TY - THES A1 - Fink, Julian T1 - Synthese von molekularen Werkzeugen zur Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse T1 - Synthesis of molecular tools to visualize and study sphingolipid metabolism and other biological processes N2 - Die Zelle stellt die kleinste Einheit des Lebens dar und zeichnet sich durch die hoch koordinierte Anordnung von mehreren Millionen (Bio-)Molekülen zu einem mikrometergroßen Objekt aus. Als struktureller Bestandteil der Lipiddoppelschicht eukaryotischer Zellen spielt neben Sterolen und Glycerolipiden die Verbindungsklasse der Sphingolipide eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung der Membranintegrität.[472] Darüber hinaus sind bioaktive Sphingolipide bei vielen grundlegenden zellulären Prozessen wie Apoptose, Wachstum, Differenzierung, Migration und Adhäsion entscheidend beteiligt.[87,120] Ein gestörtes Gleichgewicht des Sphingolipidmetabolismus und Defekte der entsprechenden Stoffwechselwege stehen im Zusammenhang mit vielen Krankheiten wie Krebs, Diabetes, Adipositas, Arteriosklerose, chronischen Entzündungen und Autoimmunerkrankungen sowie viraler und bakterieller Pathogenese.[22,143,473,474] Die Entwicklung und Anwendung von Sphingolipidanaloga als potenzielle Wirkstoffe rückten in den letzten Jahren immer weiter in den Fokus der interdisziplinären Forschung von Biologen, Chemikern und Medizinern. Als bekanntestes Beispiel ist Fingolimod (FTY720) zu nennen, das als Sphingosin-1-phosphat-Mimetikum heute unter dem Markennamen Gilenya® erfolgreich als Arzneistoff zur Behandlung von Multipler Sklerose eingesetzt wird.[475] Es besteht jedoch die Gefahr, dass Fingolimod zur Schädigung anderer Zellfunktionen und zu gravierenden Nebeneffekten wie Bradykardie führen kann.[476] Da Sphingolipide ebenfalls in der Kontrolle von bakteriellen und viralen Infektionen essentiell beteiligt sind, spielen Sphingolipide und deren synthetisch dargestellte Derivate vermehrt eine Rolle in der Wirkstoffentwicklung im Kampf gegen pathogene Krankheitserreger.[175,477-479] Die Wirkweise von antimikrobiellen Sphingolipiden ist bisher nicht vollständig aufgeklärt. Für eine Weiterentwicklung von bekannten Medikamenten gegen verschiedene Krankheiten oder für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen Erreger ist eine umfassende Untersuchung der zugrundeliegenden zellulären Mechanismen auf molekularer Ebene entscheidend. Hierfür finden aufgrund der relativ einfachen Detektion mittels Fluoreszenzmikroskopie häufig fluoreszenzmarkierte Sphingolipidderivate breite Anwendung.[480] Die kovalent gebundene Farbstoffeinheit bringt jedoch wesentliche Nachteile mit sich, da sich die Biomoleküle durch die veränderte Struktur und Polarität in ihren biologischen Eigenschaften von den natürlichen Substraten unterscheiden können. Die Verwendung von bioorthogonal funktionalisierten Biomolekülen umgeht dieses Problem, da die strukturellen Änderungen minimal gehalten werden. Nach dem zellulären Einbau dieser Derivate ist eine schnelle und spezifische Konjugation mit einem komplementären Fluorophor zu einem gewünschten Zeitpunkt durch sogenannte Click-Reaktionen wie CuAAC oder SPAAC möglich.[12,46] Das Prinzip der Click-Chemie wurde bereits auf eine Vielzahl an Biomolekülen wie Sphingolipide, Fettsäuren, Aminosäuren, Proteine, Kohlenhydrate, Nukleoside oder Nukleinsäuren (DNA und RNA) übertragen.[47,280] Jedoch bedarf es weiterer spezifisch modifizierter Verbindungen, die vielfältige bioorthogonale Reaktionen für die Untersuchung von Zellprozessen zulassen ‒ sowohl in vitro als auch in vivo. Um neue Therapieansätze gegen verschiedene Krankheiten zu entwickeln und schwerwiegende Nebenwirkungen zu vermeiden, ist die detaillierte Erforschung hochkomplexer Zellvorgänge auf molekularer Ebene von entscheidender Bedeutung. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Synthese und Charakterisierung von molekularen Werkzeugen, die in Kombination mit verschiedenen aktuellen Mikroskopie- und Massenspektrometriemethoden die Visualisierung und Untersuchung des Sphingolipidmetabolismus und weiterer biologischer Prozesse ermöglichen. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit eine Vielzahl an Sphingolipiden und deren bioorthogonal funktionalisierte Analoga ausgehend von der Aminosäure L-Serin erfolgreich synthetisiert. Die vorgestellten Verbindungen eignen sich in Kombination mit Massenspektrometrie und Fluoreszenz- oder Elektronenmikroskopie als molekulare Werkzeuge zur Untersuchung des komplexen Sphingolipidmetabolismus sowie des Einbaus und der Dynamik von Sphingolipiden in Modell- und Zellmembranen. Sowohl in humanen und tierischen Zellen als auch in Bakterien wurden die azidmodifizierten Sphingolipide durch Click-Reaktionen visualisiert, um ein verbessertes Verständnis von bakteriellen und viralen Infektionsprozessen zu erhalten. Der modulare Ansatz der Click-Chemie ermöglicht die Verwendung verschiedener komplementär funktionalisierter Farbstoffe, die unterschiedliche Eigenschaften bezüglich der Membrandurchgängigkeit oder Absorptions- und Emissionswellenlängen besitzen und somit je nach biologischer Fragestellung gezielt eingesetzt werden können. Alles in allem tragen die in dieser Arbeit synthetisierten Verbindungen dazu bei, die Rolle von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und Krankheitsverläufen auf subzellulärer Ebene aufzuklären. Dadurch wird ein entscheidender Beitrag für die Entwicklung neuartiger Wirkstoffe gegen bakterielle oder virale Erreger sowie innovativer Therapien gegen verschiedene humane Krankheiten geliefert. N2 - The cell represents the smallest unit of life and is characterized by the highly coordinated arrangement of several million (bio)molecules to form a micrometer-sized object. As a structural component of the lipid bilayer of eukaryotic cells, in addition to sterols and glycerophospholipids, the compound class of sphingolipids plays a central role in maintaining membrane integrity.[472] In addition, bioactive sphingolipids are critically involved in many basic cellular processes such as apoptosis, growth, differentiation, migration and adhesion.[87,120] A disturbed balance of the sphingolipid metabolism and defects in the corresponding metabolic pathways are associated with many diseases such as cancer, diabetes, obesity, arteriosclerosis, chronic inflammation and autoimmune diseases as well as viral and bacterial pathogenesis.[22,143,473,474] The development and application of sphingolipid analogues as potential active ingredients have moved more and more into the focus of interdisciplinary research by biologists, chemists and medical professionals in recent years. The best-known example is fingolimod (FTY720), which is now successfully used as a sphingosine-1-phosphate mimetic under the brand name Gilenya® as a drug for the treatment of multiple sclerosis.[475] However, there is a risk that fingolimod can damage other cell functions and lead to serious side effects such as bradycardia.[476] Since sphingolipids are also essential for the control of bacterial and viral infections, sphingolipids and their synthetically produced derivatives are playing an increasing a role in the development of active ingredients in the fight against pathogenic germs.[175,477-479] The mode of action of antimicrobial sphingolipids has not yet been fully elucidated. A comprehensive investigation of the underlying cellular mechanisms at the molecular level is crucial for further development of known drugs against various diseases or for the development of novel active substances against pathogens. Due to the relatively easy detection by fluorescence microscopy, fluorescence-labeled sphingolipid derivatives are widely used for this purpose.[480] However, the covalently bonded dye unit has significant disadvantages since the biological properties of the biomolecules can differ from the natural substrates concerning structure and polarity changes. The usage of bioorthogonally functionalized biomolecules avoids this problem because the structural changes are kept to a minimum. After the cellular incorporation of these derivatives, rapid and specific conjugation with a complementary fluorophore at a desired point of time is possible by so-called click reactions such as CuAAC or SPAAC.[12,46] The concept of click chemistry has already been applied to a large number of biomolecules such as sphingolipids, fatty acids, amino acids, proteins, carbohydrates, nucleosides or nucleic acids (DNA and RNA).[47,280] However, further specifically modified compounds are required, allowing diverse bioorthogonal reactions for the investigation of cell processes – both in vitro and in vivo. In order to develop new therapeutic approaches against numerous diseases and to avoid serious side effects, detailed research into highly complex cell processes at the molecular level is of crucial importance. Therefore, the aim of this work was the synthesis and characterization of molecular tools which, in combination with several current microscopy and mass spectrometry methods, enable the visualization and investigation of the sphingolipid metabolism and other biological processes. In summary, a variety of sphingolipids and their bioorthogonally functionalized analogues were successfully synthesized in this work starting from the amino acid L-serine. In combination with mass spectrometry and fluorescence or electron microscopy, the presented compounds are suitable as molecular tools for the investigation of the complex sphingolipid metabolism as well as the incorporation and dynamics of sphingolipids in model and cell membranes. The azide-modified sphingolipids were visualized by click reactions in human and animal cells as well as in bacteria to gain a better understanding of bacterial and viral infection processes. The modular approach of click chemistry enables the use of different complementarily functionalized dyes that have different properties in terms of membrane permeability or absorption and emission wavelengths and can therefore be used in a targeted manner depending on the biological issue. All in all, the compounds synthesized in this work help to elucidate the role of sphingolipids in infection processes and disease progression at subcellular level. This makes a decisive contribution to the development of novel active substances against bacterial or viral pathogens as well as of innovative therapies against various human diseases. KW - Chemische Synthese KW - Sphingolipide KW - Click-Chemie KW - Organische Synthese KW - Sphingolipidderivate KW - bioorthogonale Markierung KW - Wirkstoffentwicklung KW - Infektionsprozesse KW - Sphingolipidanaloga KW - Sphingolipidstoffwechsel Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-286992 ER - TY - THES A1 - Walter, Tim T1 - Bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide zur Evaluierung von Lipiddynamiken \(in\) \(vivo\) T1 - Bioorthogonal functionalized sphingolipids for evaluation of lipid dynamics \(in\) \(vivo\) N2 - In der Kontrolle von viralen oder bakteriellen Infektionen spielen Sphingolipide eine essentielle Rolle[335-336], weshalb sich inzwischen die Forschung vermehrt an Sphingolipiden und -analoga als Wirkstoffen gegen die verschiedensten Erreger beschäftigt.[9] Dabei finden in der Synthese und Identifikation potentieller Wirkstoffe auch clickchemiebasierte Ansätze Anwendung.[224] Allerdings ist die Wirkweise von sphingolipidbasierten Pharmaka auch in viraler und mikrobieller Pathogenese bisher ungeklärt. Mit der Entdeckung der CuAAC[112-113] sowie deren modernen Varianten und Alternativen, die gemeinsam unter dem Begriff Clickchemie zusammengefasst werden, ist es möglich, die strukturellen Änderungen von Biomolekülen klein zu halten und durch spätere Konjugation mit Farbstoffen Fluoreszenspektroskopie zu ermöglichen.[339-340] Während in den letzten Jahren die Clickchemie breite Anwendung zur Modifikation von Proteinen[130], Kohlenhydraten[341] und DNA[340] gefunden hat blieben Lipide lange unbeachtet[342], was vor allem auch für Sphingolipide gilt. In dieser Arbeit werden bioorthogonal funktionalisierte Sphingolipide und -analoga vorgestellt, um die Vielseitigkeit der Clickchemie auf das Feld der Sphingolipide zu übertragen. Die clickfähigen Lipidanaloga ermöglichen detaillierte Einblicke in die dynamische Organisation von Sphingolipiden bei Infektionsprozessen und ihr Einsatz als therapeutische Wirkstoffe oder zur Generierung von antibakteriellen Oberflächenbeschichtungen wurden untersucht. Die dargestellten azidmodifizierten Sphingolipide und –analoga konnten in Zusammenarbeit mit Kooperationspartnern, bezüglich ihrer Verwendung in Visualisierungsexperimenten und antibakteriellen Eigenschaften untersucht werden. Die Ceramidderivate konnten genutzt werden, um den Einfluss von Kettenlänge und Position des Azides der acylierten Säure auf die in vivo-Konjugation mit dem Fluoreszenzfarbstoff DBCO-Sulfo-Cy5 in Jurkatzellen genauer zu untersuchen.[211] Auch konnten azidfunktionalisierte Ceramide auf ihre Eignung zur Visualisierung von Ceramiddynamiken während T-Stimulation untersucht werden.[205] In diesem Zusammenhang sind visualisierbare Ceramide von besonderer Bedeutung, da die T-Zellstimulation die ASM-Aktivierung zur Folge hat, die wiederum Ceramide freisetzt. Mit dem azidmodifizierten Phytosphingosinderivat gelang es erstmals ein azidmodifiziertes Sphingolipid nach Inkubation von Arabidopsis thaliana Setzlingen mittels CuAAC mit einem Fluoreszenzfarbstoff zu konjugieren.[258] Des Weiteren konnten die azidfunktionalisierten N-Oleoylserinole in verschiedenen Zelltypten erfolgreich eingebaut und selektiv mit Fluoreszenzfarbstoff visualisiert werden. Kofärbungen mit GFP-PKCζ und Antikörpermarkierungen von Ceramid sowie PKCζ zeigten, dass es sich bei den Enantiomeren um ceramidimitierende Lipidanaloga handelt. Somit eignen sich diese N-Oleoylserinolanaloga, um die Interaktion von Ceramiden mit der Proteinkinase Cζ zu untersuchen. Da viele natürliche Sphingolipide antibakterielle Eigenschaften aufweisen, konnte in Kooperation mit Jérôme Becam der Einsatz azidmodifizierter Ceramide als Wirkstoff gegen Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus untersucht werden. ωN3-C6-Cer zeigt gute bakterizide Eigenschaften gegen Neisseria meningitidis und Neisseria gonorrhoeae, ohne dabei toxisch gegenüber den Wirtszellen zu sein. Die Ceramidanaloga αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer und ωN3-C16-Cer weisen keine antibakteriellen Eigenschaften auf, aber sie wurden effizient in die Membran der Neisseriae eingebaut und konnten ebenfalls erfolgreich bioorthogonal markiert werden. Des Weiteren zeigten hochauflösende dSTORM-Aufnahmen der Bakterien, im Gegensatz zu Humanzellen, eine homologe Verteilung der konjugierten Ceramide. Da Ceramide eine wichtige Rolle in der Infektionsbekämpfung spielen, sind die in dieser Arbeit synthetisierten azidmodifizierten Ceramide wertvolle Werkzeuge, um die Interaktion von Bakterien mit Humanzellen zu untersuchen. Außerdem konnte im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich eine innovative Methode entwickelt werden, um alkinpräsentierende Linker auf die Oberfläche von Nunc Covalink 96 Microtiterplatten kovalent zu binden und die Alkine konnten anschließend mittels CuAAC mit den in dieser Arbeit synthetisierten azidfunktionalisierten Lipiden zu konjugiert werden. Ziel der Methode war es potentielle Moleküle für bakterizide Oberflächenmodifikationen zu identifizieren. Mittels solcher Oberflächenmodifikationen soll die Biofilmbildung in Endotrachealtuben verhindert, und damit die Entstehung von beatmungsassozierten Pneumonien unterbunden werden. Die lipidmodifizierten Microtiterplatten sollen zukünftig auch genutzt werden, um sphingolpidaffine Proteine aus Zelllysaten zu identifizieren. N2 - Sphingolipids play an essential role in the control of viral and bacterial infections[335-336], therefore sphingolipids and analogues shift into the focus of pharmaceutical research as active ingredients against various pathogens.[9] Also click chemistry is used for synthesis and screening of potential drugs.[224] The mode of action of sphingolipid based pharmaceuticals in viral and microbial pathogenesis is not yet fully understood. By using CuAAC[112-113] and their modern variants and alternatives – summarized in the term click chemistry – it is possible to minimise the structural alterations of biomolecules and still use them in fluorescence spectroscopy after labeling. [339-340] While modification of proteins[130], carbohydrates[341] and DNA[340] via click chemistry has been widely used in recent years, lipids have remained unaffected for a long time, especially sphingolipids.[342] In this Work biorthogonal functionalised sphingolipids and analogues are presented, that transfer the versatility of the click chemistry to the field of sphingolipids. Furthermore, the clickable lipid analogues allow a detailed view into the dynamic organisation of sphingolipids in infection processes and in addition their use as therapeutic agents or for the generation of antibacterial surface coatings were investigated. The synthesized azide modified sphingolipids and analogues were evaluated for the use in visualisation experiments and their antibacterial properties were evaluated within several cooperation projects. The ceramide derivatives were used to evaluate the influence of acylated chain length and azide position in regard to in vivo labeling with the fluorescence dye DBCO-Sulfo-Cy5 in jurkat cells.[211] Furthermore, ceramide dynamics during T-cell stimulation were investigated by labeling azide functionalised ceramides.[205] In this context visualisable ceramides are of particular interest due T-cell stimulation results in ASM-activation, which again releases ceramides. With the azide modified phytosphingosine derivative, an azide modified sphingolipid was labelled via CuAAC after incubation of arabidoopsis thailana seedlings for the first time[258] Furthermore, azide functionalised N-Oleoyl serinols were successfully incorporated within different cell types and selectively visualised by labelling. Colocalization studies with GFP-PKCζ and anti body labeling of ceramide as well as PKCζ proved to be ceramide mimicking lipid analogues Many natural sphingolipids show antibacterial behaviour, therefore the use of azide modified ceramides as active ingredients against Neisseria meningitidis, Neisseria gonorrhoeae sowie Escherichia coli und Staphylococcus aureus were investigated in cooperation with Jérôme Becam ωN3-C6-Cer shows good bactericidal properties against Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae without being toxic against host cells. The ceramide analogues αN3-C6-Cer, αN3-C16-Cer and ωN3-C16-Cer show no antibacterial properties, but they were also efficiently incorporated into the membrane of Neisseriae and can be used biorthogonal labelling. Furthermore, in contrast to human cells high resolution dSTORM-images show an evenly distribution of labelled ceramides in bacteria cells. Since ceramides play an important role in the fight against infections the ceramides synthesised in this work are valuable tools to investigate the interaction of bacteria with human cells. Also an innovative method was established within this thesis to modify the surface of Nunc Covalink 96 Wellplates with alkyne presenting linkers followed by the conjugation of the azide modified lipids presented in this work via CuAAC. This method is intended to be used for screening of potential molecules for antibacterial surface modifications. In the future this kind of surface modifications are expected to prevent the biofilm formation in endotracheal tubes and prohibit the formation of ventilator-associated pneumonia. In Addition the lipid modified microtiter plates are also intended to be used to identify sphingolipid affine proteins from cell lysate. KW - Click-Chemie KW - Sphingolipide KW - Lipidmembran KW - Sphingolipid KW - bioorthogonal Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-168091 ER -