the case of the super-agonistic IL-4 variants all three interaction clusters are used to generate additional free binding energy and to increase the affinity between ligand and receptor. Therefore the modular design of the IL-4/IL-4Ralpha interaction interface probably represents a mechanism, which enables proteins to alter the affinity of interactions over a broad range without loosing specificity. Because IL-4 and IL-13 were discovered as promising targets for the therapy of allergic and asthmatic diseases, the acquired information about the binding mechanism and the molecular characteristics of the interaction between the cytokines IL-4 and IL-13 and their specific receptor chains may help to design novel and highly specific inhibitory molecules. KW - Renaturierung KW - Ligand KW - Biochemie KW - Interleukin 4 KW - Interleukin 13 KW - Interaktion KW - Rezeptor KW - Immunologie KW - Allergie KW - Allerg KW - Proteinbiochemie KW - BIAcore KW - Oberflächenplasmonresonanz (SPR) KW - Strukturbiologie KW - interleukin-4 KW - interleukin-13 KW - protein interaction KW - BIAcore KW - structural biology Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27655 ER - TY - THES A1 - Schmidt, Johann T1 - Wasserstoffbrückengesteuerte Ausrichtung von Merocyaninfarbstoffen für photorefraktive Materialien T1 - Hydrogen-Bond-Directed Orientation of Merocyanine Dyes for Photorefractive Materials N2 - Merocyaninchromophore spielen eine herausragende Rolle bei der Entwicklung von photorefraktiven Materialien für Anwendungen in der Holographie. Der photorefraktive Effekt beruht auf einer Orientierung der dipolaren Merocyanine in einem elektrischen Feld. Diese können umso effektiver ausgerichtet werden, je größer ihr Dipolmoment ist. Folglich sollten Merocyanine mit sehr großen Dipolmomenten den gewünschten Effekt hervorbringen. Es hat sich jedoch gezeigt, dass solche Merocyanine Dimere mit antiparalleler zentrosymmetrischer Struktur bilden. In dieser Anordnung addieren sich die Dipolmomente destruktiv, so dass die dipolare Eigenschaft des Materials verloren geht. In dieser Arbeit ist es gelungen, Merocyanine über sechsfache Wasserstoffbrückenbindungen zu supramolekularen Strukturen mit großen resultierenden Dipolmomenten zu assoziieren. Diese Komplexe werden in schwach polaren Lösungsmitteln sogar bei sehr niedrigen Farbstoffkonzentrationen gebildet. N2 - Merocyanine dyes play a major role in the development of photorefractive materials to be applied in holography. The photorefractive effect is based on the orientation of dipolar merocyanine dyes by an external electric field. Merocyanine dyes with very high dipole moments are supposed to be the most suitable for achieving an optimal effect because, with increasing dipole moment, a higher degree of orientation can be achieved are the more efective is the their orientation. However, strongly dipolar merocyanine dyes form antiparallel dimers with vanishing dipole moment due to their dipolar interaction. Thus, the dimers can not be oriented by an electric field. In this thesis, merocyanine dyes were successfully assembled through six-fold hydrogen-bonding into supramolecular structures with large resulting dipole moments. In less polar solvents, these complexes are formed even at very low dye concentration. KW - Merocyanine KW - Wasserstoffbrückenbindung KW - Supramolekulare Chemie KW - Ausrichtung KW - Polymethinfarbstoff KW - Rezeptor KW - Dipolmoment KW - Dipol-Dipol-Wechselwir KW - Hamilton-Rezeptor KW - Merocyanine Dye KW - Hydrogen-Bond KW - Orientation KW - Supramolecular Chemistry KW - Synthesis Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-27156 ER - TY - THES A1 - Andres, Oliver T1 - Interaktion von Masernviren mit vaskulären Endothelzellen T1 - Interaction of measles virus with vascular endothelial cells N2 - Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind. N2 - Although an effective live vaccine is available, measles still represents a major infectious disease causing about 750,000 deaths a year, preferentially in children. Due to the measles virus (MV)-induced immunosuppression secondary bacterial infections as otitis or pneumonia are common complications. Neurological involvement can lead to the acute postinfectious measles encephalitis (APME), which usually ends up with severe cerebral damage, or to the lethal subacute sclerosing panencephalitis (SSPE). In particular, immunosuppressed patients may acquire serious complications such as giant-cell pneumonia or measles inclusion body encephalitis (MIBE). However, the pathogenesis of complicated measles is poorly understood. Apart from epithelial cells, monocytes, macrophages and lymphocytes vascular endothelial cells (EC) are supposed to be important target cells for MV and involved in the pathogenesis of classic and complicated measles. Immunohistochemistry of pathologic sections has repeatedly revealed infected vascular EC in areas of extensive infection and inflammation. A systematic in-vitro analysis of the interaction of MV with human vascular EC has not been performed yet. This dissertation issues now a basic and systematic investigation of the interaction of attenuated and virulent MV strains with human vascular EC and aims to create a basis to define molecular mechanisms of MV pathogenesis. Natural conditions were approached by using primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) and a human brain microvascular endothelial cell line (HBMEC) as cell culture models and attenuated and virulent MV strains as infectious agents. As a prerequisite for all experiments, both the primary cells and the cell line were examined for their growth features and their expression of EC specific marker molecules. The surface proteins membrane cofactor protein (MCP or CD46) and signaling lymphocytic activation molecule (SLAM or CD150) have previously been described as cellular receptors for MV. It has been proven here that HUVEC and HBMEC express CD46 constitutively, whereas SLAM was not detectable on various cellular levels. Neither the activation of EC with a range of cytokines and stimulants nor the contact of EC with inactivated MV induced the expression of SLAM, although an expression of toll-like receptor 2 (TLR2) by EC can be observed. Several studies on the infection of EC with MV displayed that the attenuated MV strain Edmonston (Edm) and, to a lower extent, the virulent MV strains WTFb, Wü4797 and Wü5679 are able to infect EC, accompanied by morphologic alte¬rations and cytopathic effects. Further experiments revealed efficient replication and spreading especially of Edm and Wü4797 in EC cultures. However, CD46 specific antibodies were able to reduce the capability of Edm to infect EC clearly, the replication of Wü4797, however, was not affected. Activation of EC by preincubation with a range of cytokines or stimulants had no significant effect on MV infection, interferon-α and -γ seemed to lower the extent of MV infection. The following analyses of differential receptor modulation by MV indicate that CD46 acts as a cellular receptor only for the attenuated strain Edm, but not for the virulent strains WTFb, Wü4797 or Wü5679. The results of this dissertation provide clear evidence of a CD46- and SLAM-independent infection of human vascular EC with virulent MV strains. In consequence, a further, yet unidentified cellular receptor on EC or a receptor-independent uptake and spreading mechanism of MV in EC cultures must be postulated. Finally, it is certain that EC are involved in the pathogenesis of MV-induced complications, whether directly or indirectly. KW - Masern KW - Endothel KW - Masernvirus KW - Infektion KW - Paramyxovirose KW - Slow-Virus-Infektion KW - Virusinfektion KW - Encephalitis KW - Rezeptor KW - Toll-like-Rezeptoren KW - SLAM KW - CD150 KW - CD46 KW - HUVEC KW - HBMEC KW - measles KW - HUVEC KW - HBMEC KW - SLAM KW - CD46 Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25650 ER - TY - THES A1 - Rupprecht, Daniel T1 - Synthese und Optimierung sequenzselektiver künstlicher Rezeptoren für biologisch relevante Oligopeptide T1 - Synthesis and Optimization of Sequence Selective Artificial Receptors for Biologically Relevant Oligopeptides N2 - Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit der Entwicklung von künstlichen Rezeptoren für biologisch relevante Oligopeptide und besteht aus drei Teilen. Im ersten Teil wurde auf der Basis von computergestützten de novo Berechnungen ein künstlicher Rezeptor für den D-Alanin-D-Alanin-C-Terminus entwickelt. Diese Peptidsequenz befindet sich in bakteriellen Zellwänden und nimmt eine Schlüsselfunktion in der Wirkungsweise des Antibiotikums Vancomycin ein. Zur Entwicklung dieses Rezeptors wurde ein Guanidiniocarbonylpyrrol als Bindungsmotiv für Carboxylate mit einer Cyclotribenzylen-Einheit verknüpft. Letztere ist entsprechend der theoretischen Berechnungen in der Lage, die Methylreste des Alanins größenselektiv durch hydrophobe Wechselwirkungen zu koordinieren. Dieser Rezeptor wurde in umfangreichen Bindungsstudien bezüglich seiner Affinität in Wasser und seiner Substratselektivität untersucht. Zur Erhöhung der Löslichkeit und zur Bestimmung der Komplexstruktur mit NMR-Techniken in Wasser wurde ein weiteres Derivat des Rezeptors synthetisiert, welches in peripherer Position mit Triethylenglykolseitenketten substituiert ist. Auf diese Weise gelang es, einen hoch affinen (log K = 4,7) und hoch selektiven künstlichen Rezeptor für den D-Ala-D-Ala-Terminus darzustellen und umfassend zu charakterisieren. So konnte gezeigt werden, dass ein de novo Design derartiger Rezeptoren prinzipiell möglich ist. In einem weiteren Teilprojekt wurde ein künstlicher Rezeptor für die interne RGD-Peptidsequenz entwickelt. Diese nimmt eine zentrale Funktion in Zell-Zell- und Zell-Matrix-Erkennungsprozessen ein. Dieses Teilprojekt wurde in Zusammenarbeit mit dem Arbeitskreis Schrader (Universität Marburg) durchgeführt. Dazu wurde ein Bindungsmotiv für Alkylguanidine (in der Seitenkette von Arg, R) über einen geeigneten Spacer mit einem Bindungsmotiv für Carboxylate (in der Seitenkette von Asp, D) verknüpft. Nach der Synthese und Charakterisierung einer Reihe von vier Rezeptoren konnte die grundsätzliche Anwendbarkeit dieses Ansatzes bestätigt werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass der verwendete Spacer für die Effektivität der Koordinierung von besonderer Bedeutung ist. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse wurde in einem dritten Teilprojekt ein kombinatorisches Festphasenprotokoll zur Optimierung derartiger Spacer entwickelt. Dabei wurde das Carboxylat-Bindungsmotiv (ein Guanidiniocarbonylpyrrol) auf einem polymeren Träger immobilisiert. Zu diesem Zweck wurden umfangreiche Studien zur Synthese von Pyrrol-Tricarboxylaten und zur Verwendung verschiedener Schutzgruppen unternommen. Die Eigenschaften von drei Schutzgruppen unterschiedlicher Sensitivität (basisch, stark sauer und photolytisch spaltbar) auf dem Acylguanidin wurden in Lösung und an der festen Phase untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein umfangreiches HPLC-Protokoll zur Charakterisierung der Reaktion entwickelt. So gelang die Entwicklung und Etablierung eines universell einsetzbaren Protokolls zur Optimierung derartiger Rezeptoren, womit zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten in der kombinatorischen Chemie aber auch in weiteren Teilbereichen wie der Katalyse oder der Chromatographie ermöglicht werden. N2 - The present thesis deals with the development of artificial receptors for biologically relevant peptides and consists of three parts. In the first part an artificial receptor for the D-Ala-D-Ala-D-Terminus was developed. This target plays an important role in the mode of action of the antibiotic Vancomycin. A carboxylate binding site (CBS) was synthetically combined with a cyclotribenzylene moiety. The cyclotribenzylene is capable of size selective hydrophobic coordination of the alanine methyl side chain at least according to theoretical calculations. After the synthesis the receptor was investigated regarding affinity and selectivity of target coordination in buffered aqueous media. Furthermore, a water soluble analogue with triethylene glycole substitution in peripheric position was synthesized and characterized. By this method a highly effective (log K = 4.7) and highly selective artificial receptor for D-Ala-D-Ala was developed and the usefulness of a de novo receptor design was demonstrated. In the second part an artificial receptor for the internal RGD peptide was developed, which plays an important role in cell-cell- and cell-matrix-recognition. This part was carried out in cooperation with the workgroup of Prof. Schrader (University of Marburg). Therefore, a supramolecular binding motif for alkyl guanidines (as in the side chain of Arg, R) was combined synthetically with a binding motif for carboxylates (as in the side chain of Asp, D) via a suitable spacer. After synthesis and characterization of a series of four receptors with different flexibility this concept was confirmed while lining out the particular importance of the choice of spacer. Based on these insights a solid phase protocol for optimization of such artificial receptors, especially with internal spacers, was developed in a third part. Hence, the guanidiniocarbonyl pyrrole moiety was immobilized on polymeric support. In this context extensive research aimed at the synthesis of pyrrole tricarboxylates and the use of various protective groups was performed. The chemical behavior of the protective groups of ´different sensitivity (basic, strong acidic and photolytic cleavable) for acyl guanidines was characterized in solution and on solid support. Furthermore, an N to C solid phase protocol was established. These results obtained now open the door of a wide range of applications of the CBS for receptor optimization, catalysis or chromatography. KW - Oligopeptide KW - Kombinatorische Synthese KW - Rezeptor KW - supramolekulare Chemie KW - organische Synthese KW - Bioorganik KW - kombinatorische Methodenentwicklung KW - Schutzgruppenstrategie KW - Supramolecular Chemistry KW - Organic Synthesis KW - Bioorganic Chemistry KW - Combinatorial Method Development KW - Protective Group Strategy Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-20277 ER - TY - THES A1 - Hartung, Anke T1 - Localization of BMP receptors in distinct plasma membrane domains and its impact on BMP signaling T1 - Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Plasmamembrandomänen und deren Auswirkung auf den BMP Signalweg N2 - Endocytosis of growth factor receptors plays an important role in the activation and propagation as well as the attenuation of signaling pathways. Its malfunctioning can cause several pathologies, e.g. by controlling the level of receptors at the cell surface. BMPs are members of the TGF-ß superfamily and are involved in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis. BMP signaling is initiated at two types of transmembrane serine/threonine kinases, BRI and BRII. BMP receptor activation occurs upon ligand binding to preformed complexes (PFCs) or BMP2-induced signaling complexes (BISCs) composed of BRI and BRII. Binding of BMP2 to PFCs results in activation of the Smad pathway, whereas BISCs initiate the activation of Smad-independent pathways via p38 resulting in the induction of Alkaline phosphatase (ALP). BMP receptor endocytosis has not been extensively studied and the potential role of localization to different regions of the plasma membrane in determining the signaling pathways activated by PFCs and BISCs was not explored so far. In the present work, the localization of BMP receptors in distinct membrane domains and the consequential impact on BMP signaling were investigated. By separating detergent-resistant membranes (DRMs) from cell lysates and subsequent gradient ultracentrifugation, it could be demonstrated that BRI and BRII cofractionate with cav-1, the marker protein of caveolae. Moreover, both receptor types interacted with cav-1 and showed a partially colocalization with cav-1 at the plasma membrane. Although these results point to a caveolar localization, BMP receptors cofractionated also with DRMs in cells exhibiting no caveolae, suggesting an additional non-caveolar raft localization. Beyond that, BRII could also be localized to clathrin-coated pits (CCPs) by means of immuno-electronmicroscopy studies. The second part of this thesis demonstrated that both membrane regions influence BMP signaling in distinct ways. Smad1/5 was shown to be phosphorylated independently of endocytic events at the cell surface. On the one hand, disruption of DRM regions by cholesterol depletion inhibited specifically BMP2-mediated ALP production, while Smad signaling was unaffected. On the other hand, inhibition of clathrin-mediated endocytosis by specific inhibitors affected BMP2-induced Smad signaling as well as the induction of ALP, suggesting that both Smad-dependent and Smad-independent signaling pathways are required for BMP2 induced ALP production. These findings propose an important regulatory impact of different endocytic routes and membrane regions on BMP signaling as well as that a distinct membrane localization of BMP receptors account for specific signaling properties initiated at PFCs or BISCs. N2 - Endozytose von Wachstumsfaktor-Rezeptoren spielt eine entscheidende Rolle bei Aktivierung und Übertragung wie auch bei der Schwächung von Signalen. Störungen der Endozytose können schwere Krankheitsbilder hervorrufen, z.B. durch ihren Einfluss auf die Regulation der Rezeptormenge an der Zelloberfläche. BMPs sind Mitglieder der TGF-ß Superfamilie und sind involviert in die Regulation von Proliferation, Differenzierung, Chemotaxis und Apoptose. Zwei Arten von Transmembranproteinen, die Serin/Threonin-Kinase Aktivität besitzen, sind bedeutend für den BMP Signalweg – die BMP Rezeptoren BRI und BRII. Die Aktivierung von BRI und BRII erfolgt durch Ligandenbindung an präformierte Komplexe (PFCs) oder BMP2-induzierte Signalkomplexe (BISCs), die aus beiden Rezeptorarten bestehen. Wenn BMP2 an PFCs bindet, wird die Smad-Signalkaskade initiiert, wohingegen BISCs Smad-unabhängige Signale über p38 weiterleiten, was schließlich zur Produktion von alkalischer Phosphatase (ALP) führt. Das Feld der BMP Rezeptor Endozytose wurde noch nicht sehr ausführlich untersucht, genauso wenig wie die potentielle Rolle, die unterschiedliche Rezeptorlokalisierungen in verschiedenen Plasmamembran-Regionen bei der Initiierung der Signalwege, die durch PFCs bzw. BISCs aktiviert werden, spielen könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Membrandomänen sowie deren Einfluss auf die BMP Signalkaskade untersucht. Mittels Reinigung von Detergenz-resistenten Membranen (DRMs) aus Zelllysaten und anschließender Gradientenultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass BRI und BRII mit dem caveolären Markerprotein cav-1 kofraktionieren. Darüber hinaus interagieren beide Rezeptorarten mit cav-1 und kolokalisieren auch teilweise mit cav-1 an der Plasmamembran. Obwohl diese Ergebnisse auf ein eindeutiges Vorkommen der Rezeptoren in Caveolae schließen lassen, kofraktionieren sie auch mit DRMs in Zellen, die von Natur aus keine Caveolae ausbilden, woraus man eine zusätzliche nichtcaveoläre Raft-Lokalisierung schlussfolgern kann. Des Weiteren konnte BRII mittels Immun- Elektronenmikroskopie in „clathrin-coated pits“ (CCPs) lokalisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass beide untersuchten Membranregionen die BMP Signalkaskade auf unterschiedliche Art und Weise beeinflussen. Es wurde bewiesen, dass Smad1/5 unabhängig von endozytotischen Vorgängen an der Plasmamembran phosphoryliert wird. Einerseits führte die Zerstörung von DRM-Regionen durch Cholesterindepletion zur spezifischen Inhibierung der BMP2-vermittelten ALP Produktion, ohne gleichzeitig die BMP Signalkaskade über Smads zu beeinflussen. Andererseits bewirkte eine spezifische Blockierung der Clathrin-vermittelten Endozytose eine Inhibition des BMP2-induzierten Smad-Signalwegs und auch der ALP Produktion, was auf ein Zusammenspiel von Smad-unabhängigen und Smad-abhängigen Signalwegen bei der ALP-Induzierung schließen lässt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen die Schlussfolgerung zu, dass verschiedene endozytotische Wege und Membranregionen einen bedeutenden, regulatorischen Einfluss auf die BMP Signalkaskade ausüben. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Membranlokalisierung von BMP Rezeptoren für das Einschlagen verschiedener Signalwege ausgehend von PFCs und BISCs verantwortlich ist. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Rezeptor KW - Endocytose KW - BMP KW - Rezeptoren KW - Endozytose KW - Lipid Raft KW - Caveolae KW - BMP KW - receptors KW - endocytosis KW - lipid raft KW - caveolae Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18360 ER - TY - THES A1 - Schwegmann, Michael T1 - Eine molekulare Fliegenfalle zur Erkennung von biologisch relevanten (poly)-anionischen Substraten T1 - a molecular flytrap for the recognition of biologically relevant (poly)-anionic substrates N2 - Im Rahmen dieser Arbeit konnte ein multivalenter Rezeptor auf Basis von Guanidiniocarbonylpyrrolen zur Komplexierung von biologisch relevanten (poly)- anionischen Substraten wie Citrat, Malat und Tatrat dargestellt werden. Der Rezeptor bindet Citrat selbst in Gegenwart eines 1000fachen Überschusses an NaCl und einem 10fachen Überschuss an Bis-tris Puffer mit einer hohen Bindungskonstante von KAss = 86000 M-1 in Wasser. Wenn man Rezeptoren auf Metall- und Boronsäurebasis nicht berücksichtigt, handelt es sich nach meinem Wissen um den besten Citrat-Rezeptor, der in der Literatur bisher publiziert ist. Außerdem zeigt der Rezeptor mit einem Faktor von mindestens 8 eine hohe Selektivität für Citrat gegenüber anderen biologisch relevanten Dicarboxylaten wie Malat und Tatrat. Mithilfe von Bindungsstudien und Molecular Modeling Rechnungen konnte hergeleitet werden, welchen Einfluss die verschiedenen nicht-kovalenten Wechselwirkungen auf die Bindungskonstante haben. Dabei konnte gezeigt werden, dass Flexibilität, Hydroxy-Funktionen, pi-Stacking und Symmetrie bei den Substraten Einfluss auf die Bindungskonstanten zeigen, wobei vor allem die unpolaren Wechselwirkungen und die zusätzliche Hydroxy-Funktionen einen hohen Anteil an der Bindung zu haben scheinen. Neben der selektiven Erkennung von Citrat durch den Rezeptor konnte zusätzlich ein Sensorsystem mit Carboxyfluorescein auf Basis eines indicator displacement assays entwickelt werden, mit dem die Anwesenheit von Citrat im Gegensatz zu anderen Carboxylaten mit dem bloßen Auge (naked eye) erkannt werden kann. Neben den Polycarboxylaten zeigt der Rezeptor außerdem noch hohe Bindungskonstanten für polyanionische Zucker. So konnten z.B. für Glucophosphate mit UV-Spektroskopie Bindungskonstanten von KAss = ca. 20000 M-1 in dem sehr polaren Lösemittelgemisch 10 % DMSO/Wasser (pH = 4, Acetat-Puffer) gefunden werden. N2 - In the course of this work a multivalent receptor based on guanidiniocarbonyl-pyrrolcations for the complexation of biologically relevant (poly)-anionic substrates like citrate, malate or tatrate was synthesised. The receptor binds citrate in the presence of a 1000fold excess of NaCl and a 10fold excess of bis-tris buffer with a high binding constant of KAss = 86000 M-1 in water. To the best of my knowledge is hence the most efficient receptor for the binding of citrate in water reported so far, if receptors on metall- and boronic acid-basis are neglected. Furthermore receptor shows a high selectivity with a factor of at least 8 for citrate against other biologically relevant dicarboxylates like malate or tartrate. With the aid of binding studies and molecular modeling calculations could be determined, which influence the different non covalent interactions have on the binding constant. It was demonstrated in this way, that flexibility, hydroxyfunctions,pi-stacking and symmetry of the substrates have a major influence on the binding constant. Especially unpolar interactions and interactions with the hydroxy group seem to play a major role in the binding mode. In addition to the selective recognition of citrate with the receptor a sensor system with carboxyfluoresceine based on an indicator displacement assay (ida) could be developed. With this ida it was possible to detect citrate in contrast to other biologically relevant substrates with the naked eye. Furthermore the receptor showed high binding constants for anionic sugars. In a solvent mixture of 10 % DMSO/Water (pH = 4, acetate buffer) bindings constants of KAss = ca. 20000 M-1 were measured for the glucophosphates. KW - Supramolekulare Chemie KW - Rezeptor KW - Molekulare Erkennung KW - Molekulare Erkennung KW - Supramolekulare Chemie KW - Bioorganische Chemie KW - molecular recognition KW - supramolecular chemistry KW - bioorganic chemistry Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17829 ER - TY - THES A1 - Großmann, Claudia T1 - Interaktion zwischen der Signaltransduktion von Aldosteron, Mineralocorticoidrezeptor und epidermalem Wachstumsfaktorrezeptor T1 - Cross-talk between Aldosterone / Mineralocorticoid Receptor and EGFR Signaling N2 - Klassischerweise ist der Aldosteron-gebundene MR an der Regulation des Blutdruckes und des Wasser-Elektrolyt-Haushaltes beteiligt. Neuere klinische Studien zeigen allerdings, dass Aldosteron auch an pathophysiologischen Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System mitwirkt. Die zugrundeliegenden Mechanismen sind noch weitgehend unbekannt. Der EGFR ist ein Wachstumsfaktor und heterologer Signaltransduktor für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren von beispielsweise Angiotensin II, Phenylephrin und Endothelin-1. In der Literatur gibt es Hinweise für eine Interaktion zwischen den Signaltransduktionswegen von Aldosteron/MR und EGFR. So können Mineralocorticoide nach zerebraler Ischämie zu einem vermehrten vaskulären Remodeling und einem Anstieg der EGFR-mRNA-Konzentration führen und außerdem eine EGF-induzierte Vasokonstriktion verstärken. Daher wäre eine mögliche Erklärung für die pathophysiologische Wirkung von Aldosteron eine Induktion der EGFR-Expression mit vermehrter Wirksamkeit von vasoaktiven Peptiden. Um diese Hypothese zu überprüfen untersuchten wir in verschiedenen Modellsystemen, ob Aldosteron die EGFR-Proteinexpression erhöht. Dies war sowohl im heterologen CHO-Expressionsystem also auch in MR-exprimierenden Zelllinien und Primärkulturen der Fall. Auch in adrenalektomierten Ratten mit osmotischen Minipumpen bestätigte sich die Aldosteron-induzierte EGFR-Expression in der Aorta, im linken Herzen und der Niere. Über den eng verwandten Glucocorticoidrezeptor ließ sich keine EGFR-Expressionssteigerung auslösen, so dass es sich um einen MR-spezifischen Effekt handelt. Zur Charakterisierung des zugrundeliegenden molekularen Mechanismus, der besonders für therapeutische Interventionen von Interesse ist, wurde die Promotoraktivität des EGFR untersucht. Es zeigte sich bei Aldosteroninkubation eine gesteigerte EGFR-Promotoraktivität im Reporter-Gen-Assay. Die beteiligten Promotoranteile konnten mit Deletionskonstrukten auf zwei DNA-Fragmente eingegrenzt werden. Von Seiten des MR ist die A/B-Domäne für die Interaktion bedeutend, denn ein trunkierter MR mit den Domänen C, D, E und F genügt nicht, um den EGFR-Promoter vollständig zu aktivieren. Um Hinweise für die physiologische und pathophysiologische Bedeutung der Interaktion zwischen MR und EGFR zu erhalten, untersuchten wir sowohl den Einfluß auf die Bildung von Extrazellulärmatrix in glatten Gefäßmuskelzellen als auch auf die Natriumresorption im Sammelrohr der Niere. Als Anhaltspunkt für die vermehrte Bildung von extrazellulärer Matrix wie sie bei Remodelingprozessen vorkommt, quantifizierten wir die Fibronektinsekretion in glatten Muskelzellen der humanen Aorta (HAoSMC). Nach Aldosteroninkubation und besonders bei Koinkubation mit EGF zeigte sich eine vermehrte Fibronektinsekretion ins Medium, die sich durch Hemmer der EGFR-Kaskade normalisieren ließ. Dies unterstützt die Hypothese, dass die Aldosteron-EGFR-Interaktion an der Entstehung von Remodelingprozessen im kardiovaskulären und renalen System beteiligt ist. Neben einem Einfluss auf die Entstehung pathophysiologischer Prozesse im kardiovaskulären und renalen System kommt es über eine Aldosteron-induzierte EGFR-Expression im Sammelrohr der Niere auch zu physiologischen Effekten, nämlich einer Hemmung der Natriumresorption. Diese wirkt der klassischerweise durch Aldosteron vermittelten vermehrten Natriumresoprtion über den epithelialen Natriumkanal (ENaC) entgegen und könnte daher als negative Feedbackschleife Dauer und Ausmaß der Aldosteron-induzierten Natriumresorption limitieren. Zusätzlich zu den klassischen genomischen Wirkungen zeigen Steroide nicht-genotrope Effekte. Beim Aldosteron führen diese MR- und EGFR-vermittelt zu einer Aktivierung der ERK1/2- und JNK-1/2-Kinasen. Die nicht-genotrope Aldosteron-induzierte ERK-Aktivierung ist ferner durch c-Src-Inhibitoren hemmbar und führt zu einer Stimulation der Kerntranslokation des MR. Nicht-genotrope Effekte können folglich unter Beteiligung der EGFR-Signalkaskade die genomischen modulieren. Aldosteron führt ebenfalls zu einem Anstieg der zytosolischen Calciumkonzentration, allerdings ist dieser Effekt unabhängig vom MR. Hieraus folgt, dass die nicht-genotropen Effekte teilweise MR-vermittelt und teilweise MR-unabhängig sind. Insgesamt konnte also auf verschiedenen Ebenen eine Interaktion zwischen Aldosteron/MR und der EGFR-Signalkaskade gezeigt werden, mit Hinweisen für eine Bedeutung bei sowohl physiologischen als auch pathophysiologische Vorgängen. N2 - Classically, aldosterone-bound MR regulates blood pressure as well as salt and water homeostasis. Recent clinical studies have shown that aldosterone can additionally lead to cardiovascular and renal remodeling; however, the underlying mechanisms are still unclear. The EGFR is a growth factor and heterologous signal transducer for G-protein-coupled receptors of for example angiotensin II, phenylephrine and endothelin-1. There are indications in literature that there is cross-talk between aldosterone/MR and EGFR signaling. For example, mineralocorticoids can lead to both enhanced vascular remodeling and an increase in EGFR-mRNA after cerebral injury and they can also augment EGF-induced vasoconstriction. Therefore, one attractive hypothesis to explain the pathophysiological effects of aldosterone is an aldosterone-induced EGFR expression with consequently increased signaling of vasoactive and profibrotic peptides. To evaluate this hypothesis, we tested EGFR expression after aldosterone incubation in different model systems. We found an aldosterone-induced EGFR expression in a heterologous expression system of CHO cells, in endogenously MR-expression cell lines as well as in primary culture. This was also true in the kidney, aorta and the heart of adrenalectomized rats equipped with osmotic minipumps. The closely related glucocorticoid receptor did not lead to enhanced EGFR expression, making this phenomenon MR specific. Because of its possible therapeutical relevance for remodeling processes, the underlying molecular mechanism of the MR/EGFR cross-talk is of special interest. To characterize it we looked at the promoter activity of the EGFR which was enhanced after incubation with aldosterone. Furthermore, we could narrow down the EGFR promoter regions involved in this interaction down to two DNA fragments. Concerning the MR, the n-terminal A/B-domain is necessary to elicit full activation of the promoter while the domains C, D, E and F by themselves are not enough. To gain evidence for the physiological and pathophysiological relevance of the interaction between the MR and the EGFR, we looked at formation of extracellular matrix and sodium reabsorption in the renal collecting duct. As an indicator for enhanced formation of extracellular matrix and remodeling, we measured fibronectin secretion of human aortal smooth muscle cells. After incubation with aldosterone and especially in the presence of EGF, an increase in fibronectin secretion could be measured that was antagonized by inhibitors of the EGFR cascade. This supports the hypothesis that the aldosterone-EGFR cross-talk is involved in cardiovascular and renal remodeling processes. Besides this pathophysiological effect, aldosterone-induced EGFR expression in the renal collecting duct can also lead to a reduction in sodium reabsoption. This counteracts the increase in sodium reabsorption classically induced by aldosterone and can therefore function as a negative feedback loop limiting long-term aldosterone-induced sodium reabsorption. In addition to traditional genomic effects, steroids can also elicit non-genotropic actions. Aldosterone, for example, can lead to MR- and EGFR-mediated activation of ERK1/2 and JNK1/2. The non-genotropic aldosterone-induced ERK activation is also reduced by c-Src-inhibitors and leads to an increase in the cytosolic-nuclear shuttling of the MR. Therefore, the non-genotropic effects can modulate genomic effects via the EGFR pathway. Furthermore, aldosterone can induce a rise in the concentration of cytosolic calcium which is independent on the MR. Consequently, non-genotropic actions are partially mediated by the MR and partially MR-independent. Overall, there is a cross-talk between aldosterone/MR and EGFR signaling on different levels with evidence for relevance for physiological and pathophysiological processes. KW - Aldosteron KW - Corticosteroide KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - Epidermaler Wachstumsfaktor KW - Mineralocorticoidrezeptor KW - Aldosteron KW - EGFR KW - kardiovaskuläres Remodeling KW - nicht-genotrope Steroidwirkungen KW - mineralocorticoid receptor KW - aldosterone KW - EGFR KW - cardiovascular remodeling KW - nongenotropic steroid effects Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22260 ER - TY - THES A1 - Kemmer, Diana T1 - Natürliche Lebensmittelinhaltsstoffe als Liganden des Ah Rezeptors - Identifizierung und Charakterisierung von Beta-Carbolinen mit AhR Ligandenpotential mittels funktioneller Bioassays T1 - Natural food constituents acting as ligands of the Ah receptor - identification and characterization of ß-carbolines with AhR ligand capacity using functional bioassays N2 - In der vorliegenden Arbeit werden Studien zur Identifizierung und Charakterisierung von Lebensmittelinhaltsstoffen als natürliche Liganden des Ah Rezeptors („aryl hydrocarbon receptor“) vorgestellt. Der Ah Rezeptor ist ein liganden-abhängiger Transkriptionsfaktor, der an der Expression zahlreicher Metabolismusenzyme beteiligt ist. Im Mittelpunkt unserer Untersuchungen anhand von funktionellen AhR-abhängigen Bioassays stand die Klasse der ß-Carboline und ihrer Derivate, deren natürliches Vorkommen bereits in zahlreichen Lebensmitteln und im menschlichen Organismus beschrieben ist. Die ß-Carboline wurden für die Untersuchung auf ihr mögliches AhR Ligandenpotential ausgewählt, da sie von der Aminosäure Tryptophan abgeleitet sind, die selbst als schwacher AhR Agonist identifiziert wurde, und weil das trizyklische 9H-Pyridol[3,4-b]-Ringsystem der ß-Carboline eine strukturelle Ähnlichkeit zum prototypischen AhR Liganden 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) aufweist. Die Schwerpunkte der Untersuchungen zur AhR Ligandenaktivität von ß-Carbolinen lagen auf den Aspekten: 1) Etablierung von rekombinanten, zellbasierten funktionellen Reportergenassays; 2) Identifizierung und Charakterisierung von ß-Carbolinderivaten als Liganden des Ah Rezeptors mittels funktioneller Reportergenassays; 3) Charakterisierung mechanistischer Aspekte im AhR vermittelten Signaltransduktionsweg mittels in vitro und ex vivo Gelretardation Assays am Beispiel ausgewählter ß-Carbolinderivate mit AhR Ligandenaktivität und 4) Beschreibung der AhR Ligandenaktivität von Soja- und Würzsaucen als Modellsysteme für komplexe natürliche Lebensmittel. N2 - This research summarizes studies on the identification and characterization of compounds present in food samples, which can act as ligands of the aryl hydrocarbon receptor (Ah receptor, AhR). The Ah receptor represents a ligand-dependent transcription factor and is involved in the expression of various enzymes of the xenobiotic metabolism. Our analyses using functional AhR-dependent bioassays were focusing on ß-carbolines and their derivatives. These compounds have been described to be naturally occurring in foods and in the human body. The ß-carbolines were chosen to be evaluated for their potential to act as AhR ligands because they are derived from the amino acid tryptophan, which is a weak AhR agonist itself, and due to their structural resemblance to the tricyclic 9H-pyridol[3,4-b] ring system of the ß-carbolines to the prototypic AhR ligand 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). As the main focus of the studies was to evaluate the capacity of ß-carbolines to act as AhR ligands, the studies covered the following aspects: 1) Establishment of recombinant, cell-based functional reporter gene assays; 2) Identification and characterization of ß-carboline derivatives as ligands of the AhR by the means of functional reporter gene assays; 3) Characterization of mechanistic aspects in the AhR-mediated signal transduction pathway of distinct ß-carboline derivatives acting as AhR ligands using in vitro and ex vivo gelretardation assays; and 4) Description of the AhR ligand activities of soy and seasoning sauces, representing model systems for complex and natural food products. KW - Carbolin KW - Kohlenwasserstoffe KW - Arylgruppe KW - Rezeptor KW - Bioassay KW - ß-Carboline KW - Ah Rezeptor KW - Bioassay KW - natürliche Liganden KW - TCDD KW - ß-carbolines KW - Ah receptor KW - bioassay KW - natural ligands KW - TCDD Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15193 ER - TY - THES A1 - Projahn, Holger T1 - Synthese, Stereochemie und pharmakologische Charakterisierung von 3,7-Diazabicyclo[3.3.1]nonan Derivaten als selektive kappa-Agonisten T1 - Synthesis, stereochemistry and pharmacological characterization of 3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonane derivates as selective kappa-agonists N2 - In der vorliegenden Arbeit wird die Synthese von verschiedenen bicyclischen Substanzklassen gemäß des folgenden Syntheseschemas beschrieben. Es wurden verschiedene 2,4-di-(2-pyridyl)- oder 2,4-di-(3-fluorphenyl)-substituierte 9-Oxo-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäurediester (9-Oxo-BNDS: 21-25, 27-55) synthetisiert, welche 1. teilweise als Vorstufen zur Synthese von 1,5-Di-(hydroxymethyl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-olen (Triole: 56-65) eingesetzt wurden, 2. teilweise als Vorstufen zur Synthese von 9-Hydroxy-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäuredimethylestern (9-OH-BNDS: 66-69) verwendet wurden, die ihrerseits zu 9-O-Acyl-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäuredimethylestern (9-OAc-BNDS: 70-76) umgesetzt wurden oder 3. als Vorstufe zur Synthese der 9-Oxo-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarbonsäure 26 dienten. Die 9-Oxo-BNDS wurden aus den kommerziell erhältlichen Aceton-1,3-dicarbonsäuredimethyl- (ADS-Me), -ethylester (ADS-Et) oder den ADS 1-3 synthetisiert, die ihrerseits ausgehend von ADS-Me und den entsprechenden Alkoholen durch Umesterung hervorgehen. Die ADS wurden durch eine Mannich-Kondensation mit zwei Äquivalenten eines aromatischen Aldehyds und einem Äquivalent eines primären Amins in MeOH zu den entsprechenden 4-Piperidon-3,5-dicarbonsäureestern (PDS: 4-20) umgesetzt, die wiederum ebenfalls durch eine Mannich-Kondensation mit zwei Äquivalenten Formaldehyd und einem Äquivalent eines primären Amins in THF oder Aceton zu den entsprechenden 9-Oxo-BNDS reagieren. Dieser Syntheseschritt wurde hinsichtlich Ausbeute, Vereinfachung und Beschleunigung der Aufarbeitung optimiert. Die Stereochemie der so erhaltenen 9-Oxo-BNDS, die in Abhängigkeit vom Substitutionsmuster als cis- oder trans-Isomere entstehen, konnte mittels NMR-Spektroskopie aufgeklärt werden. Der 1,5-Dibenzylester 25 konnte durch katalytische Hydrierung mit Pd/C als Katalysator in EtOAc zur freien 1,5-Dicarbonsäure 26 umgesetzt werden. Die Triole 56-62 wurden ausgehend von den 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 21-24, 28, 33 in einer Eintopfsynthese mittels NaBH4 in THF/MeOH durch Reduktion hergestellt. Die N3- und/oder N7-benzyl-substituierten Triole 57-59 wurden mittels katalytischer Hydrierung mit Pd/C als Katalysator in MeOH zu den entsprechenden NH-substituierten Triolen 63-65 umgesetzt. Mit Hilfe von selektiven 1D-NOESY-Messungen konnte die Stereochemie der Triole bezüglich der Stellung der Hydroxygruppe an C9 zugeordnet werden. Die 9-OH-BNDS 66-69 wurden durch Reduktion der entsprechenden 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 32, 33 mit Na(CN)BH3 in MeOH synthetisiert. Die Reduktion verläuft nicht stereoselektiv, sodass die dabei entstehenden 9-OH-BNDS als Diastereomerengemische durch syn/anti-Isomerie der C9-OH-Gruppe anfallen. Das Diastereomerengemisch 66 konnte durch präparative Säulenchromatographie in die beiden reinen Isomere 66a (anti) und 66b (syn) getrennt werden. Das Gemisch 67 konnte durch Entwicklung einer HPLC-Methode und anschließender Übertragung auf ein Flashchromatographiesystem präparativ in die diastereomerenreinen Isomere 67a (anti) und 67b (syn) getrennt werden. Die stereochemische Zuordnung der Konfiguration an C9 wurde durch selektive 1D-NOESY-Messungen erreicht. Die Synthese der 9-OAc-BNDS 70-76 erfolgte durch Umsetzen des entsprechenden 9-OH-BNDS 66a, 67a, 67-69 mit einer äquimolaren Menge eines entsprechenden Carbonsäurechlorids und DBU als Hilfsbase in CHCl3. Im Fall der Synthese von Verbindung 76 musste das eingesetzte Decanoylchlorid mit Zinkstaub aktiviert werden. Die Zuordnung der Stereochemie der so erhaltenen Verbindungen basiert auf selektiven 1D-NOESY-Messungen. Die Verbindungen 25-27, 31, 56, 60, 63-66, 66a/b, 67, 67a/b, 70a, 71, 71a wurden auf pharmakologische Affinität zum kappa-Opioidrezeptor (OR) untersucht. Dadurch konnten die Verbindungen 71, 71a und 67a/b als hochaffine Liganden des kappa-OR identifizert werden. Durch die qualitative Analyse der Struktur-Wirkungs-Beziehungen, die auf dem Vergleich der pharmakologischen Daten dieser Arbeit und vorangegangener Arbeiten basiert, konnten folgende Anforderungen an selektive Liganden des kappa-OR mit 3,7-Diazabicyclo[3.3.1]nonan-Grundgerüst ermittelt werden: 1. Das Grundgerüst sollte an Position 2/4 mit 2-Pyridylresten substituiert sein. 2. An Position N3 und N7 dürfen keine Substituenten angebracht sein, die größer als ein Methylrest sind. 3. Das Molekül sollte an Position 1/5 mit Methylestergruppen versehen sein. 4. Der 3,7-Diazabicyclus kann an Position 9 eine -OH, -OAc oder möglicher-weise auch entsprechende, sterisch anspruchsvollere Funktionen besitzen. 5. Die Stellung des Substituenten an Position 9 sollte vorzugsweise anti-konfiguriert sein, bezogen auf den höher substituierten Piperidinring. N2 - The aim of the present work was the synthesis of several bicyclic compound classes as described in the following synthetic pathway. Various 2,4-di-(2-pyridyl)- or 2,4-di-(3-fluorphenyl)-substituted 9-oxo-3,7-diazabicyclo[3.3.1]-nonan-1,5-dicarboxylates (9-Oxo-BNDS: 21-25, 27-55) have been synthesized, which 1. were partially used as templates for the synthesis of 1,5-di-(hydroxymethyl)-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-9-oles (trioles: 56-65), 2. were partially used as starting compounds for the synthesis of dimethyl-9-hydroxy-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarboxylates (9-OH-BNDS: 66-69), which in turn were used for the preparation of dimethyl-9-O-acyl-3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-1,5-dicarboxylates (9-OAc-BNDS: 70-76), 3. served as starting compound for the synthesis of the 9-oxo-3,7-diazabicyclo-[3.3.1]nonan-1,5-dicarboxylic acid 26. The 9-Oxo-BNDS were prepared starting from the commercially available di-methyl- (ADS-Me) or diethylacetone-1,3-dicarboxylate (ADS-Et) or the ADS 1-3, which themselves were synthesized by transesterification of ADS-ME with the corresponding alcohols. The ADS were converted to the respective 4-piperidon-3,5-dicarboxylates (PDS: 4-20) by means of a Mannich-condensation with two equivalents of an aromatic aldehyde and one equivalent of a primary amine in MeOH as a solvent. The PDS were subjected to a second Mannich-condensation with two equivalents of formaldehyde and one equivalent of a primary amine in THF or acetone to form the corresponding 9-Oxo-BNDS. This step was optimized with respect to the yields, simplification and acceleration of the refurbishment. The stereochemistry of the so achieved 9-Oxo-BNDS, which can emerge as cis- or trans-isomers dependent on their substitution pattern, was elucidated by means of NMR-spectroscopy. The dibenzylcarboxylate 25 could be converted to the free dicarboxylic acid 26 by means of catalytic hydrogenation with Pd/C as catalyst in EtOAc as solvent. The trioles 56-62 were synthesized starting from the the 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 21-24, 28, 33 in a one-pot-reduction-step by means of NaBH4 in THF/MeOH. The N3- and/or N7-benzyl-substituted trioles 57-59 were converted to the respective NH-substituted trioles 63-65 by catalytic hydrogenation with Pd/C in MeOH. The assignment of the hydroxy-group at C9 was achieved via selective 1D-NOESY measurements. The 9-OH-BNDS 66-69 were perpared by reduction of of the appropriate 9-Oxo-BNDS HZ2, 3FLB, 32, 33 with Na(CN)BH3 in MeOH. The reduction does not proceed in a stereoselective manner, which in consequence leads to the isolation of syn/anti-isomers with respect to the hydroxygroup at C9. The isomeric mixture 66 could be resolved into both pure isomers 66a (anti) and 66b (syn) by means of preparative column chromatography. The isomeric mixture 67 was separated in order to obtain the pure isomers 67a (anti) and 67b (syn) by preparative flash-chromatography. The stereochemical assignment of the hydroxygroup at C9 was accomplished by selective 1D-NOESY measurements. The synthesis of the 9-OAc-BNDS 70-76 was carried out by reaction of the respective 9-OH-BNDS 66a, 67a, 67-69 with an equimolar amount of the congruent acylchloride and DBU as an auxilary base in CHCl3. In the case of compound 76 the deployed decanoylchloride had to be activated with zinc dust. The stereochemical assignment of the so obtained compounds is based on selective 1D-NOESY measurements. The compounds 25-27, 31, 56, 60, 63-66, 66a/b, 67, 67a/b, 70a, 71, 71a were investigated with respect to their pharmacological affinity to the kappa-opioid receptor (OR). Compounds 71, 71a and 67a/b were identified to be highly affine ligands to the kappa-OR. By means of the analysis of structure-affinity-relationships, which are based upon the comparison of the pharmacological data of the present work and previous findings, the following prerequisites for high affinity towards the kappa-OR were derived for compounds bearing the 3,7-diazabicyclo[3.3.1]nonan-skeleton: 1. The skeleton at position 2/4 should be substituted by 2-pyridyl moieties. 2. No substituents being larger than a methyl-group should be attached to the nitrogens N3 and N7. 3. The molecule should carry a methyl carboxylate at positions 1/5. 4. The 3,7-diazabicycle may possess a -OH, -OAc or probably a respective, even sterically larger substituent at position 9. 5. The orientation of the substituent at position 9 should be preferably of anti-configuration according to the higher substituted piperidine ring. KW - Opioide KW - Rezeptor KW - Diazabicyclononanone KW - Chemische Synthese KW - Stereochemie KW - Synthese KW - Pharmakologie KW - Opioide KW - Kappa KW - Diazabicyclononan KW - Synthesis KW - Pharmacology KW - Opioids KW - Kappa KW - Diazabicyclononane Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14072 ER - TY - THES A1 - Christenn, Marcus T1 - Charakterisierung von Somatostatinrezeptor-Subtyp 4 interagierenden Proteinen in der Ratte (Rattus norvegicus) T1 - Characterisation of somatostatin receptor subtype 4 interacting proteins in the rat (Rattus norvegicus) N2 - Somatostatin ist ein regulatorisches Peptid, das eine Vielzahl von biologischen Prozessen innerhalb des Körpers beeinflußt. Die Wirkung von Somatostatin wird auf zellulärer Ebene über eine Familie von fünf G-Protein-gekoppelten Rezeptoren vermittelt, die entweder in G Protein-abhängiger Weise oder vermutlich auch über andere interagierende intrazelluläre Proteine auf nachgeschaltete Signaltransduktionswege wirken. Der Somatostatinrezeptor Subtyp 4 (SSTR4) wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert und wirkt dort inhibierend auf die exzitatorische Signalweiterleitung. Es sind aber auch stimulierende Effekte des SSTR4 bekannt. Um das subtypspezifische Signalverhalten des SSTR4 weiter zu untersuchen, wurden im Rahmen dieser Arbeit Proteine gesucht, die intrazellulär mit dem SSTR4 interagieren und so seine physiologischen Effekte beeinflussen. In einem ersten Ansatz konnten drei mögli-che Interaktionspartner mit Hilfe des Hefe-Zwei-Hybrid-Systems identifiziert werden, die aber in nachfolgenden Untersuchungen als unpezifisch eingestuft wurden. Mit Hilfe einer Affinitätschromatografie wurden dann zwei Proteine identifiziert, die spezifisch mit dem SSTR4 interagieren. Sowohl PSD-95 als auch PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa bzw. 93kDa) wurden mit einem immobilisierten Peptid präzipitiert, das die neun C-terminalen Aminosäuren des SSTR4 enthält. Die Interaktion des SSTR4 mit PSD 95 wurde im Weiteren näher charakterisiert. In einem Bindungsexperiment mit rekombinaten Proteinen konnte gezeigt werden, dass die Interaktion durch die 1. und 2. PDZ-Domäne von PSD-95 vermittelt wird. In humanen embryonalen Nieren-Zellen (HEK293), die den SSTR4 stabil exprimieren, konnte PSD-95 mit dem Rezeptor koimmunpräzipitiert werden. Nach Koexpression von PSD-95 und SSTR4 findet man eine partielle Kolokalisierung beider Proteine an der Zellmembran, wobei aber der Großteil des PSD-95 weiterhin eine diffuse zytoplasmatische Verteilung zeigt. Die Interaktion wurde in vivo sowohl immunhistochemisch in kultivierten Hippocampus-Neuronen als auch durch Koimmunpräzipitation beider Proteine aus Rattengehirn-Lysaten nachgewiesen. Die Interaktion von PSD-95 mit dem SSTR4 beeinflußt weder die Agonisten-induzierte Internalisierung des Rezeptors in HEK293-Zellen, noch die Kopplung des Rezeptors an einen G-Protein-gekoppelten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal in Oozyten des afrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis. Durch die Interaktion mit PSD-95 wird der SSTR4 in physikalische Nähe zu bestimmten Zielproteinen gebracht, über die nachfolgend die Somatostatineffekte weitervermittelt werden. So ermöglicht die Interaktion vermutlich eine Integration des SSTR4 in den postsynaptischen Komplex aus PSD-95 und Glutamatrezeptoren, wo der SSTR4 die bereits beschrieben regulatorischen Effekte auf die Glutamat-vermittelte exzitatorische Signaltransduktion ausüben kann. N2 - Somatostatin is a regulatory peptid, which affects a multiplicity of biological processes within the body. The effects of Somatostatin are mediated by a family of five G-protein-coupled receptors, which act on several downstream signaltransduction pathways either in a G-protein-dependent way or probably in a G-protein-independent manner via intracellular interacting proteins. The somatostatin receptor subtype 4 (SSTR4) is mainly expressed in brain, where it inhibits the excitatory neurotransmission. In addition, excitatory effects of SSTR4 have also been published. In order to examine the subtype specific signalling of SSTR4, I tried to identify intracellular proteins which interact directly with the SSTR4 and affect its physiological effects. Using the yeast two-hybrid system I identified three possible interaction partners for SSTR4, which were however classified as non-specific in subsequent experiments. In a second approach two proteins which interact with SSTR4 could be identified by affinity-chromatography. Both proteins PSD-95 and PSD-93 (Postsynaptic density protein of 95 kDa and 93kDa) were precipitated specifically with an immobilized peptid that contains the nine C-terminal amino acids of SSTR4. The interaction of the SSTR4 with PSD-95 was further characterized. In a binding experiment with recombinant proteins I could show that the interaction is mediated by the 1st and 2nd PDZ-domain of PSD-95. In human embryonic kidney cells (HEK293) which stably express SSTR4, PSD-95 could be coprecipitated with the receptor. After coexpression of PSD-95 and SSTR4 both proteins are partially colocalized at the plasma membrane. The majority of the PSD-95 however shows a diffuse cytoplasmic distribution. The in vivo interaction was proven by immunohistochemistry on cultivated hippocampal neurons and by coimmunoprecipitation of both proteins from rat brain lysates. The interaction of PSD-95 with SSTR4 affected neither the agonist induced internalisation of the receptor in HEK293 cells, nor the coupling of the receptor to a G-protein-coupled inwardly-rectifying potassium channel in oocytes obtained from the african clawed frog Xenopus laevis. By the interaction with PSD-95, SSTR4 is brought into physical proximity to certain target proteins which mediate the effects of somatostatin. Thus the interaction probably allows an integration of SSTR4 into the postsynaptic complex of PSD-95 and glutamergic receptors, where SSTR4 could regulate the glutamat-mediated excitatory signaltransduction. KW - Ratte KW - Somatostatin KW - G-Proteine KW - Rezeptor KW - G-Protein-gekoppelter Rezeptor KW - Somatostatinrezeptor Subtyp 4 KW - interagierende Proteine KW - PDZ-Domäne KW - PSD-95 KW - G-protein-coupled receptor KW - somatostatin receptor subtype 4 KW - interacting proteins KW - PDZ-domain KW - PSD-95 Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14253 ER - TY - THES A1 - Heindel, Ulla T1 - G-Protein gekoppelte Rezeptoren für Parathormon : molekulare Determinanten der intrazellulären Signalwegankopplung T1 - G-protein coupled receptors for parathyroid hormone: molecular insights into intracellular signalling N2 - In der vorliegenden Dissertation gelang es, die strukturellen und molekularen Determinanten der PTH-Rezeptoren für die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege näher zu charakterisieren. Die Regulation des Kalzium-, Phosphat- und Knochenstoffwechsels wird zum erheblichen Teil über den PTH1-Rezeptor (P1R) vermittelt. Parathormon (PTH) aktiviert am P1R mindestens zwei Signalwege: den durch zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) vermittelten Weg und den Phospholipase C-Signalweg (PLC). Der nahe verwandte PTH2-Rezeptor (P2R) kann außer durch PTH auch über das tuberoinfundibiläre Peptid (TIP39) aktiviert werden. Jedoch besitzt dieser Rezeptor keine Ankopplung an den PLC-Signalweg. Zur Aufklärung der strukturellen und molekularen Determinaten der intrazellulären Signalwegankopplung wurden verschiedene Versuchsansätze ausgewählt, die eine Untergliederung dieser Arbeit in drei Teilprojekte ermöglicht: 1) Die PTH-Rezeptoren sind wichtige Vertreter der Klasse II der G-Protein gekoppelten Rezeptoren. Ein Vergleich der Aminosäuresequenzen der siebten Transmembrandomäne dieser Klasse zeigt ein hoch konserviertes, cytosolnahes „YCFXN“-Motiv in diesem Bereich. Im ersten Teil dieser Arbeit konnte durch Punktmutationen der einzelnen Aminosäuren dieses Motivs gezeigt werden, dass dieser Abschnitt eine entscheidende Determinierungsregion dieser Rezeptorfamilie sowohl für die Ankopplung an den cAMP-Weg, als auch an den PLC-Signalweg darstellt. Die Untersuchungen legen die Vermutung nahe, dass dieser Bereich für die Stabilisierung der Konformation dieser Rezeptoren von großer Bedeutung ist. 2) In einem zweiten Abschnitt dieser Arbeit wurde durch stufenweise Angleichung des P2R an den P1R eine Reihe von funktionell exprimierten P2R/P1R Hybridrezeptoren hergestellt, die eine Übereinstimmung des intrazellulären Bereichs des P1R von bis zu 95 % erreichen. Der Nachweis des PLC-Signalwegs durch die Bestimmung der akkumulierten Gesamtinositolphosphate und des intrazellulären Kalziums zeigte eindrucksvoll, dass trotz einer weitgehenden intrazellulären Übereinstimmung der Aminosäuresequenz des P2R mit dem P1R die Eigenschaft des P1R an den PLC-Signalweg zu koppeln nicht auf den P2R übertragen werden kann. Dies legt nahe, dass auch extrazelluläre Bereiche und Transmembranabschnitte die Ankopplung an intrazelluläre Signalwege steuern. Im Weiteren konnte für den cAMP-Signalweg durch diese Hybridrezeptoren gezeigt werden, dass im Kontext des P2R eingefügte Teilabschnitte des P1R (C-Terminus, zweite und dritte intrazelluläre Schleife ) zusammenwirken und eine effizientere Ankopplung an den cAMP-Weg ermöglichen. Weiterführende Untersuchungen der Membrantranslokation von beta Arrestin2 mit einer anschließenden Internalisierung des Rezeptors zeigten, dass sowohl der P2R als auch die hiervon abgeleiteten Hybridrezeptoren selektiv durch Stimulation mit TIP39, nicht jedoch nach einer Stimulation mit PTH, eine Translokation bewirken. Dieses Ereignis ist von den untersuchten Signalwegen (cAMP-, PLC- und Mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Signalweg) unabhängig. Erstmals wurde hier gezeigt, dass der P2R eine Phosphorilierung von MAPK bewirkt, wobei hierfür einer beta-Arrestin2 Translokation nicht notwendig ist. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass der PTH-Rezeptor in unterschiedlichen Rezeptorkonformationen existiert, so dass einzelne Rezeptorabschnitte unabhängig voneinander verschiedene Signale aktivieren können. 3) Der letzte Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Identifikation von intrazellulären Interaktionspartnern des humanen P1R. Neue Protein–Interaktionen mit dem humanen P1R wurden mit einem „Yeast-two-Hybrid“ System identifiziert. Mit Hilfe dieser Methode konnte, als ein potentiell bedeutender intrazellulärer Interaktionspartner des humanen P1R, das PDZ-Protein PDZK1 identifiziert werden. Es gelang mit Hilfe von Koimmunpräzipitations-Experimenten und von GST-pull-down-Assays die Interaktion von PDZK1 mit dem P1R zu verifizieren. PDZK1 bindet an eine Liganden-Bindungsdomäne innerhalb des C-terminalen Abschnitts des P1R, vermutlich an die letzten vier Aminosäuren. Durch einen Hefe-Interaktionstest konnte von den vier in diesem Protein vorkommenden PDZ-Domänen die PDZ1-Domäne als einzige selektiv mit dem P1R interagierende Domäne identifiziert werden. In der Niere interagiert PDZK1 über die PDZ3-Domäne mit dem Na/Pi-Transporter IIa. Eine attraktive Hypothese ist daher die Funktion von PDZK1 als einem Bindeglied zwischem dem Rezeptor und dem Transporter und die damit einhergehende PTH- vermittelte Regulation des Phosphattransports in der Niere. Diese Hypothese bedarf aber nochweiterer funktioneller Analysen (z.B. durch Untersuchungen an PDZK1 Knock-Out Mäusen). N2 - In this project we identified structural and molecular determinants of the PTH receptor familiy with importance for coupling to intracellular signaling pathways. The PTH1-receptor (P1R) is involved in the systemic regulation of calcium and phosphate metabolism, and plays a decisive role in bone metabolism. PTH achieves this by activation of at least two intracellular signalling pathways: the adenylyl cylase (AC) and the phospholipase C (PLC) pathway. The closely related PTH2-receptor (P2R) is, in addition to PTH, also activated by tuberoinfundibular peptide of 39 residues (TIP 39), but unlike the P1R, does not couple to the PLC signaling pathway. This project achieved the identification of structural and molecular deteminatnts by three different approaches: 1) The PTH receptors belong to the class II of G-protein coupled receptors. A comparison of the amino acid sequences of the seventh transmembrane domain shows a highly conserved “YCFXN”-motif near the cytosolic interface of this domain. To examine the role of this conserved motif individual point mutations of these amino acids were generated and evaluated. Studies of the receptor mutants obtained showed that this region plays an important role in coupling to the adenylyl cylase pathway as well as to the PLC signaling pathway. The data obtained in this work suggests that the “YCFXN”-motif is of significant importance for the stabilisation of the receptor conformation. 2) To identify the structural features responsible for activating the PLC pathway, we engineered a series of hybrid P1R/P2R receptor chimeras by gradually adapting the P2R’s cytosolic interface to a P1R-like sequence. These modifications of key differing regions in the second and third loop, and the C-terminal tail allowed for > 95 % of P1R sequence in the cytosolic interface of the P2R. Despite these changes it was not possible to transfer the property of P1R to couple to the PLC signaling pathway to the P2R as shown impressively by the lack of activation of the PLC signaling pathway using measurements of inositol and intracellular calcium. Apparently, extracellular regions as well as transmembrane domains are required for selective coupling to intracellular signaling pathways. By contrast we could show for the cAMP signaling pathway, that when > 95 % of the P2R´s cytosolic interface had a P1R-like sequence, P1R epitopes apparently interacted with each other to result in a more efficient coupling to the cAMP signaling pathway. Stimulation of the receptor by its ligands leads to translocation of -arrestin2 to the cell surface thus initiating internalisation of the receptor. The P2R, as well as the hybrid P1R/P2R receptor chimeras, showed beta arrestin2 translocation selectively after stimulation with TIP39 but not after stimulation with PTH. Ligand-induced translocation of beta-arrestin2 was completely independent from cAMP-, PLC- and mitogen activated proteinkinases (MAPK) signaling pathways in the P2R and its derived chimeric mutants. Furthermore, we could show here for the first time, that the P2R can activate MAPK and that this is independent from a beta-arrestin2 translocation. In conclusion, the PTH-receptors can exist in different receptor conformations which apparently allow the receptors to activate different signals independently. 3) Another goal of this work was the identification of intracellular proteins interacting with the human P1R. A yeast-two-hybrid system was used to identify new protein-protein interactions of the human P1R. Using this method a possible important interacting protein could be identified. This protein was a PDZ-protein, named PDZK1. To verify this interaction co-immunoprecipitation experiments as well as GST-pull-down experiments were done. Binding of PDZK1 occurred within the C terminal region of the P1R and there probably within the last four amino acids. PDZK1 has four PDZ-domains of which the first one was the exclusively interacting domain with the P1R, as determined by a additional yeast-two-hybrid interaction experiment. In kidney the interaction of PDZK1 with the Na/Pi-transporter type IIa occurs via the third PDZ-domain. A hypothesis is that PDZK1 acts as a connecting link between the receptor and the transporter together with a PTH-mediated regulation of the phosphate-transport in kidney. However, this hypothesis will require further studies (e.g. experiments with PDZK1 knock-out mice). KW - Parathormon KW - Rezeptor KW - Intrazellulärraum KW - Signaltransduktion KW - G-Protein gekoppelte Rezeptoren KW - PTH KW - cAMP KW - Inositol KW - PDZ KW - G-protein coupled receptors KW - PTH KW - cAMP KW - PLC KW - PDZ Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17213 ER - TY - THES A1 - Schmitter, Tim T1 - CEACAM3: ein neuartiger phagozytischer Rezeptor der angeborenen Immunantwort zur Erkennung human-spezifischer Pathogene T1 - CEACAM3: a new phagocytic receptor of the innate immunity recognizing human-specific pathogens N2 - Eine Infektion durch das ausschließlich human-spezifische Pathogen Neisseria gonorrhoeae manifestiert sich bei einer symptomatischen Kolonisierung in der sog. Gonorrhö, einer venerischen Erkrankung, die durch akute Inflammation des befallenen Gewebes und durch die massive Infiltration von Granulozyten charakterisiert ist. Die Gonokokken können im Verlauf einer symptomatischen Infektion über ihre OpaCEA-Adhäsine mit CEACAM Proteinen unterschiedlicher Wirtszellen interagieren. In der vorliegenden Doktorarbeit sollten anhand verschiedener zellbiologischer, biochemischer und genetischer Methoden die molekularen Vorgänge während der OpaCEA-Gonokokken-Phagozyten-Interaktion untersucht werden. Der Kontakt von OpaCEA-Gonokokken mit primären Granulozyten induziert die Formation von Lamellipodien-ähnlichen Membranausstülpungen und führt zur CEACAM-abhängigen Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Schon in früheren in vitro Versuchen konnte die Reorganisation des Zytoskeletts und die Opsonin-unabhängige, CEACAM-vermittelte Aufnahme OpaCEA-exprimierender Gonokokken in differenzierte promyelomonzytären Zellen und Granulozyten mit der Stimulation von Kinasen der Src-Familie und der GTPase Rac in Verbindung gebracht werden. Erste in vitro Infektionsversuche mit CEACAM-exprimierenden 293 Zellen, in denen pharmakologische oder genetische Inhibitoren gegen Kinasen der Src-Familie eingesetzt wurden, deuteten darauf hin, dass ausschließlich die CEACAM3-vermittelte Internalisierung der Gonokokken die katalytische Aktivität von Kinasen der Src-Familie benötigt. Dies konnte auch in CEACAM3-exprimierenden, Src-Kinase defizienten Maus-Fibroblasten bestätigt werden, da nur c-Src rekonstituierte Zellen OpaCEA Gonokokken internalisieren. Die Adhäsion der OpaCEA Gonokokken an CEACAM3 induziert eine Src-abhängige Tyrosinphosphorylierung der zytoplasmatischen CEACAM3-Domäne und die Kinase selbst kann über ihre SH2-Domäne direkt an das phosphorylierte CEACAM3 binden. Auch die Stimulation der GTPase Rac verläuft über das CEACAM3 Protein, da die Expression einer dominant negativen Version der Rho GTPase ausschließlich mit der CEACAM3-, aber nicht mit der CEACAM6-abhängigen Internalisierung der OpaCEA Gonokokken interferiert. Zudem induziert nur die CEACAM3-vermittelte Aufnahme die Rekrutierung und GTP-Beladung des endogenen Rac. Eine zentrale Rolle dabei spielt die Integrität der ITAM-ähnlichen Sequenz von CEACAM3. Die Mutation beider Tyrosinreste innerhalb der ITAM-ähnlichen Sequenz oder die komplette Deletion der zytoplasmatischen Domäne inhibieren die CEACAM3-vermittelte Rac-Stimulation und blockieren die Internalisierung der OpaCEA Gonokokken. Aber nicht nur OpaCEA Gonokokken interagieren mit CEACAM3, sondern auch die CEACAM-bindenden Adhäsine von Moraxella catarrhalis und Haemophilus influenzae führen zur Rac-Stimulation und damit zur Internalisierung der Pathogene. Im letzten Teil der Arbeit konnte das molekulare Bindeglied zwischen der CEACAM3-induzierten Signalkaskade und der Stimulation der kleinen GTPase Rac identifiziert werden. Das Vav Protein fungiert dabei als GEF für die kleine GTPase Rac. Eine dominant negative Version von Vav oder eine spezifische Vav-siRNA inhibieren die CEACAM3-vermittelte Aufnahme von OpaCEA-Gonokokken bzw. die GTP-Beladung von Rac. Interessanterweise bindet das Vav Protein über seine SH2 Domäne direkt an CEACAM3 und zwar nach Phosphorylierung durch aktive Src Kinasen an den Tyrosinrest 230 der ITAM-ähnlichen Sequenz. Die distinkte CEACAM3-induzierte Signalkaskade erlaubt es, die Bedeutung von CEACAM3 für die Phagozytose CEACAM-bindender Pathogene auch in primären Granulozyten zu untersuchen. Interessanterweise inhibiert PP2 die Aufnahme der Gonokokken dosisabhängig, wohingegen die Blockade der CEACAM1- bzw. CEACAM6-vermittelten Internalisierung der Gonokokken durch Nystatin keine Auswirkungen zeigt. Auch die Proteintransduktion der dominant-negativen Version von Vav (TAT-Vav-dn) bzw. Rac (TAT-Rac-dn) in primäre Granulozyten interferierte effektiv mit der Phagozytose der OpaCEA Gonokokken. Dementsprechend verhindert ausschließlich die Blockade der CEACAM3-vermittelten Phagozytose, aber nicht der CEACAM1- bzw.CEACAM6-vermittelten Aufnahme durch monoklonale Antikörper die Internalisierung bzw. die Elimination von CEACAM-bindenden Pathogenen. Diese Arbeiten beschreiben das exklusiv auf Granulozyten exprimierte CEACAM3 Protein als einen neuen gegen CEACAM-bindende Erreger gerichteten phagozytischen Rezeptor der angeborenen Immunantwort. N2 - The exclusivley human specific pathogen Neisseria gonorrhoeae is the causative agent of gonorrhoea a veneric disease characterized by an acute inflammation of infected area and a massive infiltration of granulocytes. During an acute, symptomatic gonorrhoeae the pathogen is able to interact with CEACAM proteins of different cells by the means of their so called OpaCEA-adhesins. In this doctaral thesis the pathogen-phagocyte-interaction was to be investigated by cell biology, biochemical and genetical methods. The contact of OpaCEA-expressing gonococci with primary granulocytes induces ruffling of the membrane and lammelipodia-like protrusion finally leading to the CEACAM-dependent phagocytosis of the pathogenic bacteria. Earlier infection-studies with pro-myelomonocytic cells were able to show that the phenotypic cytoskeleton rearrangement and the internalisation of gonococci was dependet on the stimulation of Src-family kinases and the small GTPase Rac. Initial in vitro infection studies with transiently transfected human epithelial 293 cells showed that exclusively CEACAM3-mediated internalisation of OpaCEA-expressing gonococci depends on the catalytic activity of Src-family kinases. This was further corroborated by infecting CEACAM3-expressing, genetic manipulated S-/Y-/F--deficient mouse fibroblasts with gonococci, as only cells reconstituted with c-Src were able to internalise OpaCEA-expressing gonococci. Bacterial ligation of CEACAM3 leads to Src-family kinase dependent tyrosin phosphorylation within the cytoplasmatic-tail of CEACAM3 and on the molecular level the kinase itself is able to directly interact with phosphorylated CEACAM3 via its SH2-domain. Accordingly, stimulation of the small GTPase Rac is connected to bacterial CEACAM3 ligation, as expression of a dominant negative Rac constructs only interferes with CEACAM3, but not with CEACAM6 mediated internalisation of gonococci. In addition recruitment of Rac to adhering bacteria and Rac stimulation is dependent on CEACAM3 mediated uptake and expression of the OpaCEA-adhesins. A critical part of CEACAM3 mediated signal transduction turned out to be it’s ITAM like sequence. Either mutation of both tyrosine residues or deletion of the whole cytoplasmatic tail inhibited CEACAM3-mediated Rac stimulation and accordingly internalisation of OpaCEA-expressing gonococci. However CEACAM3-mediated internalisation is not restricted to gonococci as CEACAM-binding Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae also stimulate Rac-GTP-loading while taken up via CEACAM3. In the last part of the doctoral thesis I was able to identify the molecular link between Rac stimulation and bacterial CEACAM3 engagement. Vav serves as a specific GEF towards the stimulation of the small GTPase Rac, as a dominant negative version of Vav or a specific Vav-siRNA blocks CEACAM3-mediated uptake of OpaCEA-expressing gonococci and GTP-loading of Rac respectively. Vav directly binds to CEACAM3 via it’s SH2 domain leading to a CEACAM3-Vav protein complex after phosphorylation of tyrosinresidue 230 of CEACAM3. by stimulated Src-family kinases. The uniqueness of CEACAM3-initiated signal transduction provided a method to identify it’s relevance during phagocytosis of CEACAM binding bacteria in primary human granulocytes. Especially the pharmacological inhibitor PP2 interferes in a concentration dependent manner with the uptake of gonococci in granulocytes while Nystatin which inhibits CEACAM1 and CEACAM6 dependent internalisation in vitro has no effect on bacterial uptakte in human granulocytes. Accordingly, interference of CEACAM3 mediated stimulation of Vav (TAT-Vav-dn) or Rac (Tat-Rac-dn) inhibited uptake of OpaCEA-gonococci into primary cells. In addition a CEACAM3-specific but not a CEACAM1 or CEACAM6 specific monoclonal antibody inhibited internalisation and elimination of CEACAM-binding bacteria. Therefore, the results presented in this doctoral thesis describe CEACAM3 which is exclusively expressed on human granulocytes as a novel single-chain phagocytic receptor of the innate immune system. KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Immunreaktion KW - Rezeptor KW - CEACAMs KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Haemophilus influenzae KW - Moraxella catarrhalis KW - angeborene Immunabwehr KW - CEACAMs KW - Neisseria gonorrhoeae KW - Haemophilus influenzae KW - Moraxella catarrhalis KW - innate Immunity Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17271 ER - TY - THES A1 - Noskov, Andrey T1 - Structural and functional studies of the Interleukin-5 receptor system T1 - Struktur und Funktionsanalyse des Interleukin-5 Rezeptor Systems N2 - The aim of current work was contribution to the long-term ongoing project on developing human IL-5 agonists/antagonists that intervene with or inhibit IL-5 numerous functions in cell culture and/or in animal disease models. To facilitate design of an IL-5 antagonist variant or low-molecular weight mimetics only capable of binding to the specific receptor alpha chain, but would lack the ability to attract the receptor common β-chain and thus initiate receptor complex activation it is necessary to gain the information on minimal structural and functional epitopes. Such a strategy was successfully adopted in our group on example of Interleukin 4. To precisely localize minimal structural epitope it is essential to have structure of the ligand in its bound form and especially informative would be structure of complex of the ligand and its specific receptor alpha chain. For this purpose large quantities (tens of milligrams), retaining full biological activity IL-5 and extracellular domain of IL-5 specific receptor α-chain were expressed in a bacterial expression system (E.coli). After successful refolding proteins were purified to 95-99% Stable and soluble receptor:ligand complex was prepared. Each established purification and refolding procedures were subjected to optimization targeting maximal yields and purity. Produced receptor:ligand complex was applied to crystallization experiments. Microcrystals were initially obtained with a flexible sparse matrix screening methodology. Crystal quality was subsequently improved by fine-tuning of the crystallization conditions. At this stage crystals of about 800x150x30µm in size can be obtained. They possess desirable visible characteristics of crystals including optical clarity, smooth facecs and sharp edges. Crystals rotate plane polarized light reflecting their well internal organization. Unfortunately relative slimness and sometimes cluster nature of the produced crystals complicates acquisition of high-resolution dataset and resolution of the structure. With some of obtained crystals diffraction to a resolution up to 4Å was observed. N2 - Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, einen Beitrag zum langfristigen Projekt der Entwicklung humaner IL-5 Agonisten/Antagonisten zu leisten, die im tierischen Krankheitsmodell oder in der Zellkultur in die verschiedenen Funktionen des IL-5 eingreifen oder sie inhibieren. Um das Design eines IL-5 Antagonisten oder einer Mimetika mit geringem Molekulargewicht zu vereinfachen, die nur an die spezifische α-Rezeptorkette bindet, nicht jedoch an die gemeinsame β-Kette und somit die Aktivierung des Rezeptorkomplexes initiieren, ist es notwendig, Informationen über minimale strukturelle und funktionelle Epitope zu erhalten. Diese Strategie wurde in unserer Arbeitsgruppe erfolgreich am Beispiel von Interleukin 4 angewandt. Um minimale strukturelle Epitope präzise zu lokalisieren, ist es es notwendig, die Struktur des Liganden in seiner gebundenen Form zu kennen. Besonders informativ wäre die Struktur des Komplexes aus Ligand und spezifischer Rezeptor α-Kette. Zu diesem Zweck wurden große Mengen (einige 10 mg) IL-5 mit vollständiger biologischer Funktionaltät und der extrazellulären Domäne der IL-5 spezifischen Rezeptor α-Kette in einem bakteriellen Expressionssystem (E. coli) exprimiert. Nach erfolgreicher Faltung wurden die Proteine zu einer Reinheit von 95-99% aufgereinigt und ein stabiler und löslicher Rezeptor:Ligandenkomplex erzeugt. Die erfolgreiche Aufreinigung und Faltungsprozedur wurde bezüglich maximaler Menge und Reinheit optimiert. Mit den produzierten Rezeptor:Ligandenkomplexen wurden Kristallisationsexperimente durchgeführt. Zunächst wurden mit einer flexiblen Sparse-Matrix Screening Methode Mikrokristalle erzeugt. Die Qualität der Kristalle wurde dann durch Feinabstimmung der Kristallisationsbedingungen verbessert. In diesem Stadium wurden Kristalle von etwa 800x150x30µm Größe erzeugt, die die gewünschten optischen Eigenschaften wie glatte Oberflächen und scharfe Kanten besaßen. Die Kristalle drehen die Polarisationsebene linear polarisierten Lichtes, was ihren gleichmäßigen Aufbau zeigt. Leider verkompliziert die geringe Dicke und das teilweise Auftreten von Clustern die Aufnahme hochauflösender Daten und damit Auflösung der Struktur. Mit einigen der erhaltenen Kristalle wurde eine Beugung bis zur Auflösung von 4 Å beobachtet. KW - Interleukin 5 KW - Rezeptor KW - Struktur KW - Interleukin-5 KW - Rezeptor KW - Asthma KW - X-ray KW - Protein-Kristallisierung KW - Interleukin-5 KW - receptor KW - asthma KW - X-ray KW - protein crystallization Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8195 ER - TY - THES A1 - Erlenhöfer, Christian T1 - Identifizierung von SLAM (CD150) als zellulären Rezeptor für Masernviren T1 - Identification of SLAM (CD150) as a cellular receptor for measles virus N2 - Das Masernvirus (MV) interagiert mit zellulären Rezeptoren auf der Oberfläche von peripheren Blut-Lymphozyten (PBL), die Virus -Bindung und -Aufnahme vermitteln. Wir konnten einen monoklonalen Antikörper mAK 5C6 selektieren, der gegen die Zelloberfläche von B95a Zellen gerichtet ist, die mit MV gut infizierbar sind. Der Antikörper 5C6 inhibiert sowohl die Bindung, als auch die Infektion mit MV Wildtyp- und Vakzine-Stämmen. Ich verwendete eine retrovirale Genbank als Quelle für humane Milz mRNA und Proteine, um ein Screening nach Rezeptoren mit Antikörpern durchzuführen. Mit Hilfe des Antikörpers 5C6 wurde, unter Verwendung von Magnetbeats und FACS-Sortierung, ein erfolgreiches Screening Rezeptor-exprimierender Zellen durchgeführt. Das von mAK 5C6 erkannte Molekül konnte kloniert und als signaling lymphocytic activation molecule (SLAM; CD150) identifiziert werden. Zur Untersuchung der Rezeptorbenutzung verschiedener MV-Stämme wurden CHO-Zellen, die entwe-der rekombinantes CD46 oder SLAM exprimierten, mit 28 Masernvirusstämmen infiziert. Unter den getesteten Viren befanden sich sowohl Vakzine-Stämme, Wildtyp-Stämme mit verschiedener Pass-agierung und rekombinante Viren. Dabei konnte gezeigt werden, dass SLAM ein Rezeptor für MV ist, der sowohl Virusaufnahme und Synzytienbildung für alle getesteten Masernvirusstämme vermittelt. Vor allem Vakzine- und laboradaptierte-Stämme, aber auch eine kleine Fraktion der getesteten Wild-typstämme, konnten sowohl CD46 als auch SLAM verwenden. Durch Verwendung rekombinanter Viren konnte ich zeigen, dass der einzelne Aminosäureaustausch im Hämagglutinin (H) Protein an Position 481 Asn/Tyr (H481NY) determiniert, ob das Virus CD46 verwendet. Der Aminosäureaus-tausch hat keinen Effekt auf die Verwendung von SLAM als Rezeptor was andeutet, dass die Bin-dungsstelle von SLAM und CD46 unterschiedlich ist. Wie bereits für CD46 beschrieben, konnte eine schnelle Rezeptormodulation sowohl auf infizierten als auch uninfizierten Zellen nach Kontakt der MV-Glykoproteine mit SLAM, festgestellt werden. Dabei zeigte sich eine kontaktvermittelte Downregulation nach Vermischung SLAM-positiver Zellen mit per-sistent infizierten BJAB Zellen oder UV-inaktiviertem Virus. SLAM wird schnell von der Zelloberfläche SLAM exprimierender Zelllinien, wie CHO-SLAM, B95a, BJAB, sowie von peripheren Blutlymphozyten (PBL) herunterreguliert. Zusammgefasst: mit SLAM (CD150) wurde ein neuer zellulärer Rezeptor für alle Masernvirusstämme identifiziert. N2 - Measles virus (MV) interacts with cellular receptors on the surface of peripheral blood lymphocytes (PBL) which mediate virus binding and uptake. We selected a monoclonal antibody (Mab 5C6) direc-ted to the surface of highly MV-susceptible B cells (B95a), which inhibits binding to and infection of cells with MV wild-type and vaccine-strains. I used a retroviral gene bank as a source for human splenic mRNAs and proteins, which made it pos-sible to screen with antibodies and to screen for receptor positiv cells. By using the suitable antibody 5C6 I successfully screened for receptor expressing cells using magnetic beads and FACS sorting. I cloned and identified the Mab 5C6 recognized molecule as Signaling Lymphocytic Activation Molecu-le (SLAM; CD150). In order to investigate which measles virus strains may use CD46 and /or CD150 as receptors, CHO cells expressing either recombinant CD46 or SLAM were infected with a panel of 28 MV-strains inclu-ding vaccine strains, wild-type strains with various passage histories and recombinant viruses. I found that SLAM served as a receptor conferring virus uptake and syncytium formation for all MV-strains tested. Predominantly vaccine and laboratory adapted strains, but also a minor fraction of wild-type strains tested, could utilize both CD46 and SLAM. Using recombinant viruses it was demonstrated that the single amino acid exchange in the haemagglutinin (H) protein at position 481 Asn/Tyr (H481NY) determines whether the virus can utilize CD46. The amino acid alteration has no affect on the usage of SLAM as receptor, and as such demonstrates that the binding sites for SLAM and CD46 are distinct. As described for CD46 a rapid receptor modulation was induced by contact of MV glycoproteins with SLAM on infected and uninfected cells. A contact-mediated downregulation was measured by mixing persistently infected BJAB cells or UV-inactivated viruses with uninfected SLAM-positive cells. SLAM is rapidly modulated from the cell surface of all SLAM expressing cell-lines including CHO-SLAM, B95a, BJAB as well as peripheral blood lymphocytes (PBL). In conclusion, I identified SLAM (CD150) as a new cellular receptor for all measles virus strains. KW - Masernvirus KW - Zelloberfläche KW - Rezeptor KW - Masern KW - SLAM KW - CD150 KW - Virus KW - Rezeptor KW - measles KW - SLAM KW - CD150 KW - virus KW - receptor Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6225 ER - TY - THES A1 - Schulte, Valerie T1 - In vitro and in vivo studies on the activating platelet collagen receptor glycoprotein VI in mice T1 - Glykoprotein VI, der aktivierende Kollagenrezeptor auf Blutplättchen - In vitro und in vivo Studien im Mausmodell N2 - The work summarized here focused on the characterization of the murine platelet collagen receptor glycoprotein (GP) VI and was performed to evaluate its potential as an antithrombotic target. The first mAb against (mouse) GPVI, JAQ1, was generated and used to demonstrate that GPVI requires the FcRgamma-chain for its expression and function and that this receptor is the central molecule in collagen-induced platelet activation. Blocking the major collagen binding site on GPVI with JAQ1 revealed the presence of a second activatory epitope within collagen. Additionally, the collagen receptor integrin alpha2beta1 was found to be required for activation via this second pathway but not to be essential for collagen-induced activation of normal platelets. In studies with mice expressing reduced levels of the GPVI-FcRgamma-complex, differential responses to GPVI ligands were observed. Most importantly, the striking difference between platelet responses to collagen and the GPVI specific synthetic collagen related peptide (CRP) confirmed the supportive role of other collagen receptor(s) on platelets. Irrespective of yet undefined additional receptors, studies with mice deficient in GPVI (FcRgamma-chain) or alpha2beta1 showed that GPVI, but not alpha2beta1 is essential for platelet-collagen interaction. Based on these results, the model of platelet attachment to collagen was revised establishing GPVI as the initial activating receptor which upregulates the activity of integrins, thus enabling firm attachment of platelets to the ECM. While the mAb JAQ1 had only limited inhibitory effects on collagen-induced activation in vitro, its in vivo application to mice resulted in completely abolished platelet responses to collagen and the GPVI specific agonists CRP and convulxin. This effect was found to be due to antibody-induced irreversible down-regulation of GPVI on circulating platelets for at least two weeks. Further studies revealed that GPVI depletion occurs independently of the targeted epitope on the receptor and does not require the divalent form of IgG as it was also induced by mAbs (JAQ2, JAQ3) or the respective Fab fragments directed against epitopes distinct from the major collagen binding site. The internalization of GPVI in vivo resulted in a long-term protection of the mice from lethal collagen-dependent thromboembolism whereas it had only moderate effects on the bleeding time, probably because the treatment did not affect other activation pathways. These results establish GPVI as a potential pharmacological target for the prevention of ischemic cardiovascular diseases and may open the way for a completely new generation of antithrombotics. N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob der thrombozytäre Kollagenrezeptor Glykoprotein (GP) VI eine geeignete Zielstruktur für neue Antithrombotika darstellt. Dazu wurden monoklonale Antikörper (mAk) gegen murines GPVI hergestellt (JAQ1, 2 und 3) und deren in vitro und in vivo Effekte im Maussystem untersucht. Es wurde erstmals gezeigt, dass die Expression und Funktion von GPVI auf Thrombozyten von der Assoziation mit der signaltransduzierenden Fc Rezeptor gamma-Kette abhängt. Obwohl GPVI als zentraler Kollagenrezeptor auf Thrombozyten identifiziert wurde, hat die Blockade der Hauptbindestelle für Kollagen mit JAQ1 die Aktivierung nicht vollständig inhibiert, was erstmals die Existenz zweier unabhängiger aktivierender Motive im Kollagen zeigte. Der Kollagenrezeptor Integrin alpha2beta1 ist essentiell für eine Aktivierung durch diesen alternativen Signalweg, nicht jedoch für die Kollagen-induzierte Aktivierung normaler Thrombozyten. Die Präsenz anderer Kollagenrezeptoren neben GPVI wurde in Untersuchungen an Thrombozyten mit reduzierten Expressionsraten des GPVI-FcRgamma-Komplexes bestätigt. Unabhängig davon wurde jedoch anhand von GPVI-, FcRgamma- und alpha2beta1-defizienten Mäusen belegt, dass GPVI, nicht aber wie zuvor angenommen alpha2beta1 der zentrale Kollagenrezeptor auf Thrombozyten ist. Diese Ergebnisse wurden in einem veränderten Modell der Thrombozyten-Kollagen Interaktion zusammengefasst, in dem GPVI als der initiale Rezeptor zur Integrinaktivierung und somit zur festen Adhäsion der Thrombozyten an die EZM etabliert wird. Im Gegensatz zu den in vitro Resultaten mit JAQ1 waren Thrombozyten von anti-GPVI-behandelten Mäusen weder durch Kollagen noch durch andere GPVI Liganden aktivierbar. Es zeigte sich, dass die Antikörper in vivo die Internalisierung sowie den proteolytischen Abbau des Rezeptors induzierten. Dieser Effekt war unabhängig von der Bindungsstelle auf GPVI und konnte auch mit monovalenten anti-GPVI Fab Fragmenten erzielt werden. Während der mindestens zweiwöchigen GPVI-Defizienz der zirkulierenden Thrombozyten waren die JAQ1-behandelten Mäuse vor Kollagen-induzierter Thromboembolie geschützt. Darüber hinaus hatte die GPVI-Depletion nur geringe Effekte auf die Blutungszeit, wahrscheinlich weil diese Behandlung keine anderen Aktivierungswege beeinflusste. Diese Ergebnisse zeigen, dass GPVI ein viel versprechendes pharmakologisches Zielprotein für die prophylaktische Therapie kardiovaskulärer Krankheiten ist, das als Grundlage zur Entwicklung neuer Antithrombotika dienen kann. KW - Maus KW - Kollagen KW - Rezeptor KW - Antithrombotikum KW - Kollagen KW - Glykoprotein VI KW - Maus KW - Plättchen KW - Antithrombotika KW - Collagen KW - Glycoprotein VI KW - Mouse KW - Platelets KW - Antithrombotics Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-6564 ER - TY - THES A1 - Kumar, Andreas T1 - Expression und Aufreinigung von intrazellulären Anteilen des Interleukin-4-Rezeptors als GST-Fusionsproteine und Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen T1 - Expression and Purification of Intracellular Parts of the Interleukin-4-Receptor as GST-Fusion-Proteins and Detection of Protein-Protein-Interactions N2 - In dieser Doktorarbeit wurden zwei intrazelluläre Anteile des IL-4 Rezeptors als GST-Fusionsproteine exprimiert. GST-E1, in dem das cytoplasmatische membranproximale 1/3 von IL-4Ralpha (173 AS) einschließlich des Box 1 Motivs an GST fusioniert ist, konnte nach differenzierter De- und Renaturierung und Bindung an Glutathion-Sepharose Matrix in elektrophoretisch reiner Form aufgereinigt werden. GST-gammainP5D4, in dem die intrazelluläre Domäne von gamma c an GST gebunden vorliegt, konnte nur als heterogenes Gemisch mit 4 C-terminal verkürzten Fraktionen erhalten werden. Mit diesen rekombinanten Fusionsproteinen wurden Immunpräzipitationsversuche in Lysaten IL-4R-transfizierter Ba/F3 Zellen vor und nach Stimulation mit IL-4 durchgeführt. Für GST-E1 wurde eine Wechselwirkung mit Jak1 nachgewiesen, die dem bisherigen Kenntnisstand entspricht; für GST-ginP5D4 hingegen konnte eine Wechselwirkung mit Jak3 nicht gezeigt werden. Beide Proteine sind in der Lage, STAT5 zu präzipitieren; diese Bindung erscheint unabhängig von der IL-4 Stimulation der Zellen und läßt neue Spekulationen über den Mechanismus der Signaltransduktion durch STAT5 zu. Danach könnten nach den hier gewonnenen Informationen beide IL-4-Rezeptorketten jeweils ein STAT5 Molekül zur STAT5-Dimerisirerung nach Rezeptoraktivierung beitragen. Es ist somit gelungen, ein in-vitro-Modell zur Messung von Protein-Protein-Wechselwirkungen am IL-4 Rezeptor zu etablieren, welches für weitere Untersuchungen eingesetzt werden kann. N2 - Two intracellular parts of the interleukin-4-receptor were expressed as GST-fusion-proteins. GST-E1, which comprises the cytoplasmic membrane-proximal 1/3 of IL-4Ralpha (173 AS) including the box1-motif fused to GST, could be purified electrophoretically clean after differential denaturation and renaturation and specific binding to Glutathion-Sepharose Matrix. GSTgammainP5D4, which comprises the intracellular domain of gamma c fused to GST, could only be purified as a heterogenous mixture with 4 C-terminally truncated proteins. Immunoprecipitation experiments were performed in lysates of IL-4R transfected Ba/F3 cells before and after stimulation with IL-4. For GST-E1, an interaction with Jak1 was shown, reflecting the current state of knowledge; however, an interaction with Jak3 could not be shown for GSTgamma in P5D4. Both proteins are able tp precipitate STAT5; this binding appears independet of IL-4 stimulation of the cells and allows for new speculations on the signal transduction mechanism by STAT5. According to the information gained in this work, both IL-4-receptor chains could contribute one STAT5 molecule to STAT5 dimerisation after receptor activation. Therefore, the goal was achieved to establish an in-vitro-model for the detection of protein-protein interactions on the interleukin-4-receptor, which can be used for further investigations. KW - Interleukin-4 KW - Rezeptor KW - Signaltransduktion KW - GST-Fusionsprotein KW - Jak/ STAT KW - Interleukin-4 KW - receptor KW - signal transduction KW - GST fusion protein KW - Jak/ STAT Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-5338 ER - TY - THES A1 - Rotzer, Diana T1 - Biologische Charakterisierung der Rezeptoren für Transforming Growth Faktor-ß T1 - Biological charakterization of the receptors for Transforming Growth Factor-ß N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) reguliert eine Vielzahl zellulärer Funktionen, wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Über membrangebundene Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren werden TGF-ß Signale durch Phosphorylierung an Smad-Proteine, die intrazellulären Signaltransduktoren, weitergeleitet, die im Kern die Transkription spezifischer Gene modulieren. Obwohl die drei TGF-ß Isoformen, TGF-ß1, -ß2 und -ß3, äußerst homologe Proteine sind, unterscheiden sich die Phänotypen ihrer Genknockouts stark. Variabilität und Spezifität können auf vielerlei Arten und Ebenen der TGF-ß Signalübertragung erreicht werden. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternativ gespleißte Variante des TGF-ß Typ II Rezeptors (TßRII), TßRII-B, charakterisiert. Dieser Rezeptor ist, im Gegensatz zum bisher bekannten TßRII, in der Lage alle drei TGF-ß Isoformen hochaffin zu binden und in Abwesenheit eines unterstützenden Typ III Rezeptors (TßRIII) Signale über den Smad-Pathway weiterzuleiten. TßRII-B ist außerdem fähig ligandenabhängig mit den verschiedenen TGF-ß Rezeptortypen zu Oligomerisieren. Erste Hinweise auf Besonderheiten der TGF-ß2 Bindung an TßRII-B wurden mittels verschiedener zellbiologischer Ansätzen gewonnen. Aus Untersuchungen zur gewebespezifischen Expression des Rezeptors geht hervor, daß TßRII-B, im Vergleich zu TßRII, ein distinktes Expressionsmuster aufweist und v.a. in TGF-ß2-beeinflußten Geweben nachgewiesen werden kann. In diesen Erkenntnissen spiegelt sich die Bedeutung dieses Rezeptors für eine TGF-ß Isoform-spezifische Signalübertragung wider. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von TGF-ß und seinen Rezeptoren bei der Entstehung von Tumoren. B-Zellen einiger Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (B-CLL), der häufigsten Form adulter Leukämie in westlichen Ländern, zeigen Resistenz gegenüber TGF-ß-vermittelter Wachstumsinhibierung und ein verändertes Expressionsmuster der TGF-ß Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche. In dieser Arbeit wird die Identifizierung und Charakterisierung zweier Mutationen innerhalb der putativen Signalpeptidsequenz des TGF-ß Typ I Rezeptors (TßRI) in B-Zellen TGF-ß resistenter CLL-Patienten beschrieben. Hierbei handelt es sich um einen Aminosäure-Austausch (L12Q) und eine ‚in-frame‘ Alanin-Deletion (A8) innerhalb einer aus 9 Alaninen bestehenden Sequenz. Es konnte gezeigt werden, daß diese Mutationen zwar keinen Einfluß auf Oberflächenexpression und Komplexbildungseigenschaften des TßRI haben, jedoch TGF-ß stimulierte Reportergeninduktion verringern, was eine kausale Beziehung bei der Entwicklung TGF-ß resistenter B-CLL-Zellen vermuten läßt. Ein Auftreten von Mutationen innerhalb der 9-Alanin-Sequenz des TßRI korreliert mit TGF-ß Insensitivität von B-CLL Zellen. Obwohl noch weitere Studien benötigt werden, um den präzisen molekularen Mechanismus zu verstehen, der zu TGF-ß Resistenz in B-CLL Zellen führt, kann spekuliert werden, daß TßRI Mutationen das Voranschreiten von B-CLL und evtl. anderen Tumorarten unterstützen. Gezieltes Screenen nach TßRI Signalpeptidsequenz Mutationen könnte demnach als prognostischer Indikator für Tumorprogression eingesetzt werden. N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) regulates a variety of cellular functions like proliferation, differentiation and apoptosis. It signals through membrane-bound serine/threonine kinase receptors, which upon stimulation phosphorylate Smad proteins, the intracellular signaltransducers, and thereby trigger their nuclear translocation and transcriptional activity. Although the three mammalian TGF-ß isoforms, TGF-ß1, -ß2 and –ß3, are highly homologous proteins, the phenotypes of their genknockouts reveal striking differences. Variability and specificity can be achieved on different levels of the TGF-ß signaltransduction. In this work an alternatively spliced variant of the TGF-ß type II receptor (TßRII), TßRII-B, is characterized, which in contrast to TßRII binds and mediates signaling of all TGF-ß isoforms. This signaling occurs via the Smad pathway and is independent of any supporting type III receptor (TßRIII). Therefore interaction and oligomerization of TßRII-B with the TGF-ß isoforms as well as the different TGF-ß receptor types was analyzed in detail. Furthermore we defined the characteristics of TGF-ß2 binding to TßRII-B. Expression studies demonstrate that TßRII-B expression is restricted to cells originating from tissues where the TGF-ß2 isoform has a predominant role. All that reflects the importance of this receptor splice-variant in TGF-ß isoform-specific signaling. The second part of this work focuses on the role of TGF-ß and its receptors in tumor development. B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common lymphoid cancer in Western societies, and is also currently incurable. B-cells from some B-CLL patients are resistant to the growth inhibitory effects of TGF-ß and show a different expression pattern of TGF-ß receptors at their cell surface. In this work the identification and characterization of two mutations within the putative signal sequence of the tßrI gene in B-cells from TGF-ß resistant B-CLL patients is described. Thereby a single aminoacid substitution (L12Q) is accompanied by an ‘in frame’ single alanine deletion within an 9-alanine stretch. It could be shown that this mutations do not mediate the apparent loss of functional TßRI in TGF-ß resistant B-CLL, but they attenuate reporter gene induction stimulated by TGF-ß, suggesting a causal relationship in the development of TGF-ß resistant B-CLL. The appearance of mutations within the 9-alanine stretch of the TßRI correlated with and predicted for B-CLL patient insensitivity to TGF-ß. Although more studies are needed to ascertain the precise molecular mechanism leading to TGF-ß resistance in B-CLL cells, it is tempting to speculate that these TßRI mutations may promote the progression of B-CLL and other cancers from their indolent to active states. This suggests that screening for TßRI signal sequence mutations can be employed as a prognostic indicator of B-CLL patient sensitivity to TGF-ß. KW - Transforming growth factor beta KW - Rezeptor KW - TGF-ß Rezeptoren KW - TßRII-B KW - chronische lymphatische Leukämie KW - Tumorgenese KW - TGF-ß receptors KW - TßRII-B KW - chronic lymphocytic Leukemia KW - tumorigenesis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180907 ER - TY - THES A1 - Hansen, Immo A. T1 - Hexamerine und Neuropeptide in der postembryonalen Entwicklung der Insekten T1 - Hexamerins and Neuropeptides during the postembryonic development of insects N2 - Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung neuartige Ansätze zur Identifizierung von biologisch aktiven Wirkstoffen, die in die Metamorphose von holometabolen Insekten eingreifen. Hexamerine und Neuropeptide besitzen sehr unterschiedliche Funktionen. Während Neuropeptide zusammen mit anderen Gewebshormonen auf einer übergeordneten regulatorischen Ebene wirken, sind Hexamerine als Speicher- und Verteidigungsproteine ein Endglied dieser hormonellen Regulationskaskade. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1) Im ersten Projekt sollten allatotrope Substanzen im Gehirn der großen Wachsmotte Galleria mellonella durch Screening einer Expressionsbibliothek mit polyklonalen Antiseren identifiziert werden. Dabei wurde das Neuropeptid Corazonin identifiziert. Die vollständige Corazonin-mRNA wurde kloniert und sequenziert. Das Expressionsmuster der Corazonin-mRNA und des Peptids wurde mittels Northern-Analyse und in-situ-Hybridisierung charakterisiert. Corazonin wird in vier Zellpaaren, die zu den lateralen neurosekretorischen Zellen gehören, exprimiert. Die Axone dieser Zellen verlaufen ipsilateral zu den Nervi corpori cardiaci I+II, feine Fasern verzweigen sich in die am Ösophagus angrenzende Hirnregion hinein. Corazonin wird offensichtlich an den Axon- Endigungen in den Corpora cardiaca in die Hämolymphe freigesetzt. Einige feine Fasern enden in den Corpora allata bzw. am Vorderdarm. Der Nachweis, dass Corazonin tatsächlich eine allatotrope Wirkung hat, konnte nicht erbracht werden. 2) Die Protein/Protein-Interaktion zwischen Hexamerinen und dem Hexamerinrezeptor der Schmeißfliege Calliphora vicina wurde durch Two-Hybrid-Experimenten analysiert. Durch Interaktionstest mit trunkierten Proteinfragmenten wurden die Bindungsdomänen beider Proteine kartiert. Als rezeptorbindende Domäne des Arylphorins wurde ein 49 AS großes Peptid in der Domäne-3 des Arylphorin- Monomers identifiziert. Die Ligandenbindungsdomäne des Hexamerinrezeptors wurde in den ersten 24 AS des N-Terminus kartiert. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein HTS-Protokoll entwickelt, das zur Identifizierung von Substanzen verwendet werden kann, welche die Bindung dieser beiden Proteine beeinflussen. Eine Two-Hybrid-Bibliothek wurde ausgehend von 7dL-Fettkörper-RNA konstruiert und mit "Hexamerinrezeptor-Ködern" gescreent. Dabei wurden zwei neue Interaktionspartner des Hexamerinrezeptors gefunden und genauer charakterisiert. Der erste identifizierte Interaktionspartner - d-AP-3 - ist Teil eines Adaptin- Komplexes, der als Adapter zwischen membranständigen Rezeptoren und Clathrin oder ähnlichen Proteinen an der rezeptorvermittelten Endozytose beteiligt ist. Die Adaptin-Interaktionsdomäne liegt innerhalb des ABP64-Spaltprodukts des Hexamerinrezeptors. Die Funktion des zweiten Interaktionspartners - AFP - ist unbekannt. AFP wird im anterioren Teil des Fettkörpers und in Hämozyten exprimiert. Die Interaktion zwischen dem Hexamerinrezeptor und AFP ist demnach auf diesen Teil des Fettkörpers beschränkt. Die mit AFP interagierende Domäne des Hexamerinrezeptors liegt innerhalb des P30-Spaltprodukts. N2 - The goal of this project was to develop innovative approaches to identify biologically active substances which interfere with the metamorphosis of holometabolous insects. Hexamerins and neuropeptides clearly have different functions. While neuropeptides are involved in initial regulatory steps hexamerins have important functions as storage and defense proteins during the final steps of the regulatory cascade. Two projects are part of this dissertation: 1) The aim of the first project was the identification of allatotropic substances in the brain of the greater waxmoth Galleria mellonella by means of screening an expression-library with polyclonal antisera. This approach led to the identification the neuropeptide corazonin. The corazonin-mRNA was cloned and sequenced. The expression profile of the mRNA and the peptide was examined with northern-blotting and in-situ-hybridization. Corazonin is produced in four neurosecretory cells localized laterally in each brain hemisphere. Axons of these cells follow the ipsilateral tract to the nervi corpori cardiaci I+II, finer fibers seem to terminate in the brain region adjacent to the oesophagus. Corazonin seems to be released in axon terminals within the corpora cardiaca. Axon endings are even regularly seen in the foregut wall and in the corpora allata. However it could not be established that corazonin in fact is an allatotropic substance. 2) The protein/protein-interaction between hexamerins and the hexamerin-receptor of the blowfly Calliphora vicina was analysed using the yeast-two-hybrid- system. By interaction tests with truncated protein fragments the binding domains of both proteins were mapped. The receptor binding domain of arylphorin was located within a peptide of 49 aa in domain-3 of the arylphorin monomer. The ligand binding domain of the hexamerin-receptor was mapped within the first 24 aa of the N-terminus. Proceeding from this results a protocol for a high-throughput-screening was developed which can be used to identify substances that interfere with the binding of these two proteins. A two-hybrid-library was constructed from 7dL-fat body RNA and screened with a hexamerin-receptor-bait. Two novel interactors of the hexamerin-receptor were identified and characterized within this project. The first identified interactor - d-AP-3 - is part of an adaptin complex which serves as an adapter between membrane-bound receptors and clathrin or related proteins and is part of the receptor-mediated endocytosis process. The adaptin-interacting domain lies within the ABP64 cleavage product of the receptor. The function of the second interactor - AFP - is unknown. AFP is produced specifically in the anterior part of the fat body and in hemocytes. Hence the interaction between the hexamerin-receptor and AFP is limited to this part of the fat body. The AFP-interacting domain is located within the P30 cleavage product of the hexamerin-receptor. KW - Blaue Fleischfliege KW - Hexamerine KW - Rezeptor KW - Arylphorine KW - Wechselwirkung KW - Große Wachsmotte KW - Jugendentwicklung KW - Corazonin KW - Genexpression KW - Biologische Schädlingsbekämpfung KW - Hexamerin KW - Neuropeptid KW - Corazonin KW - Arylphorin AFP KW - hexamerin KW - neuropeptide KW - corazonin KW - arylphorin AFP Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180084 ER - TY - THES A1 - Brede, Marc T1 - Kardiovaskuläre Phänotypisierung von Angiotensin II AT2-Rezeptor- und adrenergen Rezeptor-"Knockout"-Mäusen T1 - Cardiovascular characterization of Angiotensin II AT2-receptor- and adrenergic receptor-knockout-mice N2 - Die Deletion des AT2-Rezeptors (AT2-KO) führt zu erhöhter Blutdruckempfindlichkeit und vaskulärer Hypertrophie durch Aktivitätszunahhme der P70S6-Kinase. Die Vasodilatation von Blutgefäßen wird maßgeblich durch beta1-adrenerge Rezeptoren vermittelt. Die Deletion von alpha2-adrenergen Rezeptoren (alpha2-KO) führt zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz nach Aortenstenose. Der Mortalitätanstieg ist mit erhöhten Plasmanoradrenalin-Spiegeln (a2A-KO), bzw. Plasmaadrenalin-Spiegeln (a2C-KO) assoziiert. N2 - The deletion of AT2-receptors causes increased blood-pressure sensitivity and vascular hypertrophy by increased P70S6-Kinase activity. Vasodilation is mainly mediated by beta1-adrenoceptors. The deletion of alpha2-adrenoceptors leads to heart failure after aortic banding. The increased mortality is associated with elevated plasma levels of norepinephrine (a2A-KO) or epinephrine (a2C-KO). KW - transgen KW - Maus KW - Angiotensin KW - Rezeptor KW - adrenerg KW - Katecholamine KW - Blutgefäß KW - Hypertrophie KW - Herzinsuffizienz KW - Nebenniere KW - Angiotensin KW - receptor KW - adrenergic KW - catecholamines KW - vessel KW - hypertrophy KW - heart failure KW - adrenal gland Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179726 ER - TY - THES A1 - Große-Wilde, Anne T1 - Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL (mTRAIL-R) T1 - Cloning, molecular characterization and konditional inactivation of a murine death receptor for TRAIL (mTRAIL-R) N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden. N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological function of TRAIL. In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified. Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R deficient mice. The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy. KW - Maus KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - Rezeptor KW - Apoptose KW - Klonierung KW - 2D-Gel-Analyse KW - konditionale Knockout-Maus KW - TRAIL KW - receptor KW - apoptosis KW - cloning KW - 2D gel analysis KW - conditional knockout mouse Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-559 ER -