TY - THES A1 - Hagmann [geb. Kischkies], Laura Violetta T1 - Stringent response regulation and its impact on ex vivo survival in the commensal pathogen \(Neisseria\) \(meningitidis\) T1 - Regulation der stringenten Kontrolle und ihre Auswirkungen auf das ex vivo Überleben des kommensalen Erregers \(Neisseria\) \(meningitidis\) N2 - Neisseria meningitidis is a commensal bacterium which sometimes causes serious disease in humans. Recent studies in numerous human pathogenic bacteria have shown that the stringent response contributes to bacterial virulence. Therefore, this study analyzed the regulation of the stringent response in meningococci and in particular of RelA as well as its contribution to ex vivo fitness in a strain- and condition- dependent manner by using the carriage strain α522 and the hyperinvasive strain MC58 in different in vitro and ex vivo conditions. Growth experiments revealed that both wild-type strains were almost indistinguishable in their ex vivo phenotypes. However, quantitative real time PCR (qRT-PCR) found differences in the gene expression of relA between both strains. Furthermore, in contrast to the MC58 RelA mutant strain α522 deficient in RelA was unable to survive in human whole blood, although both strains showed the same ex vivo phenotypes in saliva and cerebrospinal fluid. Moreover, strain α522 was depended on a short non-coding AT-rich repeat element (ATRrelA) in the promoter region of relA to survive in human blood. Furthermore, cell culture experiments with human epithelial cells revealed that in both strains the deletion of relA resulted in a significantly decreased invasion rate while not significantly affecting adhesion. In order to better understand the conditional lethality of the relA deletion, computational and experimental analyses were carried out to unravel differences in amino acid biosynthetic pathways between both strains. Whereas strain MC58 is able to synthesize all 20 amino acids, strain α522 has an auxotrophy for cysteine and glutamine. In addition, the in vitro growth experiments found that RelA is required for growth in the absence of external amino acids in both strains. Furthermore, the mutant strain MC58 harboring an ATRrelA in its relA promoter region showed improved growth in minimal medium supplemented with L-cysteine and/or L-glutamine compared to the wild-type strain. Contrary, in strain α522 no differences between the wild-type and the ATRrelA deletion mutant were observed. Together this indicates that ATRrelA interferes with the complex regulatory interplay between the stringent response pathway and L-cysteine as well as L-glutamine metabolism. It further suggests that meningococcal virulence is linked to relA in a strain- and condition- depended manner. In conclusion, this work highlighted the role of the stringent response and of non-coding regulatory elements for bacterial virulence and indicates that virulence might be related to the way how meningococci accomplish growth within the host environments. N2 - Neisseria meningitidis ist ein kommensal lebendes, fakultativ pathogenes Bakterium, welches unter nicht vollständig verstandenen Umständen lebensbedrohliche Krankheitsbilder bei Menschen verursacht. Aktuelle Studien haben gezeigt, dass die stringente Antwort einen Einfluss auf die bakterielle Virulenz haben kann. Aus diesem Grund untersucht diese Arbeit die Regulation der stringenten Antwort, insbesondere die Rolle von RelA, sowie den Einfluss der stringenten Antwort auf die Ex-vivo-Fitness der Meningokokken. Die Ergebnisse wurden für den Trägerstamm α522 und den hyperinvasiven Stamm MC58 erhoben und miteinander verglichen. Wachstumsexperimente zeigten, dass sich beide Wildtyp-Stämme in ihren Ex-vivo-Phänotypen nicht unterscheiden. Jedoch wurden mittels quantitativer Echtzeit-PCR (qRT-PCR) Unterschiede zwischen beiden Stämmen in der Genexpression von relA gefunden. Zudem war die α522 relA Mutante im Gegensatz zu der MC58 relA Mutante nicht in der Lage, in menschlichem Vollblut zu überleben. Allerdings zeigten in Saliva und Liquor beide Stämme den gleichen Phänotyp. Außerdem war der Trägerstamm auf eine kurze, nicht-codierende AT-reiche Region (ATRrelA) in der Promotorregion von relA angewiesen, um im menschlichen Blut überleben zu können. Darüber hinaus zeigten Zellkulturexperimente mit humanen Epithelzellen, dass die Deletion relA die Invasionsrate in beiden Stämmen signifikant verringerte, obwohl die Adhäsionsrate durch die Deletion unbeeinflusst blieb. Um besser verstehen zu können, weshalb die Deletion von relA unter bestimmten Bedingungen letal ist, wurden mit In-silico- und experimentellen Analysen nach Unterschieden in den Aminosäurebiosynthesewegen beider Stämme gesucht. Es zeigte sich, dass Stamm MC58 in der Lage ist alle 20 Aminosäuren zu synthetisieren, während Stamm α522 eine Auxotrophie für Cystein und Glutamin aufweist. Ferner zeigten die In-vitro-Wachstumsversuche, dass RelA bei Aminosäuremangel essentiell für beide Stämme ist. Darüber hinaus zeigte eine MC58 Mutante mit einer ATRrelA –Kopie in der relA Promotorregion ein im Vergleich zum Wildtyp-Stamm verbessertes Wachstum in mit L-Cystein und/oder L-Glutamin angereichertem Minimalmedium. Gegensätzlich dazu zeigte der Stamm α522 keine Unterschiede im Wachstum zwischen dem Wildtyp und einer ATRrelA Deletions-Mutante. Dies deutet darauf hin, dass ATRrelA an dem komplexen regulatorischen Zusammenspiel der stringenten Antwort und dem L-Cystein- beziehungsweise dem L-Glutamin-Metabolismus beteiligt ist. Es lässt sich vermuten, dass RelA zu der Virulenz von Meningokokken in einer stamm- und umgebungsspezifischen Weise beiträgt. Abschließend hebt diese Arbeit die Rolle von kleinen regulatorischen Elementen für die bakterielle Virulenz hervor und postuliert, dass die Virulenz der Meningokokken auf ihrer Fähigkeit basiert, sich der durch den Wirt gegebenen Umgebung anzupassen. KW - Neisseria meningitidis KW - Stringente Kontrolle KW - Virulenzfaktor KW - Genregulation KW - Transposon KW - Stringent response KW - RelA KW - MITE KW - Stringente Antwort Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-144352 ER - TY - THES A1 - Pawlik, Marie-Christin T1 - Gene expression in the human pathogen Neisseria meningitidis: Adaptation to serum exposure and zinc limitation T1 - Genexpression im humanen Pathogen Neisseria meningitidis: Adaptation an Serumexposition und Zinkmangel N2 - Neisseria meningitidis is a facultative human pathogen that occasionally shows strong resistance against serum complement exposure. Previously described factors that mediate meningococcal serum resistance are for example the capsule, LPS sialylation, and expression of the factor H binding protein. I aimed for identification of novel serum resistance factors, thereby following two approaches, i) the analysis of the impact of global regulators of gene expression on serum resistance; and ii) a comparative analysis of closely related strains differing in serum resistance. (i) Of six meningococcal global regulators of gene expression studied, only mutation of the zinc uptake regulator Zur reduced complement deposition on meningococci. Little was known about meningococcal Zur and regulatory processes in response to zinc. I therefore elucidated the yet unidentified meningococcal Zur regulon comparing the transcriptional response of the N. meningitidis strain MC58 under zinc-rich and zinc-deficient conditions using a common reference design of microarray analysis. The meningococcal Zur regulon comprises 17 genes, of which 15 genes were repressed and two genes were activated at high zinc condition. Amongst the Zur-repressed genes were genes involved in zinc uptake, tRNA modification, and ribosomal assembly. A 23 bp meningococcal consensus Zur binding motif (Zur box) with a conserved central palindrome was established (TGTTATDNHATAACA) and detected in the promoter region of all regulated transcriptional units (genes/operons). In vitro binding of meningococcal Zur to the Zur box of three selected genes was shown for the first time using EMSAs. Binding of meningococcal Zur to DNA depended specifically on zinc, and mutations in the palindromic sequence constrained Zur binding to the DNA motif. ii) Three closely related strains of ST-41/44 cc from invasive disease and carriage which differed in their resistance to serum complement exposure were analysed to identify novel mediators of serum resistance. I compared the strains’ gene content by microarray analysis which revealed six genes being present in both carrier isolates, but absent in the invasive isolate. Four of them are part of two Islands of horizontally transferred DNA, i.e. IHT-B and –C. The working group furthermore applied a comprehensive screening assay, a transcriptome and a proteome analysis leading to identification of three target proteins. I contributed to establish the role of these three proteins in serum resistance: The adhesin Opc mediates serum resistance by binding of vitronectin, a negative regulator of the complement system; the hypothetical protein NMB0865 slightly contributes to serum resistance by a yet unknown mechanism; and NspA, recently identified to bind the negative complement regulator factor H, led to considerable reduced complement-mediated killing. N2 - Neisseria meningitidis ist ein fakultatives Humanpathogen, welches mitunter sehr resistant gegenüber Serumkomplement-Exposition ist. Bereits beschriebene Faktoren, welche die Serumresistenz von Meningokokken fördern, sind beispielsweise die Kapsel, LPS-Sialylierung und Expression des fH-bindenden Proteins. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation neuartiger Serumresistenzfaktoren, wobei ich zwei Ansätzen verfolgte: i) Die Analyse des Einflusses von globalen Regulatoren der Genexpression auf die Serumresistenz; und ii) eine vergleichenden Analyse von eng verwandten Stämmen, die sich hinsichtlich ihrer Serumresistanz unterschieden. i) Von sechs untersuchten globalen Regulatoren der Genexpression, war die Komplementdeposition auf Meningokokken nur nach Mutation des Regulators der Zinkaufnahme, Zur, reduziert. Über Zur selbst und die regulatorischen Prozesse in Reaktion auf Zink war in Meningokokken wenig bekannt. Ich habe daher das bisher nicht bestimmte Zur-Regulon von Meningokokken aufgeklärt, wofür ich mittels Mikroarrays die transkriptionelle Antwort des N. meningitidis-Stammes MC58 unter Zink-Überfluss und Zink-Mangel zu vergleichen. Das Zur-Regulon von Meningokokken umfasst 17 Gene, von denen unter Zinküberfluss 15 reprimiert und zwei aktiviert wurden. Unter den Zur-reprimierten Genen fanden sich Gene, die in die Aufnahme von Zink, die Modikation von tRNAs und den Zusammenbau des Ribosoms involviert sind. Ein 23 bp langes Binde-Konsensusmotiv für Meningokokken-Zur (Zur-Box) mit einem konservierten zentralen Palindrom wurde ermittelt (TGTTATDNHATAACA) und in der Promotorregion aller regulierten Transkriptionseinheiten (Gene/Operons) detektiert. In vitro-Bindung des N. meningitidis Zur an die Zur-Box dreier ausgewählter Genen konnte mittels EMSAs erstmals gezeigt werden. Die Bindung von Zur an DNA war spezifisch abhängig von Zink, und Mutationen in der palindromischen Sequenz hemmten die Zur-Bindung an das DNA-Motiv. ii) Drei eng verwandte Stämme des ST-41/44-Komplexes aus invasiver Erkrankung und Trägertum, die sich in ihrer Resistenz gegenüber Serumkomplement-Exposition unterschieden, wurden analysiert um neuartige Mediatoren der Serumresistenz zu identifizieren. Der Gengehalt der Stämme wurde mittels Mikroarray-Analyse verglichen. Dies offenbarte sechs Gene, die in den beiden Trägerstämmen vorhanden, aber in dem invasiven Isolat abwesend waren. Vier dieser Gene liegen innerhalb zweier Inseln horizontal transferierter DNA, d.h. IHT-B und –C. Weiterhin führte die Arbeitsgruppe eine Transkriptom- und Proteom-Analyse der drei Stämme sowie einen umfangsreichen Screening-Assay durch. Diese Ansätze führten zur Identifikation dreier Kandidaten-Proteine für die weitere Analyse. Ich wirkte daran mit, die Rolle dieser Proteine für die Serumresistenz von Meningokokken zu ermitteln: Das Adhäsin Opc vermittelt Serumresistenz durch Bindung von Vitronektin, einem negativen Regulator des Komplementsystems; das hypothetische Protein NMB0865 trägt über einen bisher unbekannten Mechanismus geringfügig zur Serumresistanz bei; und NspA, für welches vor Kurzem erkannt wurde, dass es den negativen Komplementregulator Faktor H bindet, führte zu beträchtlich reduzierter Abtötung durch Komplement. KW - Komplement KW - Neisseria meningitidis KW - Genregulation KW - Zinkmangel KW - Serumresistenz KW - Meningokokken KW - globale Regulatoren KW - Serum KW - Bakterien KW - Zink KW - serum resistance KW - meningococci KW - global regulators KW - zinc limitation Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78758 ER - TY - THES A1 - Niehus, Eike T1 - Untersuchungen zur Regulation Motilitäts-assoziierter Gene in Helicobacter pylori T1 - Regulation of Motility-Associated Genes in Helicobacter pylori N2 - Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten. N2 - The gastric human pathogen Helicobacter pylori is a fastidious bacterium, chronically colonizing the stomach of more than half of the world population, leading to severe diseases in some individuals such as ulcers or gastric cancer. H. pylori flagella-driven motility has been shown to be essential for the initial colonization of the human gastric mucosa and for the long-term persistence of the infection. The 2-8 flagella are arranged at one pole of the bacterium and covered by a membranous sheath. The flagella and chemotaxis system comprises more than forty genes. In contrast to the highly ordered gene organization in other organisms, they are scattered along the genome. The aim of this study was to comprehensively characterize the network of transcriptional regulation of flagellar biogenesis with possible links to other cell functions in H. pylori. H. pylori possesses two different flagellin genes, flaA and flaB, the transcription of the corresponding genes is controlled by sigma28 and sigma54 promoters respectively. To characterize the specific transcriptional regulation of these flagellar genes, which belong to two different regulons, transcript levels were monitored throughout the growth curve of H. pylori. A bioluminescence-based reporter gene system was successfully established in H. pylori for the first time. It was utilized to measure the activity of the newly constructed flaA- and flaB-promoter fusions. Furthermore growth-phase dependent transcript levels of the two flagellin genes were confirmed by Northern blot hybridizations and RT-PCR analysis. The results revealed a growthphase dependent differential transcriptional control of flaA and flaB in H. pylori. In agreement with the structural succession of FlaB and FlaA in the filament, as well as the affiliation of the genes to different flagellar regulons, flaA to flaB expression ratio was strongly increasing with the progression of the growth curve. An H. pylori microarray working platform was established to be able to perform genome-wide analyses on this organism. A custom made PCR-product microarray with 1590 H. pylori specific probes was constructed in cooperation with the Max-Planck-Institute for Infection Biology in Berlin. In addition, a commercially available H. pylori-specific oligonucleotide based microarray system was utilized for the first time and validated. By using the microarray technology, a set of different key regulators of the H. pylori flagellar system was analysed on a genome-wide scale for the first time. They are comprising the alternative sigma factors FliA and RpoN, the anti-sigma-factor FlgM, the RpoN specific two component system FlgS/R and the components of the flagellar basal body, FlhA and FlhF. While the fliA mutant revealed a phenotype with truncated flagella, the flgM mutant had a slightly enhanced number of flagella, correlating with their antagonistic function. Mutations in all other regulators lead to loss of flagella and motility. Based on the microarray analyses of the FliA and RpoN regulons, the flagellar regulatory classes 2 and 3 could be newly defined and enlarged by ten additional genes. The microarray studies on early flagellar components revealed a role for FlhA and FlhF as functional equivalents to master regulators. They are governing the transcription of flagellar regulatory classes 2 and 3 and a newly defined intermediate regulon. The latter comprised 24 flagellar and non-flagellar genes controlled by more than one promoter. Furthermore, studies on double mutants of the early regulators with the flagellar antisigma factor FlgM provided evidence for the complex regulatory interconnection of this factor with the determined flagellar feedback regulation of FlhA and FlhF. Based on the results of this study, a revised model of regulation pathways of flagellar biogenesis in H. pylori could be constructed. It is composed of three regulatory classes of flagellar genes and one intermediate class, governed by the three H. Pylori specific sigma factors sigma80, sigma54 and sigma28 and the associated regulators FlgS/R and FlgM. The transcriptional feedback regulation on class 3 genes is mediated by the anti-sigma factor FlgM, which is also involved in FlhA-dependent transcriptional control of class 2 flagellar genes. FlhF-dependent transcriptional control on class 2 genes is independent from FlgM. In contrast to other organisms, flagellar class 1 genes in H. pylori include flagellar motor and chemotaxis components and are coregulated with housekeeping genes. This coincides with the specific ecological adaptation of H. pylori to its niche and the necessity for the pathogen to be continuously motile to maintain a persistent infection. KW - Helicobacter pylori KW - Geißel KW - Genregulation KW - Helicobacter pylori KW - Flagellen KW - Genregulation KW - Motilität KW - Microarray KW - Helicobacter pylori KW - regulation KW - flagella KW - motility KW - microarray Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11141 ER -