TY - THES A1 - Sbiera, Iuliu T1 - Possible role of epithelial to mesenchymal transition and its associated FGF/FGFR pathway in adrenocortical carcinoma T1 - Mögliche Rolle des epithelial-mesenchymalen Transition und des damit verbundenen FGF/FGFR-Signalwegs beim Nebennierenrindenkarzinom N2 - Recent studies have hinted to an involvement of epithelial to mesenchymal transition, a mechanism often associated with metastasis in epithelial cancers, in adrenocortical carcinoma. In addition, the knowledge about the FGF/FGFR pathway in pathogenesis of the adrenal gland, a pathway often associated with the epithelial to mesenchymal transition, is sparse and fragmented. We assessed, in a large number of normal, benign and malignant adrenocortical tissues (a total of 181 different samples), the expression of canonical and novel epithelial and mesenchymal markers and compared it with their expression in typical epithelial and mesenchymal tissues. In addition, we also quantified the expression of most members of the FGF/FGFR pathway in adrenocortical tissues and compared it against well-studied epithelial and mesenchymal tissues as well as between malignant and not malignant adrenocortical tissues, in order to assess the possible connection to epithelial to mesenchymal transition and find possible drug targets. Surprisingly, both normal and neoplastic adrenocortical tissues lacked expression of epithelial markers (e.g. E-Cadhering or EpCAM) but strongly expressed mesenchymal markers (e.g. N-Cadherin or SLUG), suggesting a higher similarity of adrenocortical tissues to mesenchymal compared to epithelial tissues, reminiscent of the adrenocortical origin from the intermediate mesoderm. Despite their ubiquitous expression in all adrenocortical tissues, mesenchymal markers had a variable expression in adrenocortical carcinoma, associating either directly or inversely with different clinical markers of tumor aggressiveness. Lymph node infiltration was associated with high expression of SLUG (p = 0.04), and at the same time low expression of N-cadherin (p = 0.001), and the same pattern was observed for venous infiltration of tumoral tissue, Weiss score of tumor malignancy or Ki67 proliferation marker. In malignant compared to benign adrenal tumors, we found significant differences in the expression of 16 out of the 94 studied FGF receptor pathway related genes. Genes involved in tissue differentiation and metastatic spread through epithelial to mesenchymal transition were most strongly altered. The therapeutically targetable FGF receptors 1 and 4 were upregulated 4.6- and 6-fold, respectively, in malignant compared to benign adrenocortical tumors, which was confirmed by using two different quantification methods in both frozen and paraffin embedded tissue material. High expression of FGFR1 and 4 was significantly associated with worse patient prognosis (High FGFR1 expression was associated with a shorter overall patient survival of 84 vs 148 months (HR=1.8, 95% CI: 1.01-3.25) as well as a shorter resection free survival of 25 vs 75 months ((HR=2.93, 95% CI: 1.25-6.84), while high FGFR4 was associated with a much shorter overall survival of 50 vs 155 months (HR=2.44, 95% CI: 1.41-4.22). In conclusion, epithelial to mesenchymal transition does not seem to play a role in adrenocortical carcinoma tumor progression, and the FGF/FGFR pathway, even if it is probably not related to EMT, is nonetheless associated with tumor aggressiveness. Furthermore, quantification of FGF receptors may enable a stratification of adrenocortical carcinoma for the use of FGFR inhibitors in future clinical trials. N2 - Jüngste Studien weisen auf eine Beteiligung der epithelial-mesenchymalen Transition, ein Mechanismus der oft mit Metastasen bei Epithelkarzinomen assoziiert ist, beim Nebennierenrindenkarzinom hin. Darüber hinaus gibt es kaum Kenntnisse über die Rolle des FGF/FGFR-Signalweges in der Pathogenese der Nebenniere, ein Signalweg, der oft mit der epithelial-mesenchymalen Transition in Verbindung gebracht wird. Wir haben hier an einer großen Anzahl von normalen, gutartigen und bösartigen Nebennierenrindengewebeproben (insgesamt 181 Proben) die Expression von kanonischen und anderen epithelialen und mesenchymalen Markern untersucht und mit ihrer Expression in typischen epithelialen und mesenchymalen Geweben verglichen. Darüber hinaus, haben wir auch die Expression der meisten Mitglieder des FGF/FGFR-Signalwegs in Nebennierenrindengeweben quantifiziert und mit gut definierten epithelialen und mesenchymalen Geweben verglichen sowie zwischen bösartigen und nicht bösartigen Nebennierenrindengeweben, um die mögliche Verbindung zu epithelialer-mesenchymaler Transition zu finden und mögliche therapeutische Ziele zu identifizieren. Überraschenderweise konnte weder in normalem noch in neoplastischem Nebennierenrindengewebe die Expression von epithelialen Markern (z. B. E-Cadherin oder EpCAM) nachgewiesen werden. In beiden Geweben wurde aber eine starke Expression mesenchymaler Marker (z. B. N-Cadherin oder SLUG) gefunden, was auf eine größere Ähnlichkeit von Nebennierenrindengeweben zu mesenchymalen im Vergleich zu epithelialen Geweben hindeutet. Dies könnte mit der Entwicklung des Nebennierenrinden-gewebes aus dem intermediären Mesoderm erklärt werden. Trotz ihrer ubiquitären Expression in allen Nebennierenrindengeweben, hatten mesenchymale Marker eine variable Expression in Nebennierenrindenkarzinomen, die entweder direkt oder indirekt mit verschiedenen klinischen Markern der Tumoraggressivität assoziiert waren. Die Lymphknoteninfiltration war mit einer hohen Expression von SLUG (p = 0,04) und einer niedrigen Expression von N-Cadherin (p = 0,001) verbunden. Das gleiche Muster wurde für die venöse Infiltration von Tumorgewebe, dem Weiss-Score oder dem Ki67-Proliferationsmarker beobachtet. Signifikante Unterschiede in der Expression von 16 der 94 untersuchten Gene, die mit dem FGF-Rezeptorsignalweg in Verbindung stehen, wurden beim Vergleich von bösartigen und gutartigen Nebennierentumoren gefunden. Gene, die an der Gewebedifferenzierung und Metastasierung durch epithelial-mesenchymale Transition beteiligt sind, waren dabei am stärksten verändert. Die therapeutisch relevante FGF-Rezeptoren 1 und 4 waren bei malignen im Vergleich zu gutartigen Nebennierenrindentumoren 4,6- bzw. 6,0-fach hochreguliert. Dies wurde durch Verwendung zweier unabhängiger Quantifizierungsmethoden sowohl in gefrorenem als auch in paraffineingebettetem Gewebematerial bestätigt. Eine hohe Expression von FGFR1 und 4 war signifikant mit einer schlechteren Prognose verbunden. Eine hohe FGFR1-Expression war mit einem kürzeren Gesamtüberleben der Patienten von 84 vs. 148 Monaten (HR = 1,8; 95%CI: 1,01-3,25) sowie einem kürzeren resektions-freien Überleben von 25 vs. 75 Monaten (HR = 2,93; 95%CI: 1,25-6,84) verbunden, während eine höhere FGFR4-Expression mit einem viel kürzeren Gesamtüberleben von 50 vs. 155 Monaten assoziiert war (HR = 2,44; 95%CI: 1,41-4.22)). Zusammenfassend lässt sich sagen, dass der Mechanismus der epithelial-mesenchymalen Transition keine Rolle bei der Tumorprogression des Nebennierenrindenkarzinoms zu spielen schein. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass der FGF/FGFR-Signalweg, auch wenn er wahrscheinlich nicht mit der EMT zusammenhängt, mit der Aggressivität der Tumoren assoziiert. Die Untersuchung der Expression der FGF-Rezeptoren könnte für die Stratifizierung des Nebennierenrindenkarzinoms, zwecks Verwendung von FGFR-Inhibitoren in zukünftigen klinischen Studien, benutzt werden. KW - Nebennierenrindenkrebs KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - adrenocortical carcinoma KW - epithelial to mesenchymal transition KW - fibroblast growth factors Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-277454 ER - TY - THES A1 - Le Blanc Soto, Solange T1 - Role of FGF signaling in the adipogenic and osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells in a three-dimensional \(in\) \(vitro\) model T1 - Rolle der FGF-Signalgebung bei der adipogenen und osteogenen Differenzierung von humanen Knochenmarkstromazellen in einem dreidimensionalen \(in\) \(vitro\) Modell N2 - Adult human skeletal stem cells are considered to give rise to the bone marrow stromal compartment, including bone-forming osteoblasts and marrow adipocytes. Reduced osteogenesis and enhanced adipogenesis of these skeletal progenitors may contribute to the bone loss and marrow fat accumulation observed during aging and osteoporosis, the main disorder of bone remodeling. Concordantly, in vitro evidence indicates that adipogenic and osteogenic differentiation of human bone marrow stromal cells (hBMSCs) display an inverse relationship under numerous conditions. Hence, the identification of factors modulating inversely both differentiation pathways is of great therapeutic interest. Based on mRNA expression analysis of inversely regulated genes after switching differentiation conditions, our group had previously proposed that fibroblast growth factor 1 (FGF1) might play such a modulator role in hBMSC differentiation. The main aim of this work was, therefore, to investigate the role of FGF1 signaling in the adipogenic and osteogenic differentiation of hBMSCs using a three-dimensional (3D) culture system based on collagen type I hydrogels in order to better mimic the natural microenvironment. Adipogenic and osteogenic differentiation of hBMSCs embedded in collagen gels was successfully established. Treatment with recombinant human FGF1 (rhFGF1), as well as rhFGF2, throughout differentiation induction was found to exert a dose-dependent inhibitory effect on adipogenesis in hBMSCs. This inhibitory effect was found to be reversible and dependent on FGF receptors (FGFR) signaling, given that simultaneous pharmacological blockage of FGFRs rescued adipogenic differentiation. Additionally, matrix mineralization under osteogenic induction was also inhibited by rhFGF1 and rhFGF2 in a dose-dependent manner. A transient treatment with rhFGF1 and rhFGF2 during an expansion phase, however, enhanced proliferation of hBMSCs without affecting the differentiation capacity, although matrix mineralization under osteogenic conditions was hindered. Additionally, rhFGF1 and rhFGF2 treatments affected the matrix remodeling ability of hBMSCs, which displayed alterations in the cytoskeletal phenotype and the expression patterns of matrix metalloproteinases (MMPs) and tissue inhibitors of metalloproteinases (TIMPs). On the other hand, inhibition of FGFR signaling throughout differentiation induction elicited a strong enhancement of matrix mineralization under osteogenic conditions but had no significant effect on adipocyte formation under adipogenic induction. IX In conclusion, FGF1 and FGF2 signaling was found to support the expansion of bone marrow stromal precursors with adipogenic and osteogenic capacities, to hinder adipogenic and osteogenic differentiation if continuously present during differentiation induction and to alter the matrix remodeling ability of hBMSCs within a 3D collagenous microenvironment. N2 - Es wird angenommen, dass humane adulte skelettale Stammzellen das Knochenmarkstroma, einschliesslich der knochenbildenden Osteoblasten und den Knochenmark-Adipozyten bilden. Eine verringerte Osteogenese und eine erhöhte Adipogenese dieser skelettalen Vorläufer kann zu einem Knochenverlust und zu einer Verfettung des Knochenmarks beitragen, was während der Alterung und der Osteoporose, der Hauptstörung des Knochenumbaus, beobachtet wird. Übereinstimmend dazu konnte in einem in vitro Nachweis gezeigt werden, dass sich die adipogene und osteogene Differenzierung von humanen Knochenmarkstromazellen (hBMSCs) unter einer Vielzahl von Bedingungen invers verhält. Somit ist die Identifikation von Faktoren, welche beide Differenzierungssignalwege invers regulieren, von großem therapeutischem Interesse. Basierend auf mRNA Expressionsanalysen von Genen, die nach Änderung der Differenzierungsbedingungen invers reguliert wurden, hat unsere Gruppe bereits seit längerem angenommen, dass der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) eine solche Regulatorfunktion in der hBMSC Differenzierung einnehmen könnte. Das Hauptziel dieser Arbeit war deshalb die Rolle der FGF1 Signalgebung in der adipogenen und osteogenen Differenzierung von hBMSCs zu untersuchen. Dies erfolgte unter Einsatz von einem dreidimensionalen (3D) Kultursystem basierend auf Kollagen-Typ I-Hydrogelen um die natürliche Mikroumgebung besser imitieren zu können. Die adipogene und osteogene Differenzierung von in Kollagengelen eingebetteten hBMSCs konnte erfolgreich etabliert werden. Die Behandlung mit rekombinantem humanen FGF1 (rhFGF1), sowie mit rhFGF2, während der Differenzierungsinduktion führte zu einem dosisabhängigen hemmenden Effekt auf die Adipogenese in den hBMSCs. Dieser inhibierende Effekt ist reversibel und abhängig von Signalgebung der FGF Rezeptoren (FGFRs), da die gleichzeitige pharmakologische Blockierung von FGFRs die adipogene Differenzierung wiederhergestellt hatte. Zusätzlich wurde auch die Matrixmineralisierung durch rhFGF1 und rhFGF2 Gabe während der osteogenen Induktion in dosisabhängiger Weise inhibiert. Eine vorrübergehende Behandlung mit rhFGF1 und rhFGF2 während der Expansionsphase jedoch erhöhte die Proliferation von hBMSCs ohne die Differenzierungskapazität zu beeinflussen, obwohl die Matrixmineralisierung unter osteogenen Bedingungen verhindert wurde. Zudem beinflussten die Behandlungen mit rhFGF1 und rhFGF2 die Fähigkeit von hBMSCs die Matrix umzubauen, was sich durch phänotypische Veränderungen des Zytoskeletts und in einem veränderten Expressionsmuster von Metalloproteinasen (MMPs) und Gewebeinhibitoren von Metalloproteinasen (TIMPs) zeigte. XI Andererseits löste die Inhibition der FGFR Signalgebung während der Differenzierungsinduktion eine deutliche Zunahme der Matrixmineralisierung unter osteogenen Bedingungen aus, zeigte aber keinen signifikanten Effekt auf die Bildung von Adipozyten bei adipogener Induktion. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die FGF1 und FGF2 Signalgebung die Expansion von Vorläufern des Knochenmarkstroma mit adipogenen und osteogenen Kapazitäten unterstützt, deren Differenzierung hemmt bei kontinuierlicher Gabe während der Differenzierungsinduktion gegeben wird und die Fähigkeit des Matrixumbaus von hBMSCs innerhalb einer kollagenen 3D Mikroumgebung verändert. KW - Bone marrow stromal cell KW - Adipogenesis KW - Osteogenesis KW - Collagen gels KW - Fettzelle KW - Knochenbildung KW - Knochenmarkzelle KW - Fibroblastenwachstumsfaktor Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-147659 ER - TY - THES A1 - Simann, Meike T1 - Aufklärung der Effekte von Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 und 2 auf die Adipogenese und Osteogenese von primären humanen Knochenmark-Stroma-Zellen T1 - Elucidation of fibroblast growth factor 1 and 2 effects on the adipogenesis and osteogenesis of primary human bone marrow stromal cells N2 - Regulating and reverting the adipo-osteogenic lineage decision of trabecular human bone marrow stromal cells (hBMSCs) represents a promising approach for osteoporosis therapy and prevention. Fibroblast growth factor 1 (FGF1) and its subfamily member FGF2 were scored as lead candidates to exercise control over lineage switching processes (conversion) in favor of osteogenesis previously. However, their impact on differentiation events is controversially discussed in literature. Hence, the present study aimed to investigate the effects of these FGFs on the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion of primary hBMSCs. Moreover, involved downstream signaling mechanisms should be elucidated and, finally, the results should be evaluated with regard to the possible therapeutic approach. This study clearly revealed that culture in the presence of FGF1 strongly prevented the adipogenic differentiation of hBMSCs as well as the adipogenic conversion of pre-differentiated osteoblastic cells. Lipid droplet formation was completely inhibited by a concentration of 25 ng/µL. Meanwhile, the expression of genetic markers for adipogenic initiation, peroxisome proliferator-activated receptor gamma 2 (PPARg2) and CCAAT/enhancer binding protein alpha (C/EBPa), as well as subsequent adipocyte maturation, fatty acid binding protein 4 (FABP4) and lipoprotein lipase (LPL), were significantly downregulated. Yet, the genetic markers of osteogenic commitment and differentiation were not upregulated during adipogenic differentiation and conversion under FGF supplementation, not supporting an event of osteogenic lineage switching. Moreover, when examining the effects on the osteogenic differentiation of hBMSCs and the osteogenic conversion of pre-differentiated adipocytic cells, culture in the presence of FGF1 markedly decreased extracellular matrix (ECM) mineralization. Additionally, the gene expression of the osteogenic marker alkaline phosphatase (ALP) was significantly reduced and ALP enzyme activity was decreased. Furthermore, genetic markers of osteogenic commitment, like the master regulator runt-related transcription factor 2 (RUNX2) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4), as well as markers of osteogenic differentiation and ECM formation, like collagen 1 A1 (COL1A1) and integrin-binding sialoprotein (IBSP), were downregulated. In contrast, genes known to inhibit ECM mineralization, like ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator (ANKH) and osteopontin (OPN), were upregulated. ANKH inhibition revealed that its transcriptional elevation was not crucial for the reduced matrix mineralization, perhaps due to decreased expression of ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase 1 (ENPP1) that likely annulled ANKH upregulation. Like FGF1, also the culture in the presence of FGF2 displayed a marked anti-adipogenic and anti-osteogenic effect. The FGF receptor 1 (FGFR1) was found to be crucial for mediating the described FGF effects in adipogenic and osteogenic differentiation and conversion. Yet, adipogenic conversion displayed a lower involvement of the FGFR1. For adipogenic differentiation and osteogenic differentiation/conversion, downstream signal transduction involved the extracellular signal-regulated kinases 1 and 2 (ERK1/2) and the mitogen-activated protein kinase (MAPK)/ERK kinases 1 and 2 (MEK1/2), probably via the phosphorylation of FGFR docking protein FGFR substrate 2a (FRS2a) and its effector Ras/MAPK. The c-Jun N-terminal kinase (JNK), p38-MAPK, and protein kinase C (PKC) were not crucial for the signal transduction, yet were in part responsible for the rate of adipogenic and/or osteogenic differentiation itself, in line with current literature. Taken together, to the best of our knowledge, our study was the first to describe the strong impact of FGF1 and FGF2 on both the adipogenic and osteogenic differentiation and conversion processes of primary hBMSCs in parallel. It clearly revealed that although both FGFs were not able to promote the differentiation and lineage switching towards the osteogenic fate, they strongly prevented adipogenic differentiation and lineage switching, which seem to be elevated during osteoporosis. Our findings indicate that FGF1 and FGF2 entrapped hBMSCs in a pre-committed state. In conclusion, these agents could be applied to potently prevent unwanted adipogenesis in vitro. Moreover, our results might aid in unraveling a pharmacological control point to eliminate the increased adipogenic differentiation and conversion as potential cause of adipose tissue accumulation and decreased osteoblastogenesis in bone marrow during aging and especially in osteoporosis. N2 - Die Regulation und Umkehr des adipogenen und osteogenen Commitments von trabekulären humanen Knochenmarks-Stroma Zellen (hBMSCs) stellt einen vielversprechenden Ansatz für die Prävention und Therapie der Knochenerkrankung Osteoporose dar. Der Fibroblasten-Wachstumsfaktor 1 (FGF1) und sein Proteinfamilien-Mitglied FGF2 wurden in einer vorhergehenden Studie als Hauptkandidaten bezüglich der Kontrolle einer Konversion (Schicksalsänderung) von hBMSCs in die osteogene Richtung bewertet. Der Effekt von FGF1 und FGF2 auf die Differenzierung von hBMSCs wird jedoch in der Literatur kontrovers diskutiert. Folglich zielte die aktuelle Studie darauf ab, die Effekte dieser Faktoren auf die adipogene und osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs zu untersuchen. Außerdem sollten die nachgeschalteten Signalmechanismen aufgeklärt und die Ergebnisse abschließend bezüglich des angestrebten Therapieansatzes bewertet werden. Die vorliegende Studie zeigte eindeutig, dass die adipogene Differenzierung von hBMSCs sowie die adipogene Konversion von vordifferenzierten osteoblastischen Zellen durch die Kultur in Gegenwart von FGF1 stark inhibiert wurden. Die typische Bildung von intrazellulären Fetttropfen war bei einer Konzentration von 25 ng/µL vollständig inhibiert, während die Genexpression von frühen und späten adipogenen Markern signifikant herunterreguliert war. Die osteogenen Marker waren jedoch während der adipogenen Differenzierung und Konversion unter FGF-Zugabe nicht hochreguliert, was eine etwaige Schicksalsänderung zugunsten der osteogenen Richtung nicht unterstützte. Bei der Untersuchung der osteogenen Differenzierung von hBMSCs und der osteogenen Konversion von vordifferenzierten adipozytischen Zellen bewirkte die Zugabe von FGF1 zum Differenzierungsmedium eine deutliche Verminderung der Mineralisierung der extrazellulären Matrix (ECM). Darüber hinaus war die Genexpression der alkalischen Phosphatase (ALP) signifikant reduziert; außerdem wurde die ALP Enzymaktivität erniedrigt. Sowohl Marker des osteogenen Commitments einschließlich des osteogenen Master-Transkriptionsfaktors RUNX2 (Runt-related transcription factor 2), als auch Marker der weiterführenden osteogenen Differenzierung waren herunterreguliert. Im Kontrast dazu waren Inhibitoren der ECM-Mineralisierung hochreguliert. Die Hochregulation von ANKH (ANKH inorganic pyrophosphate transport regulator) schien hierbei jedoch keine direkte Auswirkung auf die Reduzierung der Mineralisierung zu haben; seine Wirkung wurde wahrscheinlich durch die Herunterregulation von ENPP1 (Ectonucleotide pyrophosphatase/ phosphodiesterase 1) aufgehoben. Wie FGF1 zeigte auch FGF2 eine anti-adipogene und anti-osteogene Wirkung. Der FGF Rezeptor 1 (FGFR1) war für die Weiterleitung der beschriebenen FGF-Effekte entscheidend, wobei die adipogene Konversion eine erniedrigte Beteiligung dieses Rezeptors zeigte. Bei der adipogenen Differenzierung und der osteogenen Differenzierung und Konversion waren die nachgeschalteten Signalwege ERK1/2 (Extracellular signal-regulated kinases 1 and 2) bzw. MEK1/2 (Mitogenactivated protein kinase (MAPK)/ ERK kinases 1 and 2) involviert, vermutlich über eine Phosphorylierung des FGFR Substrats FRS2a (FGFR substrate 2a) und der Ras/MAP Kinase. Im Gegensatz dazu waren die c-Jun N-terminale Kinase (JNK), die p38-MAP Kinase und die Proteinkinase C (PKC) nicht an der Weiterleitung des FGF-Signals beteiligt. Sie zeigten sich jedoch, in Übereinstimmung mit der aktuellen Literatur, verantwortlich für das Ausmaß der adipogenen bzw. osteogenen Differenzierung selbst. Zusammenfassend war die vorliegende Studie nach unserem besten Wissen die erste, die den starken Einfluss von FGF1 und FGF2 parallel sowohl auf die adipogene als auch die osteogene Differenzierung und Konversion von primären hBMSCs untersucht hat. Sie zeigte deutlich, dass, obwohl beide FGFs nicht die Differenzierung und Konversion zum osteogenen Zellschicksal hin unterstützen konnten, sie dennoch wirkungsvoll die adipogene Differenzierung und Konversion verhinderten, die während der Osteoporose erhöht zu sein scheinen. Unsere Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass hBMSCs durch FGF1 und FGF2 in einem Stadium vor dem Schicksals-Commitment festgehalten werden. Folglich könnten diese Proteine verwendet werden, um eine ungewollte Adipogenese in vitro zu verhindern. Außerdem könnten unsere Ergebnisse helfen, einen pharmakologischen Kontrollpunkt zur Eliminierung der gesteigerten adipogenen Differenzierung und Konversion aufzudecken, welche potentielle Gründe für die Fettakkumulation und die reduzierte Osteoblastogenese im Knochenmark während des Alterns und besonders in der Osteoporose sind. KW - Mesenchymzelle KW - Genexpression KW - Fibroblastenwachstumsfaktor KW - Osteoporose KW - Fettzelle KW - Bone marrow stromal cell (BMSC) KW - Osteogenesis KW - Adipogenesis KW - Differentiation KW - adipocytes KW - Mesenchymale Stammzelle Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119322 ER - TY - THES A1 - Förster, Sabine T1 - Nuclear Hormone Receptors and Fibroblast Growth Factor Receptor Signaling in Echinococcus multilocularis T1 - Signalwege in Echinococcus multilocularis am Beispiel der Nukleären Hormonrezeptoren und des Fibroblast Growth Factor Rezeptors N2 - Parasitic helminths share a large degree of common genetic heritage with their various hosts. This includes cell-cell-communication mechanisms mediated by small peptide cytokines and lipophilic/steroid hormones. These cytokines are candidate molecules for host-parasite cross-communication in helminth diseases. In this work the function of two evolutionary conserved signaling pathways in the model cestode Echinococcus multilocularis has been studied. First, signaling mechanisms mediated through fibroblast growth factors (FGF) and their cognate receptors (FGFR) which influence a multitude of biological functions, like homeostasis and differentiation, were studied. I herein investigated the role of EmFR which is the only FGFR homolog in E. multilocularis. Functional analyses using the Xenopus oocyte expression system clearly indicate that EmFR can sense both acidic and basic FGF of human origin, resulting in an activation of the EmFR tyrosine kinase domain. In vitro experiments demonstrate that mammalian FGF significantly stimulates proliferation and development of E. multilocularis metacestode vesicles and primary cells. Furthermore, DNA synthesis and the parasite’s Erk-like MAPK cascade module was stimulated in the presence of exogenously added mammalian FGF. By using the FGFR inhibitor BIBF1120 the activity of EmFR in the Xenopus oocyte system was effectively blocked. Addition of BIBF1120 to in vitro cultivated Echinococcus larval material led to detrimental effects concerning the generation of metacestode vesicles from parasite stem cells, the proliferation and survival of metacestode vesicles, and the dedifferentiation of protoscoleces towards the metacestode. In conclusion, these data demonstrate the presence of a functional EmFR-mediated signaling pathway in E. multilocularis that is able to interact with host-derived cytokines and that plays an important role in larval parasite development. Secondly, the role of nuclear hormone receptor (NHR) signaling was addressed. Lipophilic and steroid hormone signaling contributes to the regulation of metazoan development. By means of in silico analyses I demonstrate that E. multilocularis expresses a set of 17 NHRs that broadly overlaps with that of the related flatworms Schistosoma mansoni and S. japonicum, but also contains several NHR encoding genes that are unique to this parasite. One of these, EmNHR1, is homolog to the DAF-12/HR-96 subfamily of NHRs which regulate cholesterol homeostasis in metazoans. Modified yeast-two hybrid analyses revealed that host serum contains a ligand which induces homodimerization of the EmNHR1 ligand-binding domain. Also, a HNF4-like homolog, EmHNF4, was characterized. Human HNF4 plays an important role in liver development. RT-PCR experiments showed that both isoforms of the EmHNF4 encoding gene are expressed stage-dependently suggesting distinct functions of the two isoforms in the parasite. Moreover, specific regulatory mechanisms on the convergence of NHR signaling and TGF-β/BMP signaling pathways in E. multilocularis have been identified. On the one hand, EmNHR1 directly interacted with the EmSmadC and on the other hand EmHNF4b interacted with EmSmadD, EmSmadE which are all downstream signaling components of the TGF-β/BMP signaling pathway. This suggests cross-communication in order to regulate target gene expression. With these results, further studies on the role of NHR signaling in the cestode will be facilitated. Also, the first serum-free in vitro cultivation system for E. multilocularis was established using PanserinTM401 as medium. Serum-free co-cultivation with RH-feeder cells and an axenic cultivation method have been established. With the help of this serum-free cultivation system investigations on the role of specific peptide hormones, like FGFs, or lipophilic/steroid hormones, like cholesterol, for the development of helminths will be much easier. N2 - Parasitäre Würmer weisen eine große genetische Verwandtschaft mit ihren Wirten auf. Diese schließt auch Zell-Zell-Kommunikationsmechanismen ein, die sowohl durch Peptidhormone als auch durch lipophile/steroidale Hormone vermittelt werden. Man vermutet, dass diese Stoffe eine wichtige Rolle bei der Wirt-Parasiten-Kreuzkommunikation spielen. Deshalb untersuchte diese Arbeit die Funktion von zwei konservierten Signalwegen im Modellorganismus Echinococcus multilocularis. Der erste Teil dieser Arbeit beschäftigt sich mit den Fibroblast Growth Factors (FGF). Diese steuern durch die Bindung an spezifische FGF-Rezeptoren (FGFR) eine Vielzahl von biologischen Funktionen, wie beispielsweise Homöostase- und Differenzierungsprozesse. Zunächst wurde EmFR, das einzige FGFR-Homolog im Fuchsbandwurm in Xenopus Oozyten heterolog exprimiert. Dabei wurde nachgewiesen, dass der Rezeptor sowohl acidic als auch basic FGF erkennen kann und dies zur Aktivierung der Tyrosinkinasedomäne führt. Außerdem förderte im in vitro Experiment die exogene Zugabe dieser Wirtsfaktoren die Proliferation und Entwicklung von Metacestodenvesikeln und Primärzellen. Darüber hinaus wurden die DNA-Synthese und die Erk-MAPK-Kaskade des Parasiten stimuliert. Im Gegensatz dazu konnte durch die Hinzugabe des FGFR-Inhibitor BIBF1120 die Aktivität des Rezeptors im Xenopus Oozytensystem erfolgreich blockieret werden. Durch den Inhibitor wurde die Regeneration von Metacestodenvesikeln aus Stammzellen, die Proliferation und das Überleben von Metacestodenvesikeln verhindert und eine Dedifferenzierung von Protoskolizes verursacht. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass E. multilocularis einen funktionellen durch EmFR-vermittelten Signalweg besitzt, welcher in der Lage ist, mit Wirtszytokinen zu interagieren und eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Echinococcus Larvenstadien spielt. Außerdem wurde die Bedeutung der Nukleären Hormon Rezeptoren (NHR) für den Parasiten untersucht. Lipophile und steroidale Hormone regulieren viele Entwicklungsprozesse in Metazoen. Mittels in silico Analyse konnten 17 Rezeptoren der NHR-Familie in E. multilocularis identifiziert werden, die größtenteils mit dem NHR Repertoire von Schistosoma mansoni und S. japonicum übereinstimmen. Allerdings wurden auch Rezeptoren identifiziert, die einzigartig für E. multilocularis sind. Einer dieser Rezeptoren, EmNHR1, ist homolog zur DAF-12/HR-96 Familie, die den Cholesterinstoffwechsel in Metazoen reguliert. Yeast-Two Hybrid Experimente zeigten, dass Wirtsserum den putativen Liganden von EmNHR1 enthält, da dessen Zugabe zur Homodimerisierung der EmNHR1-Liganden-bindungsdomäne führte. Außerdem wurde mit EmHNF4 ein weiterer Rezeptor charakterisiert, dessen humanes Homolog die Entwicklung der Leber beeinflusst. RT-PCR-Experimente zeigten, dass die zwei entdeckten Isoformen von EmHNF4 stadienspezifisch exprimiert werden, was auf mögliche Funktionsunterschiede deutet. Darüber hinaus wurde sowohl für EmNHR1, als auch für EmHNF4 beobachtet, dass die DNA-Bindungsdomänen mit Komponenten des TGF-β/BMP-Signalwegs direkte Proteininteraktionen eingehen. Während EmNHR1 mit EmSmadC interagiert, zeigte EmHNF4b eine Reaktion mit EmSmadD und EmSmadE, was auf eine Kreuzkommunikation zwischen beiden Signalwegen deutet. Diese Ergebnisse werden zukünftige Studien bezüglich der Funktion von NHR-Signalwegen in Zestoden deutlich erleichtern. Weiterhin wurde in dieser Arbeit das erste serum-freie in vitro Kultivierungssystem für E. multilocularis etabliert. PanserinTM401 diente als Medium sowohl für die Kultur mit Fütterzellen als auch für eine axenische Kulturmethode. Mit Hilfe dieses Systems können in Zukunft Untersuchungen über die Rolle von Peptidhormonen wie FGF, oder lipophilen bzw. steroidalen Substanzen, wie Cholesterin, bei der Parasitenentwicklung besser untersucht werden. KW - Signaltransduktion KW - Fuchsbandwurm KW - Echinococcus multilocularis KW - Alveoläre Echinokokkose KW - FGF KW - Nukleäre Hormonrezeptoren KW - Echinococcus multilocularis KW - Alveolar Echinococcosis KW - FGF Signaling KW - Hormone Receptor Signaling KW - Fibroblastenwachstumsfaktor Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85832 ER -