TY - THES A1 - Voß, Lena Johanna T1 - Änderungen der Membranspannung und der Osmolarität als Auslöser für Calciumsignale in Pflanzen – Studien an Schließzellen von Nicotiana tabacum und Polypodium vulgare T1 - Induction of Calcium Signals by Changes in Membrane Potential and Osmolarity – Studies on Guard Cells of Nicotiana tabacum and Polypodium vulgare N2 - Stomata sind kleine Poren in der Blattoberfläche, die Pflanzen eine Anpassung ihres Wasserhaushalts an sich ändernde Umweltbedingungen ermöglichen. Die Öffnungsweite der Stomata wird durch den Turgordruck der Schließzellen bestimmt, der wiederum durch Ionenflüsse über die Membranen der Zelle reguliert wird. Ein Netzwerk von Signaltransduktionswegen sorgt dafür, dass Pflanzen die Stomabewegungen an die Umgebungsbedingungen anpassen können. Viele molekulare Komponenten dieser Signaltransduktionketten in Schließzellen von Angiospermen sind inzwischen bekannt und Calcium spielt darin als Signalmolekül eine wichtige Rolle. Weitgehend unbekannt sind dagegen die Mechanismen, die zur Erzeugung von transienten Erhöhungen der Calciumkonzentration führen. Auch die molekularen Grundlagen der Regulierung der Stomaweite in Nicht-Angiospermen-Arten sind bisher nur wenig verstanden. Um zur Aufklärung dieser Fragestellungen beizutragen, wurden in dieser Arbeit Mechanismen zur Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration sowie elektrophysiologische Eigenschaften von Schließzellen untersucht. Der Fokus lag hierbei insbesondere auf der Visualisierung cytosolischer Calciumsignale in Schließzellen. Im ersten Teil der Arbeit wurde durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse mittels TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) gezielt eine Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration in einzelnen Schließzellen von Nicotiana tabacum ausgelöst. Um die Dynamik der cytosolischen Calciumkonzentration dabei zeitlich und räumlich hoch aufgelöst zu visualisieren, wurde simultan zu den elektrophysiologischen Messungen ein Spinning-Disc-System für konfokale Aufnahmen eingesetzt. Während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse wurde eine transiente Vergrößerung des cytosolischen Volumens beobachtet. Diese lässt sich durch einen osmotisch getriebenen Wasserfluss erklären, der durch die Veränderung der Ionenkonzentration im Cytosol verursacht wird. Diese wiederum wird durch die spannungsabhängige Aktivierung einwärtsgleichrichtender Kaliumkanäle in der Plasmamembran der Schließzellen und durch den Kompensationsstrom der eingestochenen Mikroelektrode hervorgerufen. Mit Hilfe des calciumsensitiven Farbstoffs Fura-2 konnte gezeigt werden, dass die Erhöhung der freien cytosolischen Calciumkonzentration während der Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse durch zwei Mechanismen verursacht wird. Der erste Mechanismus ist die Aktivierung hyperpolarisationsaktivierter, calciumpermeabler Kanäle (HACCs) in der Plasmamembran, die schon 1998 von Grabov & Blatt beschrieben wurde. Zusätzlich zu diesem Mechanismus der Calciumfreisetzung, konnte ein zweiter bislang unbekannter Mechanismus aufgedeckt werden, bei dem Calcium aus intrazellulären Speichern in das Cytosol freigesetzt wird. Dieser Mechanismus hängt mit der oben beschriebenen Vergrößerung des cytosolischen Volumens zusammen und ist wahrscheinlich durch die Änderungen der mechanischen Spannung der Membran bzw. der Osmolarität innerhalb der Zelle bedingt. Diese könnten zu einer Aktivierung mechanosensitiver, calciumpermeabler Kanäle führen. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen der Regulierung von Stomata in Nicht-Angiospermen. In Schließzellen von Polypodium vulgare konnten durch die Anwendung der TEVC-Technik ähnliche spannungsabhängige Ströme über die Plasmamembran gemessen werden wie in Angiospermen. Ebenso wurden durch die Applikation hyperpolarisierender Spannungspulse an Schließzellen von Polypodium und Asplenium Erhöhungen der cytosolischen Calciumkonzentration ausgelöst, die auf die Existenz spannungsabhängiger, calciumpermeabler Kanäle in der Plasmamembran hinweisen. Die Diffusion von Fluoreszenzfarbstoffen in die Nachbarschließzellen nach der iontophoretischen Beladung in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris und Selaginella zeigte, dass in diesen Arten eine symplastische Verbindung zwischen benachbarten Schließzellen besteht, die an Schließzellen von Angiospermen bisher nicht beobachtet werden konnte. Anhand elektronenmikroskopischer Aufnahmen von Polypodium glycyrrhiza Schließzellen konnte gezeigt werden, dass diese Verbindung wahrscheinlich durch Plasmodesmata zwischen benachbarten Schließzellen gebildet wird. Durch die Analyse der Calciumdynamik in benachbarten Schließzellen nach hyperpolarisierenden Spannungspulsen stellte sich heraus, dass die Calciumhomöostase trotz symplastischer Verbindung in beiden Schließzellen unabhängig voneinander reguliert zu werden scheint. Im Rahmen der Untersuchungen an Farnschließzellen wurde desweiteren eine Methode zur Applikation von ABA etabliert, die es erlaubt mithilfe von Mikroelektroden das Phytohormon iontophoretisch in den Apoplasten zu laden. Im Gegensatz zu den Schließzellen von Nicotiana tabacum, die auf eine so durchgeführte ABA-Applikation mit dem Stomaschluss reagierten, wurde in Polypodium vulgare auf diese Weise kein Stomaschluss ausgelöst. Da die ABA-Antwort der Farnstomata aber auch von anderen Faktoren wie Wachstumsbedingungen abhängig ist (Hõrak et al., 2017), kann eine ABA-Responsivität in dieser Farnart trotzdem nicht vollkommen ausgeschlossen werden. Die Freisetzung von Calcium aus intrazellulären Speichern, wie sie in dieser Arbeit gezeigt wurde, könnte eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Stomaweite spielen. Zur Aufklärung dieser Fragestellung wäre die Identifizierung der Kanäle, die an der osmotisch/mechanisch induzierten Calciumfreisetzung aus internen Speichern beteiligt sind, von großem Interesse. Weiterführende Studien an Schließzellen von Farnen könnten die physiologische Bedeutung der aus Angiospermen bekannten Ionenkanäle für die Stomabewegungen in evolutionär älteren Landpflanzen aufklären und so maßgeblich zum Verständnis der Evolution der Regulierunsgmechanismen von Stomata beitragen. Außerdem stellt sich die Frage, welche Rolle die hier gezeigte symplastische Verbindung der Nachbarschließzellen durch Plasmodesmata für die Funktion der Stomata spielt. N2 - Stomata are small pores in the leaf surface that allow plants to adapt their water balance to changing environmental conditions. The turgor pressure of the guard cells determines the width of the stomatal aperture and is regulated by ion fluxes in or out of the guard cell. A network of different signal transduction pathways is necessary for the adaption of stomatal movements to ambient conditions. Many of these transduction pathways have been described in detail and many of their components have been identified. It is a well known fact that calcium acts as a second messenger in pathways regulating stomatal movements. However, the mechanisms that lead to transient elevations of the cytosolic calcium concentration are largely unknown. The molecular basis of the regulation of stomatal aperture in non-angiosperm species is also poorly understood. In order to gain new insights into these topics, mechanisms of calcium elevation and electrophysiological properties of guard cells were studied, focussing especially on the visualization of the cytosolic calcium concentration in guard cells. In the first part of this study, the application of hyperpolarizing voltage pulses by means of TEVC (Two Electrode Voltage Clamp) was used to specifically trigger an increase in the cytosolic calcium concentration in individual guard cells in the angiosperm model plant Nicotiana tabacum. To visualize the dynamics of the cytosolic calcium concentration with high temporal and spatial resolution, a spinning disc system for confocal imaging was used simultaneously with the electrophysiological recordings. During the application of hyperpolarizing voltage pulses a transient increase in cytosolic volume was observed. This increase can be explained by an osmotically driven water flux caused by changes of the cytosolic ion concentration. These in turn are caused by the voltage-dependent activation of inward rectifying potassium channels in the guard cell plasma membrane and by the compensating current from the impaled microelectrode. Using the calcium-sensitive dye Fura-2, it could be shown that two mechanisms lead to the elevation of the cytosolic calcium concentration during the application of hyperpolarizing voltage pulses. The first mechanism is the activation of hyperpolarization-activated calcium permeable channels (HACCs) in the plasma membrane, which has already been described in 1998 by Grabov & Blatt. In addition to this mechanism of calcium release, a second previously unknown mechanism was discovered in which calcium is released into the cytosol from intracellular stores. This mechanism is related to the increase in cytosolic volume we described above and is probably caused by changes in membrane tension or osmolarity within the cell. These changes could lead to an activation of mechanosensitive calciumpermeable channels. The second part of this thesis deals with the molecular basis of the regulation of stomata in non-angiosperms. In guard cells of Polypodium vulgare voltage-dependent currents across the plasma membrane similar to those described in angiosperm model plants could be measured using TEVC. Furthermore, the application of hyperpolarizing voltage pulses induced increases in cytosolic calcium concentration in guard cells of Polypodium and Asplenium indicating the existence of voltage-dependent calcium permeable channels in the plasma membrane. The diffusion of iontophoretically injected fluorescent dyes into the neighboring guard cells in Polypodium, Asplenium, Ceratopteris and Selaginella showed that in these species a symplastic connection between neighboring guard cells exists, which could not be observed in guard cells of angiosperms. Electron microscopic images of Polypodium glycyrrhiza guard cells showed that this connection is probably formed by plasmodesmata between adjacent guard cells. Analysis of the calcium dynamics in neighboring guard cells after hyperpolarizing voltage pulses revealed that calcium homeostasis seems to be regulated independently in both guard cells despite their symplastic connection. As part of the investigations on guard cells of ferns, a new method for the application of ABA was established, which allows the phytohormone to be charged iontophoretically into the apoplast with the aid of microelectrodes. In contrast to the guard cells of Nicotiana tabacum, which reacted with loss of turgor and subsequential stomatal closure to this method of ABA-application, no closure of the stomata could be induced in Polypodium vulgare in this way. However, since the ABA response of fern stomata is also dependent on other factors such as growth conditions (Hõrak et al., 2017), an ABA-responsiveness in this fern species can still not be completely excluded. The release of calcium from intracellular stores, as shown in this work, could play an important role for the regulation of stomatal aperture. To clarify this question, the identification of the channels involved in osmotically/mechanically induced calcium release from internal stores would be of great interest. Further studies on fern guard cells could clarify the physiological significance of ion channels known from angiosperms for the stomatal movements in early land plants, and thus contribute significantly to the understanding of the evolution of stomatal regulation. In addition, the question arises as to what role the symplastic connection of the neighboring guard cells through plasmodesmata plays for the function of stomata. KW - Schließzelle KW - Nicotiana tabacum KW - Polypodium vulgare KW - Calcium Imaging KW - Elektrophysiologie KW - Schließzellen KW - Farne KW - Abscisinsäure KW - Oregon Green-BAPTA KW - Fura-2 KW - Hyperpolarisierung KW - guard cells KW - ferns KW - abscisic acid KW - hyperpolarisation Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-219639 ER - TY - JOUR A1 - Rasouli, Fatemeh A1 - Kiani-Pouya, Ali A1 - Li, Leiting A1 - Zhang, Heng A1 - Chen, Zhonghua A1 - Hedrich, Rainer A1 - Wilson, Richard A1 - Shabala, Sergey T1 - Sugar beet (Beta vulgaris) guard cells responses to salinity stress: a proteomic analysis JF - International Journal of Molecular Sciences N2 - Soil salinity is a major environmental constraint affecting crop growth and threatening global food security. Plants adapt to salinity by optimizing the performance of stomata. Stomata are formed by two guard cells (GCs) that are morphologically and functionally distinct from the other leaf cells. These microscopic sphincters inserted into the wax-covered epidermis of the shoot balance CO\(_2\) intake for photosynthetic carbon gain and concomitant water loss. In order to better understand the molecular mechanisms underlying stomatal function under saline conditions, we used proteomics approach to study isolated GCs from the salt-tolerant sugar beet species. Of the 2088 proteins identified in sugar beet GCs, 82 were differentially regulated by salt treatment. According to bioinformatics analysis (GO enrichment analysis and protein classification), these proteins were involved in lipid metabolism, cell wall modification, ATP biosynthesis, and signaling. Among the significant differentially abundant proteins, several proteins classified as “stress proteins” were upregulated, including non-specific lipid transfer protein, chaperone proteins, heat shock proteins, inorganic pyrophosphatase 2, responsible for energized vacuole membrane for ion transportation. Moreover, several antioxidant enzymes (peroxide, superoxidase dismutase) were highly upregulated. Furthermore, cell wall proteins detected in GCs provided some evidence that GC walls were more flexible in response to salt stress. Proteins such as L-ascorbate oxidase that were constitutively high under both control and high salinity conditions may contribute to the ability of sugar beet GCs to adapt to salinity by mitigating salinity-induced oxidative stress. KW - guard cells KW - stomata KW - sugar beet KW - salt stress KW - proteomic Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-285765 SN - 1422-0067 VL - 21 IS - 7 ER - TY - THES A1 - Huang, Shouguang T1 - Role of ABA-induced Ca\(^{2+}\) signals, and the Ca\(^{2+}\)-controlled protein kinase CIPK23, in regulation of stomatal movements T1 - Rolle von ABA-abhängigen Ca\(^{2+}\) Signalen, und der Ca\(^{2+}\)-gesteuerten Proteinkinase CIPK23, bei der Regulation der Spaltöffnungsbewegungen N2 - Stomata are pores in the leaf surface, formed by pairs of guard cells. The guard cells modulate the aperture of stomata, to balance uptake of CO2 and loss of water vapor to the atmosphere. During drought, the phytohormone abscisic acid (ABA) provokes stomatal closure, via a signaling chain with both Ca2+-dependent and Ca2+-independent branches. Both branches are likely to activate SLAC1-type (Slow Anion Channel Associated 1) anion channels that are essential for initiating the closure of stomata. However, the importance of the Ca2+-dependent signaling branch is still debated, as the core ABA signaling pathway only possesses Ca2+-independent components. Therefore, the aim of this thesis was to address the role of the Ca2+-dependent branch in the ABA signaling pathway of guard cells. In the first part of the thesis, the relation between ABA-induced Ca2+ signals and stomatal closure was studied, with guard cells that express the genetically encoded Ca2+-indicator R-GECO1-mTurquoise. Ejection of ABA into the guard cell wall rapidly induced stomatal closure, however, only in ¾ of the guard cells ABA evoked a cytosolic Ca2+ signal. A small subset of stomata (¼ of the experiments) closed without Ca2+ signals, showing that the Ca2+ signals are not essential for ABA-induced stomatal closure. However, stomata in which ABA evoked Ca2+ signals closed faster as those in which no Ca2+ signals were detected. Apparently, ABA-induced Ca2+ signals enhance the velocity of stomatal closure. In addition to ABA, hyperpolarizing voltage pulses could also trigger Ca2+ signals in wild type guard cells, which in turn activated S-type anion channels. However, these voltage pulses failed to elicit S-type anion currents in the slac1/slah3 guard cells, suggesting that SLAC1 and SLAH3 contribute to Ca2+-activated conductance. Taken together, our data indicate that ABA-induced Ca2+ signals enhance the activity of S-type anion channels, which accelerates stomatal closure. The second part of the thesis deals with the signaling pathway downstream of the Ca2+ signals. Two types of Ca2+-dependent protein kinase modules (CPKs and CBL/CIPKs) have been implicated in guard cells. We focused on the protein kinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23), which is activated by the Ca2+-dependent protein CBL1 or 9 (Calcineurin B-Like protein 1 or 9) via interacting with the NAF domain of CIPK23. The CBL1/9-CIPK23 complex has been shown to affect stomatal movements, but the underlying molecular mechanisms remain largely unknown. We addressed this topic by using an estrogen-induced expression system, which specifically enhances the expression of wild type CIPK23, a phosphomimic CIPK23T190D and a kinase dead CIPK23K60N in guard cells. Our data show that guard cells expressing CIPK23T190D promoted stomatal opening, while CIPK23K60N enhanced ABA-induced stomatal closure, suggesting that CIPK23 is a negative regulator of stomatal closure. Electrophysiological measurements revealed that the inward K+ channel currents were similar in guard cells that expressed CIPK23, CIPK23T190D or CIPK23K60N, indicating that CIPK23-mediated inward K+ channel AKT1 does not contribute to stomatal movements. Expression of CIPK23K60N, or loss of CIPK23 in guard cells enhanced S-type anion activity, while the active CIPK23T190D inhibited the activity of these anion channels. These results are in line with the detected changes in stomatal movements and thus indicate that CIPK23 regulates stomatal movements by inhibiting S-type anion channels. CIPK23 thus serves as a brake to control anion channel activity. Overall, our findings demonstrate that CIPK23-mediated stomatal movements do not depend on CIPK23-AKT1 module, instead, it is achieved by regulating S-type anion channels SLAC1 and SLAH3. In sum, the data presented in this thesis give new insights into the Ca2+-dependent branch of ABA signaling, which may help to put forward new strategies to breed plants with enhanced drought stress tolerance, and in turn boost agricultural productivity in the future. N2 - Stomata sind Poren in der Blattoberfläche, die von einem Paar von Schließzellen gebildet werden. Die Schließzellen kontrollieren den Öffnungsweite der stomatären Pore, um die Aufnahme von CO2 und den Verlust von Wasserdampf in die Atmosphäre auszubalancieren. Während Trockenperioden bewirkt das Phytohormon Abscisinsäure (ABA) einen Stomaschluss über eine Signalkaskade, welche über Ca2+-abhängige und Ca2+-unabhängige Pfade verfügt. Beide Pfade aktivieren wahrscheinlich Anionenkanäle aus der SLAC1 Familie (Slow Anion Channel Associated 1), welche essentiell sind um den Stomaschluss einzuleiten. Allerdings wird über die Wichtigkeit des Ca2+-abhängigen Pfades noch immer diskutiert, da der ABA-Hauptsignalweg ausschließlich Ca2+-unabhängige Komponenten beinhaltet. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Thesis, die Rolle des Ca2+-abhängigen Pfades im ABA-Signalweg aufzulösen. Im ersten Teil der Thesis wurde mit Schließzellen, die den genetisch kodierten Ca2+-Sensor R-GECO1-mTurquoise exprimierten, der Zusammenhang zwischen ABA-induzierten Ca2+ Signalen und dem Stomaschluss untersucht. Die Injektion von ABA in die Zellwand von Schließzellen bewirkte einen schnellen Stomaschluss, jedoch wurde nur bei drei Vierteln der Zellen auch ein zytosolisches Ca2+ Signal erzeugt. Ein kleiner Teil der Stomata (in einem Viertel der Experimente) schloss sich ohne Ca2+ Signal, was zeigt, dass die Ca2+ Signale nicht essentiell für den ABA-induzierten Stomaschluss sind. Es schlossen sich jedoch Stomata schneller, in deren Schließzellen ABA-induzierte Ca2+ Signale detektiert wurden. ABA-induzierte Ca2+-Signale verbesserten also offenbar die Geschwindigkeit des Stomaschlusses. Neben ABA konnten Ca2+ Signale in wildtypischen Schließzellen auch durch hyperpolarisierende Spannungspulse erzeugt werden, welche daraufhin S-Typ Anionenkanäle aktivierten. Diese Spannungspulse konnten jedoch in slac1/slah3 Schließzellen keine S-typischen Anionenströme hervorrufen, was darauf hindeutet, dass SLAC1 und SLAH3 zur Ca2+-aktivierten Leitfähigkeit beitragen. Zusammengefasst deuten unsere Daten darauf hin, dass ABA-induzierte Ca2+ Signale die Aktivität von S-Typ Anionenkanälen verbessern und somit den Stomaschluss beschleunigen. Der zweite Teil der Thesis befasst sich mit dem Signalweg, der den Ca2+-Signalen nachgeschaltet ist. Es wurden zwei Typen Ca2+-abhängiger Proteinkinase-Module (CPKs und CBL/CIPKs) in Schließzellen nachgewiesen. Wir haben uns auf die Proteinkinase CIPK23 (CBL-Interacting Protein Kinase 23) konzentriert, welche von den Ca2+-abhängigen Proteinen CBL1 und CBL9 (Calcineurin B-Like Protein 1 oder 9) über Interaktion mit der NAF Domäne des CIPK23 aktiviert wird. Es konnte bereits gezeigt werden, dass der CBL1/CIPK23 Komplex die stomatäre Bewegung beinflusst, jedoch sind die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen bisher weitgehend unbekannt geblieben. Wir haben dieses Thema mit einem Östrogen-induzierten Expressionssystem untersucht, welches spezifisch in Schließzellen die Expression von wildtypischem CIPK23 erhöhte. Hinzu kamen Experimente mit einer phosphomimetischen CIPK23T190D und einer CIPK23K60N mit disfunktionaler Kinasedomäne. Unsere Daten zeigen, dass CIPK23T190D exprimierende Schließzellen eine verbesserte Stomaöffnung aufwiesen, während CIPK23K60N den ABA-induzierten Stomaschluss förderte, was auf eine negativ regulierende Rolle von CIPK23 beim Stomaschluss hindeutet. Elektrophysiologische Messungen zeigten, dass die einwärtsgerichteten K+-Ströme in CIPK23-, CIPK23T190D- oder CIPK23K60N-exprimierenden Schließzellen vergleichbar waren, was darauf hindeutet, dass die Aktivierung von AKT1 durch CIPK23 nicht zur stomatären Bewegung beiträgt. Allerdings führte die Expression von CIPK23K60N, wie auch der Verlust von CIPK23, in Schließzellen zu einer erhöhten S-typischen Anionenkanalaktivität, während eine CIPK23T190D-Expression diese Anionenkanalaktivität inhibierte. Diese Ergebnisse stimmen mit den Beobachtungen zu den gezeigten Veränderungen der stomatären Bewegung überein und deuten daher auf eine regulierende Rolle von CIPK23 für die stomatäre Bewegung durch die Inhibierung von S-Typ Anionenkanälen hin. Insgesamt beweisen unsere Befunde, dass die CIPK23-vermittelte stomatäre Bewegung nicht durch eine Interaktion von CIP23 mit AKT1, sondern durch die Regulierung der S-Typ Anionenkanäle SLAC1 und SLAH3 vermittelt wird. Zusammengefasst ergeben die in dieser Thesis präsentierten Daten neue Einblicke in den Ca2+-abhängigen Pfad des ABA-Signalwegs. Dies könnte in Zukunft helfen neue Strategien zur Zucht von Pflanzen mit verbesserter Trockenstresstoleranz zu entwickeln und somit die agrarwirtschaftliche Produktivität zu erhöhen. KW - Stomata KW - guard cells KW - ABA KW - OST1 KW - SLAC1 KW - anion channels KW - Ca2+ signal KW - CIPK23 KW - AKT1 KW - K+ channels KW - drought stress Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-204737 ER - TY - THES A1 - Li, Kunkun T1 - Dissecting the interconnection of Ca\(^{2+}\) and pH signaling in plants with a novel biosensor for dual imaging T1 - Untersuchung der Verknüpfung von Ca\(^{2+}\) und pH-Signalen in Pflanzen mit einem neuartigen Biosensor für duale Bildgebung N2 - Calcium ion (Ca2+) and protons (H+) are both regarded as second messengers, participating in plant growth and stress mechanisms. However, H+ signals in plant physiology are less well investigated compared to Ca2+ signals. If interconnections between these two second messengers exist remains to be uncovered because appropriate imaging tools to monitor Ca2+ and H+ simultaneously in the same cell as well as accurate bioinformatics analysis remain to be developed. To overcome this problem and unravel the role and possible interconnection of Ca2+ and H+ in plants, a new biosensor named CapHensor was developed and optimized to visualize intracellular Ca2+ and H+ changes simultaneously and ratiometrically in the same cell. The CapHensor consisted of an optimized green fluorescent pH sensor (PRpHluorin) and an established red fluorescent Ca2+ sensor (R-GECO1) that were combined in one construct via a P2A sequence. A P2A self-cleavage site between the two sensors allowed to express equal amounts but spatially separated sensors, which enabled artifact-free and ratiometric imaging of cellular Ca2+ and pH side-by-side. The function of the CapHensor was verified in pollen tubes, since they possess standing Ca2+ and pH gradients. We found better imaging quality and the signal-to-noise ratio to be enhanced in live-cell imaging when two R-GECO1 proteins were fused in tandem within the CapHensor construct. To guarantee exclusive subcellular localization and avoid mixed signals from different compartments, Nuclear Export Sequence (NES) and Nuclear Localization Sequence (NLS) were used to target PRpHluorin and R-GECO1 to distinct compartments. After optimization and verification its function, CapHensor was successfully expressed in different cell types to investigate the role of Ca2+ and H+ signals to control polar growth of pollen tube, stomatal movement or leaf defense signaling. Results obtained in the past indicated both Ca2+ gradients and pH gradients in pollen tubes play roles in polar growth. However, the role and temporal relationship between the growth process and changes in Ca2+ and pH have not been conclusively resolved. Using CapHensor, I found cytosolic acidification at the tip could promote and alkalization to suppress growth velocity in N. tabacum pollen tubes, indicating that cytosolic H+ concentrations ([H+]cyt) play an important role in regulation pollen tubes growth despite the accompanied changes in cytosolic Ca2+ concentrations ([Ca2+]cyt). Moreover, growth correlated much better with the tip [H+]cyt regime than with the course of the tip [Ca2+]cyt regime. However, surprisingly, tip-focused [Ca2+]cyt andII [H+]cyt oscillations both lagged behind growth oscillations approximately 33 s and 18 s, respectively, asking for a re-evaluation of the role that tip [Ca2+]cyt may play in pollen tube growth. Live-cell CapHensor imaging combined with electrophysiology uncovered that oscillatory membrane depolarization correlated better with tip [H+]cyt oscillations than with tip [Ca2+]cyt oscillations, indicative for a prominent role of [H+]cyt to also control electrogenic membrane transport. Using CapHensor, reading out cellular movement at the same time enabled to provide a precise temporal and spatial resolution of ion signaling events, pointing out a prominent role of [H+]cyt in pollen tube tip growth. For leaf cells, a special CapHensor construct design had to be developed, containing additional NES localization sequences to avoid overlapping of fluorescense signals from the nucleus and the cytosol. Once this was achieved, the role of Ca2+ and pH changes in guard cells, another typical single-cell system was investigated. Cytosolic pH changes have been described in stomatal movement, but the physiological role of pH and the interaction with changing Ca2+ signals were still unexplored. Combining CapHensor with the here developed technique to monitor stomatal movement in parallel, the role of Ca2+ and H+ in stomatal movement was studied in detail and novel aspects were identified. The phytohormone ABA and the bacterial elicitor flagellin (flg22) are typical abiotic and biotic stresses, respectively, to trigger stomatal closure. What kind of Ca2+ and H+ signals by ABA and flg22 are set-off in guard cells and what their temporal relationship and role for stomatal movement is were unknown. Similar [Ca2+]cyt increases were observed upon ABA and flg22 triggered stomatal closure, but [H+]cyt dynamics differed fundamentally. ABA triggered pronounced cytosolic alkalization preceded the [Ca2+]cyt responses significantly by 57 s while stomata started to close ca. 205 s after phytohormone application. With flg22, stomatal closure was accompanied only with a mild cytosolic alkalization but the [Ca2+]cyt response was much more pronounced compared to the ABA effects. Where the cytosolic alkalization originates from was unclear but the vacuole was speculated to contribute in the past. In this thesis, vacuolar pH changes were visualized by the dye BCECF over time, basically displaying exactly the opposite course of the concentration shift in the vacuole than observed in the cytosol. This is indicative for the vacuolar pH dynamics to be coupled strongly to the cytosolic pH changes. In stomatal closure signalling, reactive oxygen species (ROS) were proposed to play a major role, however, only very high concentration of H2O2 (> 200 µM), which resulted in the loss of membrane integrity, induced stomatal closure. Unexpectedly, physiological concentrations of ROS led to cytosolic acidificationIII which was associated with stomatal opening, but not stomatal closure. To study the role of [H+]cyt to steer stomatal movement in detail, extracellular and intracellular pH variations were evoked in N. tabacum guard cells and their behaviour was followed. The results demonstrated cytosolic acidification stimulated stomatal opening while cytosolic alkalization triggered stomatal closure accompanied by [Ca2+]cyt elevations. This demonstrated pH regulation to be an important aspect in stomatal movement and to feed-back on the Ca2+-dynamics. It was remarkable that cytosolic alkalization but not [Ca2+]cyt increase seemed to play a crucial role in stomatal closure, because more pronounced cytosolic alkalization, evoked stronger stomatal closure despite similar [Ca2+]cyt increases. Increases in [Ca2+]cyt, which are discussed as an early stomatal closure signal in the past, could not trigger stomatal closure alone in my experiments, even when extremely strong [Ca2+]cyt signals were triggered. Regarding the interaction between the two second messengers, [Ca2+]cyt and [H+]cyt were negatively correlated most of the times, which was different from pollen tubes showing positive correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt regimes. [Ca2+]cyt elevations were always associated with a cytosolic alkalization and this relationship could be blocked by the presence of vanadate, a plasma membrane H+-pump blocker, indicating plasma membrane H+-ATPases to contribute to the negative correlation of [Ca2+]cyt and [H+]cyt. To compare with guard cells, cytosolic and nuclear versions of CapHensor were expressed in N. benthamiana mesophyll cells, a multicellular system I investigated. Mesophyll cell responses to the same stimuli as tested in guard cells demonstrated that ABA and H2O2 did not induce any [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes while flg22 induced an increase in [Ca2+]cyt and [H+]cyt, which is different from the response in guard cells. I could thus unequivocally demonstrate that guard cells and mesophyll cells do respond differently with [Ca2+]cyt and [H+]cyt changes to the same stimuli, a concept that has been proposed before, but never demonstrated in such detail for plants. Spontaneous Ca2+ oscillations have been observed for a long time in guard cells, but the function or cause is still poorly understood. Two populations of oscillatory guard cells were identified according to their [Ca2+]cyt and [H+]cyt phase relationship in my study. In approximately half of the oscillatory cells, [H+]cyt oscillations preceded [Ca2+]cyt oscillations whereas [Ca2+]cyt was the leading signal in the other half of the guard cells population. Strikingly, natural [H+]cyt oscillations were dampened by ABA but not by flg22. This effect could be well explained by dampening of vacuolar H+ oscillations in the presence of ABA, but not through flg22. Vacuolar pH contributes to spontaneous [H+]cyt oscillations and ABA but not flg22 can block the interdependence of naturalIV [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals. To study the role of [Ca2+]cyt oscillations in stomatal movement, solutions containing high and low KCl concentrations were applied aiming to trigger [Ca2+]cyt oscillations. The triggering of [Ca2+]cyt oscillations by this method was established two decades ago leading to the dogma that [Ca2+]cyt increases are the crucial signal for stomatal closure. However, I found stomatal movement by this method was mainly due to osmotic effects rather than [Ca2+]cyt increases. Fortunately, through this methodology, I found a strong correlation between cytosolic pH and the transport of potassium across the plasma membrane and vacuole existed. The plasma membrane H+-ATPases and H+-coupled K+ transporters were identified as the cause of [H+]cyt changes, both very important aspects in stomata physiology that were not visualized experimentally before. Na+ transport is also important for stomatal regulation and leaves generally since salt can be transported from the root to the shoot. Unlike well-described Ca2+- dependent mechanisms in roots, how leaves process salt stress is not at all understood. I applied salt on protoplasts from leaves, mesophyll cells and guard cells and combined live-cell imaging with Vm recordings to understand the transport and signaling for leaf cells to cope with salt stress. In both, mesophyll and guard cells, NaCl did not trigger Ca2+-signals as described for roots but rather triggered Ca2+ peaks when washing salt out. However, membrane depolarization and pronounced alkalinization were very reliably triggered by NaCl, which could presumably act as a signal for detoxification of high salt concentrations. In line with this, I found the vacuolar cation/H+ antiporter NHX1 to play a role in sodium transport, [H+]cyt homeostasis and the control of membrane potential. Overexpression of AtNHX1 enabled to diminish [H+]cyt changes and resulted in a smaller depolarization responses druing NaCl stress. My results thus demonstrated in contrast to roots, leaf cells do not use Ca2+-dependent signalling cascades to deal with salt stress. I could show Na+ and K+ induced [H+]cyt and Vm responses and Cl- transport to only have a minor impact. Summing all my results up briefly, I uncovered pH signals to play important roles to control pollen tube growth, stomatal movement and leaf detoxification upon salt. My results strongly suggested pH changes might be a more important signal than previously thought to steer diverse processes in plants. Using CapHensor in combination with electrophysiology and bioinformatics tools, I discovered distinct interconnections between [Ca2+]cyt and [H+]cyt in different cell types and distinct [Ca2+]cyt and [H+]cyt signals are initiated through diverse stimuli and environmental cues. The CapHensor will be very useful in the future to further investigate the coordinated role of Ca2+ and pH changes in controlling plant physiology. N2 - Kalziumionen (Ca2+) und Protonen (H+) werden beide als Botenstoffe angesehen, die am Pflanzenwachstum und an Mechanismen zur Stressbewältigung beteiligt sind. In der Pflanzenphysiologie sind H+-Signale jedoch im Vergleich zu Ca2+-Signalen weniger gut untersucht. Die Frage, ob zwischen diesen beiden Botenstoffen Zusammenhänge bestehen, muss noch geklärt werden, da geeignete bildgebende Verfahren zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Ca2+ und H+ Signalen sowie eine genaue bioinformatische Analyse noch entwickelt werden müssen. Um dieses Problem zu überwinden und die Rolle und möglichen Zusammenhang von Ca2+ und H+ Signalen in Pflanzen zu entschlüsseln, wurde ein neuer Biosensor namens CapHensor entwickelt und optimiert, um intrazelluläre Ca2+- und H+-Veränderungen gleichzeitig und ratiometrisch zu untersuchen. Der CapHensor bestand aus einem optimierten grün fluoreszierenden pH-Sensor (PRpHluorin) und einem etablierten rot fluoreszierenden Ca2+-Sensor (R-GECO1), die über eine P2A-Sequenz in einem Konstrukt kombiniert wurden. Eine sogenannte P2A-„self-cleavage site“ zwischen den beiden Sensoren ermöglichte die Expression gleicher Mengen, aber räumlich getrennter Sensoren, was eine artefaktfreie und ratiometrische Darstellung von zellulärem Ca2+ und pH nebeneinander ermöglichte. Die Funktion des CapHensors wurde in Pollenschläuchen verifiziert, da diese einen ständigen Ca2+- und pH-Gradienten aufweisen. Wir stellten fest, dass die Qualität der Bildaufnahmen und das Signal-Rausch-Verhältnis bei der Bildgebung in lebenden Zellen verbessert wurden, wenn zwei R-GECO1-Proteine innerhalb des CapHensor-Konstrukts translational fusioniert wurden. Um eine ausschließliche zytosolische Lokalisierung zu gewährleisten und gemischte Signale aus verschiedenen Kompartimenten zu vermeiden, wurden sogenannte „Nuclear Export Sequence“ (NES) und die „Nuclear Localization Sequence“ (NLS) verwendet, um PRpHluorin und R-GECO1 in unterschiedlichen Kompartimente zu lokalisieren. Nach der Optimierung und Überprüfung seiner Funktionsweise wurde CapHensor erfolgreich in verschiedenen Zelltypen exprimiert, um die Rolle von Ca2+- und H+-Signalen bei der Kontrolle des polaren Wachstums von Pollenschläuchen, die Stomabewegung oder Abwehrmechanismen der Blätter zu untersuchen. Die in der Vergangenheit erzielten Ergebnisse deuten darauf hin, dass sowohl der Ca2+-Gradient als auch der pH-Gradient in Pollenschläuchen eine Rolle beim polaren Wachstum spielen, wobei dem Ca2+-Gradient zum Teil die Hauptrolle zugesprochen wird. Die Rolle und die zeitlicheVI Beziehung zwischen dem Wachstumsprozess und den Veränderungen von Ca2+ und pH sind jedoch noch nicht abschließend geklärt. Mit Hilfe von CapHensor fand ich heraus, dass eine zytosolische Ansäuerung an der Spitze die Wachstumsgeschwindigkeit in N. tabacumPollenschläuchen fördern und eine Alkalisierung die Wachstumsgeschwindigkeit unterdrücken kann, was darauf hindeutet, dass die zytosolische H+-Konzentration ([H+]cyt) trotz der damit einhergehenden Veränderungen der zytosolischen Ca2+-Konzentration ([Ca2+]cyt) eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Pollenschläuchen spielt. Außerdem korrelierte das Wachstum viel besser mit dem [H+]cyt-Verlauf an der Spitze als mit dem Verlauf des [Ca2+]cytSignals. Überraschenderweise hinkten jedoch sowohl die [Ca2+]cyt- als auch die [H+]cytOszillationen an der Spitze den Wachstumsoszillationen um etwa 33 s bzw. 18 s hinterher, so dass die Rolle von [Ca2+]cyt an der Spitze für das Wachstum des Pollenschlauchs neu bewertet werden muss. Die CapHensor-Bildgebung an lebenden Zellen in Kombination mit Elektrophysiologie ergab, dass die oszillierende Membrandepolarisation besser mit den [H+]cyt-Oszillationen an der Spitze korrelierte als mit den [Ca2+]cyt-Oszillationen, was darauf hindeutet, dass [H+]cyt auch eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des elektrogenen Membrantransports spielt. Mit Hilfe des CapHensors und dem gleichzeitigen Auslesen der Zellbewegungen konnte eine präzise zeitliche und räumliche Auflösung der Ereignisse erzielt werden, was auf eine herausragende Rolle von [H+]cyt beim Wachstum der Pollenschlauchspitze hinweist. Für den Einsatz des CapHensors in Blattzellen musste ein spezielles CapHensor-Konstrukt entwickelt werden, das zusätzliche NES-Lokalisierungssequenzen enthielt, um eine Überlappung der Fluoreszenzsignale aus dem Zellkern und dem Zytosol zu vermeiden. Nachdem dies erreicht war, wurde die Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen in Schließzellen, einem gut beschriebenen Einzelzellsystem, untersucht. Veränderungen des zytosolischen pH-Werts wurden bei der Bewegung von Stomata in früheren Studien beschrieben, aber die physiologische Rolle dieser Veränderungen und die Interaktion mit sich verändernden Ca2+-Signalen waren noch unerforscht. Der Einsatz von CapHensor zusammen mit der von mir entwickelten Technik zur parallelen Erfassung der Stomatabewegung hat unser Verständnis der Rolle von Ca2+ und H+ bei der Stomatabewegung erheblich verbessert. Das Phytohormon ABA und der bakterielle Elicitor Flagellin (flg22) sind typische abiotische bzw. biotische Stressfaktoren, die das Schließen der Stomata auslösen. Welche Art von Ca2+- und H+-Signalen in den Schließzellen durch ABA und flg22 ausgelöst werden und in welchem zeitlichen Zusammenhang sie stehen und welche Rolle sieVII für die Bewegung der Stomata spielen, war bisher unbekannt. Bei der durch ABA und flg22 ausgelösten Schließung der Stomata wurde ein Anstieg von [Ca2+]cyt beobachtet, aber die Dynamik von [H+]cyt unterschied sich grundlegend und zeigte eine andere Dynamik. ABA löste eine ausgeprägte zytosolische Alkalisierung aus, die der [Ca2+]cyt-Antwort um 57 s deutlich vorausging, während die Spaltöffnungen erst ca. 205 s danach anfingen zu schliessen. Bei Flg22 ging das Schließen der Spaltöffnungen nur mit einer leichten zytosolischen Alkalisierung einher, aber die Ca2+-Reaktion war im Vergleich zur ABA-Reaktion viel ausgeprägter. Woher die zytosolische Alkalisierung stammt, war unklar, aber in der Vergangenheit wurde spekuliert, dass die Vakuole dazu beiträgt. In dieser Arbeit wurden vakuoläre pH-Änderungen mit Hilfe des Farbstoffs BCECF über die Zeit verfolgt, wobei die Konzentrationsverschiebung in der Vakuole im Grunde genommen genau den umgekehrten Verlauf aufwies als im Zytosol beobachtet. Dies deutet darauf hin, dass die Dynamik des vakuolären pH-Wertes stark an die Änderungen des zytosolischen pHWertes gekoppelt ist. Aus der Literatur ist bekannt, dass reaktive Sauerstoffspezies (ROS) bei der Signalgebung für das Schließen der Stomata eine wichtige Rolle spielen. Als ich jedoch definierte H2O2-Mengen auf die Zellen applizierte, führten nur unphysiologosch hohe H2O2-Konzentrationen (> 200 µM), die zu einem Verlust der Membranintegrität führten, zum Schließen der Stomata. Unerwarteterweise führten physiologische Konzentrationen von ROS zu einer Ansäuerung des Zytosols, die mit der Öffnung der Stomata, aber nicht mit der Schließung der Stomata in Verbindung gebracht wurde. Um die Rolle von [H+]cyt bei der Steuerung der stomatären Bewegung im Detail zu untersuchen, wurden extrazelluläre und intrazelluläre pH-Änderungen in N. tabacumSchließzellen hervorgerufen um deren Verhalten bei pH-Änderungen zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass eine zytosolische Ansäuerung die Öffnung der Stomata stimuliert, während eine zytosolische Alkalisierung die Schließung der Stomata auslöst, begleitet von einem Anstieg von [Ca2+]cyt. Dies beweist, dass die pH-Regulierung ein wichtiger Aspekt der stomatären Bewegung darstellt und auf die Ca2+-Dynamik einwirkt. Bemerkenswert war, dass die zytosolische Alkalisierung und nicht der Ca2+-Anstieg eine entscheidende Rolle bei der Schließung der Stomata zu spielen schien, da eine stärkere zytosolische Alkalisierung trotz eines ähnlichen [Ca2+]cyt - Anstiegs eine stärkere Schließung der Stomata hervorrief. Erhöhungen von [Ca2+]cyt, die in der Vergangenheit als frühes Stomataschließungssignal diskutiert wurden, konnten in meinen Experimenten den Stomataschluß nicht allein auslösen, selbst wenn extrem starke Ca2+-Signale ausgelöst wurden. Was die Interaktion zwischen den beiden Botenstoffen anbelangt, so warenVIII [Ca2+]cyt und [H+]cyt meist negativ miteinander korreliert, was sich von den Pollenschläuchen unterschied, die eine positive Korrelation zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt aufwiesen. Ca2+- Erhöhungen waren immer mit einer Alkalisierung des Zytosols verbunden, und diese Beziehung konnte durch die Anwesenheit von Vanadat, ein H+-Pumpen Blocker blockiert werden, was darauf hindeutet, dass die H+-ATPasen der Plasmamembran zu der negativen Korrelation von [Ca2+]cyt und [H+]cyt beitragen. Im Vergleich zu den CapHensor-Reaktionen bei Schließzellen wurden zytosolische und Zellkern-lokalisierende Versionen von CapHensor in Mesophyllzellen von N. benthamiana, einem von uns untersuchten multizellulären System, exprimiert. Die Reaktionen der Mesophyllzellen auf die gleichen Stimuli wie bei den Schließzellen zeigten, dass ABA und H2O2 keine Veränderungen von [Ca2+]cyt und [H+]cyt hervorrufen, während flg22 einen Anstieg von [Ca2+]cyt und [H+]cyt bewirkt, der sich von der Reaktion in Schließzellen unterscheidet. Damit konnte ich eindeutig nachweisen, dass Schließ- und Mesophyllzellen in Bezug auf [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Änderungen sehr unterschiedlich auf dieselben Stimuli reagieren, ein Konzept, das zwar schon früher vorgeschlagen, aber noch nie so detailliert für Pflanzen nachgewiesen wurde. Ein Phänomen, das seit langem in Schließzellen beobachtet wird, dessen Funktion oder Ursache aber noch nicht verstanden ist, sind regelmäßige Ca2+-Oszillationen, die spontan auftreten. Interessanterweise wurden zwei Populationen von oszillierenden Schließzellen anhand ihrer [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Phasenbeziehung identifiziert. Bei etwa der Hälfte der oszillierenden Zellen gingen die [H+]cyt-Oszillationen den [Ca2+]cyt-Oszillationen voraus, während in der anderen Hälfte der Schließzellenpopulation [Ca2+]cyt das vorangehende Signal war. Auffallend ist, dass die natürlichen [H+]cyt-Oszillationen durch ABA gedämpft wurden, nicht aber durch flg22. Dieser Effekt lässt sich gut durch die Dämpfung der vakuolären H+-Oszillationen in Gegenwart von ABA erklären, aber nicht durch flg22, das ich mit BCECF sichtbar gemacht habe. Es zeigte sich, dass sowohl der vakuoläre pH-Wert zu spontanen [H+]cyt-Oszillationen beiträgt als auch, dass ABA, nicht aber flg22, den Zusammenhang der natürlichen [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale blockieren kann. Um die Rolle der [Ca2+]cyt-Oszillationen bei der Bewegung der Stomata zu untersuchen, wurden Lösungen mit hohen und niedrigen KCl-Konzentrationen verwendet, um [Ca2+]cyt-Oszillationen auszulösen. Das Auslösen von Ca2+-Oszillationen nach dieser Methode wurde in Studien vor zwei Jahrzehnten etabliert, und die Ergebniss daraus haben zu dem Dogma geführt, dass der Anstieg von [Ca2+]cyt das entscheidende Signal für die Schließung von Stomata ist. Ich habe jedoch herausgefunden, dass die Bewegung der Stomata mit dieser Methode hauptsächlich auf osmotischeIX Effekte und nicht auf die Auswirkungen der [Ca2+]cyt-Erhöhungen zurückzuführen waren. Glücklicherweise fand ich mit dieser Methode heraus, dass es eine starke Korrelation zwischen dem zytosolischen pH-Wert und dem Kaliumtransport über die Plasmamembran und die Vakuole gibt. Die H+-ATPasen der Plasmamembran und die H+-gekoppelten K+-Transporter wurden als Ursache für die pH-Änderungen identifiziert, beides sehr wichtige Aspekte in der Stomaphysiologie, die zuvor nicht experimentell sichtbar gemacht werden konnten. Der Transport von Natriumionen (Na+) ist für die Regulierung der Stomata und der Adaption von Blättern bei Salzstress wichtig, da Salz von der Wurzel zum Spross transportiert werden kann. Im Gegensatz zu den gut beschriebenen Ca2+-abhängigen Na+-Transportmechanismen in den Wurzeln ist überhaupt nicht bekannt, wie Blätter Salzstress verarbeiten. Ich habe Salz auf Protoplasten von Blättern, Mesophyllzellen und Schießzellen appliziert und „Live-Cell-Imaging“ mit Aufzeichnungen der Membranspannung kombiniert, um den Transport und die Signalreizweiterleitung bei Salzstress in Blättern zu verstehen. Sowohl in Mesophyll- als auch in Schließzellen löste NaCl keine Ca2+-Signale aus, wie sie für Wurzeln beschrieben wurden, sondern führte beim Auswaschen von Salz zu [Ca2+]cyt-Transienten. Eine Membrandepolarisation und eine ausgeprägte Alkalisierung wurden jedoch sehr zuverlässig durch NaCl ausgelöst, was vermutlich als Signal für die Entgiftung von hohen Salzkonzentrationen dienen könnte. Im Einklang damit konnte ich zeigen, dass der vakuoläre Kationen/H+-Antiporter NHX1 eine Rolle beim Natriumtransport, der zytosolischen pH-Homöostase und der Kontrolle des Membranpotenzials spielt. Die Überexpression von AtNHX1 ermöglichte es, [H+]cyt-Veränderungen zu vermindern und führte zu einer geringeren Depolarisationsreaktion unter NaCl-Stress. Meine Ergebnisse zeigen somit, dass Blattzellen im Gegensatz zu Wurzeln keine Ca2+-abhängigen Signalkaskaden nutzen, um mit Salzstress umzugehen, und ich konnte zeigen, dass Na+ und K+ die [H+]cyt- und Membranspannungs-Reaktionen auslöst und der Cl--Transport nur einen geringen Einfluss hat. Zusammenfassend habe ich festgestellt, dass pH-Signale eine wichtige Rolle bei der Kontrolle des Wachstums von Pollenschläuchen spielen, sowie bei der Bewegung der Stomata und der Entgiftung der Blätter durch Salz beteiligt sind. Meine Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass pH-Änderungen ein wichtigeres Signal für die Steuerung verschiedener Prozesse in Pflanzen sein könnten als bisher angenommen. Durch den Einsatz des CapHensors in Kombination mit elektrophysiologischen und bioinformatischen Methoden konnte ich feststellen, dass in verschiedenen Zelltypen unterschiedliche Zusammenhänge zwischen [Ca2+]cyt und [H+]cyt bestehenX und dass unterschiedliche [Ca2+]cyt- und [H+]cyt-Signale durch verschiedene Stimuli und Umweltreize ausgelöst werden. Der CapHensor wird in Zukunft sehr nützlich sein, um die koordinierte Rolle von Ca2+- und pH-Änderungen bei der Steuerung der Pflanzenphysiologie weiter zu untersuchen. KW - Calcium KW - pH KW - live-cell imaging KW - pollen tubes KW - guard cells KW - mesophyll cells KW - Pflanzen KW - Biosensor KW - Bilderzeugung Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-249736 ER - TY - JOUR A1 - Li, Kunkun A1 - Prada, Juan A1 - Damineli, Daniel S. C. A1 - Liese, Anja A1 - Romeis, Tina A1 - Dandekar, Thomas A1 - Feijó, José A. A1 - Hedrich, Rainer A1 - Konrad, Kai Robert T1 - An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca\(^{2+}\) and H\(^{+}\) reveals new insights into ion signaling in plants JF - New Phytologist N2 - Whereas the role of calcium ions (Ca\(^{2+}\)) in plant signaling is well studied, the physiological significance of pH‐changes remains largely undefined. Here we developed CapHensor, an optimized dual‐reporter for simultaneous Ca\(^{2+}\) and pH ratio‐imaging and studied signaling events in pollen tubes (PTs), guard cells (GCs), and mesophyll cells (MCs). Monitoring spatio‐temporal relationships between membrane voltage, Ca\(^{2+}\)‐ and pH‐dynamics revealed interconnections previously not described. In tobacco PTs, we demonstrated Ca\(^{2+}\)‐dynamics lag behind pH‐dynamics during oscillatory growth, and pH correlates more with growth than Ca\(^{2+}\). In GCs, we demonstrated abscisic acid (ABA) to initiate stomatal closure via rapid cytosolic alkalization followed by Ca2+ elevation. Preventing the alkalization blocked GC ABA‐responses and even opened stomata in the presence of ABA, disclosing an important pH‐dependent GC signaling node. In MCs, a flg22‐induced membrane depolarization preceded Ca2+‐increases and cytosolic acidification by c. 2 min, suggesting a Ca\(^{2+}\)/pH‐independent early pathogen signaling step. Imaging Ca2+ and pH resolved similar cytosol and nuclear signals and demonstrated flg22, but not ABA and hydrogen peroxide to initiate rapid membrane voltage‐, Ca\(^{2+}\)‐ and pH‐responses. We propose close interrelation in Ca\(^{2+}\)‐ and pH‐signaling that is cell type‐ and stimulus‐specific and the pH having crucial roles in regulating PT growth and stomata movement. KW - abscisic acid (ABA) KW - calcium KW - flg22 KW - guard cells KW - imaging KW - ion signaling KW - pH KW - pollen tube Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-239847 VL - 230 IS - 6 SP - 2292 EP - 2310 ER - TY - THES A1 - Karimi, Sohail Mehmood T1 - A Comparative Study on Guard Cell Function of the Glycophyte \(Arabidopsis\) \(thaliana\) and the Halophyte \(Thellungiella\) \(salsuginea\) Under Saline Growth Conditions T1 - Eine vergleichende Studie zur Schließzellfunktion des Glycophyten \(Arabidopsis\) \(thaliana\) und des Halophyten \(Thellungiella\) \(salsuginea\) unter salinen Wachstumsbedingungen N2 - The greatest problems faced during the 21st century is climate change which is a big threat to food security due to increasing number of people. The increase in extreme weather events, such as drought and heat, makes it difficult to cultivate conventional crops that are not stress tolerant. As a result, increasing irrigation of arable land leads to additional salinization of soils with plant-toxic sodium and chloride ions. Knowledge about the adaptation strategies of salt-tolerant plants to salt stress as well as detailed knowledge about the control of transpiration water loss of these plants are therefore important to guarantee productive agriculture in the future. In the present study, I have characterized salt sensitive and salt tolerant plant species at physiological, phenotypic and transcriptomic level under short (1x salt) and long-time (3x) saline growth conditions. Two approaches used for long-time saline growth conditions (i.e increasing saline conditions (3x salt) and constant high saline conditions (3x 200 mM salt) were successfully developed in the natural plant growth medium i.e soil. Salt sensitive plants, A. thaliana, were able to survive and successfully set seeds at the toxic concentrations on the increasing saline growth mediums, with minor changes in the phenotype. However, under constant high saline conditions they could not survive. This was due to keeping low potassium, and high salt ions (sodium and chloride) in the photosynthetic tissue i.e leaf. Similarly, high potassium and low salt ions in salt tolerant T. salsuginea on both saline environments were the key for survival of this plant species. Being salt tolerant, T. salsuginea always kept high potassium levels and low sodium (during 1x) and chloride levels (during both 1x and 3x) in the leaf tissue. A strict control over transpirational water loss via stomata (formed by pair of guard cells) is important to maintain plant water balance. Aperture size of the stomata is regulated by the turgidity of the guard cells. More turgid the guard cells, bigger the apertures are and hence more transpiration. Under osmotic stress, the water loss is reduced which was evident in the salt sensitive A. thaliana plants under both short and long-time saline growth conditions. As the osmotic stress was only increased during long time saline growth conditions in T. salsuginea therefore, water loss was also decreased only under these saline conditions. Environmental CO2 assimilation also takes place via stomata in plants which then is used for photosynthesis. Stomatal apertures also influence CO2 assimilation. As the light absorbing photosynthetic pigments were more affected in A. thaliana, therefore photosynthetic activity of the whole plant was also reduced. Similarly, both short and long-time saline growth conditions also reduced the effective quantum yield of A. thaliana guard cells. Growth of the plant is dependent on energy which comes from photosynthesis. Reduced environmental CO2 assimilation would affect photosynthesis and hence growth, which was clearly observed in A. thaliana guard cells under long-time saline growth conditions. Major differences in both guard cells types were observed in their chloride and potassium levels. Energy Dispersive X-Ray Analysis (EDXA) suggested strict control of chloride accumulation in T. salsuginea guard cells as the levels remain unchanged under all conditions. Similarly, use of sodium in place of potassium for osmotic adjustments seems to be dependent on Na+/K+ rations in both guard cell types. Increased salt ions and reduced potassium levels in A. thaliana guard cells posed negative effect on photochemistry which in turn increased ROS metabolism and reduced energy related pathways at transcriptomic level in this plant species. Moreover, photosynthesis was strongly affected in A. thaliana guard cells both at transcriptomic and physiological levels. Similarly, global phytohormones induced changes were more evident in A. thaliana guard cells especially on 3x salt medium. Among all phytohormones, genes under the control of auxin were more differentially expressed in A. thaliana guard cells which suggests wide changes in growth and development in this plant species under salinity. Phytohormone, ABA is vital for closing the stomata under abiotic stress conditions. Increased levels of ABA during saline conditions led to efflux of potassium and counter anions (chloride, malate, nitrate) from the guard cells which caused the outward flow of water and hence reduction in turgor pressure. Reduced turgor pressure led to reduced water loss and CO2 assimilation especially in A. thaliana. Guard cells of both plant species synthesized ABA during saline conditions which was reflected from transcriptomic data and ABA quantification in the guard cells. ABA induced signaling in both plant species varied at the ABA receptor (PYL/PYR) levels where totally contrasting responses were observed. PYL2, PYL8 and PYL9 were specific to A. thaliana, furthermore, PYL2 was found to be differentially expressed only under 3x salt growth conditions thus suggesting its role during long term salt stress in this plant species. Protein phosphatases, which negatively regulate ABA signaling on one hand and act as ABA sensor on the other hand were found to be more differentially expressed in A. thaliana than T. salsuginea guard cells, which suggests their diverse role in both plant species under saline conditions. Differential expression of more ABA signaling players in long time saline conditions was prominent which could be because of darkness, as it is well known that rapid closure of stomata under dark conditions require ABA signaling. Moreover, representation of these components in dark also suggests that plants become more sensitive to dark under saline conditions which is also evident from the transpiration rates. Altogether, increased salt ions in A. thaliana guard cells and leaves led to pigment degradation and ABA induced reduction in transpiration which in turn influenced its growth. In contrast, T. salsuginea is the salt excluder and therefore keeps low levels of salt ions especially the chloride both in leaves and guard cells which mildly affects its growth. Guard cells of A. thaliana encounter severe energy problems at physiological and transcriptomic level. Main differences in the ABA signalling between both plant species were observed at the ABA receptor level. N2 - Das größte Problem des 21. Jahrhunderts ist der Klimawandel, der aufgrund der wachsenden Zahl von Menschen eine große Bedrohung für die Ernährungssicherheit darstellt. Die Zunahme extremer Wetterereignisse wie Dürre und Hitze erschwert den Anbau konventioneller, nicht stressresistenter Pflanzen. Eine zunehmende Bewässerung von Ackerland führt daher zu einer zusätzlichen Versalzung der Böden mit pflanzentoxischen Natrium- und Chloridionen. Kenntnisse über die Anpassungsstrategien salztoleranter Pflanzen an Salzstress sowie detaillierte Kenntnisse über die Kontrolle des Wasserverlusts durch Transpiration dieser Pflanzen sind daher wichtig, um eine produktive Landwirtschaft auch in Zukunft zu gewährleisten. In der vorliegenden Studie habe ich salzempfindliche und salztolerante Pflanzenarten auf physiologischer, phänotypischer und transkriptioneller Ebene unter kurzen (1x Salz) und langen (3x) Salzwachstumsbedingungen charakterisiert. In dem natürlichen Pflanzenwachstumsmedium, dh. dem Boden, wurden zwei Ansätze erfolgreich entwickelt, die für lang anhaltende Salzwachstumsbedingungen (dh zunehmende Salzbedingungen (3x Salz) und konstant hohe Salzbedingungen (3x 200 mM Salz) verwendet wurden. Die Pflanzen waren in der Lage, Samen bei den toxischen Konzentrationen auf den ansteigenden Salzwachstumsmedien zu überleben und erfolgreich zu setzen, wobei geringfügige Änderungen des Phänotyps auftraten. Unter konstant hohen Salzbedingungen konnten sie jedoch nicht überleben. Dies lag daran, dass wenig Kalium und hohe Salzionen vorhanden waren (Natrium und Chlorid) im photosynthetischen Gewebe, dh im Blatt. Ebenso stellten hohe Kalium- und niedrige Salzionen in salztoleranten T. salsuginea in beiden salzhaltigen Umgebungen den Schlüssel zum Überleben dieser Pflanzenart dar. Da T. salsuginea salztolerant war, blieb der Kaliumspiegel stets hoch und der Natrium- (während 1x) und Chloridspiegel (während 1x und 3x) im Blattgewebe niedrig. Eine strikte Kontrolle des transpirationelen Wasserverlusts über Stomata (gebildet von zwei Schließzellen) ist wichtig, um den Wasserhaushalt der Pflanzen aufrechtzuerhalten. Die Öffnungsgröße der Stomata wird durch den Turgor der Schutzzellen reguliert. Je praller die Schließzellen, desto größer die Öffnungen und damit die Transpiration. Unter osmotischem Stress wird der Wasserverlust verringert, was bei den salzempfindlichen A. thaliana-Pflanzen sowohl unter kurz- als auch langfristigen Salzwachstumsbedingungen offensichtlich war. Da der osmotische Stress in T. salsuginea nur über einen langen Zeitraum unter Salzwachstumsbedingungen anstieg, verringerte sich auch der Wasserverlust nur unter diesen Salzbedingungen. Die Aufnahme von CO2 in die Umwelt erfolgt auch über die Stomata und wird dann für die Photosynthese verwendet. Stomata beeinflussen daher auch die CO2-Assimilation. Da die lichtabsorbierenden photosynthetischen Pigmente in A. thaliana stärker betroffen waren, war auch die photosynthetische Aktivität der gesamten Pflanze verringert. In ähnlicher Weise verringerten sowohl kurz- als auch langzeitige Salzwachstumsbedingungen auch die effektive Quantenausbeute von A. thaliana-Schließzellen. Das Wachstum der Pflanze hängt von der Energie ab, die aus der Photosynthese stammt. Eine verringerte CO2-Assimilation aus der Umwelt würde die Photosynthese und damit das Wachstum beeinträchtigen, was bei A. thaliana-Schließzellenn unter lang andauerenden Salzwachstumsbedingungen deutlich zu beobachten war. Wesentliche Unterschiede bei beiden Schließzelltypen wurden in ihren Chlorid- und Kaliumspiegeln beobachtet. Die energiedispersive Röntgenanalyse (EDXA) ergab eine strikte Kontrolle der Chloridakkumulation in T. salsuginea Schließzellen, da die Chloridkonzentrationen unter allen Bedingungen unverändert bleiben. In ähnlicher Weise scheint die Verwendung von Natrium anstelle von Kalium für osmotische Anpassungen von Na + / K + -Verhältnissen in beiden Schließzelltypen abhängig zu sein. Erhöhte Salzionen und verringerte Kaliumspiegel in A. thaliana-Schließzellen wirkten sich negativ auf die Photochemie aus, was wiederum den ROS-Metabolismus erhöhte und die energiebezogenen Wege auf transkriptomischem Niveau bei dieser Pflanzenart verringerte. Darüber hinaus war die Photosynthese in A. thaliana-Schließzellen sowohl auf transkriptioneller als auch auf physiologischer Ebene stark beeinträchtigt. In ähnlicher Weise waren globale Phytohormon-induzierte Veränderungen in A. thaliana-Schließzellen, insbesondere auf 3 × Salzmedium, deutlicher. Unter allen Phytohormonen wurden Gene unter der Kontrolle von Auxin in A. thaliana-Schließzellen differenzierter exprimiert, was auf weitreichende Veränderungen im Wachstum und in der Entwicklung dieser Pflanzenart unter Salzgehalt hindeutet. Das Phytohormon ABA ist für das Schließen der Stomata unter abiotischen Stressbedingungen von entscheidender Bedeutung. Erhöhte ABA-Spiegel unter Salzbedingungen führten zum Austritt von Kalium und Gegenanionen (Chlorid, Malat, Nitrat) aus den Schließzellen, was den Wasserfluss nach außen und damit eine Verringerung des Turgordrucks bewirkte. Reduzierter Turgordruck führte insbesondere bei A. thaliana zu einem geringeren Wasserverlust und einer geringeren CO2-Aufnahme. Die Schließzellen beider Pflanzenarten synthetisierten ABA unter Salzbedingungen, was sich aus den Transkriptomdaten und der ABA-Quantifizierung in den Schließzellen widerspiegelte. Die ABA-induzierte Signalübertragung in beiden Pflanzenarten variierte bei den ABA-Rezeptor- (PYL / PYR-) Spiegeln, bei denen völlig unterschiedliche Reaktionen beobachtet wurden. PYL2, PYL8 und PYL9 waren spezifisch für A. thaliana. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass PYL2 nur unter dreifachen Salzwachstumsbedingungen unterschiedlich exprimiert wird, was auf seine Rolle bei langfristigem Salzstress bei dieser Pflanzenart hindeutet. Es wurde gefunden, dass Proteinphosphatasen, die einerseits die ABA-Signalübertragung negativ regulieren und andererseits als ABA-Sensor wirken, in A. thaliana differenzierter exprimiert werden als in T. salsuginea-Schließzellen, was auf ihre vielfältige Rolle in beiden Pflanzenarten unter Salzbedingungen hindeutet. Eine differenzierte Expression von mehr ABA-Signalgebern unter Bedingungen mit langer Salzwasserbewässerung war auffällig, was auf Dunkelheit zurückzuführen sein könnte, da bekanntlich ein schnelles Schließen der Stomata unter dunklen Bedingungen eine ABA-Signalgebung erfordert. Darüber hinaus deutet die Darstellung dieser Komponenten im Dunkeln auch darauf hin, dass Pflanzen unter salzhaltigen Bedingungen empfindlicher gegenüber Dunkelheit werden, was auch aus den Transpirationsraten hervorgeht. Insgesamt führten erhöhte Salzionen in A. thaliana-Schließzzellen und Blättern zu einem Pigmentabbau und einer durch ABA verursachten Reduktion der Transpiration, was deren Wachstum beeinflusste. Im Gegensatz dazu ist T. salsuginea in der Lage Salz auszuschließen und hält daher geringe Mengen an Salzionen, insbesondere das Chlorid sowohl in Blättern als auch in Schließzellen, dass sein Wachstum geringfügig beeinflusst. Schließzellen von A. thaliana stoßen auf physiologischer und transkriptomischer Ebene auf schwerwiegende Energieprobleme. Hauptunterschiede in der ABA-Signalgebung zwischen beiden Pflanzenarten wurden auf der ABA-Rezeptorebene beobachtet. KW - Glycophyten KW - Halophyten KW - salinen Wachstumsbedingungen KW - Schließzellfunktion KW - Transkriptomik anlyze KW - Halophytes KW - glycophytes KW - salt stress KW - guard cells KW - transcriptomic analysis Y1 - 2021 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-190942 ER -