TY - THES A1 - Brembs, Björn T1 - An Analysis of Associative Learning in Drosophila at the Flight Simulator T1 - Eine Ananlyse des assoziativen Lernens von Drosophila im Flugsimulator N2 - Most natural learning situations are of a complex nature and consist of a tight conjunction of the animal's behavior (B) with the perceived stimuli. According to the behavior of the animal in response to these stimuli, they are classified as being either biologically neutral (conditioned stimuli, CS) or important (unconditioned stimuli, US or reinforcer). A typical learning situation is thus identified by a three term contingency of B, CS and US. A functional characterization of the single associations during conditioning in such a three term contingency has so far hardly been possible. Therefore, the operational distinction between classical conditioning as a behavior-independent learning process (CS-US associations) and operant conditioning as essentially behavior-dependent learning (B-US associations) has proven very valuable. However, most learning experiments described so far have not been successful in fully separating operant from classical conditioning into single-association tasks. The Drosophila flight simulator in which the relevant behavior is a single motor variable (yaw torque), allows for the first time to completely separate the operant (B-US, B-CS) and the classical (CS-US) components of a complex learning situation and to examine their interactions. In this thesis the contributions of the single associations (CS-US, B-US and B-CS) to memory formation are studied. Moreover, for the first time a particularly prominent single association (CS-US) is characterized extensively in a three term contingency. A yoked control shows that classical (CS-US) pattern learning requires more training than operant pattern learning. Additionally, it can be demonstrated that an operantly trained stimulus can be successfully transferred from the behavior used during training to a new behavior in a subsequent test phase. This result shows unambiguously that during operant conditioning classical (CS-US) associations can be formed. In an extension to this insight, it emerges that such a classical association blocks the formation of an operant association, which would have been formed without the operant control of the learned stimuli. Instead the operant component seems to develop less markedly and is probably merged into a complex three-way association. This three-way association could either be implemented as a sequential B-CS-US or as a hierarchical (B-CS)-US association. The comparison of a simple classical (CS-US) with a composite operant (B, CS and US) learning situation and of a simple operant (B-US) with another composite operant (B, CS and US) learning situation, suggests a hierarchy of predictors of reinforcement. Operant behavior occurring during composite operant conditioning is hardly conditioned at all. The associability of classical stimuli that bear no relation to the behavior of the animal is of an intermediate value, as is operant behavior alone. Stimuli that are controlled by operant behavior accrue associative strength most easily. If several stimuli are available as potential predictors, again the question arises which CS-US associations are formed? A number of different studies in vertebrates yielded amazingly congruent results. These results inspired to examine and compare the properties of the CS-US association in a complex learning situation at the flight simulator with these vertebrate results. It is shown for the first time that Drosophila can learn compound stimuli and recall the individual components independently and in similar proportions. The attempt to obtain second-order conditioning with these stimuli, yielded a relatively small effect. In comparison with vertebrate data, blocking and sensory preconditioning experiments produced conforming as well as dissenting results. While no blocking could be found, a sound sensory preconditioning effect was obtained. Possible reasons for the failure to find blocking are discussed and further experiments are suggested. The sensory preconditioning effect found in this study is revealed using simultaneous stimulus presentation and depends on the amount of preconditioning. It is argued that this effect is a case of 'incidental learning', where two stimuli are associated without the need of reinforcement. Finally, the implications of the results obtained in this study for the general understanding of memory formation in complex learning situations are discussed. N2 - Die meisten Lernsituationen sind von komplexer Natur und bestehen aus einer engen Verknüpfung des Verhaltens eines Tieres (B) mit den wahrgenommenen Stimuli. Entsprechend der Reaktion des Tieres auf diese Stimuli werden diese als entweder biologisch neutral (konditionierte Stimuli, CS) oder signifikant (unkonditionierte Stimuli, US oder Verstärker) klassifiziert. Eine typische Lernsituation ist also durch eine Dreiwegebeziehung zwischen B, CS und US gekennzeichnet. Eine funktionelle Charakterisierung der Einzelassoziationen während des Lernens in einer solchen Dreiwegebeziehung war experimentell bisher kaum zugänglich. Operationell wird daher zwischen klassischer Konditionierung als verhaltensunabhängigem Lernvorgang (CS-US Assoziationen) und operanter Konditionierung als essentiell verhaltensabhängigem Lernen (B-US Assoziationen) unterschieden. In den meisten bisher beschriebenen Lernexperimenten ist noch nicht einmal diese Trennung in Einzelassoziationen vollständig durchzuführen gewesen. Im Drosophila Flugsimulator, in dem das relevante Verhalten eine einzelne Bewegungsvariable (das Gierungsdrehmoment) ist, können zum ersten Mal die operanten (B-US, B-CS) und die klassischen (CS-US) Bestandteile einer komplexen Lernsituation völlig getrennt und auf ihre Interaktionen hin untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit wurden sowohl die Beiträge der Einzelassoziationen (CS-US, B-US und B-CS) bei der Akquisition der Gedächtnismatrize in komplexen Lernsituationen untersucht, als auch die Eigenschaften einer besonders prominenten Einzelassoziation (CS-US) während einer komplexen Lernsituation zum ersten Mal weitgehend charakterisiert. Mit einer gejochten (yoked) Kontrolle kann gezeigt werden, dass das klassische (CS-US) Musterlernen umfangreicheres Training als das operante Musterlernen erfordert. Außerdem kann die Fliege einen operant gelernter Stimulus von dem Verhalten mit dem er gelernt wurde, auf ein anderes Verhalten im Test übertragen. Dieses Resultat zeigt eindeutig, dass während der operanten Konditionierung klassische (CS-US) Assoziationen gebildet werden können. In einer Erweiterung dieses Ergebnisses zeigt sich, dass solch eine klassische Assoziation, wenn sie gebildet wird, die Bildung einer operanten Assoziation blockiert, die ohne operante Kontrolle der klassisch assoziierten Stimuli gebildet würde. Stattdessen scheint sich der operante Bestandteil weniger ausgeprägt zu entwickeln und ist eventuell in einer komplexen Dreiwege-Assoziation eingebunden. Die Dreiwege-Assoziation könnte entweder als sequentielle B-CS-US oder als hierarchische (B-CS)-US Assoziation implementiert sein. Der Vergleich einer einfachen klassischen (CS-US) mit einer komplexen operanten (B, CS und US) Lernsituation und einer einfachen operanten (B-US) mit einer anderen komplexen operanten (B, CS und US) Lernsituation, ermöglicht das Postulat einer Hierarchie der Prädiktoren für Verstärker. Operantes Verhalten während einer komplexen operanten Lernsituation wird wenig oder überhaupt nicht konditioniert. Die Assoziierbarkeit der klassischen Stimuli ohne Relation zum Verhalten des Tieres (CS-US) sind - wie operantes Verhalten alleine (B-US) auch - von mittlerer Assoziierbarkeit. Stimuli die von operantem Verhalten kon-trolliert werden, erhöhen am schnellsten ihre assoziative Stärke. Sind mehrere Stimuli während des Lernvorgangs zugänglich, stellt sich erneut die Frage, welche von den CS-US Assoziationen gebildet werden. Eine Vielzahl verschiedenster Studien in Vertebraten wiesen erstaunlich übereinstimmende Ergebnisse auf. Diese Ergebnisse inspirierten dazu, die Eigenschaften der CS-US Assoziationen in der komplexen Lernsituation am Flugsimulator zu untersuchen und mit Ergebnissen in Vertebraten zu vergleichen. Es wird erstmals gezeigt, dass Drosophila zusammengesetzte Stimuli lernen und die Einzelkomponenten unabhängig voneinander und in etwa ähnlichen Proportionen wiedererkennen kann. Der Versuch "Lernen zweiter Ordnung" mit diesen Stimuli zu erzielen, liefert einen relativ kleinen Effekt. Die Gegenüberstellung mit Daten aus Vertebraten liefert sowohl Abweichungen als auch Übereinstimmungen hinsichtlich der Lernregeln, die beim klassischen Konditionieren von Vertebraten gefunden wurden. Während es ein deutliches "sensorisches Präkonditionieren" gibt, konnte kein "Blocken" gefunden werden. Das sensorische Präkonditionieren in dieser Studie zeigt sich bei gleichzeitiger Stimuluspräsentation und ist vom Mass der Präkonditionierung abhängig. Es wird argumentiert, dass dieser Effekt ein Fall "beiläufigen Lernens" ist, bei dem zwei Stimuli ohne die Notwendigkeit der Verstärkung assoziiert werden. Für das nicht gefundene Blocken werden mögliche Gründe diskutiert und weiterführende Experimente vor-geschlagen. Abschließend wird über die Implikationen der Resultate dieser Arbeit für das allgemeine Verständnis der Gedächtnisbildung in komplexen Lernsituationen nachgedacht. KW - Taufliege KW - Lernen KW - Flugsimulator KW - Drosophila KW - Lernen KW - Gedächtnis KW - Assoziation KW - assoziativ KW - Flugsimulator KW - Lernregeln KW - operantes Konditionieren KW - klassisches Konditionieren KW - Drosophila KW - learning KW - memory KW - association KW - associative KW - flight simulator KW - learning rules KW - operant conditioning KW - classical conditioning Y1 - 2000 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1039 ER - TY - THES A1 - Chen, Jiangtian T1 - Functions of allatostatin A (AstA) and myoinhibitory peptides (MIPs) in the regulation of food intake and sleep in Drosophila T1 - Funktion der Allatostatin A (AstA) und myoinhibitorische Peptide (MIP) in Bezug zu Nahrungsaufnahme und Schlaf bei Drosophila N2 - Neuropeptides and peptide hormones carrying neural or physiological information are intercellular signalling substances. They control most if not all biological processes in vertebrates and invertebrates by acting on specific receptors on the target cell. In mammals, many different neuropeptides and peptide hormones are involved in the regulation of feeding and sleep. In \textit{Drosophila}, allatostatin A (AstA) and myoinhibitory peptides (MIPs) are brain-gut peptides. The AstA receptors are homologues of the mammalian galanin receptors and the amino acid sequences of MIPs are similar to a part of galanin, which has an orexigenic effect and is implicated in the control of sleep behaviour in mammals. I am interested in dissecting pleiotropic functions of AstA and MIPs in the regulation of food intake and sleep in \textit{Drosophila}. \par In the first part of the dissertation the roles of brain-gut peptide allatostatin A are analysed. Due to the genetic and molecular tools available, the fruit fly \textit{Drosophila melanogaster} is chosen to investigate functions of AstA. The aims in this part are to identify pleiotropic functions of AstA and assign specific effects to the activity of certain subsets of AstA expressing cells in \textit{Drosophila} adults. A new and restricted \textit{AstA\textsuperscript{34}-Gal4} line was generated. The confocal imaging result showed that AstA neurons are located in the posterior lateral protocerebrum (PLP), the gnathal ganglia (GNG), the medullae, and thoracic-abdominal ganglion (TAG). AstA producing DLAa neurons in the TAG innervate hindgut and the poterior part of midgut. In addition, AstA are detected in the enteroendocrine cells (EECs).\par Thermogenetic activation and neurogenetic silencing tools with the aid of the \textit{UAS/Gal4} system were employed to manipulate the activity of all or individual subsets of AstA cells and investigate the effects on food intake, locomotor activity and sleep. Our experimental results showed that thermogenetic activation of two pairs of PLP neurons and/or AstA expressing EECs reduced food intake, which can be traced to AstA signalling by using \textit{AstA} mutants. In the locomotor activity, thermogenetic activation of two pairs of PLP neurons and/or AstA expressing EECs resulted in strongly inhibited locomotor activity and promoted sleep without sexual difference, which was most apparent during the morning and evening activity peaks. The experimental and control flies were not impaired in climbing ability. In contrast, conditional silencing of the PLP neurons and/or AstA expressing EECs reduced sleep specifically in the siesta. The arousal experiment was employed to test for the sleep intensity. Thermogenetically activated flies walked significantly slower and a shorter distance than controls for all arousal stimulus intensities. Furthermore, PDF receptor was detected in the PLP neurons and the PLP neurons reacted with an intracellular increase of cAMP upon PDF, only when PDF receptor was present. Constitutive activation of AstA cells by tethered PDF increased sleep and thermogenetic activation of the PDF producing sLNvs promoted sleep specifically in the morning and evening. \par The study shows that the PLP neurons and/or EECs vis AstA signalling subserve an anorexigenic and sleep-regulating function in \textit{Drosophila}. The PLP neurons arborise in the posterior superior protocerebrum, where the sleep relevant dopaminergic neurons are located, and EECs extend themselves to reach the gut lumen. Thus, the PLP neurons are well positioned to regulate sleep and EECs potentially modulate feeding and possibly locomotor activity and sleep during sending the nutritional information from the gut to the brain. The results of imaging, activation of the PDF signalling pathway by tethered PDF and thermoactivation of PDF expressing sLNvs suggest that the PLP neurons are modulated by PDF from sLNv clock neurons and AstA in PLP neurons is the downstream target of the central clock to modulate locomotor activity and sleep. AstA receptors are homologues of galanin receptors and both of them are involved in the regulation of feeding and sleep, which appears to be conserved in evolutionary aspect.\par In the second part of the dissertation, I analysed the role of myoinhibitory peptides. MIPs are brain-gut peptides in insects and polychaeta. Also in \textit{Drosophila}, MIPs are expressed in the CNS and EECs in the gut. Previous studies have demonstrated the functions of MIPs in the regulation of food intake, gut motility and ecdysis in moths and crickets. Yet, the functions of MIPs in the fruit fly are little known. To dissect effects of MIPs regarding feeding, locomotor activity and sleep in \textit{Drosophila melanogater}, I manipulated the activity of MIP\textsuperscript{WÜ} cells by using newly generated \textit{Mip\textsuperscript{WÜ}-Gal4} lines. Thermogenetical activation or genetical silencing of MIP\textsuperscript{WÜ} celles did not affect feeding behaviour and resulted in changes in the sleep status. \par My results are in contradiction to a recent research of Min Soohong and colleagues who demonstrated a role of MIPs in the regulation of food intake and body weight in \textit{Drosophila}. They showed that constitutive silencing of MIP\textsuperscript{KR} cells increased food intake and body weight, whereas thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells decreased food intake and body weight by using \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4} driver. Then I repeated the experiments with the \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4} driver, but could not reproduce the results. Interestingly, I just observed the opposite phenotype. When MIP\textsuperscript{KR} cells were silenced by expressing UAS-tetanus toxin (\textit{UAS-TNT}), the \textit{Mip\textsuperscript{KR}$>$TNT} flies showed reduced food intake. The thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells did not affect food intake. Furthermore, I observed that the thermogenetic activation of MIP\textsuperscript{KR} cells strongly reduced the sleep duration.\par In the third part of the dissertation, I adapted and improved a method for metabolic labelling for \textit{Drosophila} peptides to quantify the relative amount of peptides and the released peptides by mass spectrometry under different physiological and behavioural conditions. qRT-PCR is a practical technique to measure the transcription and the corresponding mRNA level of a given peptide. However, this is not the only way to measure the translation and production of peptides. Although the amount of peptides can be quantified by mass spectrometry, it is not possible to distinguish between peptides stored in vesicles and released peptides in CNS extracts. I construct an approach to assess the released peptides, which can be calculated by comparing the relative amount of peptides between two timepoints in combination with the mRNA levels which can be used as semiquantitative proxy reflecting the production of peptides during this period. \par After optimizing the protocol for metabolic labelling, I carried out a quantitative analysis of peptides before and after eclosion as a test. I was able to show that the EH- and SIFa-related peptides were strongly reduced after eclosion. This is in line with the known function and release of EH during eclosion. Since this test was positive, I next used the metabolic labelling in \textit{Drosophila} adult, which were either fed \textit{ad libitum} or starved for 24 hrs, and analysed the effects on the amount of AstA and MIPs. In the mRNA level, my results showed that in the brain \textit{AstA} mRNA level in the 24 hrs starved flies was increased compared to in the \textit{ad libitum} fed flies, whereas in the gut the \textit{AstA} mRNA level was decreased. Starvation induced the reduction of \textit{Mip} mRNA level in the brain and gut. Unfortunately, due to technical problems I was unable to analyse the metabolic labelled peptides during the course of this thesis.\par N2 - Neuropeptide und Peptidhormone sind interzelluläre Botenstoffe, die neuronale und physiologische Informationen tragen. Sie kontrollieren die meisten - wenn nicht alle - biologische Prozesse in Wirbeltieren und Wirbellosen durch ihre Wirkung auf spezifische Rezeptoren an den Zielzellen. So sind bei Säugetieren z.B. viele unterschiedliche Neuropeptide an der Regulierung des Freßverhaltens und des Schlafs beteiligt. In \textit{Drosophila} sind Allatostatin A (AstA) und myoinhibitorische Peptide (MIP) typische Gehirn-Darm- Peptide. Die AstA-Rezeptoren sind Homologe des Galanin-Rezeptors der Wirbeltiere, und die Aminosäurensequenz von MIP sind ähnlich zu einer Teilsequenz von Galanin, welches einen orexigenischen Effekt hat und mit der Kontrolle des Schlafverhaltens in Säugetieren verbunden ist. Ich bin interessiert an der Identifierung möglicher pleiotroper Funktionen von AstA und MIP in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Schlaf in \textit{Drosophila}. \par Im ersten Teil der Dissertation wird die Rolle der Hirn-Darm- Peptide der AstA-Familie analysiert. Aufgrund der verfügbaren genetischen und molekularen Werkzeuge wurde die Taufliege \textit{Drosophila melanogaster} als Modell ausgewählt, um die Funktionen von AstA zu erforschen. Der Fokus lag dabei darauf, die pleiotropen Funktionen von AstA zu identifizieren, und herauszufinden, ob den verschiedenen AstA-exprimierenden Zelltypen jeweils unterschiedliche Funktionen zukommen. Eine neue, eingeschränkte AstA-Gal4-Linie wurde generiert. AstA-exprimierende Neuronen lassen sich im posterio-lateralen Protocerebrum (PLP), dem Gnathalganglion (GNG), der Medulla und dem thorakal-abdominalen Ganglion(TAG) finden. DLAa-Neuronen im TAG innervieren den Enddarm und den vorderen Teil des Mitteldarms. Ausserdem wird AstA auch in enteroendokrinen Zellen (EEC) im Mitteldarm exprimiert.\par Thermogenetische Aktivierung und neurogenetische Stillegung wurden zusammen mithilfe des UAS/Gal4-Systems eingesetzt, um die Aktivität vieler oder einzelner Untergruppen von AstA-Zellen zu manipulieren und die Effekte auf Nahrungsaufnahme, Laufaktivität und Schlaf zu untersuchen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die thermogenetische Aktivierung der zwei Paare von PLP-Neuronen und/oder AstA-exprimierenden EEC Schlaf und Nahrungsaufnahme reduziert, was auf die signalisierende Funktion von AstA zurückzuführen ist. In der Laufaktivität führte die thermogenetische Aktivierung der zwei Paare von PLP-Neuronen und/oder AstA-exprimierende EEC zu starker Hemmung, und förderte Schlaf ohne geschlechtsspezifischen Unterschied, was während der Aktivitätsgipfel am Morgen und Abend am besten zu beobachten war. Die Experimental- sowie die Kontrollfliegen waren im generellen Klettervermögen nicht beeinträchtigt. In Kontrast dazu reduzierte eine konditionale Stillegung von PLP-Neuronen und allen \textit{AstA-Gal4} exprimierenden Neuronen besonders den Siesta-Schlaf. Fliegen mit thermogenetisch aktivierten AstA-Zellen liefen wesentlich langsamer und weniger als die Kontrollgruppe bei allen Erregungsintensitäten. Außerdem wurde der PDF-Rezeptor in den PLP-Neuronen ermittelt. Die PLP-Neuronen reagierten auf PDF-Gabe mit einem intrazellulären Anstieg von cAMP nur dann, wenn der PDF-Rezeptor anwesend war. Konstitutive Aktivierung von AstA-Zellen durch "tethered" PDF steigerte den Schlaf, und thermogenetische Aktivierung von PDF-produzierenden sLNvs förderte Schlaf besonders am Morgen und Abend.\par Die Studie zeigt, dass die PLP-Neuronen und/oder EECs via AstA eine anorexigenische und schlafregulierende Funktion in \text{Drosophila} ausübt. PLP-Neuronen verzweigen im posterio-superioren Protocerebrum, wo die für Schlaf relevanten dopaminergen Neurone lokalisiert sind. Die EECs erstrecken sich bis zum Darmlumen. Daher sind die PLP-Neuronen gut positioniert, um Schlaf zu regulieren, und EECs modulieren potenziell die Verdauung und möglicherweise auch Laufaktivität und Schlaf durch Vermittlung der Nahrungsinformationen vom Darm zum Gehirn. Die Ergebnisse von Imaging, Aktivierung des PDF-wegs durch "tethered" PDF und Thermoaktivierung von PDF-exprimierenden s-LNvs weisen darauf hin, dass die PLP-Neuronen durch PDF aus sLNv-Uhr-Neuronen moduliert werden. AstA in den PLP-Neuronen scheint ein indirektes Ausgangssignal der inneren Uhr das die Laufaktivität und Schlaf modelliert. Die AstA-Rezeptoren sind Homologe der Galanin-Rezeptoren; beide sind an der Regulierung von Ernährung und Schlaf beteiligt, was auf eine evolutionär bewahrte Funktion hindeutet. \par Im zweiten Teil der Dissertation habe ich die Rolle der MIP analysiert. MIP sind Hirn-Darm- Peptide der Insekten und Polychaeta. Auch in \textit{Drosophila} wird MIP durch Neurone im ZNS und durch EEC im Darm exprimiert. Bisherige Studien haben Funktionen von MIP bei der Nahrungsaufnahme, Regulation der Darmbewegung und Häutung in Motten und Grillen demonstriert. Für \textit{Drosophila} waren Funktionen von MIP nicht bekannt. Um mögliche Effekte von MIP bezüglich des Freßverhaltens, Laufaktivität und und Schlaf in \textit{Drosophila melanogaster} zu finden, habe ich die Aktivität von MIP\textsuperscript{WÜ}-Zellen mit Hilfe der neu in unserem Labor hergestellten \textit{Mip\textsuperscript{WÜ} -Gal4}-Linien manipuliert. Dabei konnte ich keinen Effekt auf das Freßverhalten finden, nachdem ich die MIP\textsuperscript{WÜ}–Zellen thermogenetisch aktiviert oder genetisch stillgelegt habe. Allerdings führte dies zu Änderungen des Schlafstatuses. \par Meine Ergebnisse stehen im Widerspruch zu einer neueren Veröffentlichung von Min Soohong und Kollegen, die eine Rolle der MIP in der Regulation von Nahrungsaufnahme und Körpergewicht von \textit{Drosophila} nachweisen konnten. Sie zeigten dass konstitutive Stillegung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen Nahrungsaufnahme und Körpergewicht steigerte, während thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen Nahrungsaufnahme und Körpergewicht durch \textit{MIP\textsuperscript{KR}-Gal4}-Treiber verringerte. Ich habe daraufhin die Versuche mit der von Soohong eingesetzen \textit{Mip\textsuperscript{KR}-Gal4}-Treiber wiederholt, konnte aber damit die Ergebnisse nicht bestätigen. Interessanterweise habe ich genau das Gegenteil beobachtet. Wenn ich MIP\textsuperscript{KR}-Zellen durch Expresseion von UAS-Tetanustoxin (UAS-TNT) ausgeschaltet habe, zeigten die \textit{Mip\textsuperscript{KR}$>$TNT}-Fliegen eine reduzierte Nahrungsaufnahme. Eine thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen hat die Nahrungsaufnahme nicht beeinflusst. Weiterhin habe ich beobachtet, dass die thermogenetische Aktivierung der MIP\textsuperscript{KR}-Zellen die Schlafdauer stark reduziert.\par Im dritten Teil der Dissertation haben ich eine Methode zur metabolischen Markierung für \textit{Drosophila}-Peptide adaptiert und verbessert, um die relative Menge von Peptiden und die Peptidausschüttung mittels Massenspektrometrie unter verschiedenen physiologischen Bedingungen und Verhaltenskontexten zu quantifizieren. qRT-PCR ist eine praktische Technik um die Transkription und die entsprechende mRNA-Menge für ein gegebenes Peptid zu messen. Dies ist allerdings kein zwingendes Maß für die Translation und Menge eines Peptids. Massenspektrometisch kann die Peptidmenge zwar quantifiziert werden, es kann aber nicht zwischen in Vesikel gespeicherten Peptiden und ausgeschütteten Peptiden in ZNS-Extrakten unterschieden werden. Ich habe nach einem Zugang zu den ausgeschütteten Peptiden gesucht, die durch Vergleich der relativen Menge der Peptide zwischen zwei Zeitpunkten kalkuliert werden können, wenn die mRNA-Menge, welche ein semiquantitatives Proxy der Produktion der Peptide in dieser Periode darstellt, bekannt ist. \par Nachdem ich das Protokoll für die metabolische Markierung optimiert hatte, habe ich als Test eine quantitative Peptidomanalyse vor und nach dem Adultschlupf durchgeführt. Dabei konnte ich zeigen, dass die EH- und SIFa-relatierte Peptide nach dem Schlupf stark reduziert sind. Dies passt gut überein mit der bekannten Funktion und Freisetzung von EH während des Schlupfs. Da dieser Test positiv war, habe ich dann als nächsten Schritt die metabolische Markierung in adulten \textit{Drosophila} eingesetzt, die für 24h entweder \textit{ad libitum} gefüttert oder gehungert wurden, und geschaut, wie sich dies auf die Menge der AstA und MIP auswirkt. Meine Ergebnisse zeigten, dass das \textit{AstA} mRNA-Niveau im Gehirn der Fliegen, die 24 Stunden gehungert haben im Vergleich zu \textit{ad libitum} gefütterten Fliegen steigt, während das \textit{AstA} mRNA-Niveau im Darm sank. Hunger führte zur Reduzierung des \textit{Mip} mRNA-Spiegels in Gehirn und Darm. Wegen technischer Probleme konnte ich die metabolisch markierten Peptide während meiner Forschungsphase leider nicht mehr analysieren. \par KW - AstA KW - MIPs KW - Nahrungsaufnahme KW - Schlaf KW - Taufliege KW - Peptide KW - Drosophila Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-156838 ER - TY - THES A1 - Chen, Yi-chun T1 - Experimental access to the content of an olfactory memory trace in larval Drosophila T1 - Eine experimentelle Strategie zur Beschreibung des Inhaltesdes Duftgedächtnisses von Larven der Drosophila N2 - Animals need to evaluate their experiences in order to cope with new situations they encounter. This requires the ability of learning and memory. Drosophila melanogaster lends itself as an animal model for such research because elaborate genetic techniques are available. Drosphila larva even saves cellular redundancy in parts of its nervous system. My Thesis has two parts dealing with associative olfactory learning in larval Drosophila. Firstly, I tackle the question of odour processing in respect to odour quality and intensity. Secondly, by focusing on the evolutionarily conserved presynaptic protein Synapsin, olfactory learning on the cellular and molecular level is investigated. Part I.1. provides a behaviour-based estimate of odour similarity in larval Drosophila by using four recognition-type experiments to result in a combined, task-independent estimate of perceived difference between odour-pairs. A further comparison of these combined perceived differences to published calculations of physico-chemical difference reveals a weak correlation between perceptual and physico-chemical similarity. Part I.2. focuses on how odour intensity is interpreted in the process of olfactory learning in larval Drosophila. First, the dose-effect curves of learnability across odour intensities are described in order to choose odour intensities such that larvae are trained at intermediate odour intensity, but tested for retention either with that trained intermediate odour intensity, or with respectively HIGHer or LOWer intensities. A specificity of retention for the trained intensity is observed for all the odours used. Such intensity specificity of learning adds to appreciate the richness in 'content' of olfactory memory traces, and to define the demands on computational models of associative olfactory memory trace formation. In part II.1. of the thesis, the cellular site and molecular mode of Synapsin function is investigated- an evolutionarily conserved, presynaptic vesicular phosphoprotein. On the cellular level, the study shows a Synapsin-dependent memory trace in the mushroom bodies, a third-order “cortical” brain region of the insects; on the molecular level, Synapsin engages as a downstream element of the AC-cAMP-PKA signalling cascade. N2 - Tiere müssen ihre eigenen Erfahrungen heranziehen, damit sie neue Situationen meistern können. Dies setzt die Fähigkeit zum Lernen und ein Gedächtnis voraus. Drosophila melanogaster eignet sich dank der Vielzahl verfügbarer genetischer Methoden als ein Modellorganismus für solche Forschung. Die Drosophila Larve kommt zudem in Teilen ihres Nervensystems ohne zelluläre Redundanz aus. Meine Doktorarbeit gliedert sich in zwei Teile, die das assoziative olfaktorische Lernen der Drosophila Larven zum zentralen Gegenstand haben. Erstens bearbeite ich den Prozess der Geruchswahrnehmung hinsichtlich der Duftqualität und Duftintensität. Im zweiten Teil meiner Arbeit erforschen wir das olfaktorische Lernen auf zellulärer und molekularer Ebene und konzentrieren uns dabei auf das hochkonservierte präsynaptische Protein Synapsin. Teil I.1. handelt von der Ähnlichkeit zwischen Duftpaaren in der Wahrnehmung von Drosophila Larven anhand vier verschiedener Typen von Lernexperiment. Mit diesen Experimenten ließ sich eine Abschätzung der vom Tier wahrgenommenen Ähnlichkeiten zwischen Paaren von Duftstoffen erreichen. Ein Vergleich dieser wahrgenommenen Ähnlichkeiten mit veröffentlichten physikalisch-chemischen Ähnlichkeiten ergibt eine schwache Korrelation. Teil I.2. befasst sich damit, wie die Intensität eines Duftes in die olfaktorische Wahrnehmung und das Gedächtnis der Drosophila Larven integriert sein könnte. Zunächst wird die Lernbarkeit verschiedener Duftstoffe abhängig von ihren Intensitäten beschrieben; anhand dieser Dosis-Wirkungskurven werden dann Duftintensitäten so ausgewählt, dass die Larven mit der mittleren Duftintensität trainiert werden, aber mit einer höheren, oder mit einer niedrigeren Duftintensität getestet werden. Es zeigt sich eine Spezifität des Gedächtnisabrufs für die trainierte Intensität, und zwar für alle verwendeten Duftstoffe. Eine solche Spezifität für Intensität bereichert das Bild des ‚Inhalts’ von olfaktorischen Gedächtnisspuren und damit die Anforderungen an Computermodelle über Riechen und Geruchslernen. Im Teil II.1. habe ich in Zusammenarbeit mit Birgit Michels auf zelluläre Ebene die Funktion von Synapsin beim assoziativen Lernen von Drosophila Larven untersucht- ein evolutionär konserviertes, präsynaptisches, vesikel-assoziiertes Phosphoprotein. Auf zellulärer Ebene zeigt die Studie eine Synapsin-abhängige Gedächtnisspur im Pilzkörper, einer dem olfaktorischen Cortex der Vertebraten womöglich homologen Struktur. Auf molekularer Ebene wurde nachgewiesen, dass Synapsin als ein Zielprotein in der AC-cAMP-PKA Kaskade am Lernvorgang beteiligt ist. KW - Taufliege KW - Geruchssinn KW - Lernen KW - Sinnesphysiologie KW - Ähnlichkeit KW - Wahrnehmung KW - Geschmack KW - Duftintensität KW - Drosophila KW - Olfaction KW - Learning KW - Sensory KW - Physiology KW - Similarity KW - Perception KW - Taste KW - Odour Intensity KW - Drosophila KW - Geruchssinn KW - Lernen KW - Sinnesphysiologie Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83705 ER - TY - THES A1 - Chouhan, Nitin Singh T1 - Time-odor learning in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Olfaktorisches Zeitgedächtnis bei \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Endogenous clocks help animals to anticipate the daily environmental changes. These internal clocks rely on environmental cues, called Zeitgeber, for synchronization. The molecular clock consists of transcription-translation feedback loops and is located in about 150 neurons (Helfrich-Förster and Homberg, 1993; Helfrich-Förster, 2005). The core clock has the proteins Clock (CLK) and Cycle (CYC) that together act as a transcription activator for period (per) and timeless (tim) which then, via PER and TIM block their own transcription by inhibiting CLK/CYC activity (Darlington et al., 1998; Hardin, 2005; Dubruille and Emery, 2008). Light signals trigger the degradation of TIM through a blue-light sensing protein Cryptochrome (CRY) and thus, allows CLK/CYC to resume per and tim transcription (Emery et al., 1998; Stanewsky et al., 1998). Therefore, light acts as an important Zeitgeber for the clock entrainment. The mammalian clock consists of similarly intertwined feedback loops. Endogenous clocks facilitate appropriate alterations in a variety of behaviors according to the time of day. Also, these clocks can provide the phase information to the memory centers of the brain to form the time of day related associations (TOD). TOD memories promote appropriate usage of resources and concurrently better the survival success of an animal. For instance, animals can form time-place associations related to the availability of a biologically significant stimulus like food or mate. Such memories will help the animal to obtain resources at different locations at the appropriate time of day. The significance of these memories is supported by the fact that many organisms including bees, ants, rats and mice demonstrate time-place learning (Biebach et al. 1991; Mistlberger et al. 1997; Van der Zee et al. 2008; Wenger et al. 1991). Previous studies have shown that TOD related memories rely on an internal clock, but the identity of the clock and the underlying mechanism remain less well understood. The present study demonstrates that flies can also form TOD associated odor memories and further seeks to identify the appropriate mechanism. Hungry flies were trained in the morning to associate odor A with the sucrose reward and subsequently were exposed to odor B without reward. The same flies were exposed in the afternoon to odor B with and odor A without reward. Two cycles of the 65 reversal training on two subsequent days resulted in the significant retrieval of specific odor memories in the morning and afternoon tests. Therefore, flies were able to modulate their odor preference according to the time of day. In contrast, flies trained in a non-reversal manner were unable to form TOD related memories. The study also demonstrates that flies are only able to form time-odor memories when the two reciprocal training cycles occur at a minimum 6 h interval. This work also highlights the role of the internal state of flies in establishing timeodor memories. Prolonged starvation motivates flies to appropriate their search for the food. It increases the cost associated with a wrong choice in the T-maze test as it precludes the food discovery. Accordingly, an extended starvation promotes the TOD related changes in the odor preference in flies already with a single cycle of reversal training. Intriguingly, prolonged starvation is required for the time-odor memory acquisition but is dispensable during the memory retrieval. Endogenous oscillators promote time-odor associations in flies. Flies in constant darkness have functional rhythms and can form time-odor memories. In contrast, flies kept in constant light become arrhythmic and demonstrated no change in their odor preference through the day. Also, clock mutant flies per01 and clkAR, show compromised performance compared to CS flies when trained in the time-odor conditioning assay. These results suggest that flies need a per and clk dependent oscillator for establishing TOD related memories. Also, the clock governed rhythms are necessary for the timeodor memory acquisition but not for the retrieval. Pigment-Dispersing Factor (PDF) neuropeptide is a clock output factor (Park and Hall, 1998; Park et al., 2000; Helfrich-Förster, 2009). pdf01 mutant flies are unable to form significant time-odor memories. PDF is released by 8 neurons per hemisphere in the fly brain. This cluster includes the small (s-LNvs) and large (l-LNvs) ventral lateral neurons. Restoring PDF in these 16 neurons in the pdf01 mutant background rescues the time-odor learning defect. The PDF neuropeptide activates a seven transmembrane G-protein coupled receptor (PDFR) which is broadly expressed in the fly brain (Hyun et al., 2005). The present study shows that the expression of PDFR in about 10 dorsal neurons (DN1p) is sufficient for robust time-odor associations in flies. 66 In conclusion, flies use distinct endogenous oscillators to acquire and retrieve time-odor memories. The first oscillator is light dependent and likely signals through the PDF neuropeptide to promote the usage of the time as an associative cue during appetitive conditioning. In contrast, the second clock is light independent and specifically signals the time information for the memory retrieval. The identity of this clock and the underlying mechanism are open to investigation. N2 - Die endogenen circadianen Uhren helfen Tieren, die täglichen Veränderungen der Umwelt zu antizipieren. Diese internen Uhren stützen sich auf externe Umweltreize, sogenannte Zeitgeber, die den Tagesrhythmus vorgeben. Im Fliegengehirn bilden etwa 150 Neuronen die zentrale innere Uhr (Helfrich-Förster and Homberg, 1993; Helfrich- Förster, 2005). Diese Neuronen exprimieren die molekulare Uhr, die aus Transkriptions- Translations-Feedback-Schleifen besteht. Die Uhr besitzt die Proteine Clock (CLK) und Cycle (CYC), die zusammen die Transkription von period (per) und timeless (tim) aktivieren. PER und TIM bilden dann ein Heterodimer um die Transkription von clk und cyc zu blockieren (Darlington et al., 1998; Hardin, 2005; Dubruille and Emery, 2008). Lichtsignale lösen den Abbau von TIM durch das für blaues Licht sensitive‚ 'Sensing Protein Cryptochrome‘ (CRY) aus, daß wiederum CLK und CYC freisetzt um die per und tim Transkription wieder aufzunehmen (Emery et al., 1998; Stanewsky et al., 1998). Daher wirkt Licht als wichtiger Zeitgeber. Die innere Uhr der Säuger besteht aus ähnlich miteinander verflochtenen Rückkopplungsschleifen. Die internen Uhren ermöglichen und erleichtern Verhaltensveränderungen in einer Vielzahl von Situation, entsprechend der Tageszeit. Zudem wird die Information den jeweiligen Speicherorten im Gehirn bereit gestellt, um zeitbezogene Gedächtnisbildung zu ermöglichen. Zeitabhängige Gedächtnisbildung sorgt für eine angemessene Nutzung der Ressourcen und sichert gleichzeitig das Überleben des Tieres. Zum Beispiel können Tiere Zeit-Ort-Assoziationen im Zusammenhang mit der Verfügbarkeit einer biologisch wichtigen Ressource, wie Nahrung oder Paarungspartnern bilden. Solche Assoziationen helfen dem Tier Ressourcen an verschiedenen Orten, abhängig von der Tageszeit, zu erschließen. Die Wichtigkeit dieser Fähigkeit wird durch die Tatsache gestützt, daß zum Beispiel Bienen, Ameisen, Ratten und Mäuse ein zeitlich abhängiges Ortgedächtnis bilden können (Biebach et al. 1991; Mistlberger et al. 1997; Van der Zee et al. 2008; Wenger et al. 1991). Frühere Studien haben gezeigt, daß zeitbezogene Erinnerungen auf einer internen Uhr beruhen. Die genaue Identität dieser Uhr und die zugrunde liegenden Mechanismen sind jedoch nicht ausreichend bekannt. In der vorliegenden Studie wird gezeigt, daß Fliegen in der Lage sind ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Zudem wird versucht die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu identifizieren. Hungrige Fliegen werden zu verschiedenen Tageszeiten konditioniert verschiedene Gerüche mit einer Saccharose-Belohnung zu assoziieren. Morgens ist Geruch A mit Zucker gepaart während Geruch B ohne Zucker präsentiert wird, am Nachmittag ist Geruch B belohnt, Geruch A nicht. Dieses reziproke Training wird an zwei aufeinander folgenden Tagen durchgeführt. Am dritten Tag werden die Fliegen entweder am Morgen oder Nachmittag auf ihre Geruchspräferenz zwischen A und B getestet. Die Fliegen modulieren ihre Geruchspräferenz abhängig von der Tageszeit. Im Gegensatz dazu sind Fliegen, die nicht mittels eines reziproken Trainings konditioniert wurden, nicht in der Lage, ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Die Ergebnisse zeigen auch, daß Fliegen nur dann in der Lage sind zeitbezogene Erinnerungen zu bilden, wenn die beiden reziproken Trainingszyklen mindestens 6 h voneinander getrennt durchgeführt werden. Die Arbeit ebeleuchtet zudem die Rolle des internen Zustands der Fliegen im Kontext des zeitabhängigen olfaktorischen Gedächtnisses. Länger andauernder Hunger motiviert die Fliegen stärker ihre Suche nach Nahrung zeitlich anzupassen. Schon ein Zyklus reziproken Trainings reicht für die Bildung Zeit-spezifischen Geruchsgedächtnisses aus. Die Erhöhung der Kosten, die mit einer falschen Wahl in einem T-maze-Test verbunden ist, kann offenbar zeitabhängige Änderungen der Geruchspräferenzen in Fliegen begünstigen. Erstaunlicherweise begünstigt der Hunger speziell die Gedächtnisbildung, ist jedoch für den Test nicht erforderlich. Endogene circadiane Oszillatoren werden für das zeitabhängige olfaktorische Gedächtnis der Fliegen gebraucht. Fliegen, die im Dauerdunkel gehalten wurden, zeigen rhythmisches Verhalten so wie zeitbezogenes olfaktorisches Gedächtnis. Im Gegensatz dazu sind im Dauerlicht aufgezogene Fliegen arrhythmisch und zeigen kein Zeit-spezifisches Geruchsgedächtnis. Zudem sind auch die arrhythmischen Mutanten per01 und clkAR in der Zeit-Geruchskonditionierung gestört. Diese Ergebnisse legen nahe, daß Fliegen einen per- und clk-abhängigen Oszillator benötigen, der von externen Lichtsignalen abhängig ist, um ein zeitabhängiges olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. Außerdem wird der durch die innere Uhr vorgegebene Rhythmus nur während der Gedächtnisbildung und nicht für das Abrufen des Gelernten benötigt. Pigment dispersing factor (PDF) ist ein Neuropeptid, das von Neuronen der inneren Uhr gebildet wird (Park and Hall, 1998; Park et al., 2000; Helfrich-Förster, 2009). Die pdf01-Mutante ist nicht in der Lage ein signifikantes zeitbezogenes olfaktorisches Gedächtnis zu bilden. PDF wird von jeweils einer Gruppe von 8 Neuronen pro Hemisphäre, die die kleinen und großen ventral-lateralen Neuronen umfaßt, sezerniert. Die Wiederherstellung der Expression von PDF in diesen 16 Neuronen im pdf01 Mutanten Hintergrund, rettet das zeitabhängige olfaktorische Gedächtnis. Das PDF-Neuropeptid aktiviert einen sieben-Transmembran-G-Protein- gekoppelten Rezeptor (PDFR), der weit verbreitet im Fliegenhirn exprimiert wird (Hyun et al., 2005). Diese Studie zeigt, daß die Expression von PDFR in ~ 10 dorsalen Neuronen (DN1p) für eine robuste zeitabhängige olfaktorische Gedächtnisbildung in Fliegen ausreicht. Zusammenfassend läßt sich sagen, daß Fliegen verschiedene endogene Oszillatoren benutzen um ein zeitabhängiges olfaktorische Gedächtnis zu bilden und abzurufen. Der erste Oszillator ist lichtabhängig und wahrscheinlich durch das PDF- Neuropeptid vermittelt. Es ermöglicht die Verwendung der Information 'Zeit' als assoziatives Signal während der appetitiven Konditionierung. Im Gegensatz dazu ist die zweite Uhr lichtunabhängig und vermittelt speziell die Zeitinformation für die Gedächtnisabfrage. Die Identität der zweiten Uhr und der zugrunde liegende Mechanismus sowie die zugrunde liegende Kommunikation zwischen den Neuronen, bedarf weiterer Untersuchungen. KW - Learning and memory KW - Circadian rhythms KW - Odor-feeding-time memory KW - Taufliege KW - Tagesrhythmus KW - Geruchswahrnehmung KW - Konditionierung KW - Molekulargenetik Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-145675 ER - TY - THES A1 - Cook, Mandy T1 - The neurodegenerative Drosophila melanogaster AMPK mutant loechrig T1 - The neurodegenerative Drosophila melanogaster AMPK Mutante loechrig N2 - In dieser Doktorarbeit wird die Drosophila Mutante loechrig (loe), die progressive Degeneration des Nervensystems aufweist, weiter beschrieben. In der loe Mutante fehlt eine neuronale Isoform der γ- Untereinheit der Proteinkinase AMPK (AMP-activated protein kinase). Die heterotrimere AMPK (auch als SNF4Aγ bekannt) kontrolliert das Energieniveau der Zelle, was ständiges Beobachten des ATP/AMP- Verhältnis erfordert. AMPK wird durch niedrige Energiekonzentrationen und Beeinträchtigungen im Metabolismus, wie zum Beispiel Sauerstoffmangel, aktiviert und reguliert mehrere wichtige Signaltransduktionswege, die den Zellmetabolismus kontrollieren. Jedoch ist die Rolle von AMPK im neuronalen Überleben noch unklar. Eines der Proteine, dass von AMPK reguliert wird, ist HMGR (hydroxymethylglutaryl-CoA- reductase), ein Schlüsselenzym in der Cholesterin- und Isoprenoidsynthese. Es wurde gezeigt, dass wenn die Konzentration von HMGR manipuliert wird, auch der Schweregrad des neurodegenerativen Phänotyps in loe beeinflusst wird. Obwohl die regulatorische Rolle von AMPK auf HMGR in Drosophila konserviert ist, können Insekten Cholesterin nicht de novo synthetisieren. Dennoch ist der Syntheseweg von Isoprenoiden zwischen Vertebraten und Insekten evolutionär konserviert. Isoprenylierung von Proteinen, wie zum Beispiel von kleinen G-Proteinen, stellt den Proteinen einen hydophobischen Anker bereit, mit denen sie sich an die Zellmembran binden können, was in anschließender Aktivierung resultieren kann. In dieser Doktorarbeit wird gezeigt, dass die loe Mutation die Prenylierung von Rho1 und den LIM-Kinasesignalweg beeinflusst, was eine wichtige Rolle im Umsatz von Aktin und axonalem Auswachsen spielt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Mutation in LOE, Hyperaktivität des Isoprenoidsynthesewegs verursacht, was zur erhöhten Farnesylierung von Rho1 und einer dementsprechend höheren Konzentration von Phospho- Cofilin führt. Eine Mutation in Rho1 verbessert den neurodegenerativen Phänotyp und die Lebenserwartung von loe. Der Anstieg vom inaktiven Cofilin in loe führt zu einer Zunahme von filamentösen Aktin. Aktin ist am Auswachen von Neuronen beteiligt und Experimente in denen loe Neurone analysiert wurden, gaben wertvolle Einblicke in eine mögliche Rolle die AMPK, und dementsprechend Aktin, im Neuronenwachstum spielt. Des Weiteren wurde demonstriert, dass Neurone, die von der loe Mutante stamen, einen verlangsamten axonalen Transport aufweisen, was darauf hinweist dass Veränderungen, die durch den Einfluss von loe auf den Rho1 Signalweg im Zytoskelettnetzwerk hervorgerufen wurden, zur Störung des axonalen Transports und anschließenden neuronalen Tod führen. Es zeigte außerdem, dass Aktin nicht nur am neuronalen Auswachsen beteiligt ist, sondern auch wichtig für die Aufrechterhaltung von Neuronen ist. Das bedeutet, dass Änderungen der Aktindynamik zur progressiven Degeneration von Neuronen führen kann. Zusammenfassend unterstreichen diese Ergebnisse die wichtige Bedeutung von AMPK in den Funktionen und im Überleben von Neuronen und eröffnen einen neuartigen funktionellen Mechanismus in dem Änderungen in AMPK neuronale Degeneration hervorrufen kann. N2 - In this thesis the Drosophila mutant loechrig (loe), that shows progressive degeneration of the nervous system, is further described. Loe is missing a neuronal isoform of the protein kinase AMPK γ subunit (AMP-activated protein kinase- also known as SNF4Aγ) The heterotrimeric AMPK controls the energy level of the cell, which requires constant monitoring of the ATP/AMP levels. It is activated by low energy levels and metabolic insults like oxygen starvation and regulates multiple important signal pathways that control cell metabolism. Still, its role in neuronal survival is unclear. One of AMPK’s downstream targets is HMGR (hydroxymethylglutaryl-CoA- reductase), a key enzyme in cholesterol and isoprenoid synthesis. It has been shown that manipulating the levels of HMGR affects the severity of the neurodegenerative phenotype in loe. Whereas the regulatory role of AMPK on HMGR is conserved in Drosophila, insects cannot synthesize cholesterol de novo. However, the synthesis of isoprenoids is a pathway that is evolutionarily conserved between vertebrates and insects. Isoprenylation of target proteins like small G-proteins provides a hydrophobic anchor that allows the association of these proteins with membranes and following activation. This thesis shows that the loe mutation interferes with the prenylation of Rho1 and the regulation of the LIM kinase pathway, which plays an important role in actin turnover and axonal outgrowth. The results suggest that the mutation in LOE, causes hyperactivity of the isoprenoid synthesis pathway, which leads to increased farnesylation of RHO1 and therefore higher levels of phospho-cofilin. A mutation in Rho1 improves the neurodegenerative phenotype and life span. The increased inactive cofilin amount in loe leads to an up regulation of filamentous actin. Actin is involved in neuronal outgrowth and experiments analyzing loe neurons gave valuable insights into a possible role of AMPK and accordingly actin on neurite growth and stability. It was demonstrated that neurons derived from loe mutants exhibit reduces axonal transport suggesting that changes in the cytoskeletal network caused by the effect of loe on the Rho1 pathway lead to disruptions in axonal transport and subsequent neuronal death. It also shows that actin is not only involved in neuronal outgrowth, its also important in maintenance of neurons, suggesting that interference with actin dynamics leads to progressive degeneration of neurons. Together, these results further support the importance of AMPK in neuronal function and survival and provide a novel functional mechanisms how alterations in AMPK can cause neuronal degeneration KW - Taufliege KW - Nervendegeneration KW - AMP KW - Proteinkinasen KW - Molekulargenetik KW - Drosophila KW - Neurodegeneration KW - AMPK KW - Drosophila KW - Neurodegeneration KW - Rho Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72027 ER - TY - THES A1 - Cruz, Alexandre Bettencourt da T1 - Molecular and functional characterization of the swiss-cheese and olk mutants in Drosophila melanogaster : two approaches to killing neurons T1 - Molekulare und funktionelle Untersuchung der swiss-cheese und olk Mutanten in Drosophila melanogaster N2 - In this thesis two genes involved in causing neurodegenerative phenotypes in Drosophila are described. olk (omb-like), a futsch allele, is a micotubule associated protein (MAP) which is homologous to MAP1B and sws (swiss cheese) a serine esterase of yet unknown function within the nervous system. The lack of either one of these genes causes progressive neurodegeneration in two different ways. The sws mutant is characterized by general degeneration of the adult nervous system, glial hyperwrapping and neuronal apoptosis. Deletion of NTE (neuropathy target esterase), the SWS homolog in vertebrates, has been shown to cause a similar pattern of progressive neural degeneration in mice. NTE reacts with organophosphates causing axonal degeneration in humans. Inhibition of vertebrate NTE is insufficient to induce paralyzing axonal degeneration, a reaction called "aging reaction" is necessary for the disease to set in. It is hypothesized that a second "non-esterase" function of NTE is responsible for this phenomenon. The biological function of SWS within the nervous system is still unknown. To characterize the function of this protein several transgenic fly lines expressing different mutated forms of SWS were established. The controlled expression of altered SWS protein with the GAL4/UAS system allowed the analysis of isolated parts of the protein that were altered in the respective constructs. The characterization of a possible non-esterase function was of particular interest in these experiments. One previously described aberrant SWS construct lacking the first 80 amino acids (SWSΔ1-80) showed a deleterious, dominant effect when overexpressed and was used as a model for organophosphate (OP) intoxication. This construct retains part of its detrimental effect even without catalytically active serine esterase function. This strongly suggests that there is another characteristic to SWS that is not defined solely by its serine esterase activity. Experiments analyzing the lipid contents of sws mutant, wildtype (wt) and SWS overexpressing flies gave valuable insights into a possible biological function of SWS. Phosphatidylcholine, a major component of cell membranes, accumulates in sws mutants whereas it is depleted in SWS overexpressing flies. This suggests that SWS is involved in phosphatidylcholine regulation. The produced α-SWS antibody made it possible to study the intracellular localization of SWS. Images of double stainings with ER (endoplasmic reticulum) markers show that SWS is in great part localized to the ER. This is consistent with findings of SWS/ NTE localization in yeast and mouse cells. The olk mutant also shows progressive neurodegeneration but it is more localized to the olfactory system and mushroom bodies. Regarding specific cell types it seemed that specifically the projection neurons (PNs) are affected. A behavioral phenotype consisting of poor olfactory memory compared to wt is also observed even before histologically visible neurodegeneration sets in. Considering that the projection neurons connect the antennal lobes to the mushroom bodies, widely regarded as the "learning center", this impairment was expected. Three mutants where identified (olk1-3) by complementation analysis with the previously known futschN94 allele and sequencing of the coding sequence of olk1 revealed a nonsense mutation early in the protein. Consistent with the predicted function of Futsch as a microtubule associated protein (MAP), abnormalities are most likely due to a defective microtubule network and defects in axonal transport. In histological sections a modified cytoskeletal network is observed and western blots confirm a difference in the amount of tubulin present in the olk1 mutant versus the wt. The elaboration of neuronal axons and dendrites is dependent on a functional cytoskeleton. Observation of transport processes in primary neural cultures derived from olk1 mutant flies also showed a reduction of mitochondrial transport. Interaction with the fragile X mental retardation gene (dfmr1) was observed with the olk mutant. A dfmr1/ olk1 double mutant shows an ameliorated phenotype compared to the olk1 single mutant. tau, another MAP gene, was also shown to be able to partially rescue the olk1 mutant. N2 - In dieser Arbeit werden zwei neurodegenerative Mutanten in Drosophila beschrieben. Zum einen drei Allele des futsch Gens namens olk (omb-like). futsch wurde bereits als Mikrotubuli assoziertes Protein (MAP) beschrieben und ist als MAP1B Ortholog identifiziert worden. Zum anderen sws (swiss cheese), eine Serinesterase, deren Funktion im Nervensystem noch unbekannt ist. In sws mutanten Fliegen ist Vakuolisierung im gesamten Gehirn sichtbar, es handelt sich um einen generellen, progressiven, neurodegenerativen Phänotyp. Neuronale Apoptose wie auch multiple Membranhüllen um Gliazellen sind für die sws Mutanten charakteristisch. Die biologische Funktion von SWS innerhalb des Nervensystems ist bisher noch nicht geklärt. Vertebraten, die für das sws Ortholog NTE (neuropathy target esterase) mutant sind, zeigen einen ähnlichen Phänotyp wie sws mutante Fliegen. Auch Vergiftung von NTE mit Organophosphaten kann zu axonaler Degeneration führen. Dabei ist jedoch die Inhibition von NTE nicht ausreichend um die Axondegeneration hervorzurufen. Eine weitere Reaktion, die sogenannte "Aging reaction" is notwendig um die paralysierende Wirkung auszulösen. Eine These besagt, dass NTE eine zweite, von der Esterasefunktion unabhängige Funktion ("Nicht-Esterase" Funktion) besitzt, die diese Wirkung auslöst. Zur Aufklärung der physiologischen Funktion von SWS wurden verschiedene transgene Fliegenlinien etabliert. Diese produzieren verschiedene, mutierte Formen des SWS Proteins, dessen Expression mit Hilfe des GAL4/ UAS Systems genau gesteuert werden kann. Diese Methode erlaubt eine eingehende Untersuchung einzelner Proteindomänen, die in den jeweiligen Konstrukten verändert waren. Insbesondere die Charakterisierung der möglichen "Nicht-Esterase" Funktion war von Interesse. Eine bereits beschriebene mutante Form des SWS Proteins, dem die ersten 80 Aminosäuren fehlen (SWSΔ1-80), zeigte einen dominanten degenerativen Effekt. Die Überexpression von SWSΔ1-80 führt, wie auch die Vergiftung mit bestimmten Organophosphaten, zur Degeneration der betroffenen Zellen und wurde deshalb als Modell für Organophosphatvergiftung herangezogen. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Konstrukt auch dann einen schädlichen Effekt zeigt, wenn die katalytische Serinesterasefähigkeit durch Mutation entfernt wurde. Dies deutet die Möglichkeit an, dass SWS eine, von der Esteraseaktivität unhabhängige, Funktion ausüben kann. Ein Vergleich des Lipidgehalts von sws Mutanten mit wt und SWS überexprimierenden Fliegen gab wertvolle Hinweise auf eine mögliche biologische Funktion von SWS. Der Gehalt an Phosphatidylcholin, ein Hauptbestandteil von Zellmembranen, scheint in sws Mutanten erhöht zu sein, während es in SWS überexprimierenden Fliegen in geringeren Mengen zu finden ist. Dies weist darauf hin, dass SWS an der Phosphatidylcholinregulation beteiligt sein könnte. Der in dieser Arbeit hergestellte α-SWS Antikörper ermöglichte eine genauere intrazelluläre Lokalisation des SWS Proteins. Doppelfärbungen mit einem ER (Endoplasmatisches Retikulum) Marker zeigen, dass ein grosser Anteil von SWS im ER zu finden ist. Dies stimmt mit den kürzlich veröffentlichten Ergebnisse zur Lokalisation von SWS/ NTE in Hefe- und Mauszellen überein. Die olk Mutante zeigt ebenfalls progressive Neurodegeneration, die Effekte sind jedoch lokaler, insbesondere das olfaktorische System und die Pilzkörper sind betroffen. Die Projektionsneurone (PN) degenerieren in dieser Mutante innerhalb von etwa 20 Tagen. Noch vor der histologisch sichtbaren Degeneration ist bereits ein Verhaltensphänotyp erkennbar, der sich in schlechter, olfaktorischen Lernleistung äussert. Projektionsneurone verbinden die Antennalloben und die Pilzkörper, die als "Lernzentren" gelten, daher entspricht ein Lerndefekt den Erwartungen. Die drei olk Mutanten (olk1-3) wurden durch Komplementationstests mit dem publizierten futschN94 Allel als weitere futsch Allele identifiziert. In olk1 zeigte die Sequenzierung der kodierenden Sequenz eine Mutation, die frühzeitig zu einem Stopcodon im Protein führt. Die Degenerationserscheinungen in der Mutanten sind vermutlich auf Defekte im Mikrotubulinetzwek und axonalen Transport zurück zu führen. In histologischen Gehirnschnitten sind Veränderungen im Zytoskelett zu beobachten und Western Blots deuten auf einen erhöhten Tubulingehalt in der olk1 Mutante hin. Für die Entwicklung von Axonen und Dendriten ist ein intaktes Zytoskelett unentbehrlich. Transportprozesse sind in olk1 Mutanten ebenso betroffen, insbesondere ist der mitochondriale Transport reduziert. Das fragile X mental retardation Gen (dfmr1) interagiert mit der olk Mutante, so dass eine dfmr1/ olk1 Doppelmutante einen weniger starken Phänotyp zeigt als die olk1 Mutante. tau, ein weiteres MAP Gen, besitzt ebenso die Fähigkeit den olk1 Phänotyp partiell zu suprimieren. KW - Taufliege KW - Nervendegeneration KW - Molekulargenetik KW - Drosophila KW - Neurodegeneration KW - futsch KW - MAP KW - swiss-cheese KW - Drosophila KW - neurodegeneration KW - futsch KW - MAP KW - swiss-cheese Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-17734 ER - TY - THES A1 - Dusik, Verena T1 - Immunhistochemische und funktionelle Charakterisierung der Mitogen-aktivierten Proteinkinase p38 in der inneren Uhr von Drosophila melanogaster T1 - Immunhistochemical and functional characterisation of the mitogen-activated protein kinase p38 in the endogenous clock of Drosophila melanogaster N2 - Circadianes und Stress-System sind zwei physiologische Systeme, die dem Organismus helfen sich an Veränderungen ihrer Umwelt anzupassen. Während letzteres spontane und schnelle Antworten auf akute, unvorhersehbare Umweltreize liefert, sagt das circadiane System täglich wiederkehrende Ereignisse vorher and bereitet den Organismus so vorzeitig auf diese nahende Umweltveränderung vor. Dennoch, trotz dieser unterschiedlichen Reaktionsmechanismen agieren beide Systeme nicht komplett autonom. Studien der vergangen Jahre belegen vielmehr eine Interaktion beider Systeme. So postulieren sie zum einem Unterschiede in der Stressantwort in Abhängigkeit von der Tageszeit zu der der Reiz auftritt und weisen zugleich auf eine Zunahme von gestörten biologischen Tagesrhythmen, wie zum Beispiel Schlafstörungen, in Folge von unkontrollierten oder exzessiven Stress hin. Ebenso liefern kürzlich durchgeführte Studien an Vertebraten und Pilzen Hinweise, dass mit p38, eine Stress-aktivierte Kinase, an der Signalweiterleitung zur inneren Uhr beteiligt ist (Hayashi et al., 2003), sogar durch dieses endogene Zeitmesssystem reguliert wird (Vitalini et al., 2007; Lamb et al., 2011) und deuten damit erstmals eine mögliche Verbindung zwischen Stress-induzierten und regulären rhythmischen Anpassungen des Organismus an Umweltveränderungen an. Molekulare und zelluläre Mechanismen dieser Verknüpfung sind bisher noch nicht bekannt. Während die Rolle von p38 MAPK bei der Stress- und Immunantwort in Drosophila melanogaster gut charakterisiert ist, wurden Expression und Funktion von p38 in der inneren Uhr hingegen bislang nicht untersucht. Die hier vorliegende Arbeit hatte daher zum Ziel mittels immunhistochemischer, verhaltensphysiologischer und molekularer Methoden eine mögliche Rolle der Stress-aktivierten Kinase im circadianen System der Fliege aufzudecken. Antikörperfärbungen sowie Studien mit Reporterlinien zeigen deutliche Färbesignale in den s-LNv, l-LNv und DN1a und erbringen erstmals einen Nachweis für p38 Expression in den Uhrneuronen der Fliege. Ebenso scheint die Aktivität von p38 MAPK in den DN1a uhrgesteuert zu sein. So liegt p38 vermehrt in seiner aktiven Form in der Dunkelphase vor und zeigt, neben seiner circadian regulierten Aktivierung, zusätzlich auch eine Inaktivierung durch Licht. 15-Minuten-Lichtpulse in der subjektiven Nacht führen zu einer signifikanten Reduktion von aktivierter, phosphorylierter p38 MAPK in den DN1a von Canton S Wildtypfliegen im Vergleich zu Fliegen ohne Lichtpuls-Behandlung. Aufzeichnungen der Lokomotoraktivität offenbaren zusätzlich die Notwendigkeit von p38 MAPK für wildtypisches Timing der Abendaktivität sowie zum Erhalt von 24-Stunden-Verhaltensrhythmen unter konstanten Dauerdunkel-Bedindungen. So zeigen Fliegen mit reduzierten p38 Level in Uhrneuronen einen verzögerten Beginn der Abendaktivität und stark verlängerte Freilaufperioden. In Übereinstimmung mit Effekten auf das Laufverhalten scheint darüber hinaus die Expression einer dominant-negativen Form von p38b in Drosophila’s wichtigsten Uhrneuronen eine verspätete nukleäre Translokation von Period zur Folge zu haben. Westernblots legen zusätzlich einen Einfluss von p38 auf den Phosphorylierungsgrad von Period nahe und liefern damit einen mögliche Erklärung für den verspäteten Kerneintritt des Uhrproteins. Abschließende Stützung der Westernblotergebnisse bringen in vitro Kinasenassays und deuten auf p38 als eine potentielle „Uhrkinase“ hin, welche auch in vivo Period an Serin 661 sowie weiteren potentiellen Phosphorylierungsstellen phosphorylieren könnte. Zusammengenommen deuten die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit eindeutig auf eine bedeutende Rolle von p38, neben dessen Funkion im Stress-System, auch im circadianen System der Fliege hin und offenbaren damit die Möglichkeit, dass p38 als Schnittstelle zwischen beider Systeme fungiert. N2 - The circadian and the stress system are two distinct physiological systems that help the organism to adapt to environmental challenges. While the latter elicits reactive responses to acute environmental changes, the circadian system predicts daily occurring alterations and prepares the organism in advance. However, despite of these differences both responses are not mutually exclusive. Studies in the last years obviously prove a strong interaction between both systems showing a strong time-related stress response depending on the time of day of stressor presentation on the one hand and increased disturbances of daily rhythms, like sleep disorders, in consequence of uncontrolled or excessive stress on the other. In line with this fact, recent studies in vertebrates and fungi indicate that p38, a stress-activated Kinase, is involved in signaling to the circadian clock (Hayashi et al., 2003) and in turn is additionally regulated by this timekeeping system (Vitalini et al., 2007; Lamb et al., 2011) providing an interesting link between stress-induced and regularly rhythmic adaptations of the organism to environmental changes. However, little is known about molecular and cellular mechanisms of this interconnection. In Drosophila melanogaster the role of p38 MAPK is well characterized in terms of immune and stress response, p38 expression and function in the circadian clock has not been reported so far. Therefore, the present thesis aimed to elucidate a putative role of the stress-activated Kinase in the fly’s circadian system using an immunohistochemical, behavioral as well as molecular approach. Surprisingly, for the first time antibody as well as reporterline studies cleary prove p38 expression in Drosophila clock neurons showing visible staining in s-LNvs, l-LNvs and DN1as. Moreover p38 MAPK in DN1as seems to be activated in a clock-dependent manner. p38 is most active under darkness and, besides its circadian activation, additionally gets inactivated by light. 15 minutes light pulse applied during the dark phase lead to a significant reduction in phosphorylated and activated p38 MAPK in Canton S wildtype flies compared to flies without light pulse treatment. In addition, locomotor activity recordings reveal that p38 is essential for a wild-type timing of evening activity and for maintaining ~24h behavioral rhythms under constant darkness. Flies with reduced p38 activity in clock neurons show delayed evening activity onsets and drastically lengthened the period of their free-running rhythms. In line with these effects on locomotor behavior, the nuclear translocation of the clock protein Period is significantly delayed on the expression of a dominant-negative form of p38b in Drosophila’s most important clock neurons. Western Blots reveal that p38 affects the phosphorylation degree of Period, what is likely the reason for its effects on nuclear entry of Period. In vitro kinase assays additionally confirm the Western Blot results and point to p38 as a potential “clock kinase” phosphorylating Period at Serin 661 and putative phosphorylation sites. Taken together, the results of the present thesis clearly indicate a prominent role of p38 in the circadian system of the fly besides its function in stress-input pathways und open up the possibility of p38 MAPK being a nodal point of both physiological systems. KW - Taufliege KW - Biologische Uhr KW - MAP-Kinase KW - Innere Uhr KW - MAPK KW - p38 KW - Phosphorylierung KW - Mitogen-aktivierte Proteinkinase KW - Drosophila melanogaster KW - Circadiane Rhythmen KW - Drosophila Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-124636 ER - TY - THES A1 - Eck, Saskia T1 - The impact of thermogenetic depolarizations of specific clock neurons on Drosophila melanogaster's circadian clock T1 - Der Einfluss thermogenetischer Depolarisationen spezifischer Uhrneurone auf Drosophila melanogasters circadiane Uhr N2 - The rotation of the earth around its own axis determines periodically changing environmental conditions, like alterations in light and temperature. For the purpose of adapting all organisms’ behavior, physiology and metabolism to recurring changes, endogenous clocks have evolved, which allow the organisms to anticipate environmental changes. In chronobiology, the scientific field dealing with the investigation of the underlying mechanisms of the endogenous clock, the fruit fly Drosophila melanogaster serves as a beneficial model organism. The fruit fly’s circadian clock exhibits a rather simple anatomical organization, but nevertheless constitutes homologies to the mammalian system. Thus also in this PhD-thesis the fruit fly was used to decipher general features of the circadian clock’s interneuronal communication. Drosophila melanogaster’s circadian clock consists of about 150 clock neurons, which are located in the central nervous system of the fly. These clock neurons can be subdivided regarding to their anatomical position in the brain into the dorsal neurons (DN1s, DN2s, DN3s), as well as into the lateral neurons (LPNs, LNds, s-LNvs, l-LNvs). Functionally these clock neuron clusters can be classified as Morning- and Evening oscillators (M- and E- oscillators), driving different parts of the fly’s locomotor activity in light-dark conditions (LD). The Morning-oscillators are represented by the s-LNvs and are known to be the main pacemakers, driving the pace of the clock in constant conditions (constant darkness; DD). The group of Evening-oscillators consists of the LNds, the DN1s and the 5th s-LNv and is important for the proper timing of the evening activity in LD. All of these clock neurons are not functionally independent, but form complex neuronal connections, which are highly plastic in their response to different environmental stimuli (Zeitgebers), like light or temperature. Even though a lot is known about the function and the importance of some clock neuron clusters, the exact interplay between the neurons is not fully known yet. To investigate the mechanisms, which are involved in communication processes among different clock neurons, we depolarized specific clock cells in a temporally and cell-type restricted manner using dTrpA1, a thermosensitive cation channel, which allows the depolarization of neurons by application of temperature pulses (TP) above 29°C to the intact and freely moving fly. Using different clock specific GAL4-driver lines and applying TPs at different time points within the circadian cycle in DD enabled us with the help of phase shift experiments to draw conclusions on the properties of the endogenous clock. The obtained phase shifts in locomotor behavior elicited by specific clock neuronal activation were plotted as phase response curves (PRCs). The depolarization of all clock neurons shifted the phase of activity the strongest, especially in the delay zone of the PRC. The exclusive depolarization of the M oscillators together with the l-LNvs (PDF+ neurons: s-LNvs & l-LNvs) caused shifts in the delay and in the advance zone as well, however the advances were severely enhanced in their temporal occurrence ranging into the subjective day. We concluded that light might have inhibitory effects on the PDF+ cells in that particular part of the PRC, as typical light PRCs do not exhibit that kind of distinctive advances. By completely excluding light in the PRC-experiments of this PhD-thesis, this photic inhibitory input to the PDF+ neurons is missing, probably causing the broadened advance zone. These findings suggest the existence of an inhibitory light-input pathway to the PDF+ cells from the photoreceptive organs (Hofbauer-Buchner eyelet, photoreceptor cells of compound eyes, ocelli) or from other clock neurons, which might inhibit phase advances during the subjective day. To get an impression of the molecular state of the clock in the delay and advance zone, staining experiments against Period (PER), one of the most important core clock components, and against the neuropeptide Pigment Dispersing Factor (PDF) were performed. The cycling of PER levels mirrored the behavioral phase shifts in experimental flies, whereas the controls were widely unaffected. As just those neurons, which had been depolarized, exhibited immediate shifted PER oscillations, this effect has to be rapidly regulated in a cell-autonomous manner. However, the molecular link between clock neuron depolarization and shifts in the molecular clock’s cycling is still missing. This issue was addressed by CREB (cAMP responsive element binding protein) quantification in the large ventrolateral neurons (l-LNvs), as these neurons responded unexpectedly and strongest to the artificial depolarization exhibiting a huge increase in PER levels. It had been previously suggested that CREB is involved in circadian rhythms by binding to regulatory sequences of the period gene (Belvin et al., 1999), thus activating its transcription. We were able to show, that CREB levels in the l-LNvs are under circadian regulation, as they exhibit higher CREB levels at the end of the subjective night relative to the end of the subjective day. That effect was further reinforced by artificial depolarization, independently of the time point of depolarization. Furthermore the data indicate that rises in CREB levels are coinciding with the time point of increases of PER levels in the l-LNvs, suggesting CREB being the molecular link between the neuronal electrical state and the molecular clock. Taking together, the results indicate that a temporal depolarization using dTrpA1 is able to significantly phase shift the clock on the behavioral and protein level. An artificial depolarization at the beginning of the subjective night caused phase delays, whereas a depolarization at the end of the subjective night resulted in advances. The activation of all clock neurons caused a PRC that roughly resembled a light-PRC. However, the depolarization of the PDF+ neurons led to a PRC exhibiting a shape that did not resemble that of a light-mediated PRC, indicating the complex processing ability of excitatory and inhibitory input by the circadian clock. Even though this experimental approach is highly artificial, just the exclusion of light-inputs enabled us to draw novel conclusions on the network communication and its light input pathways. N2 - Die Rotation der Erde um ihre eigene Achse hat periodisch verändernde Umweltbedingungen, wie beispielsweise Veränderungen in den Lichtverhältnissen und der Temperatur, zur Folge. Um das Verhalten, die Physiologie und den Metabolismus eines Organismus an stets wiederkehrende Veränderungen anzupassen, haben sich endogene/circadiane Uhren entwickelt, die es dem Organismus erlauben diese Umweltbedingungen zu antizipieren. In der Chronobiologie, einem wissenschaftlichen Fachbereich, der sich mit der Untersuchung der zugrunde liegenden Mechanismen der Inneren Uhr befasst, dient die Taufliege Drosophila melanogaster als nützlicher Modellorganismus. Die Innere Uhr der Taufliege ist anatomisch eher einfach organisiert, weist trotz alledem jedoch Homologien zum Säugersystem auf. Auch im Rahmen dieser Doktorarbeit diente die Taufliege daher dazu grundlegende Netzwerkeigenschaften der circadianen Uhr zu untersuchen. Die Innere Uhr von Drosophila melanogaster besteht aus ungefähr 150 Uhrneuronen, die sich im zentralen Nervensystem der Fliege befinden. Diese Uhrneurone können, bezüglich ihrer anatomischen Position im Gehirn in die Gruppe der dorsalen Neurone (DN1, DN2, DN3), sowie in die der lateralen Neurone untergliedert werden (LPN, LNd, s-LNv, l-LNv). Funktionell werden diese Uhrneuronengruppen als Morgen- und Abendoszillatoren (M- und E-Oszillatoren) klassifiziert, da sie für unterschiedliche Verhaltensanteile in der Laufaktivität der Fliege unter Licht-Dunkel-Verhältnissen (LD) verantwortlich sind. Die s-LNv stellen dabei die Morgenoszillatoren (M-Oszillatoren) dar und werden als Hauptschrittmacher betrachtet, da sie die Geschwindigkeit der Uhr unter konstanten Bedingungen (Dauerdunkel; DD) bestimmen. Die Gruppe der Abendoszillatoren (EOszillatoren) besteht aus den LNd, einigen DN1 und der fünften s-LNv (5th s-LNv) und ist für die richtige Terminierung der Abendaktivität in LD zuständig. All diese Uhrneurone sind funktionell nicht unabhängig voneinander, sondern bilden komplexe neuronale Verschaltungen untereinander aus, die durch einen hohen Grad an Plastizität bezüglich ihrer Reaktion auf unterschiedliche Umweltparameter (Zeitgeber), wie Licht oder Temperatur, gekennzeichnet sind. Obwohl bereits vieles hinsichtlich der Funktion und der Bedeutung einiger Gruppen von Uhrneuronen bekannt ist, ist das genaue Zusammenspiel unter ihnen immer noch recht unklar. Um die Mechanismen, die in den Kommunikationsprozessen zwischen verschiedenen Uhrneuronen involviert sind, zu untersuchen, machten wir Gebrauch von dTrpA1, einem thermosensitiven Kationenkanal, der es durch die Applizierung von Temperaturpulsen (TP) über 29°C ermöglicht, Neuronen in der intakten und sich frei bewegenden Fliege zeitlich begrenzt und zellspezifisch zu depolarisieren. Mithilfe verschiedener Uhr-spezifischer GAL4-Treiberlinien und der Verabreichung von TP zu verschiedenen Zeitpunkten des circadianen Zyklus in DD, war es uns möglich Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Inneren Uhr anhand von Phasen-Verschiebungsexperimenten zu ziehen. Die hervorgerufenen Phasenverschiebungen im Laufverhalten, die durch die Aktivierung spezieller Uhrneuronen hervorgerufen wurden, wurden dabei als Phasen Responz Kurve (engl. phase response curve; PRC) dargestellt. Die Depolarisierung aller Uhrneurone verschob die Phase der Aktivität am stärksten, insbesondere in der Phasen-Verzögerungszone der PRC. Wurden ausschließlich die M-Oszillatoren zusammen mit den l-LNv (PDF+ Neurone: s-LNv & l-LNv) depolarisiert, wurden ebenso Phasenverschiebungen nach vorne, wie auch nach hinten hervorgerufen, jedoch reichten die Verschiebungen nach vorne deutlich in den subjektiven Tag hinein. Daraus schlussfolgerten wir, dass Licht inhibitorischen Einfluss in diesem Bereich der PRC haben muss, da typische Licht-PRCs nicht derart ausgeprägte Vorverschiebungen aufweisen. Aufgrund des vollständigen Lichtausschlusses in den PRC-Versuchen dieser Doktorarbeit fehlt jedoch dieser Licht-vermittelte inhibitorische Einfluss zu den PDF+ Neuronen und führt daher zur zeitlich stark ausgeprägten Phasen-Vorverschiebungszone. Diese Ergebnisse lassen daher vermuten, dass ein inhibitorisch wirkender Licht-vermittelter Eingang zu den PDF+ Neuronen von den photorezeptiven Organen (Hofbauer-Buchner Äuglein, Photorezeptoren der Komplexaugen, Ocellen) oder von anderen Uhrneuronen existieren muss, der die Phasen-Vorverschiebungen während des subjektiven Tages unterdrückt. Um Kenntnis über den molekularen Status der Uhr in der Verzögerungs- und Phasen-Vorverschiebungszone zu erlangen, wurden Färbungen gegen das Protein Period (PER), eines der zentralen Bestandteile der Inneren Uhr und gegen das Neuropeptid Pigment Dispersing Factor (PDF) angefertigt. Der zeitliche Verlauf im Auf- und Abbau des PER Proteins spiegelte die Phasenverschiebungen im Verhalten der Experimentalfliegen wider, wohingegen die Kontrollen weitestgehend unauffällig blieben. Zudem waren nur diejenigen Neurone von einer unmittelbaren Verschiebung der PER Protein Oszillation betroffen, die depolarisiert wurden, was auf einen schnellen Zell-autonomen Prozess schließen lässt. Die molekulare Verknüpfung, die zwischen der Depolarisation der Uhrneuronen und der Verschiebung der molekularen Uhr-Oszillation fungiert, ist immer noch unbekannt. Diesem Thema wurde nachgegangen, indem CREB (engl. cAMP responsive element binding protein) in den großen ventrolateralen Neuronen (l-LNv) quantifiziert wurde, da diese Neuronen unerwarteterweise und am wirksamsten auf die artifizielle Depolarisation mit einer starken PER-Akkumulation reagiert haben. In vorherigen Arbeiten wurde bereits angenommen, dass CREB in die circadiane Rhythmik involviert sei, indem es an Regulationssequenzen des period Gens bindet (Belvin et al., 1999) und somit dessen Transkription aktiviert. Wir konnten zeigen, dass die Menge an CREB Protein in den l-LNv circadian reguliert wird, da diese am Ende der subjektiven Nacht im Vergleich zum Ende des subjektiven Tages deutlich erhöht ist. Dieser Effekt konnte durch die artifizielle Depolarisation, aber unabhängig von deren Zeitpunkt, weiter verstärkt werden. Zudem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Akkumulation des CREB Proteins mit dem Zeitpunkt des Anstiegs des PER Proteins in den l-LNv koinzidiert. Das lässt die Vermutung zu, dass CREB als molekulare Verbindung zwischen dem elektrischen neuronalen Status und der molekularen Uhr dienen kann. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die zeitlich begrenzte Depolarisation mithilfe von dTrpA1 signifikante Phasenverschiebungen im Verhalten wie auch auf der Proteinebene hervorrufen kann. Eine artifizielle Depolarisation zu Beginn der subjektiven Nacht verursacht Phasenverschiebungen nach hinten, wohingegen eine Depolarisation zum Ende der subjektiven Nacht Phasenverschiebungen nach vorne zur Folge hat. Die Aktivierung aller Uhrneurone brachte eine PRC hervor, die weitestgehend einer Licht-PRC gleicht. Die Depolarisierung der PDF+ Zellen hingegen ergab eine PRC, die sich insbesondere bezüglich der ausgeprägten Phasen-Vorverschiebungszone von einer Licht-vermittelten PRC unterscheidet. Die Innere Uhr scheint somit die Fähigkeit zu besitzen, exzitatorische und inhibitorische Eingänge in komplexer Art und Weise zu verarbeiten. Obwohl der in dieser Doktorarbeit gewählte experimentelle Ansatz hochgradig artifiziell ist, war es uns gerade durch den Ausschluss von Licht möglich, neue Schlussfolgerungen bezüglich der Kommunikation innerhalb des Netzwerks und dessen Lichtinformations-Eingänge zu ziehen. KW - Chronobiologie KW - Circadian clock KW - Tagesrhythmus KW - Taufliege Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-137118 ER - TY - THES A1 - Ehmann, Nadine T1 - Linking the active zone ultrastructure to function in Drosophila T1 - Struktur-Funktions-Beziehungen an der aktiven Zone in Drosophila N2 - Accurate information transfer between neurons governs proper brain function. At chemical synapses, communication is mediated via neurotransmitter release from specialized presynaptic intercellular contact sites, so called active zones. Their molecular composition constitutes a precisely arranged framework that sets the stage for synaptic communication. Active zones contain a variety of proteins that deliver the speed, accuracy and plasticity inherent to neurotransmission. Though, how the molecular arrangement of these proteins influences active zone output is still ambiguous. Elucidating the nanoscopic organization of AZs has been hindered by the diffraction-limited resolution of conventional light microscopy, which is insufficient to resolve the active zone architecture on the nanometer scale. Recently, super-resolution techniques entered the field of neuroscience, which yield the capacity to bridge the gap in resolution between light and electron microscopy without losing molecular specificity. Here, localization microscopy methods are of special interest, as they can potentially deliver quantitative information about molecular distributions, even giving absolute numbers of proteins present within cellular nanodomains. This thesis puts forward an approach based on conventional immunohistochemistry to quantify endogenous protein organizations in situ by employing direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). Focussing on Bruchpilot (Brp) as a major component of Drosophila active zones, the results show that the cytomatrix at the active zone is composed of units, which comprise on average ~137 Brp molecules, most of which are arranged in approximately 15 heptameric clusters. To test for a quantitative relationship between active zone ultrastructure and synaptic output, Drosophila mutants and electrophysiology were employed. The findings indicate that the precise spatial arrangement of Brp reflects properties of short-term plasticity and distinguishes distinct mechanistic causes of synaptic depression. Moreover, functional diversification could be connected to a heretofore unrecognized ultrastructural gradient along a Drosophila motor neuron. N2 - Kommunikation zwischen Nervenzellen ist von grundlegender Bedeutung für die Hirnfunktion. An chemischen Synapsen findet diese an hoch spezialisierten interzellulären Kontaktstellen statt, den aktiven Zonen, welche die Voraussetzung für präzise Neurotransmission schaffen und somit die synaptische Kommunikation gewährleisten. In aktiven Zonen befindet sich eine Vielzahl von Proteinen dicht gepackt, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Plastizität der Signaltransduktion vermitteln. Bisher ist es jedoch unklar, in welcher Weise die molekularen Organisationsprinzipien dieser Proteine die Funktion der aktiven Zone beeinflussen. Teilweise ist dies dem Auflösungsvermögen konventioneller Lichtmikroskopie geschuldet, das nicht ausreicht um die Architektur der aktiven Zone im Nanometer Bereich aufzuklären. Unlängst jedoch haben neue Methoden der hochaufgelösten Fluoreszenzmikroskopie ihren Weg in die Neurowissenschaften gefunden. Diese sind in der Lage die Lücke zwischen optischer Lichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie zu schließen, ohne die Identität der Proteinspezies aus den Augen zu verlieren. Besonderes Interesse kommt hierbei sogenannten Lokalisationsmikroskopie Techniken zu. Diese können neben der Darstellung molekularer Organisationen im Idealfall sogar quantitative Informationen über die absolute Anzahl bestimmter Moleküle in subzellulären Bereichen liefern. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Methode entwickelt, die auf klassischer Immunohistochemie beruht und dSTORM (direct stochastic optical reconstruction microscopy) nutzt, um die endogene Proteinorganisation in situ zu quantifizieren. Fokussierend auf Brp (Bruchpilot), einem Protein an der aktiven Zone von Drosophila melanogaster, zeigen die Ergebnisse, dass die Zytomatrix an der aktiven Zone modular aufgebaut ist, wobei jedes Modul ~137 Brp Moleküle umfasst. Diese sind zum Großteil in etwa 15 Gruppen mit je 7 Untereinheiten angeordnet. Um auf einen quantitativen Zusammenhang zwischen der Ultrastruktur der aktiven Zone und ihrer Funktion zu schließen, wurden Drosophila Mutanten eingesetzt und mittels Elektrophysiologie funktionell untersucht. Die Ergebnisse veranschaulichen, dass sich spezifische Eigenschaften von Kurzzeitplastizität in der präzisen Anordnung von Brp widerspiegeln, was Rückschlüsse auf verschiedene Ursprünge synaptischer Depression zulässt. Darüber hinaus beschrieben dSTORM Experimente erstmals, dass ein funktioneller Gradient entlang des Motoneurons mit der graduellen Veränderung der Anzahl von Bruchpilotmolekülen pro aktive Zone korreliert. KW - Taufliege KW - Elektrophysiologie KW - Fluoreszenzmikroskopie KW - Synapse KW - Drosophila KW - active zone KW - structure-function relationships KW - super-resolution microscopy KW - electrophysiology KW - Synapses KW - Microscopy Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-118186 ER - TY - THES A1 - Engelhardt [geb. Christiansen], Frauke T1 - Synaptic Connectivity in the Mushroom Body Calyx of Drosophila melanogaster T1 - Synaptische Konnektivität im Pilzkörper Kalyx in Drosophila melanogaster N2 - Learning and memory is considered to require synaptic plasticity at presynaptic specializations of neurons. Kenyon cells are the intrinsic neurons of the primary olfactory learning center in the brain of arthropods – the mushroom body neuropils. An olfactory mushroom body memory trace is supposed to be located at the presynapses of Kenyon cells. In the calyx, a sub-compartment of the mushroom bodies, Kenyon cell dendrites receive olfactory input provided via projection neurons. Their output synapses, however, were thought to reside exclusively along their axonal projections outside the calyx, in the mushroom body lobes. By means of high-resolution imaging and with novel transgenic tools, we showed that the calyx of the fruit fly Drosophila melanogaster also comprised Kenyon cell presynapses. At these presynapses, synaptic vesicles were present, which were capable of neurotransmitter release upon stimulation. In addition, the newly identified Kenyon cell presynapses shared similarities with most other presynapses: their active zones, the sites of vesicle fusion, contained the proteins Bruchpilot and Syd-1. These proteins are part of the cytomatrix at the active zone, a scaffold controlling synaptic vesicle endo- and exocytosis. Kenyon cell presynapses were present in γ- and α/β-type KCs but not in α/β-type Kenyon cells. The newly identified Kenyon cell derived presynapses in the calyx are candidate sites for an olfactory associative memory trace. We hypothesize that, as in mammals, recurrent neuronal activity might operate for memory retrieval in the fly olfactory system. Moreover, we present evidence for structural synaptic plasticity in the mushroom body calyx. This is the first demonstration of synaptic plasticity in the central nervous system of Drosophila melanogaster. The volume of the mushroom body calyx can change according to changes in the environment. Also size and numbers of microglomeruli - sub-structures of the calyx, at which projection neurons contact Kenyon cells – can change. We investigated the synapses within the microglomeruli in detail by using new transgenic tools for visualizing presynaptic active zones and postsynaptic densities. Here, we could show, by disruption of the projection neuron - Kenyon cell circuit, that synapses of microglomeruli were subject to activity-dependent synaptic plasticity. Projection neurons that could not generate action potentials compensated their functional limitation by increasing the number of active zones per microglomerulus. Moreover, they built more and enlarged microglomeruli. Our data provide clear evidence for an activity-induced, structural synaptic plasticity as well as for the activity-induced reorganization of the olfactory circuitry in the mushroom body calyx. N2 - Synaptische Plastizität an den präsynaptischen Spezialisierungen von Neuronen sind nach allgemeinem Verständnis die Grundlage für Lern- und Gedächtnisprozesse. Kenyon Zellen sind die intrinsischen Zellen des Zentrums für olfaktorisches Lernen im Gehirn von Arthropoden – den Pilzkörper Neuropilen. An den Präsynapsen der Kenyon Zellen wird eine olfaktorische Gedächtnisspur vermutet. Im Kalyx, einer Substruktur der Pilzkörper, erhalten die Kenyon Zell Dendriten ihren olfaktorischen Input durch Projektionsneurone. Ihre Präsynapsen wiederum befinden sich ausschließlich in ihren axonalen Kompartimenten außerhalb des Kalyx, nämlich in den Loben der Pilzkörper. Mit Hilfe von hochauflösenden bildgebenden Techniken und neuen transgenen Methoden, ist es uns in der Fruchtfliege Drosophila melanogaster gelungen, Kenyon Zell Präsynapsen im Kalyx zu identifizieren. Diese Präsynapsen enthalten synaptische Vesikel, die nach Stimulation ihren Inhalt freisetzen können. Sie weisen noch weitere Gemeinsamkeiten mit den meisten anderen Präsynapsen auf: Ihre Aktiven Zonen, die Orte der Transmitterfreisetzung, enthalten die Proteine Bruchpilot und Syd-1. Diese sind Teil der Zytomatrix an der Aktiven Zone, ein Proteingerüst das Endo- und Exozytose der synaptischen Vesikel kontrolliert. Die Präsynapsen im Kalyx wurden in γ- and α/β-Typ Kenyon Zellen aber nicht in α/β-Typ Kenyon Zellen gefunden. Die neu identifizierten Kenyon Zell Präsynapsen beherbergen potentiell eine Gedächtnisspur für olfaktorisch assoziatives Lernen. Möglicherweise wird im olfaktorischen Nervensystem von Fruchtfliegen rücklaufende neuronale Aktivität benötigt, um Gedächtnis abzurufen, so wie es auch für Säuger beschrieben ist. Darüber hinaus zeigen wir synaptische Plastizität im Kalyx. Dies ist die erste Beschreibung überhaupt von synaptischer Plastizität im zentralen Nervensystem von Drosophila melanogaster. Das Volumen des Kalyx kann sich als Antwort auf äußere Einflüsse verändern. Genauso auch Größe und Anzahl der Mikroglomeruli, Substrukturen des Kalyx, in denen Projektionsneurone und Kenyon Zellen aufeinander treffen. Wir untersuchten die Synapsen in Mikroglomeruli detailliert, mithilfe von neuen transgenen Methoden, die es erlauben, präsynaptische Aktive Zonen sowie Postsynaptische Spezialisierungen zu visualisieren. Mittels Beeinträchtigung der Kommunikation zwischen Projektionsneuronen und Kenyon Zellen, konnten wir synaptische Plastizität in Mikroglomeruli zeigen. Projektionsneurone, die nicht in der Lage waren, Aktionspotentiale zu erzeugen, kompensierten ihre funktionelle Einschränkung durch den vermehrten Einbau von Aktiven Zonen in Mikroglomeruli. Außerdem produzierten sie mehr und vergrößerte Mikroglomeruli. Unsere Daten zeigen deutlich eine aktivitätsinduzierte Veränderung des olfaktorischen neuronalen Netzes, sowie strukturelle synaptische Plastizität im Kalyx. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Drosophila melanogaster KW - mushroom body KW - calyx KW - Geruch KW - Lernen KW - Gedächtnis KW - Kalyx Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85058 ER - TY - THES A1 - Ernst, Roman T1 - Visuelle Mustererkennung und Parameterextraktion bei Drosophila melanogaster T1 - Visual pattern recognition and parameter extraction in Drosophila melanogaster N2 - In operanten Konditionierungsexperimenten im Flugsimulator werden vier Parameter gefunden die Drosophila melanogaster aus visuellen Mustern extrahieren kann: Musterfläche, vertikale Position des Musterschwerpunkts, Verteiltheit und Musterausrichtung in horizontaler und vertikaler Richtung. Es ist nicht auszuschliessen, dass die Fliege weitere Musterparameter extrahieren kann. Spontane Musterpräferenzen und konditionierte Präferenzen zeigen unterschiedliche Zusammenhänge mit den Musterparametern. Aus räumlich getrennten Musterelementen zusammengesetzte Muster werden von der Fliege wie ein Gesamtmuster behandelt. Retinaler Transfer wird auch bei der Präsentation von Mustern an zwei verschiedenen vertikalen Trainingspositionen nicht beobachtet. Muster werden generalisiert, wenn die Schwerpunkte korrespondierender Muster zwischen Training und Test ungefähr an der gleichen Position liegen aber keine retinale Überlappung von Trainings- und Testmustern besteht. Retinotopie des Mustergedächtnisses liegt in diesem Fall nicht auf der Ebene der Bildpunkte, jedoch möglicherweise auf der Ebene des Parameters 'Musterschwerpunkt' vor. Fliegen können nicht trainiert werden bestimmte Musterpaare zu diskriminieren die sich nur durch die vertikale Position ihres Musterschwerpunktes unterscheiden. Dennoch bevorzugen sie beim Lerntest mit anderen Mustern mit korrespondierenden Schwerpunktspositionen die zuvor nicht bestrafte Schwerpunktsposition. Für die Modellierung der Extraktion von Musterschwerpunkt und Musterfläche wird ein einfaches künstliches neuronales Filter präsentiert, dessen Architektur auf einem Berechnungsalgorithmus für den gemeinsamen Schwerpunkt mehrerer Teilelemente beruht. N2 - The results of operant conditioning experiments at the flight simulator suggest that Drosophila melanogaster can extract four parameters from visual patterns: pattern area, vertical position of the center of gravity, separatedness and horizontal/vertical pattern orientation. It can not be excluded that the fly can extract additional parameters. Spontaneous pattern preferences and conditioned preferences show different relationships with pattern parameters. The fly treats separated pattern elements as a compound figure. Retinal transfer is not observed even when patterns are presented at two different vertical training positions. Patterns are generalized if the positions of the centers of gravity of corresponding patterns are retained between training and test although training and test patterns do not overlap retinally. In this case there is no retinotopy of pattern memory on the pixel level but possibly on the level of the pattern parameter 'center of gravity'. Flies can not be trained to discriminate certain patterns that differ only by the vertical position of their centers of gravity. However, when tested with different patterns with corresponding centers of gravity they prefer the previously unpunished position of the center of gravity. The extraction of center of gravity and pattern area are modelled with a simple artificial neuronal filter. The architecture of this filter is based on an algorithm for the computation of the common center of gravity of multiple elements. KW - Taufliege KW - Mustererkennung KW - Visuelle Wahrnehmung KW - visuelle Mustererkennung KW - Musterlernen KW - Parameterextraktion KW - Generalisierung KW - neuronales Filter KW - Drosophila melanogaster KW - visiual pattern recognition KW - pattern conditioning KW - parameter extraction KW - generalization KW - neuronal filter KW - Drosophila melanogaster Y1 - 1999 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-1156 ER - TY - THES A1 - Eschbach, Claire T1 - Classical and operant learning in the larvae of Drosophila melanogaster T1 - Klassiches und operantes Lernen bei Larven der Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit studiere ich einige psychologische Aspekte im Verhalten der Drosophila, insbesondere von Drosophila Larven. Nach einer Einleitung, in der ich den wissenschaftlichen Kontext darstelle und die Mechanismen der olfaktorischen Wahrnehmung sowie des klassichen und operanten Lernens beschreibe, stelle ich die verschiedenen Experimente meiner Doktorarbeit vor. Wahrnehmung Das zweite Kapitel behandelt die Art, in der adulte Drosophila zwischen Einzeldüften und Duftgemischen generaliseren. Ich habe gefunden, daß die Fliegen eine Mischung aus zwei Düften als gleich verschieden von ihren beiden Elementen wahrnehmen; und daß die Intensität sowie die chemisch-physikalische Natur der Elemente das Ausmass der Generalisierung zwischen der Mischung und ihren beiden Elementen beeinflusst. Diese Entdeckungen sollten für die weitere Forschung anregend sein, wie zum Beispiel zum functional imaging. Gedächtnis Das dritte Kapitel stellt die Etablierung eines neuen Protokolls zur klassischen Konditionierung bei Drosophila Larven dar. Es handelt sich um Experimente, bei denen ein Duft mit einer mechanischen Störung als Strafreiz verknüpft wird. Das Protokoll wird einen Vergleich zwischen zwei Arten vom aversiven Gedächtnissen (Geschmack vs. mechanische Störung als Strafreize) ermöglichen, einschliesslich eines Vergleiches ihrer neurogenetischen Grundlagen; zudem kann nun geforscht werden, ob die jeweiligen Gedächtnisse spezifisch für die Art des verwendeten Strafreizes sind. Selbstgestaltung Das vierte Kapitel umfasst unsere Versuche, operantes Gedächtnis bei Drosophila Larven zu beobachten. Zumindest für die unmittelbar ersten Momente des Tests konnte ich zeigen, dass die Larven ihr Verhalten entsprechend dem Training ausrichten. Dieses Gedächtnis scheint jedoch im Laufe des Tests schnell zu verschwinden. Es ist daher geraten, diese Ergebnisse über operantes Lernen zu wiederholen, eventuell das experimentelle Protokoll zu verbessern, um so eine systematische Analyse der Bedingungen und Mechanismen für das operante Lernen bei der Drosophila Larve zu erlauben. Im fünften Kapitel verwende ich die im Rahmen des vierten Kapitels entwickelten Methoden für eine Analyse der Fortbewegung der Larven. Ich habe insbesondere die Wirkung des pflanzlichen ‚cognitive enhancers’ Rhodiola rosea untersucht, sowie die Auswirkungen von Mutationen in den Genen, welche für Synapsin und SAP47 kodieren; schliesslich habe ich getestet, ob die Geschmacksqualität der Testsituation lokomotorische Parameter verändert. Diese Dissertation erbringt also eine Reihe neuer Aspekte zur Psychologie der Drosophila und wird hoffentlich in diesem Bereich der Forschung neue Wege öffnen. N2 - In this thesis I studied psychological aspects in the behaviour of Drosophila, and especially Drosophila larvae. After an introduction where I present the general scientific context and describe the mechanisms of olfactory perception as well as of classical and operant conditioning, I present the different experiments that I realised during my PhD. Perception The second chapter deals with the way adult Drosophila generalise between single odours and binary mixtures of odours. I found that flies perceive a mixture of two odours as equally similar to the two elements composing it; and that the intensity as well as the physico-chemical nature of the elements composing a mixture affect the degree of generalisation between this mixture and one of its elements. These findings now call for further investigation on the physiological level, using functional imaging. Memory The third chapter presents a series of experiments in Drosophila larvae in order to define some characteristics of a new protocol for classical aversive learning which involves associating odours with mechanical disturbance as a punishment. The protocol and the first results should open new doors for the study of classical conditioning in Drosophila larvae, by allowing the comparison between two types of aversive memory (gustatory vs. mechanical reinforcement), including a comparison of their neurogenetic bases. It will also allow enquiries into the question whether these respective memories are specific for the kind of reinforcer used. Agency The fourth chapter documents our attempts to establish operant memory in Drosophila larvae. By analysing the first moments of the test, I could reveal that the larvae modified their behaviour according to their previous operant training. However, this memory seems to be quickly extinguished during the course of the test. We now aim at repeating these results and improving the protocol, in order to be able to systematically study the mechanisms allowing and underlying operant learning in Drosophila larvae. In the fifth chapter, I use the methods developed in chapter four for an analysis of larval locomotion. I determine whether larval locomotion in terms of speed or angular speed is affected by a treatment with the “cognitive enhancer” Rhodiola rosea, or by mutations in the Synapsin or SAP47 genes which are involved in the formation of olfactory memory. I also characterize the modifications induced by the presence of gustatory stimuli in the substrate on which the larvae are crawling. This thesis thus brings new elements to the current knowledge of Drosophila KW - Lernen KW - Taufliege KW - Neurobiologie KW - Drosophila KW - learning KW - Drosophila KW - neurobiology KW - behaviour Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70583 ER - TY - THES A1 - Fischer, Robin T1 - Generating useful tools for future studies in the center of the circadian clock – defined knockout mutants for PERIOD and TIMELESS T1 - Generierung nützlicher Instrumente für zukünftige Studien im Zentrum der Inneren Uhr - definierte knockout Mutanten für PERIOD und TIMELESS N2 - To unravel the role of single genes underlying certain biological processes, scientists often use amorphic or hypomorphic alleles. In the past, such mutants were often created by chance. Enormous approaches with many animals and massive screening effort for striking phenotypes were necessary to find a needle in the haystack. Therefore at the beginning chemical mutagens or radiation were used to induce mutations in the genome. Later P-element insertions and inaccurate jump-outs enabled the advantage of potential larger deletions or inversions. The mutations were characterized and subsequently kept in smaller populations in the laboratories. Thus additional mutations with unknown background effects could accumulate. The precision of the knockout through homologous recombination and the additional advantage of being able to generate many useful rescue constructs that can be easily reintegrated into the target locus made us trying an ends-out targeting procedure of the two core clock genes period and timeless in Drosophila melanogaster. Instead of the endogenous region, a small fragment of approximately 100 base pairs remains including an attP-site that can be used as integration site for in vitro created rescue constructs. After a successful ends-out targeting procedure, the locus will be restored with e.g. flies expressing the endogenous gene under the native promoter at the original locus coupled to a fluorescence tag or expressing luciferase. We also linked this project to other research interests of our work group, like the epigenetic related ADAR-editing project of the Timeless protein, a promising newly discovered feature of time point specific timeless mRNA modification after transcription with yet unexplored consequences. The editing position within the Timeless protein is likewise interesting and not only noticed for the first time. This will render new insights into the otherwise not-satisfying investigation and quest for functional important sequences of the Timeless protein, which anyway shows less homology to other yet characterized proteins. Last but not least, we bothered with the question of the role of Shaggy on the circadian clock. The impact of an overexpression or downregulation of Shaggy on the pace of the clock is obvious and often described. The influence of Shaggy on Period and Timeless was also shown, but for the latter it is still controversially discussed. Some are talking of a Cryptochrome stabilization effect and rhythmic animals in constant light due to Shaggy overexpression, others show a decrease of Cryptochrome levels under these conditions. Also the constant light rhythmicity of the flies, as it was published, could not be repeated so far. We were able to expose the conditions behind the Cryptochrome stabilization and discuss possibilities for the phenomenon of rhythmicity under constant light due to Shaggy overexpression. N2 - Um die Rolle einzelner Gene hinter biologischen Prozessen zu entschlüsseln, bedienen sich Wissenschaftler häufig amorpher oder hypomorpher Allele. Diese wurden in der Vergangenheit oft auf Zufall basierend generiert. Gewaltige Ansätze mit zahllosen Tieren unter enormem Selektionsaufwand bei der Suche nach markanten Phänotypen waren notwendig um sprichwörtlich die Nadel im Heuhaufen zu finden. Zunächst wurden chemische Mutagene oder Strahlung verwendet um Mutationen im Genom zu induzieren. Später kamen P-element Insertionen und induziertes unpräzises Herausspringen der Transposons dazu. Das hatte den Vorteil, dass so unter Umstände größere Deletionen oder Inversionen entstanden. Die Mutationen wurden charakterisiert und die Tiere anschließend in kleinen Populationen gehalten. Dadurch konnten sich zusätzliche Mutationen mit möglichen Hintergrundeffekten unbemerkt ansammeln. Ebenso blieben weitere durchaus mögliche Mutationen aufgrund der Mutagene und dem deutlicheren Phänotyp der primären Mutation oftmals unbemerkt. Die Präzision eines Knockouts durch homologe Rekombination und der Vorteil, zusätzlich im Stande zu sein, jedes entworfene Rettungskonstrukt auf einfache Weise wieder einsetzen zu können, überzeugte uns, eine Ends-out Targeting Prozedur mit den zwei Uhr Basisgenen period und timeless in Drosophila melanogaster durchzuführen. Dabei soll ein geplanter Knockout zu einer kompletten Deletion des gesamten Bereichs durch homologe Rekombination führen. Anstelle der endogenen Region verbleibt lediglich ein kleines Fragment von ungefähr 100 Basenpaaren inklusive einer attP-Stelle, die als Insertionsstelle für in vitro hergestellte Konstrukte genutzt werden kann. Angestrebte Ziele sind beispielsweise Fliegen, die das endogene Gen unter der Kontrolle des ursprünglichen Promoters am originalen Lokus gebunden an einen Fluoreszenzmarker oder aber gekoppelt an Luziferase exprimieren. Wir koppelten dieses Projekt zusätzlich mit anderen Forschungsinteressen unserer Arbeitsgruppe, wie zum Beispiel dem epigenetischen ADAR-Editierungsprojekt des Timeless Proteins, einer vielversprechenden Neuentdeckung zeitpunktspezifischer und posttranskriptionaler Modifizierung der timeless mRNA, mit bisher noch unbekannten Folgen. Die Position der Editierung innerhalb des Timeless Proteins ist ebenfalls sehr interessant und nicht zum ersten Mal im Fokus von Wissenschaftlern. Dies wird neue Einblicke in die sonst bislang nicht zufriedenstellende Suche nach funktionell wichtigen Strukturen von Timeless bringen, welche aufgrund der geringen Homologie zu anderen bisher charakterisierten Proteinen bislang nur unzureichend bestimmt werden konnten. Zuletzt beschäftigten wir uns mit der Frage nach der Rolle von Shaggy bezüglich der inneren Uhr. Der Einfluss einer Überexpression oder Herabregulierung von Shaggy auf die Taktung der Uhr ist eindeutig und wurde schon oft beschrieben. Der Einfluss von Shaggy auf Period und Timeless wurde ebenfalls bereits gezeigt, wird jedoch im Falle des letzteren Proteins noch sehr kontrovers diskutiert. Während einige von einem Cryptochrom stabilisierenden Effekt und rhythmischen Tieren in konstanter Beleuchtung aufgrund von Shaggy Überexpression sprechen, zeigen andere einen Abfall des Cryptochromlevels unter eben genau diesen Umständen. Es war uns möglich die Umstände hinter der Cryptochromstabilisierung aufzudecken. Darüber hinaus zeigen wir mögliche Gründe für das Phänomen des Rhythmus im Dauerlicht von Shaggy Überexpressionstieren auf. KW - Biologische Uhr KW - Circadian clock KW - Period KW - Timeless KW - Genetic engineering KW - Shaggy KW - Taufliege KW - Knockout Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119141 ER - TY - THES A1 - Franz, Mirjam T1 - Analyse der Hangover Funktion während der Entwicklung von Ethanol-induziertem Verhalten T1 - Analysis of the Hangover function during the development of ethanol-induced behaviour N2 - Die Entwicklung von Ethanoltoleranz ist ein Indikator für eine mögliche Abhängigkeit von Alkohol. Der genaue molekulare Mechanismus der Ethanoltoleranzentwicklung ist jedoch nicht bekannt. Drosophila ermöglicht die molekulare und phänotypische Untersuchung von verschiedenen Mutanten mit veränderter Toleranz und kann so zu einem besseren Verständnis beitragen. Die hangAE10 Mutante entwickelt eine reduzierte Ethanoltoleranz, wobei dieser Phänotyp auf Defekte in der zellulären Stressantwort zurückzuführen ist. Für ein besseres Verständnis, in welchen molekularen Mechanismen bzw. Signalwegen HANG wirkt, wurde die Funktion des Proteins auf zellulärer Ebene analysiert und mögliche Zielgene charakterisiert. Die auffällige Proteinstruktur von HANG spricht für eine Interaktion mit Nukleinsäuren. Immunhistochemische Analysen von ektopisch exprimiertem Hangover Protein ergaben, dass dieses nicht mit der DNA co-lokalisiert und auch nicht an polytänen Chromosomen nachgewiesen werden kann. Die ektopische Expression von HANG in Speicheldrüsenzellen zeigte eine punktförmige Verteilung des Proteins innerhalb des Zellkerns. Dieses punktförmige Expressionsmuster wird häufig in RNA-bindenden Proteinen gefunden. Deshalb wurden Co-Lokalisationsstudien von HANG mit Markern für RNAmodifizierende Proteine durchgeführt. Dabei wurde keine Interaktion mit verschiedenen Markerproteinen des Spleißapparates gefunden. Mithilfe von in vitro Experimenten konnte aber die Bindung von RNA an bestimmten Hangover Proteinbereichen nachgewiesen werden Diese Ergebnisse legen nahe, dass HANG eine RNA-regulierende Funktion hat. In einem cDNA Microarray Experiment wurde das Gen dunce als mögliches Zielgen von Hangover identifiziert. Das Gen dunce kodiert für eine Phosphodiesterase, welche spezifisch cAMP hydrolysiert. Zur Bestätigung der cDNA Microarray Experimente wurden die dnc Transkriptunterschiede in Wildtyp und hangAE10 Mutante mithilfe von semiquantitativer RT-PCR für jede der vier Gruppen untersucht. Dabei konnte eine Reduktion der dncRMRA-Transkriptgruppe in hangAE10 Mutanten nachgewiesen werden. Aufgrund dieser Ergebnisse wurde die dncRMRA -spezifische dncΔ143 Mutante hergestellt und auf Verhaltensebene analysiert. Die Experimente zeigten, dass sowohl dnc1, als auch die dncΔ143 Mutante eine reduzierte Ethanoltoleranz und Defekte in der zellulären Stressantwort aufweisen. Für die Rettung der reduzierten Toleranz von hangAE10 und dncΔ143 in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde die dncRMRA Promotor- GAL4 Linie hergestellt. Die reduzierte Ethanoltoleranz der dncΔ143 Mutanten konnte über die Expression von UAS-dnc mit der dncRMRA-GAL4 Linie auf Wildtyp Level gerettet werden. Die reduzierte Toleranz der hangAE10 Mutante konnte mithilfe derselben GAL4 Linie verbessert werden. Dies beweist, dass in beiden Mutanten dieselben Zellen für die Entwicklung von Ethanoltoleranz benötigt werden und sie wahrscheinlich in der gleichen Signaltransduktionskaskade eine Funktion haben. Aufgrund der Anfälligkeit der UAS/ GAL4 Systems gegenüber Hitze war es außerdem nicht möglich die Defekte der zellulären Stressantwort von dncΔ143 bzw. hangAE10 Fliegen zu retten. Die Rettung der reduzierten Ethanoltoleranz der dcnΔ143 Mutante führte außerdem zu der Vermutung, dass die cAMP Regulation eine wichtige Funktion bei der Ethanoltoleranzentwicklung hat. Über die Expression von cAMP-regulierenden Proteinen in dncRMRA-spezifischen Neuronen wurde der Einfluss von cAMP bei Ethanol-induziertem Verhalten überprüft. Bei der Überexpression von dunce und rutabaga konnte weder eine Veränderung für die Ethanolsensitivität, noch für die Toleranzentwicklung festgestellt werden. Eine Erklärung hierfür wäre, dass Veränderungen in der cAMP Konzentration über Rückkopplungsmechanismen zwischen Dunce und Rutabaga ausgeglichen werden können. Für eine genauere Aussage müsste jedoch die cAMP Konzentration in diesen Fliegen gemessen werden. Die Überexpression von pka- in dncRMRA spezifischen Zellen führt zu einer erhöhten Ethanolresistenz. Das bedeutet, dass die Modulation der cAMP Konzentration durch dunce und rutabaga in dncRMRA spezifischen Zellen keinen Einfluss auf Ethanol-induziertes Verhalten hat, wohingegen die Stärke der cAMP vermittelten Signalverarbeitung über die cAMP-abhängige PKA zu Veränderungen im Verhalten führt. Für Mutanten des cAMP Signalweges ist außerdem bekannt, dass sie Defekte im olfaktorischen Lernen bzw. Gedächtnis aufweisen. Deshalb wurden die dncΔ143, dnc1 und hangAE10 Mutanten in diesem Paradigma getestet. Sowohl dnc1, als auch dncΔ143 Fliegen zeigten einen reduzierten Performance Index für das zwei und 30 Minuten Gedächtnis. Nach 180 Minuten verhielten sich die dncΔ143 Mutanten nicht mehr unterschiedlich zum Wildtyp, die dnc1 Mutante zeigte jedoch immer noch eine Reduktion des Performance Index im Vergleich zur Kontrolle. Demnach ist in dncΔ143 Mutanten nur das Kurzzeitgedächtnis betroffen, wohingegen hangAE10 Mutanten keine Reduktion des Performance Index für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis aufweisen. Die unterschiedlichen Ergebnisse der beiden Mutanten in der Gedächtnisentwicklung deuten außerdem daraufhin, dass Lernen und Gedächtnis in dncΔ143 und hangAE10 Mutanten von der Toleranzentwicklung unabhängig über unterschiedliche cAMP-abhängige Signaltransduktionskaskaden reguliert werden. N2 - The development of ethanol tolerance is an indicator for a possible alcohol addiction. However the correct molecular mechanism of ethanol tolerance development is not known. The model organism Drosophila allows molecular and phenotypic observations of several mutants with altered ethanol tolerance (Scholz et al., 2000). HangAE10 mutants develop reduced ethanol tolerance because of defects in the cellular stress response (Scholz et al., 2005). For a better understanding of molecular mechanisms or signaling pathways, HANG putative target genes were identified, characterized and the protein function was analyzed on cellular level. The Hangover protein has 16 zinc finger domains, two of them are found in RNA modifying proteins (Scholz et al., 2005; Nelissen et al., 1991). This striking protein structure argues for an interaction of HANG with nucleic acids. In immunohistochemical studies with an ectopically expressed Hangover protein neither colocalization with DNA nor detectable Hangover binding on polytene chromosomes was observed. The ectopic expression of HANG in salivary glands shows a speckled protein distribution in the nucleus, which is similar to the expression pattern in RNA modifying proteins (Spector, 2001). Therefore colocalization studies of HANG with markers for RNA modifying proteins were performed. However no interaction with nucleoli was found. Certain factors of the splicing machinery also show no colocalization with Hangover. Since the studies were done with ectopically expressed protein, the results do not necessarily reflect the wild type behavior of HANG, as the interaction partner is not expressed in a comparable amount. RNA binding to specific parts of the Hangover protein was detected by in vitro experiments. Furthermore wild type expression of Hangover in neuronal cells shows the typical speckled distribution of RNA modifying proteins. These results suggest a RNA regulating function of HANG. In cDNA microarray experiments dunce was identified as a putative target gene of Hangover (Klebes and Scholz, unpublished data). The gene dunce encodes a phosphodiesterase that specifically hydrolyses cAMP (Davis and Kiger, 1981). The 14 dnc transcripts can be divided into four groups based on their length and function (http://flybase.org/; Qiu et al., 1993). To confirm the results of the cDNA microarray experiments, semiquantitative RT-PCRs were performed to analyze the differences in dnc transcript levels between wild type and hangAE10 mutants for each dnc group. A reduced amount of dncRMRA transcripts was observed in hangAE10 mutants. On the basis of these results the dncRMRA transcript specific dncΔ143 mutant was generated (Saratsis, 2006) and tested on behavioral level. Behavioral analysis of dnc1 and dncΔ143 mutants showed reduced ethanol tolerance and defects in the cellular stress response. For rescue experiments of reduced ethanol tolerance in hangAE10 and dncΔ143 mutants in specific dncRMRA neurons, the promotor dncRMRA-GAL4 line was generated (Saratsis, 2006). In-situ hybridization studies suggested that the expression pattern of dncRMRA-GAL4 reflects the endogenous expression of the dncRMRA transcripts. For unambiguous results colocalization studies with a specific DncRMRA antibody has to be done. The dncRMRA-GAL4 line shows a broad expression pattern, with transgene expression in about every 200th cell in the brain. It innervates the antennal lobes, parts of the mushroom body and regions of the central complex. The reduced ethanol tolerance in dncΔ143 mutants was rescued to wild type level by expressing UAS-dnc with the promotor dncRMRA-GAL4 line. Whereas the reduced ethanol tolerance in hangAE10 mutants was advanced by expressing UAS-hang with the same GAL4 line. This demonstrates that both mutants involve the same set of neurons for developing ethanol tolerance and probably act in the same signaling pathway. Expression studies showed that dncRMRA lies downstream of hang. The attempt to rescue the reduced ethanol tolerance in hangAE10 flies by expressing dnc using dncRMRA-GAL4 line did not advance the tolerance in these flies. An obvious explanation is that HANG does not only regulate dunce but also other genes and these regulation defects in hangAE10 mutants cannot be reversed by dnc expression. Due to the sensitivity of the UAS/ GAL4 system towards heat it was impossible to rescue the cellular stress response defects in dncΔ143 and hangAE10 mutants. The rescue of the dncΔ143 tolerance phenotype resulted in the assumption that cAMP regulation has an important function in the development of ethanol tolerance. The effect of cAMP on ethanol induced behavior should be tested by expression of cAMP regulating proteins in dncRMRA specific neurons. There the overexpression of dunce should result in an increase and the overexpression of rutabaga should lead to a decrease in cAMP levels. However, for both experiments there was neither a change in ethanol sensitivity nor in ethanol tolerance. An explanation would be that changes in cAMP concentration could be balanced by feedback loops between Dunce and Rutabaga. For a decisive conclusion the cAMP concentration in these flies has to be measured. Overexpressing pka-c, a gene that encodes the catalytic subunit of PKA in dncRMRA specific cells, leads to a higher resistance towards ethanol. This shows that the modulation of cAMP level by Dunce and Rutabaga has no effect on ethanol induced behavior in dncRMRA specific cells. Whereas the intensity of cAMP mediated signaling processes result in behavioral changes. Several mutants of the cAMP signaling pathway are impaired in olfactory learning and memory. Therefore dnc1, dncΔ143 and hangAE10 mutants were tested in this paradigm. Dnc1 as well as dncΔ143 flies showed reduced performance indices two and 30 minutes memory. After 180 minutes the performance index of dncΔ143 mutants was not significantly different from wild type whereas dnc1 mutants still had a reduction in comparison to wild type. Thus, dncΔ143 mutants have defects in short-term memory whereas short-term memory of hangAE10 mutants is not affected. However it is not known how hangAE10 flies will perform for mid-term and long-term memory formation. Similar to memory formation there exist different phases of tolerance development. To detect, if the long-term or the short-term form of tolerance is affected, the kinetic of tolerance development was investigated for dncΔ143 and hangAE10 mutants. In dncΔ143 mutants the first phase of tolerance development is defective, whereas in hangAE10 mutants the early and the late phase seem to be affected. Thus a part of the reduced tolerance in hangAE10 and the complete reduction in dncΔ143 mutants could be due to defects in the same signaling pathway regulated via cAMP. The variable results for the development of short-term memory in both mutants indicate that memory formation in dncΔ143 and hangAE10 mutants is independent of ethanol tolerance development and is regulated by different cAMP signaling pathways. KW - Taufliege KW - Tachyphylaxie KW - Alkohol KW - Erfahrungsorientiertes Lernen KW - Drosophila KW - Ethanoltolerance KW - dunce KW - hangover Y1 - 2009 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-35591 ER - TY - THES A1 - Funk, Natalja T1 - Das Sap47-Gen aus Drosophila melanogaster : Gezielte Mutagenisierung und Suche nach Interaktionspartnern T1 - The Sap47 gene of Drosophila melanogaster: mutagenesis and identification of interaction partners N2 - SAP47 ist ein Synapsenassoziiertes Protein von 47 kDa aus Drosophila melanogaster, das zu einer neuen Proteinfamilie gehört. Um eine Sap47 Mutante zu erzeugen wurden drei Methoden eingesetzt: Gezielte Mutagenese durch homologe Rekombination, RNA interference (RNAi) und Transposon Remobilisierung. Um einen Interaktionspartner für das SAP47 Protein zu identifizieren wurden ein Yeast-Two-Hybrid System und das "CytoTrap" Verfahren eingesetzt. N2 - SAP47 (synapse-associated protein of 47 kDA) of Drosophila melanogaster belongs to a novel protein family of unknown function. Three techniques were used for Sap47 mutagenesis: "gene targeting" by homologous recombination, RNA interference (RNAi) and Jump-out mutagenesis. A standard yeast-two-hybrid system and the "CytoTrap" assay were used to identify interaction partners for the SAP47 protein. KW - Taufliege KW - Molekulargenetik KW - Sap47 KW - Synapse KW - RNA interference KW - Gezeilte Mutagenese KW - Sap47 KW - synapse KW - RNA interference KW - gene targeting Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7667 ER - TY - THES A1 - Gehring, Jennifer T1 - Functional analysis of the latrophilin homolog dCirl in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse des latrophilin Homologs dCirl in Drosophila melanogaster N2 - Latrophilin, alternatively named calcium-independent receptor of α-latrotoxin (CIRL), resembles a prototype of the adhesion class G-protein coupled receptors (GPCRs). Initially identified as a high-affinity receptor for α-latrotoxin, a component of the black widow spider, latrophilins are now associated with various distinct functions, such as synaptic exocytosis, tissue polarity and fertility (Tobaben et al., 2002; Langenhan et al., 2009; Promel et al., 2012). Despite these exploratory efforts the precise subcellular localisation as well as the endogenous ligand of CIRL still remains elusive. In this work genetic experiments, imaging approaches and behavioural studies have been used to unravel the localisation and physiological function of the latrophilin homolog dCirl in Drosophila melanogaster. Containing only one latrophilin homolog together with its genetic accessibility and well-established transgenic approaches, Drosophila seemed an ideally suited model organism. The present study showed that dCirl is widely expressed in the larval central nervous system including moto- and sensory neurons. Further, this work revealed that removal of the latrophilin homolog does not greatly affect synaptic transmission but it seems that aspects of the postsynaptic structural layout are controlled by dCIRL in the fruit fly. Additionally, dCirl expression at the transcriptional level was confirmed in larval and adult chordotonal organs, specialised mechanosensors implicated in proprioception (Eberl, 1999). Expression of dCIRL at the protein level could not yet been confirmed in moto- and sensory neurons likely due to low endogenous expression. However, behavioural studies using dCirl knockout mutant larvae indicated a putative mechanosensory function of dCIRL regarding touch sensitivity and locomotion behaviour. The second part of this thesis presents a strategy to examine interactions between several presynaptic proteins in living cells. The attempt described in this work is based on the discovery that GFP when split into two non-fluorescent fragments can form a fluorescent complex. The association of the fragments can be facilitated by fusing them to two proteins that interact with each other. Therefore, the split GFP method enables direct visualization of synaptic protein interactions in living cells. In initial experiments I could show that full length reporter protein fusions with n-Synaptobrevin (n-Syb), Synaptotagmin (Syt) and Syntaxin (Syx) allow expression in Drosophila and confirmed that fusion to either end of each synaptic protein did not impair expression or influence the viability of transgenic flies. Further, transgenes containing protein fusions of Syx, Syt, and n-Syb with split GFP fragments were established in previous studies (Gehring, 2010). The present work characterises the interaction of these protein fusions during different stages of synaptic vesicle turnover at active zones such as synaptic vesicle docking at the presynaptic membrane and vesicle fusion. These results suggest that the spGFP assay seems only partly suitable for resolving fast and transient protein-protein interactions at larval Drosophila active zones in vivo. N2 - Latrophilin, auch als Calcium-unabhängiger Rezeptor für α-Latrotoxin (CIRL) bezeichnet, repräsentiert einen Prototyp der Adhäsions G-Protein gekoppelten Rezeptorklasse. Ursprünglich als hoch-affiner Rezeptor für α-Latrotoxin entdeckt, werden Latrophiline heute mit zahlreichen verschiedenen Funktionen, wie synaptischer Exozytose, Gewebepolarität und Fertilität assoziiert (Tobaben et al., 2002; Langenhan et al., 2009; Promel et al., 2012). Trotz dieser Fortschritte sind die genaue subzelluläre Lokalisation sowie der endogene Ligand noch weitgehend unbekannt. Diese Studie verwendet genetische Ansätze, bildgebende Verfahren und Verhaltensstudien, um die Lokalisation und physiologische Funktion des Latrophilinhomologs dCirl in Drosophila melanogaster aufzuklären. Die Tatsache, dass Drosophila nur ein einziges Latrophilin Homolog besitzt, zusammen mit den genetischen Möglichkeiten und den sehr gut etablierten transgenen Methoden, machen die Fruchtfliege zu einem idealen Modellorganismus. Die erhobenen Daten belegen, dass dCirl verstärkt im larvalen Nervensystem, einschließlich motorischer und sensorischer Neurone, exprimiert wird. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass in dCirl Knockout-Mutanten die basale synaptische Transmission unverändert ist, vermutlich aber Teile der postsynaptischen Struktur durch dCIRL in der Fruchtfliege kontrolliert werden. Zusätzlich konnte nachgewiesen werden, dass dCirl auf Transkriptionsebene in den larvalen und adulten Chordotonalorganen exprimiert wird, spezifische Mechanosensoren, die an der Propriozeption beteiligt sind (Eberl, 1999). Die Expression von dCIRL auf Proteinebene in motorischen und sensorischen Neuronen konnte aufgrund niedriger endogener Expressionslevel noch nicht verifiziert werden. Allerdings deuten Verhaltensstudien, die Berührungsempfindlichkeit und Lokomotion untersuchen, auf eine mögliche mechanosensorische Funktion von dCIRL in den Larven von Drosophila hin. Der zweite Teil dieser Arbeit zeigt eine Strategie auf, die es ermöglicht, das Zusammenspiel verschiedener präsynaptischer Proteine in vivo zu untersuchen. Die hier beschriebene Methode basiert auf der Entdeckung, dass sich zwei nicht-fluoreszierende Fragmente des grün leuchtenden Proteins (GFP), zu einem fluoreszierenden Komplex zusammenlagern können. Diese geteilten GFP-Fragmente (split-GFPs) werden mit zwei unterschiedlichen Proteinen fusioniert, die miteinander interagieren. Die split-GFP Methode ermöglicht so eine direkte Visualisierung von Protein-Protein-Interaktionen in lebenden Zellen. In ersten Experimenten konnte ich zeigen, dass Synaptobrevin (n-Syb), Synaptotagmin (Syt) und Syntaxin (Syx), die mit vollständigen Fluorophoren markiert wurden, für die Expression in Drosophila geeignet sind und bestätigen, dass sowohl die N-terminale als auch die C-terminale Proteinfusion möglich ist. Zudem konnte durch diese Versuche die Überlebensfähigkeit der transgenen Fliegen überprüft werden. In vorangegangenen Studien wurden Transgene hergestellt, die Proteinfusionen von n-Syb, Syt und Syx mit split-GFP Fragmenten enthalten (Gehring, 2010). Die vorliegende Arbeit charakterisiert die Wechselwirkung dieser Proteinfusionen während unterschiedlicher Stufen der synaptischen Vesikelfreisetzung an der aktiven Zone, wie beispielsweise dem Vesikel-docking an der präsynaptischen Membran und der Vesikelfusion. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die split-GFP Technik nur bedingt geeignet ist um schnelle und transiente Protein-Protein Interaktionen an der larvalen aktiven Zone von Drosophila in vivo darzustellen. KW - Taufliege KW - G-Protein gekoppelte Rezeptor KW - Drosophila melanogaster KW - Cirl KW - Latrophilin Y1 - 2017 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-101061 ER - TY - THES A1 - Gerlach, Jennifer T1 - Influence of Myc-interacting proteins on transcription and development T1 - Der Einfluss von Myc-interagierenden Proteinen auf Transkription und Entwicklung N2 - The transcription factor Myc interacts with several co-factors to regulate growth and proliferationand thereby enables normal animal development. Deregulation of Myc is associated witha wide range of human tumors. Myc binds to DNA together with its dimerization partner Max, preferentially to canonical E-box motifs, but this sequence-specific interaction is probably not sufficient for Myc’s binding to target genes. In this work, the PAF1 complex was characterized as a novel co-factor of Myc in Drosophila melanogaster. All components of the complex are required for Myc’s recruitment to chromatin, but the subunit Atu has the strongest effect on Myc's binding to target genes through ist direct physical interaction with Myc. Unexpectedly, the impact of Atu depletion on the Expression of Myc target genes was weak compared to its effect on Myc binding. However, the influence of Atu becomes more prominent in situations of elevated Myc levels in vivo . Mycrepressed as well as Myc-activated targets are affected, consistent with the notion that Myc recruitment is impaired. An independent set of analyses revealed that Myc retains substantial activity even in the complete absence of Max. The overexpression of Myc in Max0 mutants specifically blocks their pupariation without affecting their survival, which raised the possibility that Myc might affect ecdysone biosynthesis. This connection was studied in the second part of this Thesis which showed that Myc inhibits the expression of ecdysteroidogenic genes and thereby the production of ecdysone. Myc most likely affects the signaling pathways (PTTH and insulin signaling) upstream of the PG, the organ where ecdysone is produced. By combining existing ChIPseq, RNAseq and electronic annotation data, we identified five potential Maxindependent Myc targets and provided experimental data that they might be involved in Myc's effect on Max mutant animals. Together our data confirm that some Myc functions are Max-independent and they raise the possibility that this effect might play a role during replication. N2 - Der Transkriptionsfaktor Myc interagiert mit verschiedenen Cofaktoren, um Wachstum und Proliferation zu regulieren, was die normale Entwicklung von Tieren ermöglicht. Die Fehlreguliereung von Myc wird mit einer großen Anzahl menschlicher Tumore in Verbindung gebracht. Myc bindet gemeinsam mit seinem Dimerisationspartner Max an DNA, bevorzugt an kanonische E-Box Motive. Allerdings ist diese sequenz-spezifische Interaktion wahrscheinlich nicht ausreichend für die Bindung von Myc an Zielgene. In dieser Arbeit wurde der PAF1 Komplex als ein neuartiger Cofaktor von Myc in Drosophila melanogaster charakterisiert. Alle Komponenten des Komplexes sind für die Rekrutierung von Myc an Chromatin notwendig, jedoch hat die Untereinheit Atu, durch ihre direkte physische Interaktion mit Myc, den stärksten Effekt auf die Bindung von Myc an Zielgene. Verglichen mit dem Effekt auf die Bindung von Myc hatte die Depletion von Atu nur einen schwachen Einfluss auf die Expression der Myc Zielgene. In vivo ist der Einfluss von Atu stärker ausgeprägt in Situationen in denen die Myc Proteinlevel erhöht sind. Sowohl Myc-reprimierte als auch Myc-aktivierte Gene sind dadurch betroffen. Dies stimmt mit der Entdeckung überein, dass die Rekrutierung von Myc beeinträchtigt ist. Unabhängige Versuche haben gezeigt, dass Myc eine deutliche Aktivität behält auch bei vollständiger Abwesenheit von Max. Die Überexpression von Myc in Max0 Mutanten verhindert deren Verpuppung ohne ihr Überleben zu beeinträchtigen. Dies führt zu der Vermutung, dass Myc einen Einfluss auf die Biosynthese von Ecdyson hat. Diese Verbindung wurde im zweiten Teil der Arbeit untersucht und hat gezeigt, dass Myc die Expression von Genen, die an der Ecdyson-Synthese beteiligt sind, verhindert und dadurch die Produktion von Ecdyson selbst. Myc wirkt bevorzugt auf die Signalwege (PTTH und Insulin Signalkaskade) oberhalb der Prothorakaldrüse, dem Organ in dem Ecdyson produziert wird. Durch die Kombination von ChIPseq, RNAseq und der Auswertung elektronischer Daten wurden von uns fünf potentielle Max-unabhängige Zielgene von Myc identifiziert. Des weiteren haben experimentelle Daten gezeigt, dass diese in Zusammenhang mit dem Effekt von Myc auf Max0 Mutanten stehen. Zusammenfassend haben unsere Daten bestätigt, dass einige Funktionen von Myc Max-unabhängig sind und es besteht die Möglichkeit, dass dieser Effekt eine Rolle während der Replikation spielen könnte. KW - Drosophila Myc transcription growth PAF1 KW - Taufliege KW - Myc Y1 - 2018 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-154917 ER - TY - THES A1 - Gmeiner, Florian T1 - Der Einfluss der Neurotransmitter Dopamin, Serotonin und GABA sowie ihrer Transporter auf das Schlafverhalten von Drosophila melanogaster T1 - The influence of the neurotransmitters dopamine, serotonin and GABA as well as its transporters on the sleep behaviour of drosophila melanogaster N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von Dopamin, Serotonin und GABA auf das Schlafverhalten von Drosophila melanogaster genauer untersucht. Mit Hilfe von Mutanten in Wiederaufnahmetransportern für Dopamin und Serotonin konnte gezeigt werden, dass Dopamin und Serotonin entgegengesetzte Wirkungen auf die Schlafmenge der Fliegen haben. Dopamin hat eine schlafhemmende, Serotonin eine schlaffördernde Wirkung. Die Nutzung eines neuronal dopamindefizienten Fliegenstammes erweitert diese Erkenntnisse. Die Nutzung von RNAi zur Hinunterregulierung der Rezeptoren für Dopamin brachte keine weiteren Erkenntnisse, da sie zu keinem messbaren Effekt führen. Jedoch ergab eine parallel dazu durchgeführte Hinunterregulierung des GABABR2 Rezeptors, dass dieser maßgeblich für die Aufrechterhaltung des Schlafes in der zweiten Hälfte der Nacht verantwortlich ist. Es konnte gezeigt werden, dass für diese Aufgabe vor allem ihre Expression in den l-LNv Neuronen relevant ist. Dabei ist für die GABABR2 Rezeptoren kein Effekt, für Dopamin und Serotonin nur in geringen Ausmaß ein Effekt auf die Innere Uhr in Form von gering veränderter Periode zu beobachten. Durch eine Kombination der Transportermutanten für Dopamin und Serotonin mit dem intakten, als auch mutierten WHITE Transporter zeigte sich eine interessante Interaktion dieser drei Transporter bei der Regulation der Gesamtschlafmenge, wobei die white Mutation zu einer Reduzierung der Gesamtschlafmenge führt. UPLC Messungen der Stämme ergaben, dass der Effekt von white vermutlich auf dessen Einfluss auf den beta-Alanyldopamingehalt der Fliegen basiert. beta-Alanyldopamin wird bei dem Transport von Dopamin über die Gliazellen durch das Enzym EBONY gebildet, dessen Mutation in der Kombination mit intaktem WHITE und mutiertem Dopamintransporter zu einer drastischen Reduktion des Schlafes während der Nacht führt. Im Rahmen der Untersuchung konnte zudem gezeigt werden, dass entgegen des bisherigen Wissens aus Zellkulturstudien in Drosophila melanogaster kein beta-Alanylserotonin gebildet wird. Möglicherweise wird nur Dopamin, nicht jedoch Serotonin über die Gliazellen recycelt. Dies ist ein interessanter Unterschied, der sowohl eine zeitliche, als auch lokale Feinregulation der Gegenspieler Dopamin und Serotonin ermöglicht. Die Untersuchung der Dimerpartner BROWN und SCARLET zeigte, dass lediglich BROWN zu einer Reduktion des Schlafes führt. Ein Effekt, der auch in einer Fliegenlinie mit spontaner white Mutation beobachtet werden konnte. Die genaue Funktion dieses Heterodimertransporters und seine neuronale Lokalisation wurden im Rahmen dieser Arbeit noch nicht geklärt. Dennoch liegt eine Funktion als Dopamin- oder beta-Alanyldopamintransporter in Gliazellen auf Grund der ermittelten Ergebnisse nahe. Zusätzlich konnte zum ersten Mal in Drosophila melanogaster eine Funktion der Amintransporter bei der Anpassung der Inneren Uhr an extreme kurze bzw. lange Photoperioden gezeigt werden. Eine anatomische Lokalisierung des WHITE Transporters im Gehirn von Drosophila melanogaster, die weitere Charakterisierung der Rolle des WHITE/BROWN Dimers und die Zuordnung bestimmter dopaminerger und serotonerger Neurone bei der Modulation der Aktivitätsmaxima stellen spannende Fragen für zukünftige Arbeiten dar. N2 - The main focus in the present work, was the observation of the influence of dopamine, serotonin and GABA on the sleep behaviour of Drosophila melanogaster. By utilizing mutants for the dopamine transporter as well as the serotonin transporter, it was possible to show, that dopamine and serotonin have opposing effects on the total sleep amount of flies. Dopamine has a sleep inhibiting, serotonin a sleep promoting function. A neuronal dopamine deficient stock complemented those findings. Usage of RNAi to downregulate dopamine receptors did not enhance the information, since no measurable effect could be detected. But in parallel performed experiments with RNAi mediated knockdown of GABABR2 receptors could show its role in the maintenance of sleep during the second half of the night. I could show that especially the expression in the l-LNv is needed for that. In case of the GABABR2 receptors no effect on the period was observed, for dopamine and serotonin only a minor effect on the clock in form of a mild period change accompanied those drastic sleep phenotypes. Combining the amine transporter mutants with functional as well as mutated white led to some interesting observations regarding the interaction of those transporters in regulating total sleep, in which white reduces the total sleep amount. Following up those experiments with UPLC measurements, it was shown that presumably WHITE causes its effect due to its relevance for the amount of beta-alanyldopamine in adult flies. When dopamine is transported into the glia cells, beta-alanyldopamine is synthesized by the enzyme EBONY. The ebony mutant revealed a drastic sleep phenotype when combined with an intact WHITE transporter and a mutated dopamine transporter. This leads to a dramatic decrease of sleep during the night phase. When doing the UPLC measurements it was furthermore revealed, that unexpectedly regarding the knowledge from cell culture experiments, beta-alanylserotonin cannot be detected. Presumably, only dopamine, but not serotonin is recycled by the glia cells. This interesting difference gives space for a temporal as well as for a local fine regulation of the dopamine and serotonin signals. Investigating the dimer partners of WHITE, BROWN and SCARLET, I found that BROWN just as a spontaneous white mutation that I observed, led to a decrease of total sleep. The function of this heterodimer and its neuronal localisation in the brain remains unknown. Regarding the data presented in this work, it is likely that this dimer transports either dopamine or beta-alanyldopamine in glia cells. Furthermore, I could observe that dopamine and serotonin change the ability of the circadian clock to adapt to different photoperiods, a so far unstudied phenotype. 96 An anatomical approach to localize the WHITE transporter in the brain of Drosophila melanogaster and a further characterization of the function of the WHITE/BROWN dimer, with regard to sleep and eventually the mapping of serotonergic and dopaminergic neurons, which modulate the activity peak responses, are questions for future work. KW - Taufliege KW - Drosophila melanogaster KW - Schlaf KW - Dopamin KW - Serotonin KW - GABA KW - Drosophila melanogaster KW - sleep KW - dopamine KW - serotonin KW - GABA KW - Schlaf KW - Dopamin KW - Serotonin KW - Aminobuttersäure Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99152 ER - TY - THES A1 - Grebler, Rudi T1 - Untersuchung der Rolle von Rhodopsin 7 und Cryptochrom im Sehprozess von Drosophila melanogaster T1 - Investigation of Rhodopsin 7 and Cryptochrome in Drosophila melanogaster vision N2 - Ausgangspunkt für die Detektion von Licht ist im gesamten Tierreich die Absorption von Photonen durch photorezeptive Proteine, die sogenannten Opsine und in geringerem Ausmaß die Typ 1 Cryptochrome. Die Taufliege Drosophila melanogaster besitzt sechs eingehend charakterisierte, auch als Rhodopsine bezeichnete Opsine (Rh1-Rh6) und ein Cryptochrom (CRY). Neben den Ocellen und den Hofbauer-Buchner Äuglein werden die Rhodopsine in erster Linie in den Photorezeptorzellen der Komplexaugen, den Hauptorganen der Lichtperzeption exprimiert, wo sie der Vermittlung der visuellen Wahrnehmung dienen. Basierend auf Sequenzvergleichen wurde im Jahr 2000 ein neues Protein namens Rh7 zur Gruppe der Drosophila Opsine hinzugefügt. Bis heute fehlt allerdings jeglicher experimentelle Beleg für die photorezeptive Funktion dieses Proteins. Im Gegensatz dazu wird Cryptochrom in erster Linie in einigen Uhrneuronen des Drosophila Gehirns exprimiert, wo es diesen Neuronen die Fähigkeit zur Lichtdetektion verleiht und das Photoentrainment der inneren Uhr lenkt. Neueren Untersuchungen zu folge spielt CRY allerdings auch bei der visuellen Wahrnehmung der Augen eine Rolle. Die vorliegende Arbeit zielte nun darauf ab die potentielle Funktion von Rh7 als neuen Photorezeptor in Drosophila sowie die Rolle von CRY bei der visuellen Lichtperzeption zu untersuchen. Die Aufnahmen der Elektroretinogramme (ERGs) von transgenen Fliegen, die Rh7 anstelle von oder zusammen mit dem dominanten Photorezeptor Rh1 in den Komplexaugen exprimieren, zeigen, dass Rh7 die Phototransduktionskaskade bei Belichtung mit Weißlicht nicht aktivieren kann. Die Abwesenheit von Rh7 sorgt allerdings trotzdem für eine Beeinträchtigung der lichtinduzierten Antwort der Rezeptorzellen im Komplexauge. So zeigen die Intensitäts-Response Kurven der ERG Rezeptorpotentialamplitude von rh7 Knockout-Fliegen unter Weißlicht niedriger und mittlerer Intensität nach einer anfänglichen Dunkeladaptation von 15min eine insgesamt, im Vergleich zur Kontrolle erhöhte Rezeptorpotentialamplitude. Der Verlauf dieser Kurven deutet außerdem darauf hin, dass die Zunahme der Rezeptorpotentialamplitude mit steigender Lichtintensität größer wird. Zudem zeigt das Aktionsspektrum für die Rezeptorpotentialamplitude der rh7 Knockout-Fliegen, dass diese Empfindlichkeitszunahme im gesamten Bereich von 370-648nm auftritt. Diese Beeinträchtigung scheint jedoch zu fehlen, wenn die Fliegen vor Experimentbeginn nur 1min dunkeladaptiert wurden, oder wenn intensives Blaulicht zur Belichtung verwendet wird. Des weiteren ist auch das 4s nach Ende des Lichtpulses im ERG gemessene Nachpotential bei fehlendem Rh7 reduziert. Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Rh7, wenn auch nicht als Photorezeptor, bei Belichtung mit Weißlicht niedriger und mittlerer Intensität die Lichtantwort in den Rezeptorzellen des Komplexauges in Abhängigkeit von Intensität und Adaptationszustand beeinflusst und dass dieser Einfluss scheinbar nicht durch Licht eines eng begrenzten Wellenlängenbereichs induziert wird. Des weiteren legt die Untersuchung des ERG Nachpotentials nahe, dass Rh7 möglicherweise für eine normale Beendigung der Lichtantwort benötigt wird. Die allgemeine Funktion von Rh7 als Photorezeptor in Drosophila sowie die Eigenschaften der endogenen Funktion von Rh7 werden diskutiert. Unabhängig davon wird in der vorliegenden Arbeit auch gezeigt, dass Fliegen ohne CRY zwar nach 15-minütiger, nicht jedoch nach 1-minütiger Dunkeladaptation bei Belichtung mit Weißlicht niedriger Intensität eine insgesamt geringere ERG Rezeptorpotentialamplitude aufweisen. Dies könnte auf eine Beeinträchtigung der Dunkeladaptationsprozesse bei Abwesenheit von CRY hindeuten. N2 - Throughout the animal kingdom light detection is based on the absorption of photons by photoreceptive proteins, the so called opsins and to a minor degree the type 1 cryptochromes. The fruit fly Drosophila melanogaster possesses six well characterized opsins, also referred to as rhodopsins (Rh1-Rh6) and one cryptochrome (CRY). Besides the ocelli and the Hofbauer-Buchner eyelet, the rhodopsins are predominantly expressed in the photoreceptor cells of the compound eye, the major light receptive organ of the fly, where they mediate visual perception. Based on sequence comparisons a new protein, called Rh7, was added to the group of Drosophila opsins in the year 2000. But to date there is no experimental evidence for the photoreceptive function of this protein. By contrast cryptochrome is predominantly expressed in some clock neurons of the Drosophila brain, where it confers light sensitivity to these neurons and guides the photoentrainment of the endogenous clock. But recent publications also envisage a role for CRY in visual perception. The present thesis now aimed to investigate the putative function of Rh7 as a new photoreceptor in Drosophila as well as the role of CRY in visual perception. Recordings of the electroretinogram (ERG) of transgenic flies, that express Rh7 instead of or together with the major photoreceptor Rh1 in the compound eye, show that Rh7 can not activate the phototransduction cascade under white-light. Nevertheless, the absence of Rh7 impairs the light induced response of the receptor cells in the compound eye. Thus, the irradiance-response curves for the ERG receptor potential of rh7 knockout-flies show an overall increased amplitude of the receptor potential compared to controls upon illumination with white-light in the low- and mid-intensity range and after an initial dark adaptation of 15min. The curve shape also indicates that the gain in amplitude gets bigger with increasing light intensity. In addition the action spectrum for the receptor potential of rh7 knockout-flies demonstrates that this increase in sensitivity covers the whole range from 370-648nm. However this impairment seems to be absent when flies were only allowed to dark adapt for 1min before the experiment or when intense blue light is used for illumination. Moreover also the ERG afterpotential measured 4s after lights-off is reduced in absence of Rh7. Taken together these results indicate that Rh7, even though it might not work as a photoreceptor under white-light, alters the light response of the receptor cells in the compound eyes under low- and mid-intense white-light in an intensity and adaptation dependent manner and that this alteration seems not to be caused by light of a limited spectral range. Furthermore the analysis of the ERG afterpotential indicates that Rh7 may also be required for normal light response termination. The general function of Rh7 as a photoreceptor in Drosophila as well as the characteristics of the endogenous function of Rh7 are discussed. Independently the present thesis also demonstrates that flies lacking CRY show a decreased ERG receptor potential amplitude upon illumination with low-intensity white-light when 15min but not when 1min of dark adaptation preceded the recording. This may indicate an impairment of the dark adaptation process without cryptochrome. KW - Taufliege KW - Rhodopsin 7 KW - Rhodopsin KW - Cryptochrom KW - Drosophila Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114466 ER - TY - THES A1 - Grotemeyer, Alexander T1 - Characterisation and application of new optogenetic tools in \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Charakterisierung und Anwendung neuer optogenetischer Werkzeuge in \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - Since Channelrhodopsins has been described first and introduced successfully in freely moving animals (Nagel et al., 2003 and 2005), tremendous impact has been made in this interesting field of neuroscience. Subsequently, many different optogenetic tools have been described and used to address long-lasting scientific issues. Furthermore, beside the ‘classical’ Channelrhodopsin-2 (ChR2), basically a cation-selective ion channel, also altered ChR2 descendants, anion selective channels and light-sensitive metabotropic proteins have expanded the optogenetic toolbox. However, in spite of this variety of different tools most researches still pick Channelrhodopsin-2 for their optogenetic approaches due to its well-known kinetics. In this thesis, an improved Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), is described, which might become an useful tool to provide ambitious neuroscientific approaches by dint of its characteristics. Here, ChR2XXM was chosen to investigate the functional consequences of Drosophila larvae lacking latrophilin in their chordotonal organs. Finally, the functionality of GtACR, was checked at the Drosophila NMJ. For a in-depth characterisation, electrophysiology along with behavioural setups was employed. In detail, ChR2XXM was found to have a better cellular expression pattern, high spatiotemporal precision, substantial increased light sensitivity and improved affinity to its chromophore retinal, as compared to ChR2. Employing ChR2XXM, effects of latrophilin (dCIRL) on signal transmission in the chordotonal organ could be clarified with a minimum of side effects, e.g. possible heat response of the chordotonal organ, due to high light sensitivity. Moreover, optogenetic activation of the chordotonal organ, in vivo, led to behavioural changes. Additionally, GtACR1 was found to be effective to inhibit motoneuronal excitation but is accompanied by unexpected side effects. These results demonstrate that further improvement and research of optogenetic tools is highly valuable and required to enable researchers to choose the best fitting optogenetic tool to address their scientific questions. N2 - Seit dem Channelrhodopsine das erste Mal beschrieben und erfolgreich in lebende Tiere eingebracht wurden (Nagel et al., 2003 und 2005), kam es zu einem beträchtlichen Fortschritt in diesem interessanten Gebiet der Neurowissenschaften. In der nachfolgenden Zeit wurden viele verschiedene optogenetische Werkzeuge beschrieben und zur Bearbeitung neurowissenschaftlicher Fragestellungen angewandt. Des Weiteren haben neben dem „klassischen“ Channelrhodopsin-2 (ChR2), ein im Wesentlichen Kation selektiver Kanal, auch modifizierte ChR2 Abkömmlinge, Anion selektive Kanäle und Licht sensitive metabotrope Proteine, die opotogenetische Werkzeugkiste erweitert. Dennoch greifen die meisten Wissenschaftler trotz der Vielfalt an optogenetischen Werkzeugen meist noch zu Channelrhodopsin-2, da seine Wirkungseigenschaften sehr gut erforscht sind. In der nachfolgenden Arbeit wird ein weiterentwickeltes Channelrhodopsin, Channelrhodopsin2-XXM (ChR2XXM), beschrieben. Aufgrund seiner vielfältigen Eigenschaften stellt es ein vielversprechendes Werkzeug dar, vor allem für zukünftige neurowissenschaftliche Forschungsarbeiten. Hierbei wurde ChR2XXM eingesetzt, um zu untersuchen welche Auswirkungen das Fehlen von Latrophilin im Chordotonal Organ von Drosophilalarven hat. Schließlich wurde noch die Funktionalität von GtACR an der neuromuskulären Endplatte der Drosophila überprüft. Für die umfassende Charakterisierung wurden elektrophysiologische und verhaltensbasierte Experimente an Larven durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass ChR2XXM aufgrund einer erhöhten Affinität zu dem Chromophore Retinal, im Vergleich zu ChR2 ein besseres zelluläres Expressionsmuster, eine bessere zeitliche Auflösung und eine erheblich höhere Lichtsensitiviät aufweist. Durch den Einsatz von ChR2XXM konnte, aufgrund der hohen Lichtsensitiviät, mit nur minimalen Nebeneffekten, wie z.B. mögliche Wärmeaktivierung des Chordotonalorgans, der Einfluss von Latrophilin (dCIRL) auf die Signaltransmission im Chordotonalorgan, aufgeklärt werden. Ferner führte eine optogenetische, in vivo, Aktivierung des Chordotonalorgans zu Verhaltensänderungen. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass GtACR1 zwar effektiv motoneuronale Erregung inhibieren kann, dies aber von unerwarteten Nebeneffekten begleitet wird. Diese Ergebnisse zeigen auf, dass weitere Forschung und Verbesserungen im Bereich der optogenetischen Werkzeuge sehr wertvoll und notwendig ist, um Wissenschaftlern zu erlauben das am besten geeignetste optogenetische Werkzeug für ihre wissenschaftlichen Fragestellungen auswählen zu können. KW - Optogenetik KW - Taufliege KW - Elektrophysiologie KW - Channelrhodopsin-2 KW - optogenetics KW - Drosophila melanogaster KW - Channelrhodopsin KW - Electrophysiology Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178793 ER - TY - THES A1 - Gruber, Franz Andreas T1 - Untersuchung zur Regulation der Expression des zuckerkonditionierten Verhaltens bei Drosophila melanogaster T1 - Analysing the regulation of the expression of sugar-conditioned behaviour in Drosophila melanogaster N2 - In dieser Doktorarbeit habe ich die Regulation der Expression des zuckerbelohnten Verhaltens durch den Fütterungszustand bei Drosophila melanogaster untersucht. Die Fliegen können während einer Trainingsphase mit Hilfe einer Zuckerbelohnung auf einen bestimmten Duft konditioniert werden. Nach dem Training können die Fliegen dann auf das olfaktorische Gedächtnis getestet werden. Die Bereitschaft das zuckerkonditionierte Gedächtnis im Test zu zeigen wird vom Fütterungszustand kontrolliert, wie ich in Übereinstimmung mit den Ergebnissen früherer Arbeiten demonstrierte (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008). Nur nicht gefütterte Fliegen exprimieren das Gedächtnis, während Fütterungen bis kurz vor dem Test eine reversibel supprimierende Wirkung haben. Einen ähnlichen regulatorischen Einfluss übt der Futterentzug auch auf die Expression anderer futterbezogener Verhaltensweisen, wie z.B. die naive Zuckerpräferenz, aus. Nachdem ich den drastischen Einfluss des Fütterungszustands auf die Ausprägung des zuckerkonditionierten Verhaltens gezeigt bzw. bestätigt hatte, habe ich nach verhaltensregulierenden Faktoren gesucht, die bei einer Fütterung die Gedächtnisexpression unterdrücken. Als mögliche Kandidaten untersuchte ich Parameter, die zum Teil bereits bei verschiedenen futterbezogenen Verhaltensweisen unterschiedlicher Tierarten als „Sättigungssignale“ identifiziert worden waren (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). Dabei stellte sich heraus, dass weder die „ernährende“ Eigenschaft des Futters, noch ein durch Futteraufnahme bedingter Anstieg der internen Glukosekonzentration für die Suppression des zuckerkonditionierten Gedächtnisses notwendig sind. Die Unterdrückung der Gedächtnisexpression kann auch nicht durch Unterschiede in den aufgenommenen Futtermengen, die als verhaltensinhibitorische Dehnungssignale des Verdauungstrakts wirken könnten, oder mit der Stärke des süßen Geschmacks erklärt werden. Die Suppression des zuckerbelohnten Verhaltens folgte den Konzentrationen der gefütterten Substanzen und war unabhängig von deren chemischen Spezifität. Deshalb wird die Osmolarität des aufgenommenen Futters als ein entscheidender Faktor für die Unterdrückung der zuckerkonditionierten Gedächtnisexpression angenommen. Weil nur inkorporierte Substanzen einen Unterdrückungseffekt hatten, wird ein osmolaritätsdetektierender Mechanismus im Körper 67 postuliert, wahrscheinlich im Verdauungstrakt und/oder der Hämolymphe. Die Hämolymphosmolarität ist als „Sättigungssignal“ bei einigen wirbellosen Tieren bereits nachgewiesen worden (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Deshalb habe ich mit Hilfe genetischer Methoden und ohne die Fliegen zu füttern, versucht über einen künstlich induzierten Anstieg der Trehaloseund Lipidkonzentrationen die Osmolarität der Hämolymphe in Drosophila zu erhöhen. Eine solche konzentrationserhöhende Wirkung für Lipide und die Trehalose, dem Hauptblutzucker der Insekten, ist bereits für das adipokinetische Hormon (AKH), das von Zellen der Corpora cardiaca exprimiert wird, nachgewiesen worden (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). Es stellte sich heraus, dass die künstliche Stimulierung AKH-produzierender Neurone das zuckerkonditionierten Verhalten temporär, reversible und selektiv unterdrückt. Gleiche Behandlungen hatten keinen Effekt auf ein aversiv konditioniertes olfaktorisches Gedächtnis oder ein naives Zuckerpräferenzverhalten. Wie aus dieser Arbeit hervorgeht, stellt wahrscheinlich die Osmolarität des Verdauungstrakts und der Hämolymphe oder nur der Hämolymphe ein physiologisches Korrelat zum Fütterungszustand dar und wirkt als unterdrückendes Signal. Dass Fütterungen das zuckerkonditionierte Verhalten und die Zuckerpräferenz supprimieren, die künstliche Stimulation AKH-produzierender Zellen aber selektiv nur die zuckerbelohnte Gedächtnisexpression unterdrückt, deutet auf mindestens zwei unterschiedliche „Sättigungssignalwege“ hin. Außerdem macht es deutlich wie uneinheitlich futterbezogene Verhaltensweisen, wie das zuckerbelohnte Verhalten und die naive Zuckerpräferenz, reguliert werden. N2 - In this work I investigated the regulation of the expression of the sugar conditioned behavior by feeding states in Drosophila melanogaster. During the training flies are able to associate an odor with a sugar reward. During the test these flies have the opportunity to show their odor memory. In accordance with previous findings (Tempel et al. 1983; Gruber 2006; Krashes et al. 2008), I also showed that the readiness to express sugar conditioned memory is controlled by the feeding state. The memory was only displayed by starved flies, whereas feedings of the flies until the test cause a reversible and temporary suppression of conditioned behavior. Feeding states similarly influence the expression of other food-related behaviors like sugar preference. After I have showed/confirmed the drastic influence of feeding state on sugar conditioned behavior, I tried to search for factors which suppress the memory expression of conditioned flies during feeding. Therefore I verified physiological parameters as promising candidates which have already been identified as “satiation-signals” for different food-related behaviors through the animal kingdom (Marty et al. 2007; Powley and Phillips 2004; Havel 2001; Bernays and Chapman 1974; Simpson and Bernays 1983; Gelperin 1971a). As the results revealed, neither the nutritional value of the available food nor an increase of the internal glucose-concentrations were necessary for suppressing conditioned behavior. Furthermore differences in sweet taste and in the amount of the ingested food, which likely serve as volumetric signals of the digestive system, were not critical determinants for inhibition of the memory expression. Because suppression followed the concentration of the substances independent of the chemical specificity, I conclude that the osmolarity of the ingested food is a critical factor for inhibition of sugar conditioned behavior. Only ingested substances were suppressive. Therefore an internal osmolarity-detecting mechanism is postulated, most probably in the digestive system or the hemolymph. Hemolymph-osmolarity has already been shown as a “satiation-signal” for some invertebrates (Bernays and Chapman 1974; Simpson and Raubenheimer 1993; Gelperin 1971a; Phifer and Prior 1985). Thus I tried to increase the hemolymph-osmolarity by an artificially induced rise of the concentration of lipids and trehalose, the main blood sugar of insects. A concentration-increasing effect such like this has already been shown for the adipokinetic hormone (AKH), which is expressed in cells of the corpora cardiaca (Kim and Rulifson 2004; Lee and Park 2004; Isabel et al. 2005). I demonstrated that an artificial stimulation of AKH69 producing neurons induces the suppression of sugar conditioned behavior, but leaves aversive conditioned behavior and naïve sugar preference unchanged. This work indicates that the osmolarity of the digestive system and the hemolymph or only of the hemolymph serves as (a) physiological correlate(s), which signals suppression. Feeding induced inhibition of the expression of sugar conditioned behavior and naïve sugar preference, whereas the artificial stimulation of AKH-producing cells selectively inhibited sugar rewarded memory expression alone. Thus I assume at least two separable “satiation”-pathways. Moreover these results demonstrate the non-uniform regulation of different food-related behaviors like sugar conditioned behavior and naïve sugar preference. KW - Taufliege KW - Futterentzug KW - Klassische Konditionierung KW - Konditionierung KW - Gedächtnis KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Osmolarität KW - Drosophila melanogaster KW - zuckerkonditioniertes Verhalten KW - klassische Konditionierung KW - Futterentzug KW - Drosophila melanogaster KW - sugar-conditioned behaviour KW - classical conditioning KW - food deprivation KW - starvation Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-48802 ER - TY - THES A1 - Guan, Chonglin T1 - Functional and genetic dissection of mechanosensory organs of \(Drosophila\) \(melanogaster\) T1 - Funktionelle und genetische Analyse von mmechanosensorischen Organe in \(Drosophila\) \(melanogaster\) N2 - In Drosophila larvae and adults, chordotonal organs (chos) are highly versatile mechanosensors that are essential for proprioception, touch sensation and hearing. Chos share molecular, anatomical and functional properties with the inner ear hair cells of mammals. These multiple similarities make chos powerful models for the molecular study of mechanosensation. In the present study, I have developed a preparation to directly record from the sensory neurons of larval chos (from the lateral chos or lch5) and managed to correlate defined mechanical inputs with the corresponding electrical outputs. The findings of this setup are described in several case studies. (1) The basal functional lch5 parameters, including the time course of response during continuous mechanical stimulation and the recovery time between successive bouts of stimulation, was characterized. (2) The calcium-independent receptor of α-latrotoxin (dCIRL/Latrophilin), an Adhesion class G protein-coupled receptor (aGPCR), is identified as a modulator of the mechanical signals perceived by lch5 neurons. The results indicate that dCIRL/Latrophilin is required for the perception of external and internal mechanical stimuli and shapes the sensitivity of neuronal mechanosensation. (3) By combining this setup with optogenetics, I have confirmed that dCIRL modulates lch5 neuronal activity at the level of their receptor current (sensory encoding) rather than their ability to generate action potentials. (4) dCIRL´s structural properties (e.g. ectodomain length) are essential for the mechanosensitive properties of chordotonal neurons. (5) The versatility of chos also provides an opportunity to study multimodalities at multiple levels. In this context, I performed an experiment to directly record neuronal activities at different temperatures. The results show that both spontaneous and mechanically evoked activity increase in proportion to temperature, suggesting that dCIRL is not required for thermosensation in chos. These findings, from the development of an assay of sound/vibration sensation, to neuronal signal processing, to molecular aspects of mechanosensory transduction, have provided the first insights into the mechanosensitivity of dCIRL. In addition to the functional screening of peripheral sensory neurons, another electrophysiological approach was applied in the central nervous system: dCIRL may impact the excitability of the motor neurons in the ventral nerve cord (VNC). In the second part of my work, whole-cell patch clamp recordings of motor neuron somata demonstrated that action potential firing in the dCirl\(^K\)\(^O\) did not differ from control samples, indicating comparable membrane excitability. N2 - In Drosophila Larven, sowie in adulten Tieren, sind die Chordotonalorgane (Chos) sehr vielseitige Mechanosensoren und von wesentlicher Bedeutung für die Propriozeption, das Tastgefühl und die auditive Wahrnehmung. Chos teilen molekulare, anatomische und funktionelle Eigenschaften mit Innenohrhaarzellen der Säugetiere und machen sie somit zu leistungsstarken Modellen um molekulare Mechanismen der Mechanosensorik zu untersuchen. In der vorliegenden Studie habe ich ein Präparat entwickelt, um direkt von sensorischen Neuronen der larvalen Chos (von lateralen Chos oder lch5) abzuleiten und definierte mechanische Eingänge mit den korrelierenden elektrischen Ausgängen zu verbinden. Im Folgenden sind die Ergebnisse dieses experimentellen Setups zusammengefasst. (1) Die basalen funktionellen Parameter von lch5 insbesondere der Zeitverlauf der Reaktion während kontinuierlicher mechanischer Stimulation und die Erholungszeit zwischen aufeinanderfolgenden Stimulationen wurden bestimmt. (2) Der Calcium-unabhängige Rezeptor von α-Latrotoxin (dCIRL/Latrophilin), ein Adhäsion Klasse G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) wurde als Modulator der von Ich5 Neuronen perzipierten mechanischen Signale identifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass dCIRL/Latrophilin für die Wahrnehmung der externen und internen mechanischen Reize erforderlich ist und die Empfindlichkeit neuronaler Mechanosensorik modelliert. (3) Mit Hilfe optogenetischer Werkzeuge konnte ich bestätigen, dass dCIRL die Aktivität von lch5 Neuronen auf Ebene des Rezeptorstroms (sensorische Kodierung) und nicht der Generierung von Aktionspotentialen moduliert. (4) Die strukturellen Eigenschaften von dCIRL (z.B. Ektodomänenlänge) sind wesentlich für die mechanosensitiven Eigenschaften von Chos. (5) Die Vielseitigkeit der Chos bietet des Weiteren die Möglichkeit, Multimodalitäten auf mehreren Ebenen zu untersuchen. In diesem Zusammenhang wurde die neuronale Aktivität der Chos bei verschiedenen Temperaturen analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass sich sowohl spontane als auch mechanisch evozierte Aktivität im Verhältnis zur Temperatur erhöhen, was darauf hindeutet, dass dCIRL keine Rolle in der Temperaturwahrnehmung spielt. Diese Erkenntnisse, von der Entwicklung des Präparats der Ton/Vibrations Wahrnehmung, über die neuronalen Signalverarbeitung bis hin zu molekularen Aspekten der Mechanotransduktion, haben erste Einblicke in die Mechanosensitivität von dCIRL gewährt. Neben der funktionellen Charakterisierung peripherer sensorischer Neurone wurde ein weiterer elektrophysiologischer Ansatz im larvalen Zentralnervensystem gewählt, um zu untersuchen, ob sich dCIRL auf die Erregbarkeit motorischer Nervenzellen im Strickleiternervensystem (VNC) auswirkt. Im zweiten Teil meiner Arbeit wird mit Hilfe des whole-cell-patch-clamp-Verfahrens gezeigt, dass die Aktionspotentialfrequenz in Motoneuronen von dCirl\(^K\)\(^O\) Mutanten ähnlich derer von Kontrolltieren ist, d.h. ihre Membranerregbarkeit ist vergleichbar. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Mechanosensation KW - Adhesion-GPCR KW - Electrophysiology KW - Mechanorezeptor KW - Elektrophysiologie KW - Chordontonal organ Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-146220 ER - TY - THES A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS-15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - synaptic proteins KW - monoclonal antibodies Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 N1 - korrigierte Ausgabe der Arbeit aus dem Jahr 2022 unter: https://doi.org/10.25972/OPUS-27020 ER - TY - BOOK A1 - Halder, Partho T1 - Identification and characterization of synaptic proteins of Drosophila melanogaster using monoclonal antibodies of the Wuerzburg Hybridoma Library T1 - Identifikation und Charakterisierung von synaptischen Proteinen von Drosophila melanogaster mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern der Würzburger Hybridoma-Bibliothek N2 - For a large fraction of the proteins expressed in the human brain only the primary structure is known from the genome project. Proteins conserved in evolution can be studied in genetic models such as Drosophila. In this doctoral thesis monoclonal antibodies (mAbs) from the Wuerzburg Hybridoma library are produced and characterized with the aim to identify the target antigen. The mAb ab52 was found to be an IgM which recognized a cytosolic protein of Mr ~110 kDa on Western blots. The antigen was resolved by two-dimensional gel electrophoresis (2DE) as a single distinct spot. Mass spectrometric analysis of this spot revealed EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) to be a strong candidate. Another mAb from the library, aa2, was already found to recognize EPS-15, and comparison of the signal of both mAbs on Western blots of 1D and 2D electrophoretic separations revealed similar patterns, hence indicating that both antigens could represent the same protein. Finally absence of the wild-type signal in homozygous Eps15 mutants in a Western blot with ab52 confirmed the ab52 antigen to be EPS-15. Thus both the mAbs aa2 and ab52 recognize the Drosophila homologue of EPS-15. The mAb aa2, being an IgG, is more suitable for applications like immunoprecipitation (IP). It has already been submitted to the Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) to be easily available for the entire research community. The mAb na21 was also found to be an IgM. It recognizes a membrane associated antigen of Mr ~10 kDa on Western blots. Due to the membrane associated nature of the protein, it was not possible to resolve it by 2DE and due to the IgM nature of the mAb it was not possible to enrich the antigen by IP. Preliminary attempts to biochemically purify the endogenously expressed protein from the tissue, gave 99 promising results but could not be completed due to lack of time. Thus biochemical purification of the protein seems possible in order to facilitate its identification by mass spectrometry. Several other mAbs were studied for their staining pattern on cryosections and whole mounts of Drosophila brains. However, many of these mAbs stained very few structures in the brain, which indicated that only a very limited amount of protein would be available as starting material. Because these antibodies did not produce signals on Western blots, which made it impossible to enrich the antigens by electrophoretic methods, we did not attempt their purification. However, the specific localization of these proteins makes them highly interesting and calls for their further characterization, as they may play a highly specialized role in the development and/or function of the neural circuits they are present in. The purification and identification of such low expression proteins would need novel methods of enrichment of the stained structures. N2 - Für einen Großteil der Proteine, die im menschlichen Gehirn exprimiert werden, ist lediglich die Primärstruktur aus dem Genomprojekt bekannt. Proteine, die in der Evolution konserviert wurden, können in genetischen Modellsystemen wie Drosophila untersucht werden. In dieser Doktorarbeit werden monoklonale Antikörper (mAk) aus der Würzburger Hybridoma Bibliothek produziert und charakterisiert, mit dem Ziel, die erkannten Proteine zu identifizieren. Der mAk ab52 wurde als IgM typisiert, das auf Western Blots ein zytosolisches Protein von Mr ~110 kDa erkennt. Das Antigen wurde durch zwei-dimensionale Gelelektrophorese (2DE) als einzelner Fleck aufgelöst. Massenspektrometrische Analyse dieses Flecks identifizierte dass EPS-15 (epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15) als viel versprechenden Kandidaten. Da für einen anderen mAk aus der Bibliothek, aa2, bereits bekannt war, dass er EPS-15 erkennt, wurden die Western-Blot-Signale der beiden Antikörper nach 1D und 2D Trennungen von Kopfhomogenat verglichen. Die Ähnlichkeit der beiden Muster deuteten darauf hin, dass beide Antigene dasselbe Protein erkennen. Das Fehlen des Wildtyp-Signals in homozygoten Eps15 Mutanten in einem Western Blot mit mAk ab52 bestätigten schließlich, dass EPS-15 das Antigen zu mAk ab52 darstellt. Demnach erkennen beide mAk, aa2 und ab52, das Drosophila Homolog zu EPS- 15. Da mAk aa2 ein IgG ist, dürfte er für Anwendungen wie Immunpräzipitation (IP) besser geeignet sein. Er wurde daher bereits bei der Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB) eingereicht, um ihn der ganzen Forschergemeinde leicht zugänglich zu machen. Der mAk na21 wurde ebenfalls als IgM typisiert. Er erkennt ein Membran assoziiertes Antigen von Mr ~10 kDa auf Western Blots. Aufgrund der Membranassoziierung des Proteins war es nicht möglich, es in 2DE aufzulösen und 101 da es sich um ein IgM handelt, war eine Anreicherung des Antigens mittels IP nicht erfolgreich. Vorversuche zur biochemischen Reinigung des endogenen Proteins aus Gewebe waren Erfolg versprechend, konnten aber aus Zeitmangel nicht abgeschlossen werden. Daher erscheint eine biochemische Reinigung des Proteins für eine Identifikation durch Massenspektrometrie möglich. Eine Reihe weiterer mAk wurden hinsichtlich ihrer Färbemuster auf Gefrierschnitten und in Ganzpräparaten von Drosophila Gehirnen untersucht. Allerdings färbten viele dieser mAk sehr wenige Strukturen im Gehirn, so dass nur eine sehr begrenzte Menge an Protein als Startmaterial verfügbar wäre. Da diese Antikörper keine Signale auf Western Blots produzierten und daher eine Anreicherung des Antigens durch elektrophoretische Methoden ausschlossen, wurde keine Reinigung versucht. Andererseits macht die spezifische Lokalisation dieser Proteine sie hoch interessant für eine weitere Charakterisierung, da sie eine besonders spezialisierte Rolle in der Entwicklung oder für die Funktion von neuralen Schaltkreisen, in denen sie vorkommen, spielen könnten. Die Reinigung und Identifikation solcher Proteine mit niedrigem Expressionsniveau würde neue Methoden der Anreicherung der gefärbten Strukturen erfordern. KW - synaptic proteins KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Monoklonaler Antikörper KW - synaptische Proteine KW - monoklonale Antikörper KW - Drosophila melanogaster KW - monoclonal antibodies Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-270205 N1 - ursprüngliche Originalausgabe der Dissertation erschienen am 19.01.2012 unter: https://nbn-resolving.org/urn:nbn:de:bvb:20-opus-67325 ER - TY - THES A1 - Hampel, Stefanie T1 - Funktionelle Analyse des Einflusses von putativen T-Beta-H-positiven Neuronen auf das ethanolinduzierte Verhalten von Drosophila melanogaster T1 - Functional analysis of putative TbH neurons involved in ethanol induced behavior of Drosophila melanogaster N2 - Es sollten neuronale Netzwerke in Drosophila melanogaster identifiziert werden, die in die Entwicklung von ethanolinduziertem Verhalten involviert sind. Mittels der Tyramin-beta-Hydroxylase (TbH) wird der letzte Schritt der Biosynthese von Oktopamin aus Tyramin gewährleistet. TbHM18 Mutanten entwickeln eine reduzierte Ethanoltoleranz und haben keine nachweisbaren Oktopamin Konzentrationen (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). Die molekulargenetische Ursache dieser Mutante wurde näher untersucht. Wahrscheinlich ist die Deletion von einem Teil des Intron 1, des Exon 2 und einem Teil des Intron 2 des TbH-Gens verantwortlich für den Verlust der Tyramin-beta-Hydroxylase. Die Deletion der kodierenden Sequenz führt jedoch nicht zu einem Leserasterschub in der Aminosäuresequenz. Demzufolge könnte ein verkürztes Protein hergestellt werden. Ferner gibt es zwei Transkripte des TbH-Gens, woraus eventuell zwei Proteine exprimiert werden könnten. Ein Protein wäre die Tyramin-beta-Hydroxylase und das andere könnte eine Dopamin-beta-Hydroxylase sein. Um möglicherweise spezifische putative Subsets von TH-positiven Neuronen zu markieren, wurden verschiedene GAL4-Treiberlinien mit Hilfe unterschiedlicher Fragmente der Promoterregion des TbH-Gens hergestellt. Mittels des GAL4/UAS Systems konnte die Neurotransmitterausschüttung in putativen TbH-positiven Neuronen der TbH-GAL4-Linien inhibiert werden. Auf diese Weise sollte die Funktion der putativen TbH-positiven Neurone während der Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz untersucht werden. Das Transgen Tetanustoxin wurde mit der 1.3TbH-GAL4 Treiberlinie in einem bestimmten Set von Neuronen exprimiert. Die Inhibition der Synaptobrevin-abhängigen Neurotransmission in den 1.3TH-GAL4-positiven Neuronen beeinflusst nicht das ethanolinduzierte Verhalten. Hingegen das Ausschalten der Erregbarkeit der Zellen mit Hilfe eines UAS-Kir2.1 Transgens resultiert in erhöhter Resistenz gegenüber Ethanol. Das heißt, dass Synaptobrevin-unabhängige zelluläre Mechanismen der Zellen notwendig sind, um ethanolinduziertes Verhalten zu regulieren. Die 1.3TbH-GAL4-Linie exprimiert in einem sehr spezifischen Subset von Neuronen GAL4, bzw. Effektoren. Insgesamt werden ≈ 10 Zellen detektiert. Davon liegen die Somata zweier Neurone caudal und projizieren in die Region der ersten und vierten Bande des Fächerförmigen Körpers. Weitere kleine Ansammlungen von acht Zellen können um den Ösophagus und im Bereich des Subösophagialganglion verzeichnet werden. Die mit GFP markierten Neurone exprimieren wahrscheinlich kein Oktopamin. Ferner resultierte die Inhibition der synaptischen Transmission von 6.2TbH-GAL4-positiven Neuronen, mit Hilfe von Tetanustoxin, in einer erhöhten Ethanolsensitivität. Ebenfalls zu einer ethanolinduzierten Verhaltensänderung führt die Inaktivierung der 6.2TbH-GAL4 Zellen mittels eines UAS-Kir2.1 Transgens. Dabei entwickeln die Fliegen eine erhöhte Ethanolresistenz. Somit wäre möglich, dass die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Resistenz über verschiedene zelluläre Mechanismen reguliert werden. Die 6.2TbH-GAL4-Linie ermöglicht die Transgen-Expression in 65-70 Neuronen. Diese innerverieren u.a. das Subösophagialganglion, den Ösophagus, den Ellipsoid Körper, das laterale und das dorso-laterale Protocerebrum. Fünf der Neurone, die sich durch die 6.2TbH-GAL4 Treiberlinie markieren lassen, exprimieren Oktopamin. Dazu gehört ein VUM-Neuron und vier große caudale Zellen. Eine weitere putativ oktopaminerge GAL4-Linie Tdc2-GAL4 wurde mit der UAS-Kir2.1 Effektorlinie gekreuzt und die Nachkommen im Inebriometer gemessen. Bei Inaktivierung der Erregbarkeit der Tdc2-positiven Neurone resultiert dies in einer erhöhten Ethanolsensitivität, hingegen in keiner Veränderung der Toleranz. Die reduzierten Levels an Oktopamin spielen dabei wahrscheinlich eine Rolle. Hingegen regulieren eventuelle neurosekretorische Zellen über andere Mechanismen die Ethanolresistenz, wie die 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 Fliegen zeigen. Es konnte gezeigt werden, dass unterschiedliche Neuronencluster für verschiedene ethanolinduzierte Verhaltensantworten verantwortlich sind. Da wahrscheinlich neurosekretorische Zellen des PI die Ethanolresistenz beeinflussen (RODAN et al. 2002), hingegen den Zentralkomplex-innervierende Zellen eher für die Entwicklung von Ethanolsensitivität und Toleranz notwendig sind (URIZAR et al. 2007). N2 - We wanted to identify neuronal networks in Drosophila melanogaster that are involved in the development of ethanol sensitivity and/or tolerance. The tyramine-beta-hydroxylase (TbH) catalyzes the last step in the biosynthesis of tyramine into octopamine. The TbHM18 mutant develdops a reduced ethanol tolerance, because they have no concentrations of octopamine in their bodies (MONASTIRIOTI et al. 1996; SCHOLZ et al. 2000). We investigated the molecular reason of the mutant. Probably the deletion of a part of intron 1, exon 2 and a part of intron 2 of the TbH gene is responsible for the loss of the tyramine-beta-hydroxylase. The deletion of the coding sequence does not result in a frame shift of the aminoacid sequence and because of this a truncated protein could be expressed. Further there are two transcripts of the TbH gene, from that two proteins could be expressed. One protein could be the tyramine-beta-hydroxylase and the other, a dopamine-beta-hydroxylase. For possibly marking specific putative subsets of TbH-positive neurons, different GAL4 driver lines were generated with different promoter fragments out of the TbH gene. Via the GAL4/UAS system the neurotransmitter release could be inhibited in putative TbH-positive neurons. In this manner the function of the putative TbH-positive neurons should be analyzed during the development of ethanol sensitivity and tolerance. The transgene tetanustoxin was expressed in a specific subset of 1.3TbH-GAL4 positive neurons. The ethanol induced behaviour is not influenced by inhibition of synaptobrevin-dependent neurotransmission in 1.3TbH-GAL4 positive neurons. Blocking the excitability of cells by using a UAS-Kir2.1 transgene results in increased ethanol resistence. That means that synaptobrevin-independent cellular mechanisms of cells are necessary for regulating ethanol induced behaviour. The 1.3TbH-GAL4 line expresses GAL4 in a very specific subset of neurons as well as effectors. All in all about 10 cells can be detected. Two somata of these cells are located caudal which project to the first and fourth layer of the fanshaped body. Eight more cells are localized frontal around the esophagus and in the subesophagial region. Probably the GFP-marked neurons do not express octopamine. Furthermore the inhibition of synaptic transmission with tetanustoxin of 6.2TbH-GAL4 positive neurons results in an increased ethanol sensitivity. Also the inactivation of 6.2TbH-GAL4 cells with an UAS-Kir2.1 transgene leads to an ethanol-induced change of behaviour and there the flies develop an increased ethanol resistence. It could be possible that the development of ethanol sensitivity and tolerance is regulated by different cellular mechanisms. The 6.2TbH-GAL4 line enables transgene expression in 65-70 neurons. These are innervating for example the SOG, esophagus, ellipsoid body, lateral and the dorsolateral protocerebrum. Five of these 6.2TbH-GAL4 driven neurons express octopamine, which include four big caudal cells and probably one VUM-neuron. An additional putative octopaminergic GAL4-line, the Tdc2-GAL4 line was crossed to the UAS-Kir2.1 effector line and the offspring measured for ethanol sensitivity and tolerance in the inebriometer. Inactivation of the excitability of the Tdc2-positive neurons results in an increased ethanol sensitivity, but on the other hand to no change of ethanol tolerance. The reduced octopamine levels do probably play a role in this. However the potential neurosecretory cells regulate the ethanol resistence by different mechanisms, like 6.2TbH-GAL4, UAS-Kir2.1 flies show. The inhibition of neurotransmission with three other TbH-GAL4 lines (600TbH-GAL4, 4.6TbH-GAL4, 6.6TbH-GAL4) show no divergence of ethanol-induced behaviour compared to wildtype flies. There, the specific expression pattern of 600TbH-GAL4 line includes five cells in the pars intercerebralis and a brain surrounding glia layer. Further the 6.6TbH-GAL4 line enables expression of effector genes in eight cells and in a surrounding layer of the brain as well. The expression of 600TbH-GAL4 line and 6.6TbH-GAL4 line do not overlap with the octopaminergic expression pattern of our colocalization studies. The expression of UAS- effector genes driven by 4.6TbH-GAL4 line can be provided in approxymatly 67 neurons of the adult brain. With this GAL4-line the structures of the ellipsoid body, antennal lobes, pars intercerebralis and a big commissur are innervated. Seven cells can be detected caudal, but the region that they are projecting to is unknown. It could be shown that different clusters of neurons are responsible for several ethanol-induced behavioural responses. Because neurosecretory cells of the pars intercerebralis seem to influence the ethanol resistance (RODAN et al. 2002), but central complex- innervating cells are necessary rather for the development of ethanol sensitivity and tolerance (URIZAR et al. 2007). KW - Taufliege KW - TbH KW - Drosophila melanogaster KW - Ethanol KW - TbH KW - Drosophila melanogaster KW - Ethanol Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-25600 ER - TY - THES A1 - Hartlieb, Heiko T1 - Functional analysis of Mushroom body miniature’s RGG-box and its role in neuroblast proliferation in Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse der RGG-Box von Mushroom body miniature und deren Rolle in der Neuroblastenproliferation in Drosophila melanogaster N2 - Development of the central nervous system in Drosophila melanogaster relies on neural stem cells called neuroblasts. Neuroblasts divide asymmetrically to give rise to a new neuroblast as well as a small daughter cell which eventually generates neurons or glia cells. Between each division, neuroblasts have to re-grow to be able to divide again. In previous studies, it was shown that neuroblast proliferation, cell size and the number of progeny cells is negatively affected in larvae carrying a P-element induced disruption of the gene mushroom body miniature (mbm). This mbm null mutation called mbmSH1819 is homozygously lethal during pupation. It was furthermore shown that the nucleolar protein Mbm plays a role in the processing of ribosomal RNA (rRNA) as well as the translocation of ribosomal protein S6 (RpS6) in neuroblasts and that it is a transcriptional target of Myc. Therefore, it was suggested that Mbm might regulate neuroblast proliferation through a role in ribosome biogenesis. In the present study, it was attempted to further elucidate these proposed roles of Mbm and to identify the protein domains that are important for those functions. Mbm contains an arginine/glycine rich region in which a di-RG as well as a di-RGG motif could be found. Together, these two motifs were defined as Mbm’s RGG-box. RGG-boxes can be found in many proteins of different families and they can either promote or inhibit protein-RNA as well as protein-protein interactions. Therefore, Mbm’s RGG-box is a likely candidate for a domain involved in rRNA binding and RpS6 translocation. It could be shown by deletion of the RGG-box, that MbmdRGG is unable to fully rescue survivability and neuroblast cell size defects of the null mutation mbmSH1819. Furthermore, Mbm does indeed rely on its RGG-box for the binding of rRNA in vitro and in mbmdRGG as well as mbmSH1819 mutants RpS6 is partially delocalized. Mbm itself also seems to depend on the RGG-box for correct localization since MbmdRGG is partially delocalized to the nucleus. Interestingly, protein synthesis rates are increased in mbmdRGG mutants, possibly induced by an increase in TOR expression. Therefore, Mbm might possess a promoting function in TOR signaling in certain conditions, which is regulated by its RGG-box. Moreover, RGG-boxes often rely on methylation by protein arginine methyltransferases (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) to fulfill their functions. Mbm might be symmetrically dimethylated within its RGG-box, but the results are very equivocal. In any case, Dart1 and Dart5 do not seem to be capable of Mbm methylation. Additionally, Mbm contains two C2HC type zinc-finger motifs, which could be involved in rRNA binding. In an earlier study, it was shown that the mutation of the zinc-fingers, mbmZnF, does not lead to changes in neuroblast cell size, but that MbmZnF is delocalized to the cytoplasm. In the present study, mbmZnF mutants were included in most experiments. The results, however, are puzzling since mbmZnF mutant larvae exhibit an even lower viability than the mbm null mutants and MbmZnF shows stronger binding to rRNA than wild-type Mbm. This suggests an unspecific interaction of MbmZnF with either another protein, DNA or RNA, possibly leading to a dominant negative effect by disturbing other interaction partners. Therefore, it is difficult to draw conclusions about the zinc-fingers’ functions. In summary, this study provides further evidence that Mbm is involved in neuroblast proliferation as well as the regulation of ribosome biogenesis and that Mbm relies on its RGG-box to fulfill its functions. N2 - Die Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster beruht auf neuronalen Stammzellen genannt Neuroblasten. Neuroblasten teilen sich asymmetrisch und bringen dabei sowohl einen neuen Neuroblasten als auch eine kleinere Tochterzelle hervor, die wiederum letztlich Neuronen oder Gliazellen generiert. Zwischen jeder Zellteilung müssen die Neuroblasten wieder auf ihre ursprüngliche Größe wachsen, sodass sie zur erneuten Teilung in der Lage sind. In vorhergehenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl die Proliferation der Neuroblasten, deren Zellgröße als auch die Anzahl ihrer Tocherzellen reduziert ist in Larven, die eine P-Element-induzierte Unterbrechung des Gens mushroom body miniature (mbm) tragen. Diese mbm-Nullmutation, genannt mbmSH1819, ist homozygot letal während des Puppenstadiums. Es konnte außerdem gezeigt werden, dass das nucleoläre Protein Mbm eine Rolle in der Prozessierung ribosomaler RNA (rRNA), sowie der Translokation des ribosomalen Proteins S6 (RpS6) in Neuroblasten erfüllt und dass seine Transkription durch Myc reguliert wird. Daher wurde geschlussfolgert, dass Mbm die Proliferation von Neuroblasten durch eine Funktion in der Ribosomenbiogenese regulieren könnte. In der vorliegenden Studie wurde das Ziel verfolgt, weitere Hinweise auf diese möglichen Funktionen von Mbm zu finden und die Proteindomänen zu identifizieren, die dafür benötigt werden. Mbm beinhaltet einen Arginin/Glycin-reichen Abschnitt, der ein di-RG sowie ein di-RGG Motiv enthält. Diese beiden Motive wurden zusammen zu Mbms RGG-Box definiert. RGG-Boxen finden sich in vielen Proteinen verschiedener Familien und sie können sich sowohl verstärkend als auch inhibierend auf Protein-RNA- sowie Protein-Protein-Interaktionen auswirken. Somit stellt Mbms RGG-Box einen vielversprechenden Kandidaten dar für eine Proteindomäne, die in die rRNA-Bindung sowie die Translokation von RpS6 involviert ist. Es konnte gezeigt werden, dass Mbm mit deletierter RGG-Box (MbmdRGG) nicht in der Lage ist, die Überlebensfähigkeit und die Neuroblastengröße der Nullmutation mbmSH1819 vollständig zu retten. Des Weiteren benötigt Mbm die RGG-Box, um rRNA in vitro zu binden und in mbmdRGG sowie mbmSH1819 Mutanten konnte eine partielle Delokalisation von RpS6 beobachtet werden. Die korrekte Lokalisation von Mbm selbst scheint auch von der RGG-Box abzuhängen, da MbmdRGG teilweise in den Nukleus delokalisiert ist. Interessanterweise ist außerdem die Proteinsyntheserate in mbmdRGG Mutanten erhöht, was möglicherweise in einer Erhöhung der TOR-Expression begründet ist. Somit könnte Mbm unter bestimmten Bedingungen eine verstärkende Funktion im TOR-Signalweg erfüllen, die durch seine eigene RGG-Box reguliert wird. Des Weiteren sind RGG-Boxen hinsichtlich ihrer Funktion häufig von der Methylierung durch Protein-Arginin-Methyltransferasen (in Drosophila: Darts – Drosophila arginine methyltransferases) abhängig. Mbm könnte innerhalb seiner RGG-Box symmetrisch dimethyliert sein, allerdings sind die Ergebnisse in dieser Hinsicht sehr zweifelhaft. Jedenfalls scheinen Dart1 und Dart5 nicht imstande zu sein, Mbm zu methylieren. Außerdem beinhaltet Mbm zwei Zink-Finger-Motive des C2HC-Typs, die in die Bindung von rRNA involviert sein könnten. Eine vorhergehende Studie konnte zeigen, dass die Mutation der Zink-Finger, mbmZnF, zwar nicht zu einer Veränderung der Neuroblastengröße führt, allerdings, dass MbmZnF ins Zytoplasma delokalisiert vorliegt. In der vorliegenden Studie wurden die mbmZnF Mutanten in die meisten Experimente mit einbezogen. Allerdings sind die Ergebnisse rätselhaft, da mbmZnF-mutierte Larven sogar eine geringere Überlebensrate zeigen als die mbm Nullmutanten und da MbmZnF eine stärkere Bindungsaffinität zu rRNA zeigt als wildtypisches Mbm. Dies weist auf eine unspezifische Interaktion zwischen MbmZnF und einem anderen Protein, RNA oder DNA hin, was einen dominant-negativen Effekt auslösen könnte, indem andere Interaktionspartner gestört werden. Somit gestaltet es sich schwierig, Schlussfolgerungen zur Funktion der Zink-Finger zu ziehen. Zusammengefasst liefert die vorliegende Studie weitere Anhaltspunkte, dass Mbm in der Neuroblastenproliferation sowie der Regulation der Ribosomenbiogenese involviert ist und dass Mbm seine RGG-Box benötigt, um seine Funktionen zu erfüllen. KW - Taufliege KW - Neuroblast KW - Gehirn KW - Entwicklung KW - Drosophila melanogaster KW - brain development KW - neuroblast proliferation KW - mushroom body miniature KW - Gehirnentwicklung KW - Neuroblastenproliferation Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-199674 ER - TY - THES A1 - Herter, Eva Kristine T1 - Characterization of direct Myc target genes in Drosophila melanogaster and Investigating the interaction of Chinmo and Myc T1 - Charakterisierung direkter Myc Zielgene in Drosophila melanogaster und Interaktionsanalyse der Proteine Chinmo und Myc N2 - The correct regulation of cell growth and proliferation is essential during normal animal development. Myc proteins function as transcription factors, being involved in the con-trol of many growth- and proliferation-associated genes and deregulation of Myc is one of the main driving factors of human malignancies. The first part of this thesis focuses on the identification of directly regulated Myc target genes in Drosophila melanogaster, by combining ChIPseq and RNAseq approaches. The analysis results in a core set of Myc target genes of less than 300 genes which are mainly involved in ribosome biogenesis. Among these genes we identify a novel class of Myc targets, the non-coding small nucleolar RNAs (snoRNAs). In vivo studies show that loss of snoRNAs not only impairs growth during normal development, but that overexpression of several snoRNAs can also enhance tumor development in a neu-ronal tumor model. Together the data show that Myc acts as a master regulator of ribo-some biogenesis and that Myc’s transforming effects in tumor development are at least partially mediated by the snoRNAs. In the second part of the thesis, the interaction of Myc and the Zf-protein Chinmo is described. Co-immunoprecipitations of the two proteins performed under endogenous and exogenous conditions show that they interact physically and that neither the two Zf-domains nor the BTB/POZ-domain of Chinmo are important for this interaction. Fur-thermore ChIP experiments and Myc dependent luciferase assays show that Chinmo and Myc share common target genes, and that Chinmo is presumably also involved in their regulation. While the exact way of how Myc and Chinmo genetically interact with each other still has to be investigated, we show that their interaction is important in a tumor model. Overexpression of the tumor-suppressors Ras and Chinmo leads to tu-mor formation in Drosophila larvae, which is drastically impaired upon loss of Myc. N2 - Die korrekte Regulation von Zellwachstum und Proliferation ist von entscheidender Bedeutung für die Entwicklung von Tieren. Myc-Proteine fungieren als Transkriptions-faktoren, die in die Funktionskontrolle vieler Gene eingebunden sind die eine Rolle bei Zellwachstum und Proliferation spielen. Fehlregulierung von Myc ist ein Hauptfaktor menschlicher Tumorbildung. Der erste Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit der Identifizierung direkt regulierter Myc Zielgene in Drosophila melanogaster durch Kombination von ChIPseq und RNAseq Analysen. Insgesamt wurde eine Hauptgruppe von weniger als 300 Myc Ziel-genen identifiziert, von denen der Großteil eine Funktion in der Ribosomen Biogenese hat. Unter diesen Genen haben wir eine neue Klasse an Myc Zielgenen identifiziert, die nicht-codierenden „small nucleolar RNAs“ (snoRNAs). In vivo Experimente zeigen, dass der Verlust der snoRNAs nicht nur das Wachstum während der natürlichen Ent-wicklung beeinträchtigt, sondern auch, dass Überexpression verschiedener snoRNAs die Tumorbildung in einem neuronalen Tumormodel begünstigt. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass Myc maßgeblich Ribosomen Biogenese steuert und dass der transformierende Effekt, den Myc in der Tumorentwicklung inne hat, zumindest teilwei-se durch die snoRNAs gesteuert wird. Im zweiten Teil der Arbeit wird die Interaktion von Myc und dem Zink-Finger Protein Chinmo beschrieben. Co-Immunoprezipitationen der zwei Proteine die unter endogenen und exogenen Bedingungen durchgeführt wurden zeigen, dass sie physisch miteinander interagieren und dass weder Chinmos Zf-Domänen noch seine BTB/POZ-Domäne für diese Interaktion verantwortlich sind. ChIP-Versuche und Myc abhängige Luciferase-Assays zeigen weiterhin, dass Chinmo und Myc gemeinsame Zielgene besitzen und dass Chinmo darüber hinaus wahrscheinlich auch an ihrer Regulation beteiligt ist. Während der genaue Zusammenhang der genetischen Interaktionen von Myc und Chinmo noch ungewiss ist und weiterer Untersuchungen bedarf, kann gezeigt werden, dass die Interaktion der beiden Proteine in einem Tumormodel eine Rolle spielt. Die Tumorbildung die durch Überexpression des Tumorsuppressors Ras zusammen mit Chinmo hervorgerufen wird, wird durch den Verlust von Myc stark reduziert. KW - Myc KW - Drosophila melanogaster KW - Transcription KW - snoRNA KW - Ribosome KW - Growth KW - Taufliege KW - Transkription Y1 - 2015 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-122272 ER - TY - THES A1 - Hieke, Marie T1 - Synaptic arrangements and potential communication partners of \(Drosophila’s\) PDF-containing clock neurons within the accessory medulla T1 - Synaptische Konstellationen und potentielle Kommunikationspartner von \(Drosophila’s\) PDF-enthaltenden Uhrneuronen innerhalb der akzessorischen Medulla N2 - Endogenous clocks regulate physiological as well as behavioral rhythms within all organisms. They are well investigated in D. melanogaster on a molecular as well as anatomical level. The neuronal clock network within the brain represents the center for rhythmic activity control. One neuronal clock subgroup, the pigment dispersing factor (PDF) neurons, stands out for its importance in regulating rhythmic behavior. These neurons express the neuropeptide PDF (pigment dispersing factor). A small neuropil at the medulla’s edge, the accessory medulla (AME), is of special interest, as it has been determined as the main center for clock control. It is not only highly innervated by the PDF neurons but also by terminals of all other clock neuron subgroups. Furthermore, terminals of the photoreceptors provide light information to the AME. Many different types of neurons converge within the AME and afterward spread to their next target. Thereby the AME is supplied with information from a variety of brain regions. Among these neurons are the aminergic ones whose receptors’ are expressed in the PDF neurons. The present study sheds light onto putative synaptic partners and anatomical arrangements within the neuronal clock network, especially within the AME, as such knowledge is a prerequisite to understand circadian behavior. The aminergic neurons’ conspicuous vicinity to the PDF neurons suggests synaptic communication among them. Thus, based on former anatomical studies regarding this issue detailed light microscopic studies have been performed. Double immunolabellings, analyses of the spatial relation of pre- and postsynaptic sites of the individual neuron populations with respect to each other and the identification of putative synaptic partners using GRASP reenforce the hypothesis of synaptic interactions within the AME between dopaminergic/ serotonergic neurons and the PDF neurons. To shed light on the synaptic partners I performed first steps in array tomography, as it allows terrific informative analyses of fluorescent signals on an ultrastructural level. Therefore, I tested different ways of sample preparation in order to achieve and optimize fluorescent signals on 100 nm thin tissue sections and I made overlays with electron microscopic images. Furthermore, I made assumptions about synaptic modulations within the neuronal clock network via glial cells. I detected their cell bodies in close vicinity to the AME and PDFcontaining clock neurons. It has already been shown that glial cells modulate the release of PDF from s-LNvs’ terminals within the dorsal brain. On an anatomical level this modulation appears to exist also within the AME, as synaptic contacts that involve PDF-positive dendritic terminals are embedded into glial fibers. Intriguingly, these postsynaptic PDF fibers are often VIIAbstract part of dyadic or even multiple-contact sites in opposite to prolonged presynaptic active zonesimplicating complex neuronal interactions within the AME. To unravel possible mechanisms of such synaptic arrangements, I tried to localize the ABC transporter White. Its presence within glial cells would indicate a recycling mechanism of transmitted amines which allows their fast re-provision. Taken together, synapses accompanied by glial cells appear to be a common arrangement within the AME to regulate circadian behavior. The complexity of mechanisms that contribute in modulation of circadian information is reflected by the complex diversity of synaptic arrangements that involves obviously several types of neuron populations N2 - Endogene Uhren steuern sowohl physiologische als auch verhaltensbedingte Rhythmen bei allen Organismen. In D. melanogaster sind sie nicht nur auf molekularer sondern auch auf anatomischer Ebene bereits gut erforscht. Das neuronale Uhrnetzwerk im Gehirn stellt das Zentrum der Steuerung der rhythmischen Aktivität dar. Eine Uhrneuronengruppe sticht allein schon durch ihre besonderen anatomischen Eigenschaften hervor. Diese Neurone exprimieren das Neuropeptid PDF (pigment dispersing factor), welches zudem besonderen Einfluss auf die Lokomotionsaktivität der Fliege hat. Ein kleines Neuropil am Rande der Medulla, die akzessorische Medulla (AME) ist von besonderem Interesse, da neben seiner intensiven Innervation durch die PDF-Neurone auch Terminale aller anderen Uhrneuronengruppen zu finden sind. Zudem wird sie durch Terminale der Photorezeptoren mit Informatonen über die Lichtverhätnisse versorgt. Die AME erreichen des Weiteren Informationen aus vielen anderen Hirnregionen. Eine Vielzahl von Neuronentypen laufen in ihr zusammen, um sich anschließend wieder in verschiedenste Hirnareale zu verteilen. So wird die AME auch durchzogen von Fasern mit aminergem Inhalt, dessen Rezeptoren wiederum auf den PDF-Neuronen zu finden sind. Die vorliegende Arbeit gibt Aufschluss über vermutliche synaptische Partner und anatomische Anordnungen innerhalb des neuronalen Uhrnetzwerkes, insbesondere innerhalb der AME. Solch Wissen stellt eine Grundvoraussetzung dar, um zirkadianes Verhalten verstehen zu können. Die auffällige Nähe der aminergen Neurone zu den PDF Neuronen lässt eine synaptische Interaktion zwischen ihnen vermuten. Deshalb wurden basierend auf vorangegangen Studien detailiertere Untersuchungen dieser Thematik durchgeführt. So wird die Hypothese über synaptische Interaktionen innerhalb der AME zwischen dopaminergen/ serotonergen Neuronen und den PDF Neuronen bestärkt mittels Doppelimmunofärbungen, gegenüberstellende Analysen über die räumlichen Nähe von prä- und postsynaptischen Stellen der jeweiligen Neuronenpopulationen und durch die Identifikation vermutlicher synaptischer Partner unter Verwendung von GRASP. Zur möglichen Identifikation der synaptischen Partner unternahm ich erste Schritte in der Array Tomographie, welche hochinformative Analysen von fluoreszierenden Signalen auf einem ultrastrukturellen Level ermöglicht. Dazu testete ich verschieden Wege der Gewebepräparation, um Flureszenzsignale zu erhalten bzw. zu optimieren und bildete erste Überlagerungen der Fluoreszenz- und Elektronenmikrskopbilder. Die Auswertung der elektronenmikroskopischen Bilder erlaubten Mutmaßungen über mö- gliche synaptische Modulationen innerhalb des neuronalen Uhrnetzwerkes durch Gliazellen. Ihre Zellkörper fand ich in unmittelbarer Nähe zu den PDF Neuronen. Im dorsalen Hirn wurden neuronale Modulationen an den kleinen PDF Neuronen durch Gliazellen bereits festgestellt. Auf anatomischer Ebene scheint diese Modulation auch innerhalb der AME zu erfolgen, da synaptische Kontakte, welche PDF-positive Dendriten involvieren, von Gliafasern umgeben sind. Interessanterweise sind diese postsynaptischen PDF Fasern dabei oftmals Teil dyadischer oder sogar multipler Kontakte, die sich gegenüber einer ausgedehnten aktiven Zone befinden. Um mögliche Mechanismen solcher synaptischer Anordnungen zu erklären, versuchte ich den ABC Transporter White im Hirn von Drosophila zu lokalisieren. Seine Präsenz in Gliazellen würde auf einen Recyclingmechanismus hindeuten, welcher eine schnelle Wiederbereitstellung des Transmiters ermöglichen würde. Zusammengefasst scheinen Synapsen mit postsynaptischen PDF-Neuronen in Begleitung von Gliazellen, ein gebräuchliches synaptisches Arrangement innerhalb der AME dazustellen. Diese komplexe Diversität der synaptischen Anordnung reflektiert die komplexen Mechanismen, welche der Verarbeitung der zirkadianen Informationen zugrunde liegen KW - Taufliege KW - Chronobiologie KW - Endogene Rhythmik KW - PDF neurons KW - glia cells KW - circadian clock KW - accessory medulla KW - sleep KW - aminergic neurons KW - synapses KW - Gliazelle KW - Aminerge Nervenzelle KW - Pigmentdispergierender Faktor KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175988 ER - TY - THES A1 - Horn [née Bunz], Melanie T1 - The impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on fitness: Influence of day length, humidity and food composition T1 - Auswirkungen von Drosophila melanogaster`s Innerer Uhr auf die Fitness: Einfluss von Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Ernährung N2 - We are living in a system that underlies permanent environmental changes due to the rotation of our planet. These changes are rhythmic with the most prominent one having a period of about 24 hours, but also shorter and longer rhythms characterize our environment. To cope with the ever-changing environmental conditions, it is thought to be beneficial if an organism can track and anticipate these changes. The so called endogenous clocks enable this and might provide a fitness advantage. To investigate and unravel the mechanism of endogenous clocks Chronobiologists have used different model organisms. In this thesis Drosophila melanogaster was used as model organism with its about 150 clock neurons representing the main endogenous clock of the fly in the central brain. The molecular mechanisms and the interlocked feedback loops with the main circadian key players like period, timeless, clock or cycle are under investigation since the 1970s and are characterized quite well so far. But the impact of a functional endogenous clock in combination with diverse factors and the resulting fitness advantages were analysed in only a few studies and remains for the most part unknown. Therefore the aim of this thesis was to unravel the impact of Drosophila melanogaster`s endogenous clock on the fitness of the fly. To achieve this goal different factors – like day length, humidity and food composition – were analyzed in wild type CS and three different period mutants, namely perL, perS and per01, that carry a point mutation altering or abolishing the free-running period of the fruit fly as well as a second arrhythmic strain, clkAR. In competition assay experiments wild type and clock mutant flies competed for up to 63 generations under a normal 24 hour rhythm with 12 hours light/day and 12 hours darkness/night (LD12:12) or T-cycles with 19 or 29 hours, according to the mutants free-running period, or constant light (LL) in case of the arrhythmic mutant as well as under natural-like outdoor conditions in two consecutive years. Overall the wild type CS strain was outcompeting the clock mutant strains independent of the environmental conditions. As the perL fly strain elongated their free-running period, the competition experiments were repeated with naturally cantonized new fly strains. With these experiments it could be shown that the genetic background of the fly strains – which are kept for decades in the lab, with backcrosses every few years – is very important and influences the fitness of flies. But also the day length impacts the fitness of the flies, enabling them to persist in higher percentage in a population under competition. Further factors that might influence the survival in a competing population were investigated, like e.g. mating preferences and locomotor activity of homo- and heterozygous females or sperm number of males transferred per mating. But these factors can still not explain the results in total and play no or only minor roles and show the complexity of the whole system with still unknown characteristics. Furthermore populations of flies were recorded to see if the flies exhibit a common locomotor activity pattern or not and indeed a population activity pattern could be recorded for the first time and social contact as a Zeitgeber could be verified for Drosophila melanogaster. In addition humidity and its impact on the flies´ fitness as well as a potential Zeitgeber was examined in this thesis. The flies experienced different relative humidities for eclosion and wing expansion and humidity cycle phase shifting experiments were performed to address these two different questions of fitness impact and potential Zeitgeber. The fruit fly usually ecloses in the morning hours when the relative humidity is quite high and the general assumption was that they do so to prevent desiccation. The results of this thesis were quite clear and demonstrate that the relative humidity has no great effect on the fitness of the flies according to successful eclosion or wing expansion and that temperature might be the more important factor. In the humidity cycle phase shifting experiments it could be revealed that relative humidity cannot act as a Zeitgeber for Drosophila melanogaster, but it influences and therefore masks the activity of flies by allowing or surpressing activity at specific relative humidity values. As final experiments the lifespan of wild type and clock mutant flies was investigated under different day length and with different food qualities to unravel the impact of these factors on the fitness and therefore survival of the flies on the long run. As expected the flies with nutrient-poor minimum medium died earlier than on the nutrient-rich maximum medium, but a small effect of day length could also be seen with flies living slightly longer when they experience environmental day length conditions resembling their free-running period. The experiments also showed a fitness advantage of the wild type fly strain against the clock mutant strains for long term, but not short term (about the first 2-3 weeks). As a conclusion it can be said that genetic variation is important to be able to adapt to changing environmental conditions and to optimize fitness and therefore survival. Having a functional endogenous clock with a free-running period of about 24 hours provides fitness advantages for the fruit fly, at least under competition. The whole system is very complex and many factors – known and unknown ones – play a role in this system by interacting on different levels, e.g. physiology, metabolism and/or behavior. N2 - Wir leben in einem System, welches durch die Erdrotation permanenten Veränderungen der Umwelt unterliegt. Diese Veränderungen sind rhythmischer Natur, wobei die wichtigste Veränderung einen Rhythmus von circa 24 Stunden aufweist. Aber auch kürzere und längere Rhythmen charakterisieren unsere Umwelt. Um mit den permanenten Veränderungen klar zu kommen geht man davon aus, dass es von Vorteil ist wenn ein Organismus die Veränderungen wahrnehmen und vorausahnen kann. Die sogenannten Inneren Uhren ermöglichen dies und stellen möglicherweise einen Fitness Vorteil dar. Um den Mechanismus von Inneren Uhren zu untersuchen und aufzudecken benutzen Chronobiologen verschiedene Modellorganismen. In dieser Arbeit wurde Drosophila melanogaster, mit ihren etwa 150 Uhrneuronen welche die Innere Uhr im Zentralen Nervensystem darstellen, als Modellorganismus verwendet. Der molekulare Mechanismus und die ineinandergreifenden Rückkopplungsschleifen mit den Hauptakteuren period, timeless, clock und cycle werden seit den 1970ern erforscht und wurden bisher recht gut charakterisiert. Aber der Einfluss einer funktionellen Inneren Uhr in Kombination mit diversen Faktoren und die daraus resultierenden Fitness Vorteile wurden in nur wenigen Studien untersucht und bleiben zu großen Teilen unbekannt. Deshalb war es das Ziel dieser Arbeit den Einfluss von Drosophilas Innere Uhr auf die Fitness der Taufliege aufzudecken. Um dieses Ziel zu erreichen wurden verschiedene Faktoren – wie z.B. Tageslänge, Luftfeuchtigkeit und Futterqualität – in Wildtyp CS und drei verschiedenen period Mutanten – namentlich perL, perS und per01, welche alle eine Punktmutation tragen, welche die Freilauf-Periodenlänge verändert oder zu Arrhythmizität führt – sowie einem weiteren arrhythmischen Fliegenstamm, clkAR, untersucht. In Konkurrenzversuchen konkurrierten Wildtyp und Uhrmutanten über bis zu 63 Generationen unter normalen 24 Stunden Rhythmen mit jeweils 12 Stunden Licht/Tag und 12 Stunden Dunkelheit/Nacht oder unter T-Zyklen mit 19 oder 29 Stunden, entsprechend der Freilauf-Periodenlänge der Mutanten, oder Dauerlicht (LL) im Falle der arrhythmischen Mutante, sowie unter naturähnlichen Bedingungen im Feldversuch in zwei aufeinanderfolgenden Jahren. Im Gesamten war der Wildtyp den Uhrmutanten überlegen, unabhängig von den Umweltbedingungen. Da die perL Mutanten Ihre Freilauf-Periodenlänge deutlich verlängerten, wurden die Konkurrenzexperimente mit auf natürlicher Weise mit dem Wildtyp CS rückgekreuzten Fliegenstämmen wiederholt. Mit diesen Experimenten konnte gezeigt werden, dass der genetische Hintergrund der Fliegenstämme – welche teils für Jahrzehnte im Labor gehalten und nur wenige Male rückgekreuzt werden – sehr wichtig ist und die Fitness der Fliegen beeinflusst. Aber auch die Länge der Tage (19 h, 24 h oder 29 h) beeinflusst die Fitness der Fliegen und ermöglicht es Ihnen in höherem Anteil in einer Population unter Konkurrenz zu bestehen. Weitere Faktoren, welche das Überleben unter Konkurrenz möglicherweise beeinflussen können, wie z.B. eine Paarungspräferenz und Laufaktivität von homo- und heterozygoten Weibchen oder die Anzahl an Spermien, die pro Paarung übertragen werden, wurden untersucht. Diese Faktoren allein konnten jedoch die Ergebnisse der Konkurrenzversuche nicht erklären und spielen dabei keine oder nur geringfügige Rollen und stellen ein Beispiel für die Komplexität des ganzen Systems mit noch weiteren unbekannten Faktoren dar. Im Weiteren wurde das Laufverhalten von ganzen Fliegenpopulationen aufgezeichnet, um zu erforschen, ob eine Fliegenpopulation einen gemeinsamen Freilauf an Laufaktivität aufweist oder nicht. Und tatsächlich konnte zum ersten Mal das Laufverhalten von ganzen Populationen aufgezeichnet werden und Sozialer Kontakt als Zeitgeber für Drosophila melanogaster bestätigt werden. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit relative Luftfeuchtigkeit und deren Auswirkung auf die Fitness der Fliegen, als auch als potentieller Zeitgeber untersucht. Die Fliegen wurden zum Schlupf und zur Entfaltung der Flügel unterschiedlichen Luftfeuchtigkeiten ausgesetzt und es wurden Phasenverschiebungsversuche mit Luftfeuchtigkeitszyklen durchgeführt, um diese zwei verschiedenen Fragen nach Fitness und potentiellem Zeitgeber zu beantworten. Die Fruchtfliege schlüpft normalerweise in den Morgenstunden, wenn die Luftfeuchtigkeit relativ hoch ist, weshalb im Allgemeinen angenommen wird, dass dies zu diesem Zeitpunkt des Tages geschieht, um eine Austrocknung zu verhindern. Die Ergebnisse dieser Arbeit waren sehr eindeutig und demonstrierten, dass die relative Luftfeuchtigkeit keinen großen Einfluss auf die Fitness der Fliegen in Bezug auf den Schlupferfolg und korrektes Entfalten der Flügel hat und dass die Temperatur wohl eher der ausschlaggebende Faktor sein könnte. In den Phasenverschiebungsversuchen mit Luftfeuchtigkeitszyklen konnte aufgedeckt werden, dass relative Luftfeuchtigkeit keinen Zeitgeber für Drosophila melanogaster darstellt, aber die Laufaktivität der Fliegen beeinflusst und maskiert, indem das Laufverhalten bei bestimmten relativen Luftfeuchtigkeiten zugelassen oder unterdrückt wird. Außerdem wurde die Lebenserwartung der Wildtyp und Uhrmutanten Fliegenstämme unter verschiedenen Tageslängen und mit unterschiedlicher Futterqualität untersucht, um den Einfluss dieser Faktoren auf die Fitness und somit das Überleben der Fliegen auf Dauer zu charakterisieren. Wie erwartet starben die Fliegen auf dem nährstoffarmen Minimalmedium früher als auf dem nährstoffreichen Maximalmedium, aber es konnte auch ein kleiner Effekt der Tageslänge gezeigt werden. Hierbei lebten die Fliegen etwas länger, wenn die Tageslänge die Freilauf-Periodenlänge der Fliegen widerspiegelte. Diese Versuche zeigten auch einen Fitness Vorteil der Wildtyp Fliegen gegenüber der Uhrmutanten auf lange Sicht, jedoch nicht zu Beginn (in den ersten ca. 2-3 Wochen). Abschließend kann zusammengefasst werden, dass genetische Variation wichtig ist, um sich an Veränderungen in der Umwelt anzupassen und die eigene Fitness und somit Überleben zu steigern. Eine funktionelle Innere Uhr mit einer Periodenlänge von etwa 24 Stunden zu besitzen stellt einen Fitness Vorteil für die Fliegen dar, zumindest unter Konkurrenzbedingungen. Das ganze System ist sehr komplex und viele Faktoren – bekannte und noch unbekannte – spielen eine Rolle in diesem System, welches auf verschiedenen Ebenen interagiert, wie z.B. auf physiologischer, metabolistischer oder auf der Verhaltensebene. KW - Taufliege KW - Drosophila KW - Biologische Uhr KW - Tageslänge KW - Luftfeuchtigkeit KW - Drosophila melanogaster KW - Fitness Y1 - 2020 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-211415 ER - TY - THES A1 - Hovhanyan, Anna T1 - Functional analyses of Mushroom body miniature (Mbm) in growth and proliferation of neural progenitor cells in the central brain of Drosophila melanogaster T1 - Funktionelle Analyse des Mushroom body minature (Mbm) in das Wachstum und die Proliferation von neuronalen Vorläuferzellen im zentralen Gehirn von Drosophila melanogaster N2 - Zellwachstum und Zellteilung stellen zwei miteinander verknüpfte Prozesse dar, die dennoch grundsätzlich voneinander zu unterscheiden sind. Die Wiederaufnahme der Proliferation von neuralen Vorläuferzellen (Neuroblasten) im Zentralhirn von Drosophila nach der spät-embryonalen Ruhephase erfordert zunächst Zellwachstum. Der Erhalt der regulären Zellgröße ist eine wichtige Voraussetzung für die kontinuierliche Proliferation der Neuroblasten über die gesamte larvale Entwicklungsphase. Neben extrinsischen Ernährungssignalen ist für das Zellwachstum eine kontinuierliche Versorgung mit funktionellen Ribosomen notwendig, damit die Proteinsynthese aufrechterhalten werden kann. Mutationen im mushroom body miniature (mbm) Gen wurden über einen genetischen Screen nach strukturellen Gehirnmutanten identifiziert. Der Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der funktionellen Charakterisierung des Mbm Proteins als neues nukleoläres Protein und damit seiner möglichen Beteiligung in der Ribosomenbiogenese. Der Vergleich der relativen Expressionslevel von Mbm und anderen nuklearen Proteinen in verschiedenen Zelltypen zeigte eine verstärkte Expression von Mbm in der fibrillären Komponente des Nukleolus von Neuroblasten. Diese Beobachtung legte die Vermutung nahe, dass in Neuroblasten neben generell benötigten Faktoren der Ribosomenbiogenese auch Zelltyp-spezifische Faktoren existieren. Mutationen in mbm verursachen Proliferationsdefekte von Neuroblasten, wirken sich jedoch nicht auf deren Zellpolarität, die Orientierung der mitotischen Spindel oder die Asymmetrie der Zellteilung aus. Stattdessen wurde eine Reduktion der Zellgröße beobachtet, was im Einklang mit einer Beeinträchtigung der Ribosomenbiogenese steht. Insbesondere führt der Verlust der Mbm Funktion zu einer Retention der kleinen ribosomalen Untereinheit im Nukleolus, was eine verminderte Proteinsynthese zur Folge hat. Interessanterweise wurden Störungen der Ribosomenbiogenese nur in den Neuroblasten beobachtet. Zudem ist Mbm offensichtlich nicht erforderlich, um Wachstum oder die Proliferation von Zellen der Flügelimginalscheibe und S2-Zellen zu steuern, was wiederum dafür spricht, dass Mbm eine Neuroblasten-spezifische Funktion erfüllt. Darüber hinaus wurden die transkriptionelle Regulation des mbm-Gens und die funktionelle Bedeutung von posttranslationalen Modifikationen analysiert. Mbm Transkription wird von dMyc reguliert. Ein gemeinsames Merkmal von dMyc Zielgenen ist das Vorhandensein einer konservierten „E-Box“-Sequenz in deren Promotorregionen. In der Umgebung der mbm-Transkriptionsstartstelle befinden sich zwei „E-Box“-Motive. Mit Hilfe von Genreporteranalysen konnte nachgewiesen werden, dass nur eine von ihnen die dMyc-abhängige Transkription vermittelt. Die dMyc-abhängige Expression von Mbm konnte auch in Neuroblasten verifiziert werden. Auf posttranslationaler Ebene wird Mbm durch die Proteinkinase CK2 phosphoryliert. In der C-terminalen Hälfte des Mbm Proteins wurden in zwei Clustern mit einer Abfolge von sauren Aminosäuren sechs Serin- und Threoninreste als CK2- Phosphorylierungsstellen identifiziert. Eine Mutationsanalyse dieser Stellen bestätigte deren Bedeutung für die Mbm Funktion in vivo. Weiterhin ergaben sich Evidenzen, dass die Mbm-Lokalisierung durch die CK2-vermittelte Phosphorylierung gesteuert wird. Obwohl die genaue molekulare Funktion von Mbm in der Ribosomenbiogenese noch im Unklaren ist, unterstreichen die Ergebnisse dieser Studie die besondere Rolle von Mbm in der Ribosomenbiogenese von Neuroblasten um Zellwachstum und Proliferation zu regulieren. N2 - Cell growth and cell division are two interconnected yet distinct processes. Initiation of proliferation of central brain progenitor cells (neuroblasts) after the late embryonic quiescence stage requires cell growth, and maintenance of proper cell size is an important prerequisite for continuous larval neuroblast proliferation. Beside extrinsic nutrition signals, cell growth requires constant supply with functional ribosomes to maintain protein synthesis. Mutations in the mushroom body miniature (mbm) gene were previously identified in a screen for structural brain mutants. This study focused on the function of the Mbm protein as a new nucleolar protein, which is the site of ribosome biogenesis. The comparison of the relative expression levels of Mbm and other nucleolar proteins in different cell types showed a pronounced expression of Mbm in neuroblasts, particularly in the fibrillar component of the nucleolus, suggesting that in addition to nucleolar components generally required for ribosome biogenesis, more neuroblast specific nucleolar factors exist. Mutations in mbm cause neuroblast proliferation defects but do not interfere with cell polarity, spindle orientation or asymmetry of cell division of neuroblasts. Instead a reduction in cell size was observed, which correlates with an impairment of ribosome biogenesis. In particular, loss of Mbm leads to the retention of the small ribosomal subunit in the nucleolus resulting in decreased protein synthesis. Interestingly, the defect in ribosome biogenesis was only observed in neuroblasts. Moreover, Mbm is apparently not required for cell size and proliferation control in wing imaginal disc and S2 cells supporting the idea of a neuroblast-specific function of Mbm. Furthermore, the transcriptional regulation of the mbm gene and the functional relevance of posttranslational modifications were analyzed. Mbm is a transcriptional target of dMyc. A common feature of dMyc target genes is the presence of a conserved E-box sequence in their promoter regions. Two E-box motifs are found in the vicinity of the transcriptional start site of mbm. Gene reporter assays verified that only one of them mediates dMyc-dependent transcription. Complementary studies in flies showed that removal of dMyc function in neuroblasts resulted in reduced Mbm expression levels. At the posttranslational level, Mbm becomes phosphorylated by protein kinase CK2. Six serine and threonine residues located in two acidic amino acid rich clusters in the C-terminal half of the Mbm protein were identified as CK2 phosphorylation sites. Mutational analysis of these sites verified their importance for Mbm function in vivo and indicated that Mbm localization is controlled by CK2-mediated phosphorylation. Although the molecular function of Mbm in ribosome biogenesis remains to be determined, the results of this study emphasize the specific role of Mbm in neuroblast ribosome biogenesis to control cell growth and proliferation. KW - Taufliege KW - Mbm KW - Neuroblast KW - cell growth KW - proliferation KW - ribosome biogenesis KW - CK2 KW - Myc KW - Vorläuferzellen KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-91303 ER - TY - THES A1 - Huber, Saskia T1 - Charakterisierung von SAP47 in Drosophila melanogaster und der dazugehörigen Proteinfamilie T1 - Characterization of SAP47 in Drosophila melanogaster and its protein familiy N2 - In der Arbeit wird ein synapsenassoziiertes Protein, das SAP47 und seine zugehörige Proteinfamilie charakterisiert. N2 - A synapse associated protein, SAP47, and its protein family is characterized. KW - Taufliege KW - Synapse KW - Proteine KW - Molekularbiologie KW - Drosophila KW - Synapse KW - SAP47 KW - BSD KW - Drosophila KW - synapse KW - SAP47 KW - BSD Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7777 ER - TY - THES A1 - Jauch, Mandy T1 - Die Serin/Arginin Proteinkinase 79D (SRPK79D) von Drosophila melanogaster und ihre Rolle bei der Bildung Aktiver Zonen von Synapsen T1 - The serine/arginine protein kinase 79D (SRPK79D) of Drosophila melanogaster and its role in the formation of active zones of synapses N2 - Synapsen als Stellen der Kommunikation zwischen Neuronen besitzen spezialisierte Bereiche – Aktive Zonen (AZs) genannt –, die aus einem hoch komplexen Netzwerk von Proteinen aufgebaut sind und die Maschinerie für den Prozess der Neurotransmitter-Ausschüttung und das Vesikel-Recycling beinhalten. In Drosophila ist das Protein Bruchpilot (BRP) ein wichtiger Baustein für die T-förmigen Bänder („T-Bars“) der präsynaptischen Aktiven Zonen. BRP ist notwendig für eine intakte Struktur der Aktiven Zone und eine normale Exocytose von Neurotransmitter-Vesikeln. Auf der Suche nach Mutationen, welche die Verteilung von Bruchpilot im Gewebe beeinträchtigen, wurde eine P-Element-Insertion im Gen CG11489 an der Position 79D identifiziert, welches eine Kinase kodiert, die einen hohen Grad an Homologie zur Familie der SR Proteinkinasen (SRPKs) von Säugern aufweist. Die Mitglieder dieser Familie zeichnen sich durch eine evolutionär hoch konservierte zweigeteilte Kinasedomäne aus, die durch eine nicht konservierte Spacer-Sequenz unterbrochen ist. SRPKs phosphorylieren SR-Proteine, die zu einer evolutionär hoch konservierten Familie Serin/Arginin-reicher Spleißfaktoren gehören und konstitutive sowie alternative Spleißprozesse steuern und damit auf post-transkriptioneller Ebene die Genexpression regulieren. Mutation des Srpk79D-Gens durch die P-Element-Insertion (Srpk79DP1) oder eine Deletion im Gen (Srpk79DVN Nullmutante) führt zu auffälligen BRP-Akkumulationen in larvalen und adulten Nerven. In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass diese BRP-Akkumulationen auf Ultrastruktur-Ebene ausgedehnten axonalen Agglomeraten elektronendichter Bänder entsprechen und von klaren Vesikeln umgeben sind. Charakterisierung durch Immuno-Elektronenmikroskopie ergab, dass diese Strukturen BRP-immunoreaktiv sind. Um die Bildung BRP-enthaltender Agglomerate in Axonen zu verhindern und damit eine intakte Gehirnfunktion zu gewährleisten, scheint die SRPK79D nur auf niedrigem Niveau exprimiert zu werden, da die endogene Kinase mit verschiedenen Antikörpern nicht nachweisbar war. Wie in anderen Arbeiten gezeigt werden konnte, ist die Expression der PB-, PC- oder PF-Isoform der vier möglichen SRPK79D-Varianten, die durch alternativen Transkriptionsstart in Exon eins beziehungsweise drei und alternatives Spleißen von Exon sieben zustande kommen, zur Rettung des Phänotyps der BRP-Akkumulation im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund ausreichend. Zur Charakterisierung der Rescue-Eigenschaften der SRPK79D-PE-Isoform wurde mit der Klonierung der cDNA in einen UAS-Vektor begonnen. Offenbar beruht die Bildung der axonalen BRP-Agglomerate nicht auf einer Überexpression von BRP in den betroffenen Neuronen, denn auch bei reduzierter Expression des BRP-Proteins im Srpk79DVN Nullmutanten-Hintergrund entstehen die BRP-Agglomerate. In Köpfen der Srpk79DVN Nullmutante ist die Gesamtmenge an Bruchpilot-Protein im Vergleich zum Wildtyp nicht deutlich verändert. Auch die auf Protein-Ebene untersuchte Expression der verschiedenen Isoformen der präsynaptischen Proteine Synapsin, Sap47 und CSP weicht in der Srpk79DVN Nullmutante nicht wesentlich von der Wildtyp-Situation ab, sodass sich keine Hinweise auf verändertes Spleißen der entsprechenden prä-mRNAs ergeben. Jedes der sieben bekannten SR-Proteine von Drosophila ist ein potentielles Zielprotein der SRPK79D. Knock-down-Experimente für die drei hier untersuchten SR-Proteine SC35, X16/9G8 und B52/SRp55 im gesamten Nervensystem durch RNA-Interferenz zeigten allerdings keinen Effekt auf die Verteilung von BRP im Gewebe. Hinsichtlich der Flugfähigkeit der Tiere hat die Srpk79DVN Nullmutation keinen additiven Effekt zum Knock-down des BRP-Proteins, denn die Doppelmutanten zeigten bei der Bestimmung des Anteils an flugunfähigen Tieren vergleichbare Werte wie die Einzelmutanten, die entweder die Nullmutation im Srpk79D-Gen trugen, oder BRP reduziert exprimierten. Vermutlich sind Bruchpilot und die SR Proteinkinase 79D somit Teil desselben Signalwegs. Durch Doppelfärbungen mit Antikörpern gegen BRP und CAPA-Peptide wurde abschließend entdeckt, dass Bruchpilot auch im Median- und Transvers-Nervensystem (MeN/TVN) von Drosophila zu finden ist, welche die Neurohämal-Organe beherbergen. Aufgabe dieser Organe ist die Speicherung und Ausschüttung von Neuropeptid-Hormonen. Daher ist zu vermuten, dass das BRP-Protein neben Funktionen bei der Neurotransmitter-Exocytose möglicherweise eine Rolle bei der Ausschüttung von Neuropeptiden spielt. Anders als in den Axonen der larvalen Segmental- und Intersegmentalnerven der Srpk79DVN Nullmutante, die charakteristische BRP-Agglomerate aufweisen, hat die Mutation des Srpk79D-Gens in den Axonen der Va-Neurone, die das MeN/TVN-System bilden, keinen sichtbaren Effekt auf die Verteilung von Brp, denn das Muster bei Färbung gegen BRP weist keine deutlichen Veränderungen zum Wildtyp auf. N2 - Synapses as sites of communication between neurons contain specialized regions termed active zones (AZs) which are composed of a highly complex network of proteins comprising the exocytotic machinery for neurotransmitter release and vesicle recycling. In Drosophila the Bruchpilot (BRP) protein is an important building block of the T-shaped ribbons („T-bars“) at presynaptic active zones. By screening for mutations affecting the tissue distribution of Bruchpilot, a P-transposon insertion in the Srpk gene at the position 79D has been identified (Srpk79D, CG11489). This gene codes for a kinase which shows high homology to the mammalian family of serine/arginine protein kinases (SRPKs). Members of this family have an evolutionarily highly conserved bipartite kinase domain in common which is separated by a non-conserved spacer sequence. SRPKs phosphorylate SR proteins, an evolutionarily highly conserved family of serine/arginine-rich splicing factors that control the processes of constitutive and alternative splicing. Mutation of the Srpk79D gene caused by the P-element insertion (Srpk79DP1) or by a deletion in the gene (Srpk79DVN null mutant) leads to conspicuous accumulations of BRP in larval and adult axons. This thesis shows that these BRP accumulations at the ultrastructural level correspond to extensive axonal agglomerates of electron-dense ribbons surrounded by clear vesicles. Using immuno electron microscopy, these accumulation were characterized as BRP immuno-reactive structures. To prevent the assembly of BRP containing agglomerates in axons and to maintain intact brain function the SRPK79D seems to be expressed only at low levels because the endogenous kinase was not detectable using various antibodies. It was shown in other thesis that the expression of the PB, PC or PF isoform of the four possible SRPK79D variants resulting from two alternative transcription start sites in exon one and three, respectively, and alternative splicing of exon seven is sufficient to rescue the phenotype of BRP accumulation in the Srpk79DVN null-mutant background. Cloning of the cDNA for the SRPK79D-PE isoform into a UAS vector has been started in order to characterize the ability of this isoform to rescue the BRP-phenotype. It seems as if the formation of axonal BRP agglomerates is not due to BRP overexpression in the affected neurons as was shown by reduced expression of the BRP protein in the Srpk79DVN null-mutant background which still leads to BRP agglomerates. The overall amount of Bruchpilot protein in adult heads of the Srpk79DVN null mutant is not clearly altered compared to wild type. No clear alteration was observed between Srpk79DVN null-mutant and wild-type flies comparing the expression of different presynaptic proteins like Synapsin, Synapse-associated protein of 47 kDa (Sap47), and Cysteine string protein (CSP). The experiment does not point towards altered splicing of the corresponding pre-mRNAs. Each of the seven known SR proteins of Drosophila is a potential target protein of the SRPK79D. Pan-neuronal knock-down experiments for the three SR proteins SC35, X16/9G8, and B52/SRp55 investigated in this thesis by RNA interference did not show an effect on the tissue distribution of BRP. It was shown that the Srpk79DVN null mutation has no additive effect on the knock-down of the BRP protein regarding the flight ability of the respective animals because the double mutants showed similar values of non-flyers as each of the single mutants with either null mutation of the Srpk79D gene or knock-down of BRP. Presumably, Bruchpilot and the SR protein kinase 79D are part of the same signaling pathway. Performing double fluorescence stainings with antibodies against BRP and the CAPA peptides it was shown that Bruchpilot is also present in the median and transverse nerve system (MeN/TVN) of Drosophila containing the neurohaemal organs. These organs are responsible for storage and release of neuropeptide hormones. In contrast to the larval segmental and intersegmental nerves of the Srpk79DVN null mutant which show characteristic BRP agglomerates, mutation of the Srpk79D gene does not affect the distribution of BRP in the axons of the Va neurons which form the MeN/TVN system. The staining pattern of BRP in these nerves does not show clear alterations in the Srpk79DVN null mutant compared to wild type. The finding that BRP is present in the median and transverse nerve system opens the field for speculation of a role for the Bruchpilot protein not only in the neurotransmitter exocytosis but also in the release of neuropeptides. KW - Taufliege KW - Serin KW - Arginin KW - Proteinkinasen KW - Synapse KW - Genexpression KW - Aktive Zone KW - Serin/Arginin Proteinkinase KW - SRPK KW - Bruchpilot KW - Drosophila KW - Synapse KW - Motorische Endplatte KW - Nervenzelle KW - Neurotransmitter KW - active zone KW - serine/arginine protein kinase KW - SRPK KW - Bruchpilot Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-53974 ER - TY - THES A1 - Jenett, Arnim T1 - The Virtual Insect Brain Protocol : development and application of software for the standardization of neuroanatomy T1 - Das Virtual Insect Brain Protocol N2 - Since the fruit fly Drosophila melanogaster entered the laboratories as a model organism, new genetic, physiological, molecular and behavioral techniques for the functional analysis of the brain rapidly accumulated. Nowadays this concerted assault obtains its main thrust form Gal4 expression patterns that can be visualized and provide the means for manipulating -in unrestrained animals- groups of neurons of the brain. To take advantage of these patterns one needs to know their anatomy. This thesis describes the Virtual Insect Brain (VIB) protocol, a software package for the quantitative assessment, comparison, and presentation of neuroanatomical data. It is based on the 3D-reconstruction and visualization software Amira (Mercury Inc.). Its main part is a standardization procedure which aligns individual 3D images (series of virtual sections obtained by confocal microscopy) to a common coordinate system and computes average intensities for each voxel (volume pixel). The VIB protocol facilitates direct comparison of gene expression patterns and describes their interindividual variability. It provides volumetry of brain regions and helps to characterize the phenotypes of brain structure mutants. Using the VIB protocol does not require any programming skills since all operations are carried out at a (near to) self-explanatory graphical user interface. Although the VIB protocol has been developed for the standardization of Drosophila neuroanatomy, the program structure can be used for the standardization of other 3D structures as well. Standardizing brains and gene expression patterns is a new approach to biological shape and its variability. Using the VIB protocol consequently may help to integrate knowledge on the correlation of form and function of the insect brain. The VIB protocol provides a first set of tools supporting this endeavor in Drosophila. The software is freely available at http://www.neurofly.de. N2 - Seitdem die Taufliege Drosophila melanogaster als Modellorganismus Einzug in die Forschung erhalten hat, sammeln sich mehr und mehr genetische, physiologische und molekulare Techniken für die Funktionsanalyse des Gehirns an. Diese beruhen heutzutage meist auf Gal4 Expressionsmustern, die sichtbar gemacht werden können und eine gezielte Manipulierung von definierten Zellgruppen ermöglichen. Um Ergebnisse verschiedener Untersuchungen miteinander in Beziehung setzen zu können, muss man jedoch die typische Anatomie der zugrunde liegenden Expressionsmuster kennen. Diese Arbeit beschreibt das Virtual Insect Brain (VIB) Protokoll, eine Software für die Darstellung, die quantitative Einschätzung und den Vergleich von neuroanatomischen Daten, sowie einige exemplarische Anwendungen des VIB Protokolls. Die Software basiert auf der 3D-Rekonstruktions- und der Visualisierungs-Software Amira (Mercury Inc.). Sein Hauptbestandteil ist ein Normierungverfahren, das 3D-Bild-Stapel (Folgen virtueller Schnittbilder, erhalten durch konfokale Mikroskopie) auf ein gemeinsames Koordinatensystem abbildet und für jedes Voxel (dreidimensionaler Bildpunkt) die durchschnittliche Intensität berechnet. Das VIB Protokoll erleichtert dadurch den direkten Vergleich von Expressionsmustern und beschreibt ihre interindividuelle Variabilität. Es liefert volumetrische Messungen zu definierten Gehirnregionen und hilft, die durch Mutation entstehenden Veränderungen der Gehirnstruktur zu erkennen. Das Verwenden des VIB Protokolls erfordert keinerlei Programmierkenntnisse, da alle Vorgänge auf einer selbsterklärenden graphischen Benutzeroberfläche ausgeführt werden können. Obgleich das VIB Protokoll für die Normierung der Neuroanatomy von Taufliegen entwickelt worden ist, kann die Programmstruktur auch für die Normierung anderer 3D-Strukturen benutzt werden. Gehirne und Expressionsmuster zu standardisieren ist ein neuer Ansatz die Variabilität der Neuroanatomie zu hinterfragen. Bei konsequenter Verwendung kann das VIB Protokoll helfen Wissen über Form und Funktion des Insektengehirns zu miteinander zu vernetzen. Das VIB Protokoll liefert einen ersten Satz Werkzeuge, die diese Bemühung in der Taufliege ermöglichen. Die Software kann kostenfrei von http://www.neurofly.de herunter geladen werden. KW - Taufliege KW - Gehirn KW - Neuroanatomie KW - Software KW - Drosophila melanogaster KW - Standardgehirn KW - Neuroanatomie KW - VIB KW - standardization KW - software Y1 - 2007 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22297 ER - TY - THES A1 - Kapustjansky, Alexander T1 - In vivo imaging and optogenetic approach to study the formation of olfactory memory and locomotor behaviour in Drosophila melanogaster T1 - In vivo Imaging und der optogenetische Ansatz zu Untersuchung der Gedächtnissbildung und lokomotorischem Verhalten bei Drosophila melanogaster N2 - Understanding of complex interactions and events in a nervous system, leading from the molecular level up to certain behavioural patterns calls for interdisciplinary interactions of various research areas. The goal of the presented work is to achieve such an interdisciplinary approach to study and manipulate animal behaviour and its underlying mechanisms. Optical in vivo imaging is a new constantly evolving method, allowing one to study not only the local but also wide reaching activity in the nervous system. Due to ease of its genetic accessibility Drosophila melanogaster represents an extraordinary experimental organism to utilize not only imaging but also various optogenetic techniques to study the neuronal underpinnings of behaviour. In this study four genetically encoded sensors were used to investigate the temporal dynamics of cAMP concentration changes in the horizontal lobes of the mushroom body, a brain area important for learning and memory, in response to various physiological and pharmacological stimuli. Several transgenic lines with various genomic insertion sites for the sensor constructs Epac1, Epac2, Epac2K390E and HCN2 were screened for the best signal quality, one line was selected for further experiments. The in vivo functionality of the sensor was assessed via pharmacological application of 8-bromo-cAMP as well as Forskolin, a substance stimulating cAMP producing adenylyl cyclases. This was followed by recording of the cAMP dynamics in response to the application of dopamine and octopamine, as well as to the presentation of electric shock, odorants or a simulated olfactory signal, induced by acetylcholine application to the observed brain area. In addition the interaction between the shock and the simulated olfactory signal by simultaneous presentation of both stimuli was studied. Preliminary results are supporting a coincidence detection mechanism at the level of the adenylyl cyclase as postulated by the present model for classical olfactory conditioning. In a second series of experiments an effort was made to selecticvely activate a subset of neurons via the optogenetic tool Channelrhodopsin (ChR2). This was achieved by recording the behaviour of the fly in a walking ball paradigm. A new method was developed to analyse the walking behaviour of the animal whose brain was made optically accessible via a dissection technique, as used for imaging, thus allowing one to target selected brain areas. Using the Gal4-UAS system the protocerebral bridge, a substructure of the central complex, was highlighted by expressing the ChR2 tagged by fluorescent protein EYFP. First behavioural recordings of such specially prepared animals were made. Lastly a new experimental paradigm for single animal conditioning was developed (Shock Box). Its design is based on the established Heat Box paradigm, however in addition to spatial and operant conditioning available in the Heat Box, the design of the new paradigm allows one to set up experiments to study classical and semioperant olfactory conditioning, as well as semioperant place learning and operant no idleness experiments. First experiments involving place learning were successfully performed in the new apparatus. N2 - Das Verständniss für die komplexen Interaktionen und Zusammenhänge, die von der molekularen Ebene bis zum Auftreten von bestimmten Verhaltensmustern führen, erfordert die interdisziplinäre Zusammenarbeit unterschiedlicher Forschungsrichtungen. Das Ziel der vorgelegten Arbeit war es einen solchen interdisziplinären Ansatz für die Erforschung und die Manipulation von Verhalten und ihm zu Grunde liegenden Mechanismen zu verwirklichen. Optisches in vivo Imaging ist eine neue, sich ständig weiterentwickelnde Methode, welche es ermöglicht, nicht nur lokale sondern auch weitläufige Aktivitäten innerhalb des Nervensystem zu untersuchen. Drosophila melanogaster stellt aufgrund der leichten genetischen Zugänglichkeit einen herausragenden experimentellen Organismus dar, bei welchem neben optischem Imaging eine ganze Reihe optogenetischer Methoden angewandt werden kann, um die neuronalen Grundlagen des Verhaltens zu erforschen. Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Hilfe von vier genetisch kodierten Sensoren in vivo die Dynamik der cAMP Konzentration in den horizontalen Loben des Pilzkörpers, bei Applikation unterschiedlicher physiologischer und pharmazeutischer Stimuli untersucht. Dabei wurden mehrere transgene Fliegenlinien mit Sensorkonstrukten Epac1, Epac2, Epac2K390E und HCN2 an unterschiedlichen genomischen Insertionsorten, hinsichtlich ihrer Signalqualität untersucht, eine der Linien wurde für weitere Experimente ausgewählt. Zunächst wurde an dieser die in vivo Tauglichkeit des Sensors gezeigt, indem die Konzentration von cAMP durch pharmakologische Applikationen von 8-Bromo-cAMP und Forskolin, einer Substanz welche die Aktivität von cAMP produzierenden Adenylatcyclasen stimuliert, appliziert wurden. Anschließend wurde eine Untersuchung der cAMP Dynamik als Antwort auf einen elektrischen Schock, unterschiedliche Düfte, sowie einen durch Applikation von Acetylcholin simulierten Duftstimulus durchgeführt. Vorläufige Ergebnisse bestärken das aktuelle Modell der klassischen olfaktorischen Konditionierung durch die Koinzidenzdetektion auf der Ebene der Adenylatcyclase. In einem weiteren Experiment wurde der Versuch einer optogenetischen neuronalen Aktivierung unternommen, dabei wurde basierend auf einem Laufball Paradigma eine Methode entwickelt, das Laufverhalten der Fliegen zu analysieren während ihr Gehirn durch eine Imaging-Präparation freigelegt wurde, um gezielt bestimmte durch fluoreszierende Proteine markierte Gehirnbereiche anzuregen. Erste Aufzeichnungen des Laufverhaltens bei Aktivierung der protocerebrallen Brücke, einer Substruktur des Zentralkomplexes, wurden durchgeführt. Schließlich wurde eine neue Apparatur (Shock Box) für die Konditionierung von Einzeltieren entwickelt und gebaut, das Design beruht auf dem der sogenannten Heat Box, ermöglicht jedoch klassische und semioperante olfaktorische Konditionierung zusätzlich zu der in der Heat Box möglichen räumlichen und operanten Konditionierung. Die ersten Versuche für räumliches Lernen wurden in der Apparatur durchgeführt. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Cyclo-AMP KW - Gedächtnis KW - In vivo KW - Imaging KW - Drosophila KW - Memory KW - In vivo KW - Imaging KW - Drosophila KW - Memory Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69535 ER - TY - THES A1 - Keller, Andreas T1 - Genetic Intervention in Sensory Systems of a Fly T1 - Genetische Intervention in sensorischen Systemen einer Fliege N2 - Die vorliegende Arbeit vergleicht Transgene, die in Drosophila Neuronen exprimiert wurden, um diese abzutöten oder zu blockieren. Tetanus Neurotoxin erwies sich als sehr effizient, um chemische Synapsen zu blockieren. Synapsen, die aus einer chemischen und einer elektrischen Komponente bestehen, ließen sich dagegen mit einem ektopisch exprimierten humanen Kalium-Kanal zuverlässiger ausschalten. Es wurden drei Möglichkeiten verglichen, eine zeitliche Kontrolle über die Funktion von Neuronen zu erlangen. Keines der getesteten Systeme erwies sich als universell anwendbar, aber die durch Rekombination induzierte Tetanus Neurotoxin Expression ist ein vielversprechender Ansatz. Die aus dieser vergleichenden methodischen Studie gewonnenen Ergebnisse wurden angewendet, um die Rolle von Neuronen in sensorischen Systemen bei der Verarbeitung verschiedener sensorischer Informationen zu untersuchen. Chemische und mechanische Rezeptorneuronen konnten den olfaktorisch gesteuerten Verhaltensweisen beziehungsweise den lokomotorischen Leistungen, denen sie zu Grunde liegen, zugeordnet werden. Hauptthema der Arbeit ist die Suche nach Neuronen, die an der Bewegungsdetektion im visuellen System beteiligt sind. Dabei zeigte sich, daß weder L2 noch L4 Neuronen im ersten visuellen Neuropil essentiell für die Detektion von Bewegung sind. Vielmehr deuten die Ergebnisse darauf hin, daß die Bewegungsdetektion über das Netzwerk der amacrinen Zellen (a) erfolgt. Die für vertikale Bewegung sensitiven VS Zellen in der Lobula Platte erwiesen sich als nicht notwendig für die Verhaltensreaktionen auf vertikale Bewegungsreize. Daraus folgt auch, daß in der Strukturmutante optomotor blind das Fehlen der VS Zellen nicht ursächlich für die stark eingeschränkten Reaktionen auf vertikale Bewegung ist. Ein anderer Defekt in optomotor blind muß dafür verantwortlich sein. Die Arbeit zeigt das große Potential der beschriebenen Methoden zur Untersuchung der Informationsverarbeitung im Nervensystem von Drosophila. Einzelne Neuronengruppen konnten komplexen Verhaltensweisen zugeordnet werden und Theorien über die Informationsverarbeitung konnten in Verhaltensexperimenten mit transgenen Fliegen getestet werden. Eine weitere Verfeinerung der Methodik zur genetischen Intervention wird das Drosophila Gehirn zu einem noch besseren Modell für die Informationsverarbeitung in Nervensystemen machen. N2 - Different transgenes that can be expressed in neurons to kill or block them were compared. Tetanus neurotoxin blocked chemical synapses very efficiently. Synapses consisting of a chemical and an electrical component were blocked more reliably by expressing a human inwardly rectifying potassium channel. To gain temporal control over neuronal function, three genetic tools have been investigated. None of the systems is without drawbacks, however, the recombination induced tetanus neurotoxin expression is a promising approach. The knowledge gained from the comparative methodological study was used to investigate the role of neurons in sensory systems in processing different sensory informations. Receptor neurons sensitive for chemical or mechanical stimuli were correlated to specific olfactory behaviors or locomotor tasks. The main topic of this thesis is the much discussed question of which neurons are involved in motion processing in the visual system of flies. Neither L2 nor L4 neurons in the first visual neuropil are essential for motion-detection. The results indicate that maybe motion is detected by the network of amacrine cells (a). The vertical motion-sensitive VS cells in the lobula plate are not necessary for behavioral responses to vertical motion. This finding implies that the lack of VS cells in the structural mutant optomotor blind is not causally related to the altered responses to motion stimuli. Other abnormalities in optomotor blind are responsible for this behavioral phenotype. This work shows the potential of the described methods in studying information processing in the Drosophila brain. Groups of neurons were correlated to complex behavioral responses and theories about information processing were tested by behavioral experiments with transgenic flies. The refinement of the genetic tools to interfere with neuronal function will make the Drosophila brain an even better model to study information processing in nervous systems. KW - Taufliege KW - Bewegungssehen KW - Neurophysiologie KW - Nervengift KW - Drosophila KW - Tetanus Neurotoxin KW - Bewegungsdetektion KW - Visuelles System KW - Lamina KW - Lobula Platte KW - Drosophila KW - Tetanus Neurotoxin KW - Motion detection KW - visual system KW - lamina KW - lobula plate Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-680 ER - TY - THES A1 - Kibler, Eike Mathias U. T1 - Casein-Kinase-2-Beta und neuronale Entwicklungsprozesse T1 - Casein kinase 2ß and neural development - examinations employing the neurogenetic model organism Drosophila melanogaster N2 - Die Pilzkörper von Drosophila melanogaster stellen eine für die Lebensfähigkeit dieses Organismus entbehrliche Gehirnstruktur dar. Die Entwicklungsprozesse, die der Bildung dieser zentralnervösen Struktur zugrunde liegen, sind gut erforscht. Die neuronalen Stammzellen, die für die Bildung dieser Gehirnstruktur verantwortlich sind, sind identifiziert und experimentell gut zugänglich. Daher bietet sich die Drosophila-Pilzkörperentwicklung als neurogenetisches Modellsystem an, grundlegende Mechanismen der Gehirnentwicklung durch die Untersuchung von Pilzkörperstrukturmutanten zu erforschen. In dieser Arbeit wurde mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) als eine durch Transposon- Insertion in den Casein-Kinase-2ß-Genlokus verursachte, hypomorphe Mutation identifiziert, die zu einer starken Verringerung der Anzahl der die Pilzkörper bildenden intrinsischen Neurone führt. Eine Reversion des mbuP1-Pilzkörperphänotyps konnte unter anderem durch die Expression von Casein-Kinase-2ß-(CK2ß)-Transgenen im mbuP1-Hintergrund erzielt werden. Durch Rekombination wurde ein fertiler mbuP1-Stamm etabliert, der nun die Untersuchung der zellulären mbuP1-Defekte ermöglicht. Eine partielle, letale Deletion der CK2ß-Transkriptionseinheit wurde erzeugt. Die Letalität dieser Deletion konnte sowohl durch ein genomisches CK2ß-Transgen als auch durch die ubiquitäre Expression einer CK2ß-cDNA gerettet, und hierdurch die essentielle Funktion der CK2ß-Transkriptionseinheit in Drosophila belegt werden. Durch die ubiquitäre Expression von in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im CK2ß-Letalhintergrund wurde gezeigt, daß die Phosphorylierung der regulatorischen CK2ß-Untereinheit durch die katalytisch aktive CK2α-Untereinheit kein lebensnotwendiger Prozess ist. Gleichartige Experimente wurden zur Untersuchung der funktionellen Bedeutung eines CK2ß-Zinkfingermotivs und eines CK2ß-Destruction-Box-Motivs durchgeführt. Diese legen nahe, daß das Zinkfingermotiv im Gegensatz zum Destruction-Box-Motiv für die in vivo-Funktion der CK2ß-Untereinheit essentiell ist. Expression der in vitro-mutagenisierten CK2ß-cDNAs im mbuP1-Hintergrund werden die funktionelle Bedeutung der ausgetauschten Aminosäuren für die Pilzkörperentwicklung zeigen. Eine letale genetische Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-MAP-Kinase-Gens rolled (rlSem) und eine lebensfähige Interaktion von mbuP1 mit einer Mutation des Drosophila-S6-Kinase-p90rsk-Gens ignorant (ignP1), bei der Flügel- und Augenent-wicklungsdefekte zu beobachten sind, wurden gefunden. Es wurde zudem gezeigt, daß rlSem als Suppressor des Pilzkörperphänotyps eines schwächeren mbu-Allels wirkt. Hierdurch konnte eine Beteiligung der Casein-Kinase-2 an MAP-Kinase-Signalübertragungswegen wahrscheinlich gemacht werden. N2 - Mushroom bodies are dispensable for the developing and adult Drosophila fly. The developmental processes underlying mushroom body formation are well studied, the neural stem cells responsable for their development are identified and experimentally well accessable. Therefore Drosophila mushroom body development can be used as a powerful neurogenetic model system to find out about fundamental mechanisms underlying brain development by studying mutant flies showing aberrant mushroom body development. In the course of this work, mushroom bodies undersized P1 (mbuP1) was identified as a hypomorphic casein kinase 2ß-allele (CK2ß) caused by the insertion of transposable elements in the casein kinase 2ß gene locus. The mbuP1-mutation leads to a drastic reduction of the number of intrinsic neurons forming the adult mushroom body. Expression of transgenic CK2ß in a mbuP1-mutant background led to a reversion of the mbuP1-associated mushroom body phenotype. Fertility of mbuP1-flies could be partially restored by recombining the original mbuP1{P3843/2}-chromosome with a w1118-chromosome. This will allow future studies to identify the cellular defects caused by mbuP1. A partial deletion of the CK2ß gene causes lethality which could be rescued by either a genomic CK2ß-transgene or by ubiquitous expression of a CK2ß-cDNA. Therefore, CK2ß has been shown to be an essential gene in Drosophila. By ubiquitous expression of in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a CK2ß-lethal background, a non-essential role of phosphorylation of the regulatory CK2ß-subunit by the catalytically active CK2α-subunit could be shown. Similar experiments were performed to examine the role of a CK2ß-zincfinger motif and a CK2ß-destruction-box motif. The obtained results suggest a non-essential in vivo function for the destruction-box motif and an essential in vivo function for the zincfinger-motif. Expression of the in vitro mutagenized CK2ß-cDNAs in a mbuP1-background will reveal the functional significance of the substituted amino acids for mushroom body development. Performed genetic interaction studies showed a lethal interaction of mbuP1 with a mutation in the Drosophila-MAP-kinase gene rolled (rlSem) and a viable genetic interaction with a mutation in the Drosophila-S6-kinase-p90rsk gene ignorant (ignP1) which revealed defects in wing formation and eye development. It also could be shown that rlSem acts as a suppressor of the mushroom body phenotype associated with a weaker mbu-allele. These observations point towards a role of casein kinase 2 in MAP-kinase signalling. KW - Taufliege KW - Pilzkörper KW - Ontogenie KW - Embryonalentwicklung KW - Proteinkinase CK2 KW - Drosophila KW - CK2 KW - Pilzkörper KW - CK2ß KW - Entwicklung KW - Drosophila KW - CK2 KW - mushroom body KW - CK2ß KW - development Y1 - 2002 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-4202 ER - TY - THES A1 - Knapek, Stephan T1 - Synapsin and Bruchpilot, two synaptic proteins underlying specific phases of olfactory aversive memory in Drosophila melanogaster T1 - Synapsin und Bruchpilot, zwei synaptische Proteine für spezifische Komponenten von aversivem olfaktorischem Gedächtnis bei Drosophila melanogaster N2 - Memory is dynamic: shortly after acquisition it is susceptible to amnesic treatments, gets gradually consolidated, and becomes resistant to retrograde amnesia (McGaugh, 2000). Associative olfactory memory of the fruit fly Drosophila melanogaster also shows these features. After a single associative training where an odor is paired with electric shock (Quinn et al., 1974; Tully and Quinn, 1985), flies form an aversive odor memory that lasts for several hours, consisting of qualitatively different components. These components can be dissociated by mutations, their underlying neuronal circuitry and susceptibility to amnesic treatments (Dubnau and Tully, 1998; Isabel et al., 2004; Keene and Waddell, 2007; Masek and Heisenberg, 2008; Xia and Tully, 2007). A component that is susceptible to an amnesic treatment, i.e. anesthesia-sensitive memory (ASM), dominates early memory, but decays rapidly (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). A consolidated anesthesia-resistant memory component (ARM) is built gradually within the following hours and lasts significantly longer (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). I showed here that the establishment of ARM requires less intensity of shock reinforcement than ASM. ARM and ASM rely on different molecular and/or neuronal processes: ARM is selectively impaired in the radish mutant, whereas for example the amnesiac and rutabaga genes are specifically required for ASM (Dudai et al., 1988; Folkers et al., 1993; Isabel et al., 2004; Quinn and Dudai, 1976; Schwaerzel et al., 2007; Tully et al., 1994). The latter comprise the cAMP signaling pathway in the fly, with the PKA being its supposed major target (Levin et al., 1992). Here I showed that a synapsin null-mutant encoding the evolutionary conserved phosphoprotein Synapsin is selectively impaired in the labile ASM. Further experiments suggested Synapsin as a potential downstream effector of the cAMP/PKA cascade. Similar to my results, Synapsin plays a role for different learning tasks in vertebrates (Gitler et al., 2004; Silva et al., 1996). Also in Aplysia, PKA-dependent phosphorylation of Synapsin has been proposed to be involved in regulation of neurotransmitter release and short-term plasticity (Angers et al., 2002; Fiumara et al., 2004). Synapsin is associated with a reserve pool of vesicles at the presynapse and is required to maintain vesicle release specifically under sustained high frequency nerve stimulation (Akbergenova and Bykhovskaia, 2007; Li et al., 1995; Pieribone et al., 1995; Sun et al., 2006). In contrast, the requirement of Bruchpilot, which is homologous to the mammalian active zone proteins ELKS/CAST (Wagh et al., 2006), is most pronounced in immediate vesicle release (Kittel et al., 2006). Under repeated stimulation of a bruchpilot mutant motor neuron, immediate vesicle release is severely impaired whereas the following steady-state release is still possible (Kittel et al., 2006). In line with that, knockdown of the Bruchpilot protein causes impairment in clustering of Ca2+ channels to the active zones and a lack of electron-dense projections at presynaptic terminals (T-bars). Thus, less synaptic vesicles of the readily-releasable pool are accumulated to the release sites and their release probability is severely impaired (Kittel et al., 2006; Wagh et al., 2006). First, I showed that Bruchpilot is required for aversive olfactory memory and localized the requirement of Bruchpilot to the Kenyon cells of the mushroom body, the second-order olfactory interneurons in Drosophila. Furthermore, I demonstrated that Bruchpilot selectively functions for the consolidated anesthesia-resistant memory. Since Synapsin is specifically required for the labile anesthesia sensitive memory, different synaptic proteins can dissociate consolidated and labile components of olfactory memory and two different modes of neurotransmission (high- vs. low frequency dependent) might differentiate ASM and ARM. N2 - Gedächtnis ist ein dynamischer Prozess. In der Zeit kurz nach seiner Bildung ist es instabil und anfällig gegen amnestische Störungen, dann wird es schrittweise konsolidiert und schließlich resistent gegenüber retrogradem Gedächtnisverlust (McGaugh, 2000). Auch das assoziative olfaktorische Gedächtnis der Fruchtfliege Drosophila melanogaster zeigt diese Merkmale. Nach einem einzelnen assoziativen Training, in welchem ein Duft mit elektrischen Stromstößen gepaart wird, bilden die Fliegen ein aversives Duftgedächtnis, welches über mehrere Stunden anhält und aus qualitativ unterschiedlichen Komponenten besteht (Quinn et al., 1974; Tully and Quinn, 1985). Diese Komponenten können zum Beispiel durch Mutationen, die zugrunde liegenden neuronalen Verknüpfungen oder durch ihre Anfälligkeit für amnestische Behandlungen unterschieden werden (Dubnau and Tully, 1998; Isabel et al., 2004; Keene and Waddell, 2007; Masek and Heisenberg, 2008; Xia and Tully, 2007). Eine gegen amnestische Behandlungen, wie beispielsweise Kälte-induzierte Betäubung, anfällige Komponente beherrscht das frühe Gedächtnis, zerfällt jedoch schnell (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). Diese wird deshalb Anästhesie-sensitives Gedächtnis genannt (anesthesia-sensitive memory [ASM]). Im Gegensatz dazu baut sich eine konsolidierte Komponente erst langsam in den folgenden Stunden nach dem Training auf, hält stattdessen jedoch länger an (Margulies et al., 2005; Quinn and Dudai, 1976). Diese Komponente ist resistent gegenüber Kälte-induzierter Anästhesie und wird deshalb als ARM (anesthesia-resistant memory) bezeichnet. In der vorliegenden Arbeit konnte ich zeigen, dass das konsolidierte ARM bereits mit deutlich weniger starken Elektroschocks im Training gebildet wird als das instabile ASM. ARM und ASM unterliegen unterschiedliche molekulare und/oder neuronale Prozesse. Während in einer Mutante für das radish Gen selektiv ARM beeinträchtigt ist, werden andere Gene wie zum Beispiel amnesiac oder rutabaga ausschließlich für ASM benötigt (Dudai et al., 1988; Folkers et al., 1993; Isabel et al., 2004; Quinn and Dudai, 1976; Schwaerzel et al., 2007; Tully et al., 1994). Die beiden letzteren sind Teil des cAMP Signalweges, welcher vermutlich hauptsächlich die cAMP abhängige Protein-Kinase A (PKA) aktiviert (Levin et al., 1992). Hier zeige ich, dass eine Null-Mutante für das evolutionär konservierte Phosphoprotein Synapsin einen selektiven Defekt in ASM hat. Weitere Experimente lassen vermuten, dass Synapsin als Effektor stromabwärts der cAMP/PKA Kaskade wirkt. Ähnlich wie bei Drosophila spielt Synaspin auch in Vertebraten eine Rolle in unterschiedlichen Lernparadigmen (Gitler et al., 2004; Silva et al., 1996). Auch in der Meeresschnecke Aplysia wurde eine PKA abhängige Phosphorylierung von Synapsin als Mechanismus für die Regulierung von Neurotransmitterausschüttung und Kurzzeitplastizität vorgeschlagen (Angers et al., 2002; Fiumara et al., 2004). Synapsin wird für die Bildung eines Reserve-Pools von Vesikeln an der Präsynapse und für die Aufrechterhaltung der Vesikelausschüttung speziell bei anhaltender, hochfrequenter Stimulation von Nervenzellen benötigt (Akbergenova and Bykhovskaia, 2007; Li et al., 1995; Pieribone et al., 1995; Sun et al., 2006). Im Gegensatz dazu wird Bruchpilot, ein Protein der aktiven Zone und homolog zu den ELKS/CAST Proteinen bei Säugern (Wagh et al., 2006), haupsächlich für sofortige Vesikelausschüttung gebraucht (Kittel et al., 2006). Bei wiederholter Stimulation an Motorneuronen einer bruchpilot Mutante ist die akute Vesikelausschüttung stark vermindert, während die darauf folgende andauernde Ausschüttung noch immer möglich ist (Kittel et al., 2006). Dazu passend beeinträchtigt eine künstliche Verminderung des Bruchpilot-Proteins die Ansammlung von Ca2+ Kanälen an den aktiven Zonen, sowie die Bildung von elektronendichten Strukturen (T-bars) an den präsynaptischen Endigungen. Deshalb akkumulieren weniger Vesikel des “readily-releasable” Pools an den Ausschüttungsstellen und die Ausschüttungswahrscheinlichkeit ist stark vermindert (Kittel et al., 2006; Wagh et al., 2006). In dieser Arbeit zeige ich zum ersten Mal, dass Bruchpilot für aversives olfaktorisches Gedächtnis benötigt wird. Der Ort an dem Bruchpilot hierfür gebraucht wird sind die Kenyon-Zellen des Pilzkörpers, die olfaktorischen Interneuronen zweiter Ordnung in Drosophila. Desweiteren zeige ich, dass die Funktion von Bruchpilot selektiv für das konsolidierte ARM ist. Da Synapsin spezifisch für das labile ASM benötigt wird, können diese beiden olfaktorischen Gedächtniskomponenten durch verschiedene synaptische Proteine getrennt werden, und zwei unterschiedliche Arten der Neurotransmitterausschüttung (abhängig von hoch- oder niedrig-frequenter Stimulation) könnten ASM und ARM auseinander halten. KW - Taufliege KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Geruchswahrnehmung KW - Molekularbiologie KW - Synapsin KW - Bruchpilot KW - Präsynapse KW - Drosophila melanogaster KW - olfaktorisches Gedächtnis KW - Synapsin KW - Bruchpilot KW - presynapse KW - Drosophila melanogaster KW - olfactory memory Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-49726 ER - TY - THES A1 - Kroiß, Matthias T1 - Reinigung und funktionelle Charakterisierung des SMN-Komplexes von Drosophila melanogaster T1 - Purification and functional characterization of the SMN-complex in Drosophila melanogaster N2 - Die Zusammenlageurng spleißosomaler UsnRNPs erfolgt beim Menschen und anderen Vertebraten durch den makromolekularen SMN-Komplex. Dieser besteht aus insgesamt neun Proteinen, genannt SMN und Gemin2-8. In dieser Arbeit wurde die Evolution dieser molekularen Maschine untersucht. Dazu wurden die Genome mehrerer Modellorganismen bioinformatisch nach Orthologen von SMN und seinen Komplexpartnern durchsucht. Es zeigte sich, dass SMN und Gemin2 die Kernkomponenten des Komplexes darstellen. Von diesen ausgehend kamen weitere Komponenten im Laufe der Evolution hinzu und zwar blockweise, wie es ihrer physischen Assoziation im humanen Komplex entspricht. Um diese Befunde einer biochemischen Überprüfung zu unterziehen, wurde ein neues Affinitätsepitop, das TagIt-Epitop, entwickelt. Nach stabiler Transfektion von Drosophila Schneider2-Zellen konnte das Fusionsprotein effizient exprimiert und der Drosophila-SMN-Komplex nativ aufgereinigt werden. Die massenspektrometrische Untersuchung des Komplexes zeigte, dass SMN und Gemin2 seine einzigen stöchiometrischen Komponenten sind. Dies ist in eindrucksvoller Übereinstimmung mit den bioinformatischen Daten. Der aufgereinigte Komplex lagert in vitro Sm-Proteine mit der entsprechenden UsnRNA zum UsnRNP-core-Komplex zusammen. Diese Ergebnisse ließen sich nach rekombinanter Rekonstitution des SMN/Gemin2-Dimers rekapitulieren. Dabei zeigte sich, dass der SMN-Komplex die unkoordinierte Bindung der Sm-Proteine an „falsche“ RNAs verhindert. Folglich genügen SMN und Gemin2 zur Zusammenlagerung des Sm-core-Komplexes, während die übrigen Gemine weitere Funktionen im Kontext der UsnRNP-Biogenese spielen könnten. Aus evolutionsbiologischer Sichtweise ist der SMN-Komplex aus Drosophila ein eindrückliches Beispiel, wie die Vereinfachung eines biochemischen Prozesses zur Kompaktierung des Genoms beitragen kann. N2 - In vertebrates, assembly of spliceosomal UsnRNPs is mediated by the SMN-complex, a macromolecular entity composed of the proteins SMN and Gemins 2-8. In this study, the evolution of this machinery has been investigated using complete genome assemblies of multiple model organisms. The SMN-complex has gained complexity in evolution by a block-wise addition of Gemins onto an ancestral core complex composed of SMN and Gemin2. In contrast to this overall evolutionary trend to higher complexity in metazoans, orthologs of most Gemins are missing in dipterans. In order to challenge these findings by biochemical means, I have developed a novel affinity epitope suitable for use in transfected Drosophila Schneider2-cells. Using protein mass spectrometry, the composition of the Drosophila SMN-complex has been determined. In accordance with the bioinformatic data, it consists of the core components SMN and Gemin2 only. Purified complex mediates assembly of UsnRNP core complexes in a manner very similar to its vertebrate counterpart. These results were recapitulated after recombinant reconstitution of the dSMN/dGemin2-dimer, demonstrating that the Drosophila complex also prevents mis-assembly of Smproteins onto non-target RNAs. Hence, only a minority of Gemins is required for the assembly reaction per se, whereas others may serve additional functions in the context of UsnRNP biogenesis. From a more general point of view, the evolution of the SMN-complex is an interesting example of how the simplification of a biochemical process contributes to genome compaction. KW - Taufliege KW - Epitop KW - Antikörper KW - Biochemische Evolution KW - SMN-Komplex KW - Spinale Muskelatrophie KW - Affinitätsreinigung KW - Epitop-Tag KW - SMN-complex KW - spinal muscular atrophy KW - affinity purification KW - epitope tagging Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-28840 ER - TY - THES A1 - König, Sebastian T1 - Spatially selective visual attention in Drosophila melanogaster T1 - Räumlich selektive visuelle Aufmerksamkeit in Drosophila melanogaster N2 - Finding the right behavior at the right time is one of the major tasks of brains. In a natural scenery there is often an abundance of stimuli present and the brain has to separate the relevant from the irrelevant ones. Selective visual attention (SVA) is a property of higher visual systems that achieves this separation, as it allows to ‘[…] focus on one source of sensory input to the exclusion of others’ (Luck and Mangun, 1996). There are probably several forms of SVA depending upon the criteria used for the separation, such as salience, color, location in space, novelty, or motion. Many studies have investigated SVA in humans and non-human primates. However, complex functions like attention were initially not expected to be already implemented in the brains of simple organisms like Drosophila. After a first demonstration of selective attention in the fly (Wolf and Heisenberg, 1980), it took some time until other studies included attentional mechanisms in their argumentation to explain certain behaviors of Drosophila. However, their definition and characterization of attention differed and often was ambiguous. Here, one particular form, spatially selective visual attention in the fly Drosophila is investigated. It has been shown earlier that the fly spontaneously may restrict its behavioral responses in stationary flight to the visual stimuli on one side of the visual field. On the basis of experiments of Sareen et al., (2011) it has been conjectured that the fly has a focus of attention (FoA) and that the fly responds to the visual stimuli within this area of the visual field. Whether the FoA is the adequate concept for this spatial property of SVA in the fly needs to be further discussed and is a subject also of the present study. At this stage, the concept will be used in the description of the new results expanding the characterization of SVA. This study continued the investigation of SVA during tethered flight with variable but controlled visual input and an automated primary data evaluation. This standardized paradigm allowed for analysis of wild-type behavior as well as for a comparison of several mutant and pharmacologically manipulated strains to the wild-type. Some properties of human SVA like the occurrence of externally as well as internally caused shifts of attention were found in Drosophila and it could be shown, that SVA in the fly can be externally guided and has an attention span. Additionally, a neurotransmitter and proteins, which play a significant role in SVA were discovered. Based on this, the genetic tools available for Drosophila provided the means to a first examination of cells and circuits involved in SVA. Finally, the free walk behavior of flies that had been shown to have compromised SVA was characterized. The results suggested that the observed phenotypes of SVA were not behavior specific. Covert shifts of the FoA were investigated. The FoA can be externally guided by visual cues to one or the other side of the visual field and even after the cue has disappeared it remains there for <4s. An intriguing finding of this study is the fact, that the quality of the cue determines whether it is attractive or repellent. For example a cue can be changed from being repellent (negative) to being attractive (positive) by changing its oscillation amplitude from 4° to 2°. Testing the effectiveness of cues in the upper and lower visual field separately, revealed that the perception of a cue by the fly is not exclusively based on a sum of its specifications. Because positive cueing did not have an after-effect in each of the two half-fields alone, but did so if the cue was shown in both, the fly seems to evaluate the cue for each combination of parameters specifically. Whether this evaluation of the cue changed on a trial-to-trial basis or if the cue in some cases failed to shift the FoA can at this point not be determined. Looking at the responses of the fly to the displacement of a black vertical stripe showed that they can be categorized as no responses, syn-directional responses (following the direction of motion of the stripe) and anti-directional responses (in the opposite direction of the motion of the stripe). The yaw-torque patterns of the latter bared similarities with spontaneous body saccades and they most likely represented escape attempts of the fly. Syn-directional responses, however, were genuine object responses, distinguishable by a longer latency until they were elicited and a larger amplitude. These properties as well as the distribution of response polarities were not influenced by the presence or absence of a cue. When two stripes were displaced simultaneously in opposite directions the rate of no responses increased in comparison to the displacement of a single stripe. If one of the stripes was cued, both, the responses towards and away from the side of cue resembled the syn-directional responses. Significant progress was made with the elucidation of the neuronal underpinnings of SVA. Ablation of the mushroom bodies (MB) demonstrated their requirement for SVA. Furthermore, it was shown that dopamine signaling has to be balanced between too much and too little. Either inhibiting the synthesis of dopamine or its re-uptake at the synapse via the dDAT impaired the flies’ susceptibility to cueing. Using the Gal4/UAS system, cell specific expression or knockdown of the dDAT was used to scrutinize the role of MB sub-compartments in SVA. The αβ-lobes turned out to be necessary and sufficient to maintain SVA. The Gal4-line c708a labels only a subset of Kenyon cells (KC) within the αβ-lobes, αβposterior. These cells stand out, because of (A) the mesh-like arrangement of their fibers within the lobes and (B) the fact that unlike the other KCs they bypass the calyx and thereby the main source of olfactory input to the MBs, forming connections only in the posterior accessory calyx (Tanaka et al., 2008). This structure receives no or only marginal olfactory input, suggesting for it a role in tasks other than olfaction. This study shows their requirement in a visual task by demonstrating that they are necessary to uphold SVA. Restoring dDAT function in these approximately only 90 cells was probably insufficient to lower the dopamine concentration at the relevant synapses and hence a rescue failed. Alternatively, the processes mediating SVA at the αβ-lobes might require an interplay between all of their KCs. In conclusion, the results provide an initial point for future research to fully understand the localization of and circuitry required for SVA in the brain. In the experiments described so far, attention has been externally guided. However, flies are also able to internally shift their FoA without any cues from the outside world. In a set of 60 consecutive simultaneous displacements of two stripes, they were more likely to produce a response with the same polarity as the preceding one than a random polarity selection predicted. This suggested a dwelling of the FoA on one side of the visual field. Assuming that each response was influenced by the previous one in a way that the probability to repeat the response polarity was increased by a certain factor (dwelling factor, df), a random selection of response type including a df was computed. Implementation of the df removed the difference between observed probability of polarity repetition and the one suggested by random selection. When the interval between displacements was iteratively increased to 5s, no significant df could be detected anymore for pauses longer than 4s. In conclusion, Drosophila has an attention span of approximately 4s. Flies with a mutation in the radish gene expressed no after-effect of cueing and had a shortened attention span of about 1s. The dDAT inhibitor methylphenidate is able to rescue the first, but does not affect the latter phenotype. Probably, radish is differently involved in the two mechanisms. This study showed, that endogenous (covert) shifts of spatially selective visual attention in the fly Drosophila can be internally and externally guided. The variables determining the quality of a cue turned out to be multifaceted and a more systematic approach is needed for a better understanding of what property or feature of the cue changes the way it is evaluated by the fly. A first step has been made to demonstrate that SVA is a fundamental process and compromising it can influence the characteristics of other behaviors like walking. The existence of an attention span, the dependence of SVA on dopamine as well as the susceptibility to pharmacological manipulations, which in humans are used to treat respective diseases, point towards striking similarities between SVA in humans and Drosophila. N2 - Eine der Hauptaufgaben eines Gehirns ist es, das richtige Verhalten zur richtigen Zeit zu finden. In einer natürlichen Umgebung gibt es eine Vielzahl visueller Reize, die das Gehirn unterteilen muss in solche, die irrelevant und solche, die bedeutsam sind. Selektive visuelle Aufmerksamkeit (SVA) ist eine Eigenschaft hoch entwickelter visueller Systeme, die diese Unterteilung erzielt, indem sie es erlaubt „[…] eine Quelle sensorischen Inputs zu fokussieren und dabei andere auszuschließen“ (Luck and Mangun, 1996). In Abhängigkeit der Kriterien (z.B. Salienz, Farbe, Lage im Raum, Neuartigkeit oder Bewegung), die für die Aufteilung herangezogen werden, existieren wahrscheinlich mehrere Formen von SVA. Viele Studien haben sich mit SVA in Menschen und in Primaten beschäftigt, ohne jedoch zu erwarten, dass eine komplexe Funktion wie Aufmerksamkeit bereits in den Gehirnen von einfachen Organismen wie Drosophila implementiert zu finden. Erst einige Zeit nachdem selektive Aufmerksamkeit ein erstes Mal in der Fliege gezeigt worden war (Wolf, Heisenberg, 1980) begannen auch andere Studien Aufmerksamkeit in ihrer Argumentation als Erklärung für bestimmte Verhaltensweisen von Drosophila heranzuziehen. Definition und Charakterisierung des Begriffes Aufmerksamkeit waren jedoch oft mehrdeutig und unterschieden sich von Studie zu Studie. In dieser Arbeit wird eine ganz bestimmte Form von Aufmerksamkeit – räumlich selektive visuelle Aufmerksamkeit - anhand der Fliege Drosophila untersucht. Es wurde bereits gezeigt, dass die Fliege im stationären Flug ihre Verhaltensantworten spontan auf visuelle Reize einer Seite des visuellen Feldes beschränken kann. Basierend auf Experimenten von Sareen et al. (2011) wurde vermutet, dass die Fliege einen Aufmerksamkeitsfokus (FoA) besitzt und auf Reize, die innerhalb dieses Teils des visuellen Feldes liegen antwortet. Ob der FoA ein angemessenes Konzept für diese räumliche Eigenschaft von SVA in der Fliege ist, steht zur Debatte und ist auch ein Thema dieser Studie. Vorerst soll dieses Konzept jedoch für die Beschreibung der Ergebnisse, die die Charakterisierung von SVA vorantreiben, genutzt werden. Die vorliegende Arbeit führt die Untersuchung von SVA mit variablem aber kontrolliertem visuellem Input im stationären Flug fort und nutzt dazu eine automatisierte Datenerfassung. Dieses standardisierte Paradigma ermöglicht eine Analyse von Verhalten im Wildtyp aber auch einen Vergleich mit verschiedenen mutanten und pharmakologisch manipulierten Fliegenstämmen. Einige im Menschen auftretende Eigenschaften von SVA wurden auch in Drosophila gefunden. Dazu zählt das Auftreten von extern und intern verursachten Aufmerksamkeitsverlagerungen. Es konnte gezeigt werden, dass SVA in der Fliege extern gelenkt werden kann und eine Aufmerksamkeitsspanne aufweist. Zusätzlich wurden ein Neurotransmitter und einige Proteine entdeckt, die eine wichtige Rolle in SVA einnehmen. Darauf basierend ermöglichten es die verfügbaren genetischen Werkzeuge mit einer ersten Untersuchung der an SVA beteiligten Zellen und Netzwerke zu beginnen. Des Weiteren wurde das Laufverhalten von Fliegen, die Einschränkungen in SVA aufwiesen charakterisiert. Die Ergebnisse lassen vermuten, dass die beobachteten Phänotypen von SVA nicht verhaltensspezifisch sind. Als nächstes wurden interne Bewegungen des Aufmerksamkeitskegels (FoA) betrachtet. Der FoA kann durch visuelle Reize von außerhalb zu der einen oder der anderen Seite des visuellen Feldes gelenkt werden. Er verweilt dort für >4s nachdem der lenkende Reiz verschwunden ist. Es ist ein spannender Befund dieser Arbeit, dass dieser Reiz in Abhängigkeit seiner Beschaffenheit abstoßend oder anziehend sein kann. So kann ein abstoßender (negativer) Reiz auf einmal anziehend (positiv) werden, wenn seine Oszillationsamplitude von 4° auf 2° reduziert wird. Eine Überprüfung der Wirksamkeit von Aufmerksamkeitslenkung durch Reize im oberen und unteren Teil des visuellen Feldes ergab, dass die Wahrnehmung eines Reizes durch die Fliege sich nicht ausschließlich aus der Summe seiner Spezifikationen ergibt. Da positive Aufmerksamkeitslenkung in keinem der beiden Halbfelder einen Nacheffekt hatte, ein solcher aber bei der Präsentation von Reizen in beiden Felder gleichzeitig auftrat, kann vermutet werden, dass die Fliege den Reiz für jede Kombination von Parametern spezifisch bewertet. Ob sich diese Bewertung in jedem einzelnen Durchgang änderte oder ob der Reiz in manchen Fällen den FoA nicht auf eine Seite lenkte kann mit dem jetzigen Kenntnisstand nicht bestimmt werden. Betrachtet man die Antworten der Fliege auf eine Versetzung eines schwarzen vertikalen Streifens, so zeigt sich eine mögliche Unterteilung in die Kategorien „keine Antwort“, „syn-direktionale Antwort“ (der Bewegungsrichtung des Streifens folgend) und „anti-direktionale Antwort“ (entgegengesetzt zur Bewegungsrichtung des Streifens). Die Drehmomentmuster der letzteren Kategorie wiesen starke Ähnlichkeit zu spontanen Körpersakkaden auf und es handelte sich bei ihnen sehr wahrscheinlich um Fluchtversuche der Fliege. Syn-direktionale Antworten waren hingegen reine Objekt-Bewegungsantworten, erkennbar an einer längeren Latenz bis zu ihrer Auslösung und einer größeren Amplitude. Diese Eigenschaften und auch die Verteilung der Antworten auf die beiden Kategorien wurden durch die An- oder Abwesenheit eines vorhergehenden Reizes nicht beeinflusst. Wurden zwei Streifen gleichzeitig gegenläufig versetzt, so blieben die Antworten im Vergleich zur Versetzung eines einzelnen Streifens häufiger aus. Wurde der FoA zuvor auf eine Seite gelenkt, so entsprachen die Drehmomentmuster der Antworten auf diese Seite und auch die der Antworten auf die andere Seite denen der syn-direktionalen Antworten. Die Aufklärung der SVA zu Grunde liegenden neuronalen Strukturen konnte bedeutend vorangetrieben werden. Eine Ablation der Pilzkörper (MB) zeigte, dass diese für SVA benötigt werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die von Dopamin übermittelte Signalstärke weder zu stark, noch zu schwach sein darf. Wurde die Synthese von Dopamin inhibiert oder seine Wiederaufnahme aus dem synaptischen Spalt mittels dDAT blockiert, führte dies dazu, dass die Aufmerksamkeit dieser Fliegen nicht mehr extern gelenkt werden konnte. Mithilfe des Gal4/UAS-Systems und zellspezifischer Expression oder Unterdrückung der Bildung von dDAT wurde die Rolle einzelner Strukturen der Pilzkörper in SVA genauer untersucht. Es zeigte sich, dass die αβ-Loben sowohl ausreichend als auch notwendig sind, um SVA nachhaltig zu lenken. Die Gal4-Linie c708a markiert einen Teil der Kenyonzellen (KC) innerhalb der αβ-Loben, αβposterior. Diese Zellen sind besonders, da (A) ihre Fasern innerhalb der Loben eine netzartige Anordnung aufweisen und (B) da sie anders als die anderen KCs nicht mit der Kalyx, der größten Quelle olfaktorischen Inputs in die MBs, verknüpft sind, sondern nur in der posterioren akzessorischen Kalyx Verbindungen ausbilden (Tanaka et al., 2008). Diese Struktur erhält keinen oder zumindest nur marginalen olfaktorischen Input und es ist anzunehmen, dass sie eher an Aufgaben aus anderen sensorischen Modalitäten beteiligt ist. In dieser Arbeit wird die Beteiligung dieser Zellen an einem visuellen Task gezeigt, genauer ihre Notwendigkeit für einen Nacheffekt der Lenkung von SVA. Eine Wiederherstellung der Funktion von dDAT in diesen ca. 90 Zellen war erfolglos, da die geringe Anzahl möglicherweise nicht ausreichte, um die Konzentration von Dopamin an den relevanten Synapsen zu senken. Es ist jedoch auch möglich, dass die Prozesse, die SVA über die αβ-Loben vermitteln ein Zusammenspiel aller dortigen KCs erfordern. Zusammen bilden die gesammelten Ergebnisse einen Ausgangspunkt für zukünftige Bestrebungen, die für SVA erforderlichen neuronalen Strukturen und deren Verortung komplett zu verstehen. In den bisher beschriebenen Experimenten wurde die Aufmerksamkeit extern gelenkt. Fliegen können ihren FoA aber auch ganz ohne äußerliche Reize intern verlagern. In einer Reihe von 60 aufeinanderfolgenden gleichzeitigen Versetzungen zweier Streifen zeigte sich, dass die Fliegen häufiger Antworten mit der gleichen Polarität wie die vorausgegangene produzierten, als dies eine zufällige Auswahl der Polarität vorhersagte. Dies ließ vermuten, dass der FoA auf einer Seite des visuellen Feldes verweilt. Es wurde angenommen, dass jede Antwort von der vorhergehenden beeinflusst wird, sodass die Wahrscheinlichkeit die Polarität dieser Antwort zu wiederholen um einen gewissen Faktor erhöht wird (dwelling factor, df). Deswegen wurde eine zufällige Verteilung der Antwortpolaritäten unter Berücksichtigung des df berechnet. Dadurch verschwand der Unterschied zwischen der beobachteten Wiederholungswahrscheinlichkeit einer Antwortpolarität und derer einer rein zufälligen Wahl der Antwort. Als das Intervall zwischen den einzelnen Versetzungen schrittweise auf 5s erhöht wurde, konnte bereits bei Pausen über 4s kein signifikanter df mehr festgestellt werden. Als Schlussfolgerung ergibt sich, dass Drosophila eine Aufmerksamkeitsspanne von etwa 4s besitzt. Fliegen mit einer Mutation im radish Gen zeigten keine anhaltende Lenkung von SVA und hatten zudem eine verkürzte Aufmerksamkeitsspanne von ungefähr 1s. Der dDAT-Inhibitor Methylphenidat beseitigte den zuerst erwähnten Phänotyp, verlängerte jedoch nicht die Aufmerksamkeitsspanne. Es ist anzunehmen, dass radish auf unterschiedliche Art und Weise an beiden Mechanismen beteiligt ist. Im Zuge dieser Arbeit wurde gezeigt, dass endogene (covert) Verlagerungen von räumlich selektiver visueller Aufmerksamkeit in der Fliege Drosophila intern und extern gelenkt werden können. Vielfältige Variablen bestimmen die Beschaffenheit eines Reizes. Es bedarf eines systematischeren Ansatzes, um die Eigenschaften eines Reizes genauer zu verstehen, die dessen Wahrnehmung durch die Fliege verändern. Es konnte bereits grundlegend gezeigt werden, dass SVA ein fundamentaler Prozess ist, dessen Fehlfunktion auch die Eigenschaften anderer Verhaltensweisen wie z.B. Laufen beeinflusst. Die Existenz einer Aufmerksamkeitsspanne, die Abhängigkeit von SVA von Dopamin sowie deren Zugänglichkeit für pharmakologische Manipulationen, deren Nutzen für den Menschen in der Behandlung aufmerksamkeitsbezogener Erkrankungen liegt, deuten auf starke Ähnlichkeiten zwischen SVA in Menschen und in Drosophila hin. KW - Taufliege KW - Visueller Reiz KW - visuell KW - Selektive Wahrnehmung KW - Aufmerksamkeit KW - Drosophila Y1 - 2016 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-134452 ER - TY - THES A1 - Leibold, Christian T1 - Das Cystein String Protein von Drosophila melanogaster - Invivo-Funktionsanalyse verschiedener Proteindomänen am Modellsystem der larvalen neuromuskulären Synapse T1 - The Cysteine string protein of Drosophila melanogaster - Invivo-functional analysis of different protein domains using the larval neuromuscular junction as a model system N2 - Cystein String Proteine (CSPs) wurden als synaptische Vesikelproteine entdeckt. In Drosophila werden sie in den funktionellen Synapsen und sekretorischen Organellen aller Entwicklungsstufen exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass CSPs an der regulierten Neurotransmitterausschüttung beteiligt sind und mehrere, von Insekten bis zum Menschen konservierte Domänen besitzen: eine N-terminale Phosphorylierungsstelle der Protein Kinase A (PKA), eine J-Domäne mit 50%iger Homologie zum bakteriellen Chaperone-Protein DnaJ, eine Linker-Domäne, einen Cystein String aus elf aufeinander folgenden Cysteinen, die durch zwei Cystein-Paare flankiert werden und einen variableren C-Terminus. Es wurden Interaktionen mit den Proteinen HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, verschiedenen Untereinheiten von G-Proteinen, Synaptotagmin, sowie spannungsabhängigen Ca2+-Kanälen beschrieben. csp-Nullmutanten CspU1 von Drosophila melanogaster zeigen einen temperatursensitiven Phänotyp, in dem adulte Fliegen von CspU1 reversibel bei 37°C innerhalb von drei Minuten paralysieren. An der neuromuskulären Synapse dritter Larven von CspU1 kann bei nicht-permissiver Temperatur von 32°C eine reversible Blockade der synaptischen Transmission beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit sollten mit Hilfe des larvalen Nerv-Muskel-Präparats dritter Larven elektrophysiologische Untersuchungen an verschiedenen csp-Mutanten durchgeführt werden. Hierdurch sollte die Bedeutung der einzelnen Domänen für die Funktion von csp weiter aufgeklärt werden. Am larvalen Nerv-Muskel-Präparat von Drosophila ist eine Arbeit auf Einzel-Zell-Niveau möglich. Die Segmentierung, die wiederkehrende Anordnung von Muskeln und innervierenden Motoneuronen, sowie das Vorkommen vieler auch im Gehirn von Drosophila lokalisierter synaptischer Proteine machen die larvale neuromuskuläre Synapse für die vorliegenden Fragestellungen. Wie in vielen anderen Arbeiten, wurden elektrophysiologische Messungen an dem Longitudinalmuskel 6 durchgeführt. Alle Messungen evozierter Muskelpotentiale (EJP) wurden, wenn nicht anders erwähnt, mit 0,2Hz Stimulusfrequenz durchgeführt. Die Reiz-Intensität wurde an jedes Präparat individuell angepasst und betrug das 2 ½ -fache des Initial-Schwellenwertes, bei dem ein vollständiges EJP ausgelöst wurde. Zunächst konnte der in der Literatur beschriebene larvale Block der synaptischen Transmitterausschüttung bei erhöhter Temperatur nicht reproduziert, jedoch durch Rückkreuzungen der Nullmutante CspU1 gegen den Wildtyp w1118 wiederhergestellt werden. Das „Rescue“-Konstrukt scDNA1, welches die Grundlage für alle weiteren mutierten Formen von csp darstellt, rettete den larvalen temperatursensitiven Phänotyp im csp-Nullmutantenhintergrund von CspU1 vollständig. Larvale Mutanten der Linie SSP, bei denen der Cystein String durch einen Serin String ausgetauscht worden war (Serine-string protein), zeigten in Übereinstimmung mit den adulten Fliegen den bekannten temperatursensitiven Phänotyp. Larvale Mutanten der Linie CLP (Cysteine-less protein) zeigten im Gegensatz zu adulten Tieren dieser Linie keinen temperatursensitiven Phänotyp, sondern ein wildtypisches Verhalten. Für die Mutante L∆8, die im Nullmutantenhintergrund von CspU1 roc ein in der Linker-Domäne um acht Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimiert, wurden verschiedene elektrophysiologische Phänotypen beobachtet: Larven der X-chromosomalen Linie zeigten den bekannten temperaturabhängigen Block der synaptischen Transmission. Larven der Insertionslinie für das 3. Chromosom zeigten keine Temperatursensitivität, sondern wildtypisches Verhalten. In immunhistochemischen Untersuchungen konnte für die X-chromosomale Linie eine deutlich schwächere Expression des L∆8-Proteins beobachtet werden. Larven der Linie C∆27, die ein im C-terminalen Bereich von CSP um 27 Aminosäuren verkürztes CSP-Protein exprimieren, im Nullmutantenhintergrund CspU1 roc konnten anhand des Phänotyps in zwei Gruppen unterteilt werden. Unabhängig vom Insertionsort zeigte eine Gruppe den bekannten larvalen temperatursensitiven Phänotyp. Die zweite Gruppe zeigte auch bei erhöhter Temperatur wildtypisches Verhalten. Im zweiten Teil der Arbeit wurde versucht, eine neue Deletionsmutante für csp durch Remobilisierung einer P-Insertion (P#1617, flybase, Bloomington) im ersten Exon zu erzeugen, da in der Nullmutante CspU1 möglicherweise auch benachbarte Gene betroffen sind. Nach Überprüfung der erzeugten Mutanten durch Western und Southern Blot, immunhistochemische Experimente und elektrophysiologische Untersuchungen am Nerv-Muskel-Präparat 3. Larven konnte keine Deletionsmutante mit temperaturabhängigem Phänotyp isoliert werden, die ausschließlich csp betraf. N2 - Cysteine string proteins (CSPs) were detected as synaptic vesicle proteins. In Drosophila they are expressed in functional synapses and secretory organelles of all developmental stages. CSPs were shown to be involved in regulated neurotransmitter release and contain several domains, which are conserved from insects to man: N-terminal phosphorylation site for protein kinase A (PKA), “J”-domain with 50% homology to a bacterial chaperone-protein DnaJ, “linker”-domain, cysteine string consisting of eleven following cysteines, flanked by two pairs of cysteines and the more variable C-terminus. Interactions with the following proteins have been described: HSC70, SGT, Syntaxin, Synaptobrevin/VAMP, several subunits of G-proteins, Synaptotagmin, and voltage-dependent Ca2+-channels. Csp-null mutants (CspU1) of Drosophila melanogaster exhibit a temperature sensitive phenotype. Adult flies of CspU1 paralyse reversibly at 37°C within three minutes. At the neuromuscular junction of 3rd instar larvae of CspU1 a reversible blockade of synaptic transmission can be observed at non-permissive temperature of 32°C. Electrophysiological studies at the larval nerve-muscle-preparation of 3rd instar larvae of different csp-mutants were performed in this Ph.D. thesis in order to investigate the relevance of the different CSP domains for the function of csp. Using the larval nerve-muscle-preparation of Drosophila studies at single-cell-levels are possible. The clear segmentation, iterated position of the body wall muscles and localization of many proteins, which are also present in the brain, account for the larval neuromuscular junction as an ideal model-system for the study of synaptic transmission. As described in previous work, electrophysiological studies have been performed at longitudinal muscle 6. All recordings of evoked junction potentials (EJP) were performed with 0.2Hz stimulus frequency (if not described in a different way). Stimulus intensity was adjusted 2 ½ times to initial threshold for a complete EJP, individually for each preparation. In the beginning larval blockade of synaptic transmitter release as described in literature could not be reproduced. Backcrossing for 12 generations of CspU1 with w1118 could restore the temperature-dependent blockade of synaptic transmission in 3rd instar larvae. “Rescue”-construct scDNA1, which was further used as template for all mutated forms of CSP used in this study, completely rescued the larval temperature-sensitive phenotype in csp-null mutant background. Larval mutants of SSP (serine-string protein, serine-string replaces cysteine-string) showed the temperature-sensitive phenotype, as known from their adult flies. In contrast to their adult flies larval mutants of CLP (cysteine-less protein) showed no temperature-sensitive phenotype, but wild type-like behaviour. For the mutant L∆8 (deletion of eight conserved amino acids of linker domain) in null mutant background of CspU1 roc two different phenotypes could be observed: The X-chromosomal strain showed the known temperature-dependent blockade of synaptic transmission. In contrast, 3rd instar larvae of the strain with insertion on the 3rd chromosome showed no temperature sensitivity, but wild type-like behaviour. In immunhistochemical staining a weaker L∆8-protein expression could be observed for the X-chromosomal line. Due to their different phenotype and independent of insertion locus, larval C∆27-mutants could be divided into two groups. One group revealed the known larval temperature-sensitive phenotype. The second group showed also at elevated temperature wild type-like behaviour. In the second part of the current work a new mutant for csp should be created because of the possibility that additional genes are influenced in the null-mutant CspU1. Therefore a deletion in the csp-Locus should be created in a jump-out mutagenesis. In the strain P1617 (flybaase, Bloomington) the PZ-element, which is located in the non-translated region of the 1st exon of csp, was remobilized. Characterization of the jump-out mutants by western and southern blot analysis, immunhistochemical experiments and electrophysiological studies at nerve-muscle-preparations of 3rd instar larvae failed to isolate a jump-out mutant with described temperature-dependent phenotype and affection only of csp. KW - Taufliege KW - Cysteinderivate KW - Temperaturabhängigkeit KW - Drosophila KW - CSP KW - Synapse KW - temperatursensitiv KW - Drosophila KW - CSP KW - Synapse KW - temperature sensitive Y1 - 2003 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-7481 ER - TY - THES A1 - Ljaschenko, Dmitrij T1 - Hebbian plasticity at neuromuscular synapses of Drosophila T1 - Hebbsche Plastizität an den neuromuskulären Synapsen in Drosophila melanogaster N2 - Synaptic plasticity determines the development of functional neural circuits. It is widely accepted as the mechanism behind learning and memory. Among different forms of synaptic plasticity, Hebbian plasticity describes an activity-induced change in synaptic strength, caused by correlated pre- and postsynaptic activity. Additionally, Hebbian plasticity is characterised by input specificity, which means it takes place only at synapses, which participate in activity. Because of its correlative nature, Hebbian plasticity suggests itself as a mechanism behind associative learning. Although it is commonly assumed that synaptic plasticity is closely linked to synaptic activity during development, the mechanistic understanding of this coupling is far from complete. In the present study channelrhodopsin-2 was used to evoke activity in vivo, at the glutamatergic Drosophila neuromuscular junction. Remarkably, correlated pre- and postsynaptic stimulation led to increased incorporation of GluR-IIA-type glutamate receptors into postsynaptic receptor fields, thus boosting postsynaptic sensitivity. This phenomenon is input-specific. Conversely, GluR-IIA was rapidly removed from synapses at which neurotransmitter release failed to evoke substantial postsynaptic depolarisation. This mechanism might be responsible to tame uncontrolled receptor field growth. Combining these results with developmental GluR-IIA dynamics leads to a comprehensive physiological concept, where Hebbian plasticity guides growth of postsynaptic receptor fields and sparse transmitter release stabilises receptor fields by preventing overgrowth. Additionally, a novel mechanism of retrograde signaling was discovered, where direct postsynaptic channelrhodopsin-2 based stimulation, without involvement of presynaptic neurotransmitter release, leads to presynaptic depression. This phenomenon is reminiscent of a known retrograde homeostatic mechanism, of inverted polarity, where neurotransmitter release is upregulated, upon reduction of postsynaptic sensitivity. N2 - Das Phänomen der synaptischen Plastizität bestimmt die Entwicklung funktionaler neuronaler Schaltkreise. Die meisten Neurowissenschaftler betrachten synaptische Plastizität als die neuronal Grundlage von Lernen und Gedächtnis. Es gibt viele Ausprägungsarten synaptischer Plastizität, eine davon ist die sogenannte Hebb’sche Plastizität. Diese ist definiert durch eine aktivitätsinduzierte, langanhaltende Veränderung der Stärke einer synaptischen Verbindung, verursacht durch korrelative Aktivierung der Prä- und der Postsynapse. Zusätzlich ist die Ausbreitung der Hebb’sche Plastizität synapsenspezifisch, d.h. nur die Synapsen, die an der korrelativen Aktivierung teilnehmen, erfahren auch die Veränderung. Das Wachstumssignal breitet sich also nicht auf benachbarte Synapsen aus. Der korrelative Wesenszug der Hebb’schen Plastizität macht sie zu einem naheliegenden zellulären Mechanismus assoziativen Lernens. Es wird angenommen, dass synaptische Aktivität und synaptische Plastizität während der Entwicklung neuronaler Schaltkreise eng gekoppelt sind. Das mechanistische Verständnis dieser Kopplung ist jedoch weitgehend unverstanden. In der vorliegenden Arbeit wurde das lichtaktivierbare Kanalrhodopsin-2 verwendet, um Aktivität an der glutamatergen neuromuskulären Synapse in der lebenden, sich frei bewegenden, Drosophila melanogaster Larve auszulösen. Wenn die Prä- und die Postsynapse korrelativ aktiviert wurden, führte dies zur verstärkten Integration von Glutamatrezeptoren des GluR-IIA Typs in die postsynaptischen Rezeptorfelder, was in einer Erhöhung der postsynaptischer Empfindlichkeit mündete. Dieses Platizitätsphänomen wurde als synapsenspezifisch identifiziert und damit als Hebb’sch. Im Gegenzug, wurde der gleiche Rezeptortyp entfernt, wenn Neurotransmitterfreisetzung nicht zu einer erheblichen Depolarisation der Postsynapse führte. Dieser Mechanismus könnte für die Kontrolle des Rezeptorfeldwachstums verantwortlich sein. Es wurde ein physiologisches Modell erarbeitet, bei dem Hebb’sche Plastizität das Wachstum postsynaptischer Rezeptorfelder während der Entwicklung leitet und sporadische, nicht synchronisierte Neurotransmitterfreisetzung die Rezeptorfeldgröße stabilisiert, indem sie das Wachstum Dieser begrenzt. Zusätzlich wurde eine neue Modalität der synaptischen Plastizität an der neuromuskulären Synapse entdeckt: Ein retrograder Signalweg wird aktiviert wenn die postsynaptische Seite, unter Umgehung der Präsynapse, direkt, lichtinduziert aktiviert wird. Dieser Signalweg führt zur präsynaptischen Depression. Das Phänomen erinnert stark an einen bereits bekannten retrograden homöostatischen Mechanismus, reziproker Polarität, bei dem Neurotransmitter Freisetzung hochreguliert wird, wenn die Empfindlichkeit der Postsynapse verringert wird. KW - Synapse KW - Hebbian plasticity KW - synapse KW - Drosophila KW - Plastizität KW - Hebbsche Lernregel KW - Taufliege Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90465 ER - TY - THES A1 - Luibl [née Hermann], Christiane T1 - The role of the neuropeptides NPF, sNPF, ITP and PDF in the circadian clock of Drosophila melanogaster T1 - Die Rolle der Neuropeptide NPF, sNPF, ITP und PDF in der circadianen Uhr von Drosophila melanogaster N2 - Organisms have evolved endogenous clocks which allow them to organize their behavior, metabolism and physiology according to the periodically changing environmental conditions on earth. Biological rhythms that are synchronized to daily changes in environment are governed by the so-called circadian clock. Since decades, chronobiologists have been investigating circadian clocks in various model organisms including the fruitfly Drosophila melanogaster, which was used in the present thesis. Anatomically, the circadian clock of the fruitfly consists of about 150 neurons in the lateral and dorsal protocerebrum, which are characterized by their position, morphology and neurochemistry. Some of these neurons had been previously shown to contain either one or several neuropeptides, which are thought to be the main signaling molecules used by the clock. The best investigated of these neuropeptides is the Pigment Dispersing Factor (PDF), which had been shown to constitute a synchronizing signal between clock neurons as well as an output factor of the clock. In collaboration with various coworkers, I investigated the roles of three other clock expressed neuropeptides for the generation of behavioral rhythms and the partly published, partly unpublished data are presented in this thesis. Thereby, I focused on the Neuropeptide F (NPF), short Neuropeptide F (sNPF) and the Ion Transport Peptide (ITP). We show that part of the neuropeptide composition within the clock network seems to be conserved among different Drosophila species. However, the PDF expression pattern in certain neurons varied in species deriving from lower latitudes compared to higher latitudes. Together with findings on the behavioral level provided by other people, these data suggest that different species may have altered certain properties of their clocks - like the neuropeptide expression in certain neurons - in order to adapt their behavior to different habitats. We then investigated locomotor rhythms in Drosophila melanogaster flies, in which neuropeptide circuits were genetically manipulated either by cell ablation or RNA interference (RNAi). We found that none of the investigated neuropeptides seems to be of equal importance for circadian locomotor rhythms as PDF. PDF had been previously shown to be necessary for rhythm maintenance in constant darkness (DD) as well as for the generation of morning (M) activity and for the right phasing of the evening (E) activity in entrained conditions. We now demonstrate that NPF and ITP seem to promote E activity in entrained conditions, but are clearly not the only factors doing so. In addition, ITP seems to reduce nighttime activity. Further, ITP and possibly also sNPF constitute weak period shortening components in DD, thereby opposing the effect of PDF. However, neither NPF or ITP, nor sNPF seem to be necessary in the clock neurons for maintaining rhythmicity in DD. It had been previously suggested that PDF is released rhythmically from the dorsal projection terminals. Now we discovered a rhythm in ITP immunostaining in the dorsal projection terminals of the ITP+ clock neurons in LD, suggesting a rhythm in peptide release also in the case of ITP. Rhythmic release of both ITP and PDF seems to be important to maintain rhythmic behavior in DD, since constantly high levels of PDF and ITP in the dorsal protocerebrum lead to behavioral arrhythmicity. Applying live-imaging techniques we further demonstrate that sNPF acts in an inhibitory way on few clock neurons, including some that are also activated by PDF, suggesting that it acts as signaling molecule within the clock network and has opposing effects to PDF. NPF did only evoke very little inhibitory responses in very few clock neurons, suggesting that it might rather be used as a clock output factor. We were not able to apply the same live-imaging approach for the investigation of the clock neuron responsiveness to ITP, but overexpression of ITP with various driver lines showed that the peptide most likely acts mainly in clock output pathways rather than inter-clock neuron communication. Taking together, I conclude that all investigated peptides contribute to the control of locomotor rhythms in the fruitfly Drosophila melanogaster. However, this control is in most aspects dominated by the actions of PDF and rather only fine-tuned or complemented by the other peptides. I assume that there is a high complexity in spatial and temporal action of the different neuropeptides in order to ensure correct signal processing within the clock network as well as clock output. N2 - Die meisten Organismen haben endogene Uhren entwickelt, mit deren Hilfe sie ihre Verhaltensweisen, ihren Metabolismus und auch ihre Physiologie an die periodisch wechselnden Umweltbedingungen auf unserer Erde anpassen können. Die sogenannten circadianen Uhren steuern dabei biologische Rhythmen, die an täglich wiederkehrende Umweltfaktoren angepasst sind. Schon seit Jahrzehnten wurden diese circadianen Uhren von Chronobiologen in verschiedensten Modellorganismen untersucht. Zu diesen gehört auch die Taufliege Drosophila melanogaster, welche im Rahmen dieser Doktorarbeit Verwendung fand. Anatomisch besteht die circadiane Uhr der Taufliege aus etwa 150 sogenannten Uhrneuronen, die sich im dorsalen und lateralen Protocerebrum der Fliege befinden. Diese können anhand ihrer Position im Gehirn, ihrer Morphologie als auch ihrer neurochemischen Eigenschaften charakterisiert werden. Es wurde bereits in früheren Arbeiten gezeigt, dass einige dieser Uhrneuronen jeweils ein oder mehrere Neuropeptide exprimieren, welche mit großer Wahrscheinlichkeit die wichtigsten Signalmoleküle der Uhr darstellen. Dabei ist der „Pigment Dispersing Factor“ (PDF) wohl das Neuropeptid, welches bisher in Bezug auf seine Funktion in der Uhr die größte Aufmerksamkeit fand. Es ist daher auch das Neuropeptid, das bei Weitem am besten untersucht ist. So wurde bereits gezeigt, dass PDF die Oszillationen der Uhrneuronen untereinander synchronisiert und auch in Ausgangssignalwegen der Uhr zu nachgeschalteten Gehirnregionen eine Rolle spielt. In Zusammenarbeit mit verschiedenen Kollegen, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit untersucht, welche Rolle drei andere Neuropeptide, welche in den Uhrneuronen exprimiert werden, in der Generierung von Verhaltensrhythmen spielen. Der Fokus lag dabei auf der Untersuchung des Neuropeptids F (NPF) des short Neuropeptids F (sNPF) und des Ion Transport Peptids (ITP). Wir konnten für manche dieser Peptide zeigen, dass ihre Verwendung im Uhrnetzwerk unterschiedlicher Drosophila-Arten konserviert zu sein scheint. Im Falle von PDF zeigten sich jedoch Unterschiede in der zellspezifischen Expression in Arten aus südlichen Breitengraden im Vergleich zu Arten aus nördlichen Breitengraden. Zusammen mit ergänzenden Verhaltensdaten anderer Arbeitsgruppen, gehen wir davon aus, dass unterschiedliche Arten bestimmte Eigenschaften ihrer Uhr – wie etwa die Neuropeptid-Expression in bestimmten Zellen – verändert haben, um ihr Verhalten bestmöglich an ihr jeweiliges Habitat anzupassen. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit die Aktivitätsrhythmik in Fliegen untersucht, in welchen gezielt bestimmte Neuropeptid-Systeme auf genetischem Wege - entweder durch Zellablation oder RNA-Interferenz (RNAi) - manipuliert wurden. Wir konnten zeigen, dass wohl keines der untersuchten Peptide eine ähnlich große Rolle für die Aktivitätsrhythmik spielt wie PDF. Aus früheren Arbeiten geht hervor, dass PDF sowohl für die Aufrechterhaltung eines Rhythmus in konstanter Dunkelheit (DD), als auch für die Generierung der Morgenaktivität und für die richtige Phasenlage der Abendaktivität in Licht-Dunkel Zyklen (LD) essentiell ist. Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen nun, dass NPF und ITP die Abendaktivität in LD fördern, dass sie jedoch nicht die einzigen Faktoren sind, die dies bewerkstelligen. ITP scheint außerdem Aktivität während der Nacht zu hemmen. Des Weiteren stellen ITP und möglicherweise auch sNPF eine schwache Perioden verkürzende Komponente in DD dar, ganz im Gegensatz zu PDF, welches eine Perioden verlängernde Wirkung besitzt. Jedoch scheinen weder ITP, NPF noch sNPF für die generelle Aufrechterhaltung eines Rhythmus in DD nötig zu sein. Vorhergehende Arbeiten wiesen bereits darauf hin, dass PDF wahrscheinlich rhythmisch an den dorsalen Nervenendigungen ausgeschüttet wird. Unsere jetzigen Ergebnisse zeigen desweiteren eine Oszillation in der ITP-Immunfärbung in den dorsalen Projektionen der ITP+ Uhrneuronen in LD, was auch auf eine rhythmische Ausschüttung dieses Peptids schließen lässt. Die rhythmische Freisetzung beider Peptide scheint für die Aufrechterhaltung eines Verhaltensrhythmus in DD wichtig zu sein, da eine konstant hohe Menge an ITP und PDF im dorsalen Gehirn den Freilauf-Rhythmus störten. Die live-Imaging Experimente dieser Arbeit zeigten, dass sNPF auf manche Uhrneuronen inhibitorisch wirkt – auch auf einige, die durch PDF aktiviert werden können. sNPF könnte also als Signalmolekül innerhalb des Uhrnetzwerkes fungieren. Auch NPF führte zu inhibitorischen Zellantworten, jedoch waren diese äußerst schwach und betrafen nur wenige Uhrneuronen, was darauf schließen lässt, dass dieses Peptid wahrscheinlich am Signalausgang der Uhr beteiligt ist. Es war uns bisher nicht möglich dieselben live-Imaging Untersuchungen auch für ITP durchzuführen, jedoch zeigten Überexpressionsstudien mit verschiedenen Treiberlinien, dass auch ITP mit großer Wahrscheinlichkeit im Signalausgang der Uhr fungiert. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle hier untersuchten Neuropeptide an der Kontrolle der rhythmischen Lokomotoraktivität von Drosophila melanogaster mitwirken. Dabei ist PDF eindeutig der dominierende Faktor, während die anderen Neuropeptide die Wirkung von PDF eher feinregulieren oder komplementieren. Aus den Daten kann geschlossen werden, dass die örtliche und zeitliche Funktionsweise dieser verschiedenen Peptide sehr komplex ist, um sowohl die Prozessierung von Signalen innerhalb des Uhrnetzwerkes als auch in den weitgehend noch unbekannten Ausgangswegen der Uhr zu gewährleisten. KW - Taufliege KW - Biologische Uhr KW - Neuropeptide KW - Innere Uhr KW - Drosophila KW - Circadian Rhythms Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-93796 ER - TY - THES A1 - Masek, Pavel T1 - Odor intensity learning in Drosophila T1 - Duftintensitätslernen bei Drosophila N2 - It has been known for a long time that Drosophila can learn to discriminate not only between different odorants but also between different concentrations of the same odor. Olfactory associative learning has been described as a pairing between odorant and electric shock and since then, most of the experiments conducted in this respect have largely neglected the dual properties of odors: quality and intensity. For odorant-coupled short-term memory, a biochemical model has been proposed that mainly relies on the known cAMP signaling pathway. Mushroom bodies (MB) have been shown to be necessary and sufficient for this type of memory, and the MB-model of odor learning and short-term memory was established. Yet, theoretically, based on the MB-model, flies should not be able to learn concentrations if trained to the lower of the two concentrations in the test. In this thesis, I investigate the role of concentration-dependent learning, establishment of a concentration-dependent memory and their correlation to the standard two-odor learning as described by the MB-model. In order to highlight the difference between learning of quality and learning of intensity of the same odor I have tried to characterize the nature of the stimulus that is actually learned by the flies, leading to the conclusion that during the training flies learn all possible cues that are presented at the time. The type of the following test seems to govern the usage of the information available. This revealed a distinction between what flies learned and what is actually measured. Furthermore, I have shown that learning of concentration is associative and that it is symmetrical between high and low concentrations. I have also shown how the subjective quality perception of an odor changes with changing intensity, suggesting that one odor can have more than one scent. There is no proof that flies perceive a range of concentrations of one odorant as one (odor) quality. Flies display a certain level of concentration invariance that is limited and related to the particular concentration. Learning of concentration is relevant only to a limited range of concentrations within the boundaries of concentration invariance. Moreover, under certain conditions, two chemically distinct odorants could smell sufficiently similarly such, that they can be generalized between each other like if they would be of the same quality. Therefore, the abilities of the fly to identify the difference in quality or in intensity of the stimuli need to be distinguished. The way how the stimulus is analyzed and processed speaks in favor of a concept postulating the existence of two separated memories. To follow this concept, I have proposed a new form of memory called odor intensity memory (OIM), characterized it and compared it to other olfactory memories. OIM is independent of some members of the known cAMP signaling pathway and very likely forms the rutabaga-independent component of the standard two-odor memory. The rutabaga-dependent odor memory requires qualitatively different olfactory stimuli. OIM is revealed within the limits of concentration invariance where the memory test gives only sub-optimal performance for the concentration differences but discrimination of odor quality is not possible at all. Based on the available experimental tools, OIM seems to require the mushroom bodies the same as odor-quality memory but its properties are different. Flies can memorize the quality of several odorants at a given time but a newly formed memory of one odor interferes with the OIM stored before. In addition, the OIM lasts only 1 to 3 hours - much shorter than the odor-quality memory. N2 - Assoziatives olfaktorisches Lernen bei Drosophila wurde ursprünglich als die Paarung eines Duftes mit einem elektrischen Bestrafungsreiz beschrieben. Seit langem ist dazu bekannt, daß Drosophila nicht nur lernen kann zwei Düfte zu unterscheiden, sondern auch verschiedene Konzentrationen desselben Dufts. Jedoch wird in den meisten auf diese Art durchgeführten Experimenten die Duftintensität weitestgehend ignoriert. - Für das olfaktorische Kurzzeitgedächtnis wurde ein biochemisches Modell vorgeschlagen, welches sich hauptsächlich auf die bekannte cAMP-Signalkaskade stützt. Es wurde gezeigt, dass die Pilzkörper (mushroom bodies, „MB“) notwendig und hinreichend für diese Art der Gedächtnisbildung sind und ein MB-Modell für Duftlernen und Kurzzeitgedächtnis konnte etabliert werden. Interessanterweise sollten Fliegen nach diesem Modell Konzentrationsunterschiede nur in einer Richtung lernen können. Sie würden den gelernten Duft nur gegenüber einer niedrigeren Konzentration wiedererkennen. In der vorliegenden Doktorarbeit habe ich das konzentrationsabhängige Duftlernen und seine Beziehung zum MB-Modell untersucht. Dabei hat sich gezeigt, dass die Fliege eine Gedächtnisspur für Geruchsintensität anlegt. Um den Unterschied zwischen dem Lernen einer Qualität und dem einer Intensität des gleichen Duftes hervorzuheben, habe ich versucht, den Reiz, der eigentlich von der Fliege gelernt wird, zu charakterisieren. Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass die Fliege während des Trainings alle in diesem Zeitabschnitt präsentierten Reize erlernt. Erst der dem Training folgende Test scheint den Gebrauch der verfügbaren Information festzulegen. Diese Erkenntnis ist eine wesentliche Grundlage um zwischen dem Testergebnis und dem, was die Fliege gelernt hat zu unterscheiden. Ich habe außerdem gezeigt, daß das Konzentrationslernen eine Form assoziativen Lernens ist und, dass entgegen der Erwartung nach dem MB-Modell eine Symmetrie zwischen den Lernwerten für die hohe und niedrige Konzentration besteht. Es gibt keinen Beweis dafür, dass Fliegen eine Vielfalt von Konzentrationen desselben Duftes als ein und dieselbe (Duft-)Qualität wahrnehmen. Die Ergebnisse legen vielmehr nahe, dass sich bei einer größeren Veränderung der Intensität eines Duftes für die Fliege (wie in vielen Fällen auch beim Menschen) seine Qualität verändert. Demzufolge ist mit jedem Geruchsstoff mehr als nur eine Fliegen-subjektive Geruchsqualität verbunden. Fliegen zeigen andererseits in engen Grenzen Konzentrationsinvarianz. Sie generalisieren zwischen Konzentrationen eines Duftes innerhalb einer Konzentrationsdekade. Deshalb ist das Konzept des Konzentrationslernens nur für ein begrenztes Konzentrationsspektrum innerhalb der Grenzen der Konzentrationsinvarianz relevant. Des weiteren habe ich gezeigt, dass unter besonderen Bedingungen zwei chemisch verschiedene Düfte generalisiert werden können. Möglicherweise haben die beiden Düfte hinreichend "ähnliche" oder gleiche Fliegen-subjektive Qualität und können nur nach der Intensität unterschieden werden. Die Fliege hat die Fähigkeit im Test Unterschiede einerseits in der Qualität und andererseits in der Intensität des Reizes zu ermitteln. Die Art und Weise, wie der Reiz analysiert und verarbeitet wird, erfordern ein Konzept zweier getrennter Gedächtnisse. Dementsprechend habe ich eine neue Gedächtnisart, ein sogenanntes Duftintensitätsgedächtnis (OIM) vorgeschlagent und versucht dieses neben anderen olfaktorischen Gedächtnissen einzuordnen. Das OIM ist unabhängig bezüglich einiger Bestandteile des bekannten cAMP-Signalwegs und stellt höchstwahrscheinlich den rutabaga-unabhängigen Teil des Zwei-Düfte-Lernens dar. Das rutabaga-abhängige Duftgedächtnis benötigt qualitativ verschiedene Duftreize. Das OIM reicht lediglich für eine suboptimale Leistung aus, funktioniert aber in den Grenzen der Konzentrationsinvarianz, innerhalb derer die Diskriminierung und damit auch das Lernen der Duftqualität nicht möglich sind. Das OIM scheint wie die Duftqualitätsgedächtnisse die Pilzkörper zu benötigen. Aber die Art der Speicherung ist von der der Duftqualitätsgedächtnisse verschieden. Fliegen können viele Duftqualitäten zu einem bestimmten Zeitpunkt aus dem Gedächtnis abrufen, jedoch interferiert ein neu gebildetes Gedächtnis eines bestimmten Duftes mit dem bereits gespeicherten OIM. Außerdem ist das OIM für nur 1-3 Stunden stabil, was erheblich kürzer als beim Duftgedächtnis ist. KW - Taufliege KW - Geruchswahrnehmung KW - Gedächtnis KW - Lernen KW - Intensität KW - Olfaktorik KW - Lernen KW - Gedächtnis KW - Drosophila KW - intensity KW - olfaction KW - memory KW - learning KW - Drosophila Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15546 ER - TY - THES A1 - Melzer, Juliane T1 - Die Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in Neuroblasten während der Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster T1 - The function of the p21-activated kinase Mbt in neuroblasts during the development of the central nervous system of Drosophila melanogaster N2 - p21-aktivierte Kinasen regulieren zahlreiche zelluläre Prozesse, die während der Entwicklung, aber auch beispielsweise bei der Krebsentstehung, von zentraler Bedeutung sind. Mbt, das einzige Typ II PAK-Protein von Drosophila melanogaster, spielt eine Rolle bei der Gehirnentwicklung. Eine Nullmutation von mbt, mbtP1, bildet kleinere Gehirne mit stark verkleinerten Pilzkörpern aus. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Mbt in Neuroblasten untersucht. Mbt wurde als Teil des apikalen Proteinkomplexes in Neuroblasten des Zentralhirns nachgewiesen. Die apikale Lokalisation von Mbt ist Zellzyklus-abhängig und wird über Bindung an Cdc42 reguliert. Sie ist essentiell für die Funktion von Mbt in Neuroblasten. Trotz apikaler Mbt-Lokalisation in Neuroblasten zeigte die mbt Nullmutante keine Defekte des basalen Mechanismus der asymmetrischen Zellteilung. Mud zeigte geringfügige Lokalisationsveränderungen, die auf einen möglichen Einfluss von Mbt hinweisen. Obwohl PAKs zentrale Regulatoren des Zytoskeletts sind, zeigte die mbtP1 Mutante keine offensichtlichen Veränderungen des Aktin- und Tubulin-Zytoskeletts. Armadillo, ein Aktin-assoziiertes Mbt-Substrat, zeigte ebenfalls keine Lokalisationsveränderung in Neuroblasten. Mbt steuert jedoch die apikale Anreicherung von Cno, einem weiteren Aktin-assoziierten Protein, in Neuroblasten. Darüber hinaus beeinflusst Mbt die Zellgröße von Neuroblasten, sowie deren Proliferationspotenzial und Überleben. mbtP1 Neuroblasten sind kleiner als wildtypische Neuroblasten, haben ein geringeres Proliferationsvermögen und eine geringere Überlebenswahrscheinlichkeit. Der Zelltod von Neuroblasten ist jedoch ein sekundärer Effekt. Daher kann eine Blockierung von Apoptose den adulten Pilzkörperphänotyp nicht retten. Signalwege, die Zellgröße und Proliferation regulieren, wurden auf eine Beteiligung von Mbt hin analysiert. mbtP1 induzierte leichte Effekte im Insulin-Signalweg und die Delokalisation eines nukleolären Proteins. Eine genetische Interaktion von mbtP1 mit Mutationen in Genen des klassischen MAPK-Signalweges identifzierte mbt als Positivregulator dieses Signalweges im Auge. Ein ähnlicher, schwächerer Effekt wurde auch bzgl. der Proliferation und Größe von Neuroblasten beobachtet. Eine 2D-Gelanalyse von Larvengehirnen identifizierte Bic und Hsp83 als mögliche von Mbt regulierte Proteine. Diese Arbeit charakterisiert eine bisher unbekannte Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in neuronalen Stammzellen und liefert damit Ansatzpunkte für eine detaillierte Aufklärung der Funktionsmechanismen von Typ II PAKs bei der Regulation von Zellproliferation und Überleben N2 - p21-activated kinases regulate numerous cellular processes central not only during development, but also for example for cancer pathogenesis. Mbt, the only type II PAK in Drosophila, regulates brain development. The mbt null mutant mbtP1 exhibits reduced brain size, with the mushroom bodies showing the most pronounced reduction. In this work, the function of Mbt in neuroblasts was investigated. Mbt was identified as a component of the apical protein complex in central brain neuroblasts. The apical localization of Mbt was cell cycle dependent and regulated by binding to Cdc42, which is essential for Mbt function in neuroblasts. Despite apical localization of Mbt, the mbtP1 null allel showed no defects in the basic mechanism of asymmetric cell division in larval neuroblasts. However, Mud showed minor localization changes indicating a possible influence of Mbt. Even though PAKs are well-known regulators of the cytoskeleton, no obvious changes in the actin and tubulin cytoskeleton were observed in mbtP1 neuroblasts. The localization of Armadillo, an actin-associated Mbt substrate, was also undisturbed throughout the cell cycle. Mbt controls the apical enrichment of Cno, another actin-associated protein. Moreover, Mbt influences neuroblast cell size, proliferation potential and survival. mbtP1 neuroblasts were smaller than wildtype neuroblasts and showed reduced proliferation activity and survival. However, the apoptotic loss of mbtP1 neuroblasts is a secondary effect. Thus, the adult mushroom body phenotype cannot be rescued by blocking apoptosis. Signalling pathways known to regulate growth and proliferation were analyzed with respect to a possible participation of Mbt. mbtP1 induced slight effects in the insulin pathway and strongly influenced the localization of an unknown nucleolar protein. Genetic interactions of mbtP1 with mutations in genes involved in the classical MAPK pathway identified mbt as a positive regulator of the MAPK pathway. A similar effect was also observed with respect to neuroblast proliferation and size. A 2D gel analysis of larval brains identified Bic and Hsp83 as candidate proteins, that might be regulated by Mbt. This work characterizes a novel function of the p21-activated kinase Mbt in neural stem cells. It provides starting points for a detailed analysis of the mechanisms of type II PAK functions in the control of cell growth, proliferation and survival. KW - Taufliege KW - Auge KW - Ontogenie KW - Pilzkörper KW - Molekularbiologie KW - p21-aktivierten Kinase KW - PAK KW - Neuroblast KW - Pilzkörper KW - Drosophila melanogaster KW - p21 activated kinase KW - PAK KW - neuroblast KW - mushroombody KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85619 ER - TY - THES A1 - Mentzel, Benjamin Tobias T1 - Biochemische und phänotypische Untersuchungen zur Funktion der p21-aktivierten Kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster T1 - Biochemical and phenotypic analysis of the p21-activated kinase DPAK3 in Drosophila melanogaster N2 - Gegenstand dieser Arbeit ist das Drosophila melanogaster Protein DPAK3, ein Vertreter der hochkonservierten Familie der p21-aktivierten Kinasen (PAK). DPAK3 und seine Homologen aus anderen Insektenarten und C. elegans können aufgrund eines Vergleichs der Proteinsequenz und struktureller Merkmale in eine eigenen Untergruppe 1* innerhalb der Gruppe 1 der PAK-Proteine eingeordnet werden. Das Genom von Drosophila kodiert noch für zwei weitere PAK-Proteine, das zur Gruppe 1 gehörende DPAK1 und das Gruppe 2 PAK-Protein Mbt. Wie die klassischen Gruppe 1 PAK-Proteine bildet DPAK3 im inaktiven Zustand Dimere. DPAK3 interagiert mit den GTP-gebundenen Formen der RhoGTPasen Rac1, Rac2 und Cdc42. Durch die Bindung dieser Proteine geht DPAK3 aus dem dimeren in den monomeren Zustand über und seine Kinaseaktivität wird durch diese Bindung gesteigert. DPAK3 ist für die Ausbildung der korrekten Morphologie kultivierter Drosophila Zellen erforderlich und beeinflußt die Regulation des Aktinzytoskeletts. Weiterhin konnte CK2beta, die regulatorische Untereinheit der Casein Kinase 2, als neuer Regulator von p21-aktivierten Kinasen identifiziert werden. Das Genom von Drosophila besitzt drei Transkriptionseinheiten, die für CK2beta', CK2betatestes und fünf verschiedene Isoformen von CK2beta kodieren. Eine vergleichende Analyse zeigt, daß alle CK2beta-Proteine mit DPAK1, DPAK3 und in geringerem Maß auch mit Mbt interagieren und in der Lage sind, die Aktivität der PAK-Proteine in vitro zu hemmen. Die Bindung von CK2beta an DPAK3 wird, wie bei allen anderen Serin- / Threoninkinasen, die bisher als Interaktionspartner von CK2beta identifiziert wurden, über die Kinasedomäne von DPAK3 vermittelt. Die Bildung des aus zwei katalytischen CK2a und zwei CK2beta Untereinheiten bestehenden CK2-Holoenzyms hängt von der Fähigkeit von CK2beta ab, Dimere zu bilden. Es konnte gezeigt werden, daß die Bildung eines b-b Dimers für die Interaktion mit und Regulation von DPAK3 nicht erforderlich ist. In vivo wurden die bisher bekannten Dpak3 Allele untersucht, wobei kein gesichertes Nullallel identifiziert werden konnte. Durch enzymatisch katalysierte Rekombination wurde eine neue Deletion hergestellt, die das komplette Leseraster von Dpak3 entfernt. Mit Hilfe von genetischen Mosaiken wurde die Rolle von DPAK3 in der Augenentwicklung untersucht. Durch den Verlust der Genfunktion von Dpak3 wird die Ausbildung der korrekten Struktur der Komplexaugen nur leicht beeinträchtigt. Bei der Analyse einer Dpak1 Mutante wurde dasselbe Ergebnis erzielt. Gleichzeitiger Verlust der Genfunktion von Dpak1 und Dpak3 hingegen führt zu massiven strukturellen Defekten. DPAK1 und DPAK3 erfüllen somit zumindest teilweise redundante Funktionen in der Augenentwicklung. Es wird Gegenstand zukünftiger Studien sein müssen, die gemeinsamen und getrennten Funktionen dieser PAK-Proteine in Drosophila aufzuklären. N2 - Subject of this work is the Drosophila melanogaster protein DPAK3, a member of the highly conserved family of p21-activated kinases. Based on the comparison of the amino acid sequence and structural features, DPAK3 and its homologues from other insect species and C. elegans can be assigned to a distinct subgroup 1* within the group 1 PAK proteins. The genome of Drosophila encodes for two additional PAK proteins, DPAK1 and Mbt, which belong to the group 1 and group 2 p21-activated kinases, respectively. Like the classical group 1 PAK proteins, DPAK3 forms dimers in its inactive conformation. DPAK3 binds to and is activated by the Rho GTPases Rac1, Rac2 and Cdc42. The interaction with these proteins leads to the disruption of the DPAK3 dimer and an increase in the kinase activity of DPAK3. DPAK3 is necessary for the development of the normal morphology of cultured Drosophila cells and influences the regulation of the actin cytoskeleton. CK2b the regulatory subunit of casein kinase 2 was identified as a new regulator of p21 activated kinases. The genome of Drosophila possesses three different transcriptional units that encode the proteins CK2b', CK2btestes and five different isoforms of CK2b. A comparative analysis shows that all CK2b proteins interact with DPAK1, DPAK3 and Mbt and negatively regulate the activity of these kinases in vitro. CK2b binds to the kinase domain of DPAK3 which is consistent with previous results obtained from other serine/threonine kinases interacting with CK2b. The CK2 holoenzyme consists of two catalytically active CK2a subunits and two regulatory CK2b subunits. My results show that the ability of CK2b to form dimers, which is essential for the formation of the CK2 holoenzyme, is not necessary for the regulation of p21 activated kinases. The analysis of the available Dpak3 alleles in vivo revealed the necessity to create a new bona fide loss of function allele. To accomplish this goal, a new deletion which removes the entire Dpak3 open reading frame was created by enzymatically catalysed recombination. Genetic mosaics were used to study the role of DPAK3 in eye development. The morphology of the complex eyes was only slightly impaired by the loss of Dpak3 function. The same result was obtained when analysing Dpak1 mutants, but removal of the gene function of both Dpak1 and Dpak3 leads to massive structural defects. This shows that Dpak1 and Dpak3 have at least partially redundant functions in eye development. Further studies will be necessary to reveal the common and distinct functions of these p21-activated kinases in Drosophila. KW - Taufliege KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-30290 ER - TY - THES A1 - Michels, Birgit T1 - Towards localizing the Synapsin-dependent olfactory memory trace in the brain of larval Drosophila T1 - Lokalisierung einer Synapsinabhängigen Duft-Gedächtnisspur im Gehirn von Drosophila Larven N2 - Animals need to adapt and modify their behaviour according to a changing environment. In particular, the ability to learn about rewarding or punishing events is crucial for survival. One key process that underlies such learning are modifications of the synaptic connection between nerve cells. This Thesis is concerned with the genetic determinants of such plasticity, and with the site of these modifications along the sensory-to-motor loops in Drosophila olfactory learning. I contributed to the development and detailed parametric description of an olfactory associative learning paradigm in larval fruit flies (Chapter I.1.). The robustness of this learning assay, together with a set of transgenic Drosophila strains established during this Thesis, enabled me to study the role for Synapsin, a presynaptic phosphoprotein likely involved in synaptic plasticity, in this form of learning (Chapter I.2.), and to investigate the cellular site of the corresponding Synapsin-dependent memory trace (Chapter I.3.). These data provide the first comprehensive account to-date of the neurogenetic bases of learning in larval Drosophila. The role for Synapsin was also analyzed with regard to pain-relief learning in adult fruit flies (Chapter II.1.); that is, if an odour precedes an electric shock during training, flies subsequently avoid that odour (‘punishment learning’), whereas presentation of the odour upon the cessation of shock subsequently leads to approach towards the odour (‘relief larning’). Such pain-relief learning was also the central topic of a study concerning the white gene (Chapter II.2.), which as we report does affect pain-relief as well as punishment learning in adult flies, but leaves larval odour-food learning unaffected. These studies regarding pain-relief learning provide the very first hints, in any experimental system, concerning the genetic determinants of this form of learning. N2 - Tiere müssen sich den wechselnden Umweltbedingungen anpassen und ihr Verhalten dementsprechend ändern. Insbesondere ist die Fähigkeit bestrafende und belohnende Ereignisse zu lernen wesentlich für das Überleben. Ein Schlüssel-Prozess, der solchem Lernen unterliegt, sind Veränderungen in der synaptischen Verbindung zwischen Nervenzellen. Diese Arbeit beschäftigt sich mit den genetischen Bestimmungsgrößen solcher Plastizität und mit dem Ort an, dem diese Veränderungen entlang der sensorisch-motorischen Nervenbahn des olfaktorischen Lernens in Drosophila stattfinden. Ich habe an der Planung und der Festlegung der Parameter eines olfaktorischen assoziativen Lernparadigmas von Drosophila Larven mitgewirkt (Kapitel I.1.). Die Robustheit dieses Lernparadigmas, zusammen mit einer Anzahl an genetisch veränderten Drosophila Stämmen, die ich während dieser Arbeit entwickelt habe, ermöglichte es mir, die Rolle des Synapsins zu untersuchen. Synapsin ist ein präsynaptisches Phosphoprotein und wahrscheinlich an synaptischer Plastizität beteiligt, welche bei dieser Art von Lernen eine Rolle spielt (Kapitel I.2.). Außerdem ermöglichte es mir den zellulären Ort der Synapsinabhängigen Gedächtnisspur zu untersuchen (Kapitel I.3.) Diese Daten liefern den ersten umfassenden Wissensstand über neuro-genetische Grundlagen des larvalen Lernens. Die Rolle des Synapsin wurde auch im „Erleichterungslernen“ in adulten Fliegen analysiert (Kapitel II.1.). Wenn während des Trainings ein Duft einem elektrischem Schock vorausgeht, vermeiden Fliegen danach diesen Duft („Beschtrafungslernen“), wohingegen die Verabreichung des Duftes nach dem Ende des Schocks anschließend zu einer Annäherung in Richtung Duft führt („Erleichterungslernen“). Solches „Erleichterungslernen“ war auch der Schwerpunkt einer Reihe von Experimenten, die sich mit dem „White“-Gen beschäftigten (Kapitel II.2.). Wie gezeigt beeinflusst dieses Gen sowohl das „Erleichterungs“- als auch das „Bestrafungs“- Lernen in adulten Fliegen; jedoch hat es keine Auswirkungen auf das Duft-Futter-Lernen in Larven. Diese Experimente, die sich mit „Erleichterungslernen“ beschäftigen, liefern die neuesten Hinweise in Systemen, die sich mit den genetischen Bestimmungsgrößen dieser Form von Lernen beschäftigen. KW - Taufliege KW - olfaktorisches Lernen KW - Synapsin KW - Larve KW - drosophila larva KW - olfactory learning KW - Synapsin Y1 - 2008 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-36338 ER - TY - THES A1 - Mrestani, Achmed T1 - Strukturelle Differenzierung und Plastizität präsynaptischer Aktiver Zonen T1 - Structural differentiation and plasticity of presynaptic active zones N2 - Ziel der vorliegenden Arbeit war die nanoskopische Analyse struktureller Differenzierung und Plastizität präsynaptischer aktiver Zonen (AZs) an der NMJ von Drosophila melanogaster mittels hochauflösender, lichtmikroskopischer Bildgebung von Bruchpilot (Brp). In erster Linie wurde das lokalisationsmikroskopische Verfahren dSTORM angewendet. Es wurden neue Analyse-Algorithmen auf der Basis von HDBSCAN entwickelt, um eine objektive, in weiten Teilen automatisierte Quantifizierung bis auf Ebene der Substruktur der AZ zu ermöglichen. Die Differenzierung wurde am Beispiel phasischer und tonischer Synapsen, die an dieser NMJ durch Is- und Ib-Neurone gebildet werden, untersucht. Phasische Is-Synapsen mit hoher Freisetzungswahrscheinlichkeit zeigten kleinere, kompaktere AZs mit weniger Molekülen und höherer molekularer Dichte mit ebenfalls kleineren, kompakteren Brp-Subclustern. Akute strukturelle Plastizität wurde am Beispiel präsynaptischer Homöostase, bei der es zu einer kompensatorisch erhöhten Neurotransmitterfreisetzung kommt, analysiert. Interessanterweise zeigte sich hier ebenfalls eine kompaktere Konfiguration der AZ, die sich auch auf Ebene der Subcluster widerspiegelte, ohne Rekrutierung von Molekülen. Es konnte demonstriert werden, dass sich eine höhere Moleküldichte in der Lokalisationsmikroskopie in eine höhere Intensität und größere Fläche in der konfokalen Mikroskopie übersetzt, und damit der Zusammenhang zu scheinbar gegensätzlichen Vorbefunden hergestellt werden. Die Verdichtung bzw. Kompaktierung erscheint im Zusammenhang mit der Kopplungsdistanz zwischen VGCCs und präsynaptischen Vesikeln als plausibles Muster der effizienten Anordnung molekularer Komponenten der AZ. Die hier eingeführten Analysewerkzeuge und molekularbiologischen Strategien, basierend auf dem CRISPR/Cas9-System, zur Markierung von AZ-Komponenten können zukünftig zur weiteren Klärung der Bedeutung der molekularen Verdichtung als allgemeines Konzept der AZ-Differenzierung beitragen. N2 - The aim of this work was a nanoscopic analysis of structural differentiation and plasticity of presynaptic active zones (AZs) at the NMJ of Drosophila melanogaster using super-resolution light microscopy of Bruchpilot (Brp). The localization microscopy technique dSTORM was primarily used. New analysis algorithms based on HDBSCAN were developed to ensure objective and largely automatized quantification including the substructure of the AZ. Differentiation was assessed using the model of phasic and tonic neurons that are represented by type Is and type Ib neurons at this NMJ. Phasic Is synapses with higher release probability displayed smaller, more compact AZs with less molecules and an enhanced molecular density with smaller, more compact Brp subclusters. For acute structural plasticity the model of presynaptic homeostasis, which is accompanied by a compensatory increase of neurotransmitter release, was used. Interestingly, this again showed a more compact arrangement of the AZ, that was also found in Brp subclusters, without addition of molecules. It could be demonstrated that a higher molecular density in localization microscopy translates into a higher intensity and area in confocal microscopy and, thus, the apparent discrepancy to earlier studies could be explained. With respect to the coupling distance between VGCCs and presynaptic vesicles compaction appears to be a plausible mechanism for an efficient remodeling of AZ components. The analysis tools and molecular biology strategies, based on the CRISPR/Cas9-System, introduced here will be useful to further clarify the importance of molecular compaction as a general concept of AZ differentiation. KW - Synapse KW - Neuronale Plastizität KW - Taufliege KW - Immunfluoreszenz KW - CRISPR/Cas-Methode KW - Hochauflösende Lichtmikroskopie KW - HDBSCAN KW - Bruchpilot Y1 - 2022 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-235787 ER - TY - THES A1 - Mronz, Markus T1 - Die visuell motivierte Objektwahl laufender Taufliegen (Drosophila melanogaster) - Verhaltensphysiologie, Modellbildung und Implementierung in einem Roboter T1 - Visually motivated object choice in walking fruit flies (Drosophila melanogaster) – behavioural physiology, modelling and implementation in a robot N2 - Im Rahmen dieser Arbeit wurden offene Fragen zur Objektwahl, zur Objektbeibehaltung und zur Aufgabe von Zielobjekten bei laufenden Taufliegen (Drosophila melanogaster) untersucht. Die Erkenntnisse zur Objektwahl wurden als kybernetisches Modell formuliert, auf einem eigens dafür konstruierten, autonom navigierenden Roboter mit Kameraauge implementiert und dessen Verhalten bei verschiedenen Landmarkenkonstellationen quantitativ mit dem Orientierungsverhalten laufender Fliegen verglichen. Es war bekannt, dass Drosophila in einer Wahlsituation zwischen unterschiedlich weit entfernten Objekten eine ausgeprägte Präferenz für nahe Objekte zeigt, wobei die Entfernung über das Ausmaß der retinalen Bildverschiebung auf dem Auge (Parallaxe) erfasst wird. In der vorliegenden Arbeit wurde analysiert, ob die Parallaxe streng aus der Eigenbewegung der Fliege resultieren muss oder ob Eigenbewegung der Objekte Nähe vortäuschen und deren Attraktivität erhöhen kann. Es wurde gezeigt, dass die Präferenz für ein Objekt bei Drosophila umso größer wird, je mehr Bewegung dessen Abbild auf der Retina erzeugt; die relative Verschiebung des Objektabbildes muss dabei nicht mit der Eigenbewegung der Fliege gekoppelt sein. Überraschenderweise verschwand die Präferenz für nahe Objekte, wenn eine zusammenstehende Gruppe aus einer nahen und mehreren fernen Objekten präsentiert wurden, solange sie zusammen einen Sehwinkel von weniger als etwa 90° einnahmen. Diese Beobachtung ist konform mit einer Vorstellung, wonach Bewegung über größere Augenbereiche integriert und nicht einzelnen Objekten zugeordnet wird. Obwohl Drosophila bei gleichem Präsentationsort auf der Retina die größere parallaktische Bewegung bevorzugte, wurden bei gleicher Entfernung dennoch frontalere gegenüber lateraleren Objekten bevorzugt. Es wird postuliert, dass der frontale und der caudale Sehbereich eine Verstärkung erfahren, die die physikalisch bedingt geringere Parallaxe überkompensiert. Laufende Fliegen reagieren verzögert auf die Präsentation eines Objekts; dies wird im Sinne einer zeitlichen Bewegungsintegration interpretiert. Die darauf folgende Richtungsänderung hängt vom Präsentationswinkel des Objektes ab. Erscheint das Objekt frontolateral, findet eine Hinwendung statt, erscheint es caudolateral, kommt es bevorzugt zur Abwendung. Eine weitere wichtige kognitive Leistung der Fliege ist das Aufgeben eines zuvor ausgewählten Ziels, wenn sich dieses Ziel während des Anlaufs als unerreichbar herausstellt. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass Fliegen mit stark reduzierten Pilzkörpern erheblich mehr Zeit benötigen als wildtypische Fliegen, um vom gewählten Zielobjekt abzulassen. Dieser dem Perseveranzverhalten bei Parkinson-kranken Menschen ähnliche Phänotyp wurde unabhängig von der Methode der Ausschaltung der Pilzkörper gefunden. Die Dauer der Perseveranz nahm mit zunehmender Attraktivität des Zielobjekts, d. h. mit abnehmender Distanz, zu. Es wird vorgeschlagen, dass die Pilzkörper für die Evaluierung von eingehender sensorischer Information oder für Entscheidungsfindungen im Allgemeinen benötig werden. Basierend auf diesen Ergebnissen wurde ein Minimalmodell für die visuelle Orientierung nach Landmarken entwickelt. Das Modell beinhaltet eine zeitliche Integration des optischen Flusses in einem frontolateralen und einem caudolateralen Kompartiment pro Auge. Je nachdem, in welchem Kompartiment eine festgesetzte Schwelle zuerst erreicht wird, kommt es entweder zu einer Hin- (frontolateral) oder zu einer Abwendungsreaktion (caudolateral). Eine Gewichtungsfunktion kompensiert die geringe parallaktische Verschiebung in diesen Sehregionen. Das Modell wurde in einem mobilen Roboter mit Kameraauge implementiert und mit dem visuellen Orientierungsverhalten der Fliege quantitativ verglichen. Der Roboter war in der Lage, viele Aspekte der Landmarkenwahl von laufenden Fliegen erfolgreich zu reproduzieren und fliegenähnliches, autonomes Orientierungsverhalten unter verschiedenen Landmarkenkonfigurationen zu zeigen. N2 - The present study addresses open questions regarding visual orientation behaviour of walking fruit flies (Drosophila melanogaster), in particular how they choose near over far objects and how they maintain or adaptively abandon their choice. The findings led to a cybernetic model, suitable to autonomously control a mobile robot with panoramic vision, which was constructed, built and quantitatively compared to fly behaviour during this study. For a wide range of landmark constellations the robot exhibits fly-like orientation behaviour. Drosophila is known to choose, with a high probability, the nearest of several similar objects first. Distance to objects is measured by the extent of the retinal shift of their images on the eye (parallax motion). The present study asked whether parallax motion needs to directly result from the fly’s self-motion or whether motion of objects can increase their attractiveness because they appear to be closer to the fly. The data show that flies prefer objects the more, the larger the shift of the object image becomes on the retina. This is independent of the source of the retinal shift, object motion or self-motion of the fly. Surprisingly, the preference for near objects disappeared when a near object was presented together with several distant objects within a viewing angle of less then 90°. This observation led to the assumption that motion parallax is spatially integrated over larger areas of the eye and not seen as an entity of the single object. Physically, the extent of parallax motion caused by a stationary object on the retina of a walking fly depends not only on the distance but also on the angle under which it is seen. Although Drosophila prefers the larger amount of visual motion at a given presentation angle, it clearly prefers frontal over lateral objects. In order to account for the preference for frontal objects an amplification of the frontal and caudal eye regions is postulated which would otherwise receive less parallax motion. It turned out that walking flies respond only delayed to the presentation of a single object. This delay is consistent with the idea of temporal integration of parallax motion in order to judge distance. Astonishingly, the following course change depends on the viewing angle of the object. If an attractive object is shown in the frontolateral eye region the flies turn towards it. If it appears in the caudolateral part of the retina the flies preferentially turn away from it. Among the key abilities of animals must be the ability to give up on a once chosen target object if that object turns out to be inaccessible. The present study proves that flies with a strong reduction in mushroom body volume need considerably more time to give up on an object. The phenotype resembles the perseverance behaviour of humans suffering from Parkinson’s disease and was found regardless of the methods of interference with the mushroom bodies. The duration of the erroneously continued approach in flies with a strong reduction in mushroom body volume increases with decreasing distance between platform rim and landmark. In the absence of landmarks the defective flies behave normally, suggesting that mushroom bodies are involved in the evaluation of incoming sensory stimuli or in more general decision making processes. Modelling and implementation. Based on the findings outlined above a minimal model for landmark orientation has been established. The minimal model is based on a temporal integration of visual motion in four compartments, a frontolateral and a caudolateral compartment per eye. Depending on which compartment reaches a certain threshold first, a turning response will be elicited either towards (frontolateral compartment) or away from the target object (caudolateral compartment). Frontal and caudal eye regions naturally receive less parallax motion than lateral eye regions. To compensate for the small amount of parallax motion in the respective eye regions a weighting function has been introduced. The algorithm was finally implemented on a mobile robot equipped with a fish-eye lens mounted on camera allowing for panoramic vision. The behaviour of the robot was measured and quantitatively compared to the orientation behaviour of walking fruit flies. The robot reproduced successfully many aspects of the fruit fly's landmark orientation behaviour and showed fly-like autonomous orientation behaviour in the presence of various landmark arrangements. KW - Taufliege KW - Bewegungssehen KW - Orientierung KW - Bewegungssehen KW - Insekt KW - Orientierung KW - Fliege KW - vision KW - motion KW - insect KW - orientation KW - fly Y1 - 2004 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11748 ER - TY - THES A1 - Niewalda, Thomas T1 - Neurogenetic analyses of pain-relief learning in the fruit fly T1 - Neurogenetische Analyse von pain-relief Lernen in der Fruchtfliege N2 - All animals learn in order to cope with challenges imposed on them by their environment. This is true also for both larval and adult fruit flies as exemplified in pavlovian conditioning. The focus of this Thesis is on various aspects of the fruit flies learning ability. My main project deals with two types of learning which we call punishment-learning and pain-relief learning. Punishment learning happens when fruit flies are exposed to an odour which is followed by electric shock. After such training, flies have learned that that odour signals pain and consequently will avoid it in the future. If the sequence of the two stimuli is reversed such that odour follows shock, flies learn the odour as a signal for relief and will later on approach it. I first report a series of experiments investigating qualitative and parametric features of relief-learning; I find that (i) relief learning does result from true associative conditioning, (ii) it requires a relatively high number of training trials, (iii) context-shock training is ineffective for subsequent shock-odour learning. A further question is whether punishment-learning and pain-relief learning share genetic determinants. In terms of genetics, I test a synapsin mutant strain, which lacks all Synapsin protein, in punishment and relief-learning. Punishment learning is significantly reduced, and relief-learning is abolished. Pan-neuronal RNAi-mediated knock-down of Synapsin results in mutant-like phenotypes, confirming the attribution of the phenotype to lack of Synapsin. Also, a rescue of Synapsin in the mushroom body of syn97 mutants restores both punishment- and relief-learning fully, suggesting the sufficiency of Synapsin in the mushroom body for both these kinds of learning. I also elucidate the relationship between perception and physiology in adult fruit flies. I use odour-shock conditioning experiments to identify degrees of similarity between odours; I find that those similarity measures are consistent across generalization and discrimination tasks of diverse difficulty. Then, as collaborator of T. Völler and A. Fiala, I investigate how such behavioural similarity/dissimilarity is reflected at the physiological level. I combine the behaviour data with calcium imaging data obtained by measuring the activity patterns of those odours in either the sensory neurons or the projection neurons at the antennal lobe. Our interpretation of the results is that the odours perceptual similarity is organized by antennal lobe interneurons. In another project I investigate the effect of gustatory stimuli on reflexive behaviour as well as their role as reinforcer in larval learning. Drosophila larvae greatly alter their behaviour in presence of sodium chloride. Increasing salt concentration modulates choice behaviour from weakly appetitive to strongly aversive. A similar concentration-behaviour function is also found for feeding: larval feeding is slightly enhanced in presence of low salt concentrations, and strongly decreased in the presence of high salt concentrations. Regarding learning, relatively weak salt concentrations function as appetitive reinforcer, whereas high salt concentrations function as aversive reinforcer. Interestingly, the behaviour-concentration curves are shifted towards higher concentrations from reflexive behaviour (choice behaviour, feeding) as compared to associative learning. This dissociation may reflect a different sensitivity in the respective sensory-motor circuitry. N2 - Tiere müssen lernen, damit sie sich in ihrer Umwelt zurechtfinden und die Herausforderungen meistern können, die ihre Umwelt ihnen bietet. Dies gilt auch für Taufliegen im larvalen und erwachsenen Stadium, wie man mit der Pavlovschen Konditionierung zeigen kann. Der Schwerpunkt dieser Doktorarbeit liegt auf verschiedenen Aspekten der Lernfähigkeit von Taufliegen. In meinem Hauptprojekt erforsche ich die Arten von Lernprozessen, die stattfinden, wenn die Fliegen entweder den Beginn oder das Ende eines Elektroschocks mit einem Duft assoziieren. Wenn Taufliegen einen Duft wahrnehmen, der von einem Elektroschock gefolgt wird, lernen sie, dass dieser Duft Schmerz signalisiert, und werden ihn konsequenterweise in Zukunft vermeiden. Man kann die Abfolge dieser beiden Reize so umkehren, dass der Duft auf den Elektroschock folgt. Durch ein solches Training wird der Duft für die Fliegen zu einem Signal für das Ende des schmerzhaften Elektroschocks und sie werden, wenn sie diesen Duft später wieder einmal wahrnehmen, auf ihn zugehen. Ich berichte im ersten Kapitel über Experimente, die qualitative und parametrische Besonderheiten der letzteren Lernform untersuchen. Ich finde heraus, dass (i) das Lernen über das Ende des Elektroschocks echtes assoziatives Lernen ist, (ii) dass es eine relativ hohe Anzahl von Trainingsdurchgängen erfordert, (iii) dass Kontext-Schock-Training unbedeutend für anschließendes Schock-Duft-Lernen ist. Im zweiten Kapitel gehe ich der Frage nach, ob die genannten beiden Typen von Lernvorgängen gemeinsame genetische Determinanten haben. Was die Genetik anbelangt, teste ich die Lernfähigkeit eines Synapsin-Mutantenstammes, dem das Synapsinprotein fehlt. Lernen über den Beginn des Elektroschocks ist stark reduziert, und Lernen über das Ende des Elektroschocks fehlt gänzlich. Die Reduzierung des Synapsinproteins im Fliegengehirn durch RNAi resultiert in mutantenähnlichen Phänotypen. Dieser Befund bestätigt, dass der Lernphänotyp auf einem Mangel an Synapsin beruht. Die Expression von Synapsin im Pilzkörper der Mutante erlaubt der Fliege, wieder normal zu lernen; dies weist auf die Hinlänglichkeit von Synapsin im Pilzkörper für beide Arten von Lernen hin. In einem weiteren Projekt untersuche ich den Zusammenhang zwischen Wahrnehmung und Physiologie in erwachsenen Taufliegen. Ich benutze Duft-Schock-Konditionierungsexperimente, um basierend auf dem Verhalten der Tiere Ähnlichkeitsränge von Düften zu ermitteln, und finde eine einheitliche Rangfolge der untersuchten Düfte für verschiedene Generalisierungs- und Diskriminierungs-Aufgaben von unterschiedlichem Schwierigkeitsgrad. Schließlich erforsche ich in Kooperation mit T. Völler and A. Fiala, wie der Grad der Verhaltensähnlichkeit /-unähnlichkeit von Düften mit der Physiologie der Fliege in Beziehung steht. Ich kombiniere die Verhaltensdaten mit Daten, die mittels funktioneller Bildgebung unter Verwendung genetisch codierter Kalziumsensoren erhalten wurden. Diese Methode erlaubt, Aktivitätsmuster, die von den untersuchten Düften verursacht werden, entweder in den sensorischen Neuronen oder in den Projektionsneuronen des Antennallobus zu messen. Unsere Interpretation der Ergebnisse ist, dass die Verhaltensähnlichkeit der Düfte auf Ebene der Interneuronen im Antennallobus organisiert wird. Weiterhin erforsche ich die Wirkung von Kochsalz (Natriumchlorid) auf das Reflexverhalten und die Rolle von Natriumchlorid als Belohnung oder Bestrafung im Larvenlernen. Larven der Taufliege verändern ihr Reflexverhalten in Gegenwart von Natriumchlorid in hohem Maße. Larven bevorzugen niedrige Salzkonzentrationen gegenüber einem Substrat ohne Salz; erhöht man die Salzkonzentration jedoch, kehrt sich das Wahlverhalten ins Gegenteil um, bis die Tiere das salzhaltige Substrat stark vermeiden. Ein ähnlicher Zusammenhang zwischen Konzentration und Verhalten wird auch für das Fressverhalten gefunden: Larven fressen von einem Substrat mit niedrigen Salzkonzentrationen geringfügig mehr, von einem Substrat mit hohen Salzkonzentrationen jedoch deutlich weniger als von einem Kontrollsubstrat ganz ohne Salz. Was das Lernen betrifft, wirken relativ schwache Salzkonzentrationen als Belohnung, während hohe Salzkonzentrationen als Bestrafung wirken. Interessanterweise ist die Verhaltens-Konzentrations-Kurve von Reflexverhalten (Wahlverhalten, Fressverhalten) verglichen mit assoziativem Lernen in Richtung höherer Konzentrationen verschoben. Diese Dissoziation könnte eine verschiedenartige Sensitivität der Schaltkreise widerspiegeln. KW - Taufliege KW - Assoziatives Gedächtnis KW - Lernverhalten KW - Synapsine KW - Molekulargenetik KW - Drosophila melanogaster KW - olfaction KW - learning KW - memory KW - synapsin Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65035 ER - TY - THES A1 - Nuwal, Nidhi T1 - Optogenetic investigation of nervous system functions using walking behavior and genome wide transcript analysis of Synapsin and Sap47 mutants of Drosophila N2 - PART I Animals need to constantly evaluate their external environment in order to survive. In some cases the internal state of the animal changes to cope with it’s surrounding. In our study we wanted to investigate the role of amines in modulating internal states of Drosophila. We have designed a behavioral paradigm where the flies are fixed in space but can walk on a small styrofoam ball suspended by a gentle stream of air. The walking activity of flies was used as behavioral readout. PART I Animals need to constantly evaluate their external environment in order to survive. In some cases the internal state of the animal changes to cope with it’s surrounding. In our study we wanted to investigate the role of amines in modulating internal states of Drosophila. We have designed a behavioral paradigm where the flies are fixed in space but can walk on a small styrofoam ball suspended by a gentle stream of air. The walking activity of flies was used as behavioral readout. An operant training paradigm was established by coupling one of the walking directions to incidence of heat punishment. We observed that animals quickly realized the contingency of punishment with walking direction and avoided walking in the punished direction in the presence of punishment, but did not continue walking in the unpunished direction in the absence of the punishment. This would indicate that the flies do not form a memory for the punished direction or rapidly erase it under new conditions. On having established the paradigm with heat punishment we have attempted to activate selected subsets of neuronal populations of Drosophila while they were walking on the ball. The selective activation of neurons was achieved by expressing the light-activated ion channel channelrhodopsin-2 (ChR2) using the Gal4-UAS system and coupling the unidirectional walking of the animals on the ball with the incidence of blue light required to activate the channels and depolarize the neurons. The feasibility of this approach was tested by light-activating sugar sensitive gustatory receptor neurons expressing ChR2, we found that when the light was actuated the flies preferred to turn in one direction the optically “rewarded” direction. Next we similarly activated different subsets of aminergic neurons. We observed that in our setup animals avoided to turn in the direction which was coupled to activation of dopaminergic neurons indicating that release of dopamine is disliked by the animals. This is in accordance with associative learning experiments where dopamine is believed to underlie the formation of an association between a neutral conditioned stimulus with the aversive unconditioned stimulus. However, when we activated tyraminergic/octopaminergic neurons we did not observe any directional preference. The activation of dopaminergic and tyraminergic/octopaminergic neurons led to arousal of the animals indicating that we were indeed successful in activating those neurons. Also, the activation of serotonergic neurons did not have any effect on directional preference of the animals. With this newly established paradigm it will be interesting to find out if in insects like in mammals a reward mediating system exists and to test subsets of aminergic or peptidergic neurons that could possibly be involved in a reward signaling system which has not been detected in our study. Also, it would be interesting to localize neuropile regions that would be involved in mediating choice behavior in our paradigm. PART II In collaboration with S. Kneitz (IZKF Wuerzburg) and T. Nuwal we performed genome-wide expression analysis of two pre-synaptic mutants - Synapsin (Syn97) and Synapse associated protein of 47 kDa (Sap47156). The rationale behind these experiments was to identify genes that were up- or down-regulated due to these mutations. The microarray experiments provided us with several candidate genes some of which we have verified by qPCR. From our qPCR analysis we can conclude that out of the verified genes only Cirl transcripts seem to be reproducibly down regulated in Synapsin mutants. The Cirl gene codes for a calcium independent receptor for latrotoxin. Further qPCR experiments need to be performed to verify other candidate genes. The molecular interactions between CIRL and SYN or their genes should now be investigated in detail. N2 - Teil I Lebewesen müssen beständig ihre äußere Umgebung auswerten, um überleben zu können. Manchmal ändern sich innere Zustände der Tiere, damit sie sich der Außenwelt anpassen. In unseren Untersuchungen wollten wir die Rolle von Aminen untersuchen, die für die Modulation von inneren Zuständen bei Drosophila notwendig sind. Wir haben ein Verhaltensparadigma entwickelt, bei dem die Fliege räumlich fixiert ist, aber auf einem Styroporball laufen kann, der auf einem Luftpolster schwebt. Die Laufaktivität der Fliege wird durch die Ballbewegungen anzeigt. Mit diesem Versuchsaufbau wurde ein operantes Lernparadigma etabliert, bei dem eine Laufrichtung mit Bestrafung durch Hitze gekoppelt wird. Wir konnten feststellen, dass die Tiere schnell den Zusammenhang zwischen dem Auftreten der Bestrafung und der Laufrichtung realisieren und die bestrafte Seite vermeiden. Wurde die eine Laufrichtung nicht mehr bestraft, so vermieden die Fliegen sie nicht mehr. Dies zeigt dass die Fliegen kein Gedächtnis für die bestrafte Richtung ausbilden oder es bei veränderten Bedingungen rasch löschen . Nachdem sich der Versuchsaufbau mit Hitzebestrafung bewährt hatte, wurde versucht, bestimmte Sub-population von Neuronen von Drosophila zu aktivieren, während die Fliege auf dem Ball läuft. Die selektive Aktivierung von Neuronen wurde durch die Expression des lichtaktivierten Jonenkanals Channelrhodopsin-2 (ChR-2) mit Hilfe des Gal4-UAS-System und Beleuchtung der Fliege mit Blaulicht erreicht, das die Kanäle aktiviert. Nun erfolgte eine Kopplung einer Laufrichtung auf dem Ball mit dem Auftreten von blauem Licht. Die Durchführbarkeit derartiger Experimente wurde durch die Aktivierung von zuckersensitiven gustatorischen Rezeptorneuronen getestet. Die Ergebnisse zeigten, dass die Tiere bevorzugt die Richtung wählen, welche die Zuckerrezeptorneurone aktiviert. Anschließend aktivierten wir verschiedene Untergruppen von Neuronen des aminergen Systems. In diesem Versuchsaufbau beobachteten wir, dass die Tiere die Laufrichtung vermieden, die gekoppelt war mit der Aktivierung dopaminerger Neurone. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit Versuchen zum assoziativen Lernen, bei dem Dopamin wahrscheinlich notwendig ist für die Assoziation zwischen dem neutralen Konditionierungsstimulus und dem aversiven unkonditionierten Stimulus. Wenn wir jedoch die tyraminergen/oktopaminergen Neurone aktivierten, konnte keine gerichtete Präferenz nachgewiesen werden. Die Aktivierung dopaminerger und tyraminger/oktopaminerger Neurone führte jedoch zur Aktivitätssteigerung der Tiere, wodurch die erfolgreiche der Aktivierung der Neurone belegt wurde. Die Aktivierung serotonerger Neurone führte ebenfalls zu keinem Effekt in der Präferenz der Tiere. In zukünftigen Experimenten mit dem neu entwickelten Paradigma wäre es interessant, herauszufinden, ob in Insekten auch ein belohnungsabhängiges System existiert, vergleichbar dem von Säugern. So wäre die Identifizierung von Subpopulationen aminerger oder peptiderger Neurone des Belohnungssystems bei Insekten wichtig, da dies nicht in unseren Experimenten entdeckt wurde. Eine weitere interessante Fragestellung wäre, welche Gehirnstruktur die Richtungswahl auf dem Ball vermittelt. Teil II In Zussamenarbeit mit S. Kneitz (IZKF, Würzburg) und T. Nuwal wurde in der vorliegenden Arbeit die genomweite Genexpression einer Synapsin-Mutante (Syn97) und einer Mutante für das Synapsen-assoziierte-Protein von 47kDa (Sap47156) untersucht. Bei beiden Proteinen handelt es sich um präsynaptische Proteine von Drosophila. Ziel dieses Experiments war es, Gene zu identifizieren die aufgrund dieser Mutationen hoch bzw. herunterreguliert vorliegen. Durch das Microarray-Experiment wurden mehrere Kandidatengene entdeckt, wovon einige dieser Gene per qPCR-Versuchen verifiziert wurden. Aufgrund der qPCR-Analysen lässt sich schlussfolgern, dass nur das Cirl-Transkript in den Synapsin-Mutanten reproduzierbar herunterreguliert vorliegt. Das Cirl gene kodiert für einen Calcium independent receptor for Latrotoxin Weitere qPCR-Experimente sind notwendig, um die anderen Kandidatengene zu bestätigen. Die molekularen Interaktionen zwichen CIRL und Synapsin oder ihren Genen müssen nun im Detail untersucht werden. KW - Taufliege KW - Nervensystem KW - Amine KW - Synapsine KW - Optogenetik KW - Oktopamin KW - Dopamin KW - Channelrhodopsin KW - Synapsin KW - Sap47 KW - Cirl KW - Optogenetic KW - Channelrhodopsin KW - Dopamine KW - Octopamine KW - Synapsin KW - Sap47 KW - Cirl Y1 - 2010 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-51694 ER -