TY  - THES
A1  - Lee, Sae Kyung
T1  - Interaction of Helicobacter pylori flagellins with the host innate immune system
T1  - Interaktion von Helicobacter pylori Flagellin mit dem angeborenen Immunsystem des Wirtes
N2  - Helicobacter pylori (H. pylori) is a gram-negative, microaerophilic, spiral-shaped bacterium. It resides in the gastric mucous layer and epithelial lining of the stomach, often clustering at the junction of epithelial cells. H. pylori colonization usually occurs during childhood, and, when left untreated, generally persists for the host’s lifetime. Persistent H. pylori infection can cause chronic superficial gastritis and gastric duodenal ulcers, which is possibly linked to the development of gastric carcinoma and primary gastric lymphoma, especially of the mucosa-associated lymphoid tissue (MALT) type. It was recently defined as a class 1 carcinogen. The gastric inflammatory response to H. pylori infection is characterized by infiltration of the mucosa by neutrophils, T and B cells, plasma cells and macrophages. This reaction is initially induced by H. pylori attachment, followed by cytokine release by gastric epithelial cells. Epidemiological studies revealed that more than 50% of adults are infected with H. pylori all over the world. However, interestingly, only a subset of individuals develops serious H. pylori-related disease, while most infected individuals show no clinical symptoms. Gastric epithelial cells, like intestinal epithelial cells, express a subset of Toll-like receptors (TLRs) and similar pattern recognition receptors, which are important for the activation of the innate immune system. Bacterial components such as lipopeptides, peptidoglycan, LPS, flagellin, and CpG DNA are the ligands of TLRs. Thus, TLRs in gastric epithelial cells might be able to contribute to innate immune responses to H. pylori infection. However, there is scant knowledge about the mechanisms of innate immune response to acute and chronic H. pylori infection. This study is focused on host cell interaction with H. pylori flagellins, which are major components of the flagellar apparatus, and innate immune responses against them. The flagellins, which are essential for bacterial motility, are important for H. pylori to survive in the stomach mucus during the whole infectious cycle. Flagellins are known to act as the main determinant of many mucosal pathogenic bacteria that mediates proinflammatory signaling, including transcriptional factor NF-B activation via TLR5. In the first part of the study, we investigated the effects of H. pylori flagellins on TLR5 expression, NF-B activation and IL-8 production in various human intestinal and gastric epithelial cell lines by using Western blotting, semi-quantitative RT-PCR and ELISA. IL-8 is a potent neutrophil-activating chemokine expressed by gastric epithelial cells. When we stimulated the cells with the native form of or E. coli-expressed recombinant H. pylori flagellins, FlaA and FlaB, IL-8 was not induced in any case, while S. typhimurium flagellin (FliC) induced it significantly. H. pylori was able to modulate TLR5 protein expression and NF-B activation in epithelial cells regardless of the presence of flagellins. Having established the finding that H. pylori flagellins have unusually low immune-stimulatory properties, we further investigated to find out possible reasons why H. pylori flagellins are distinct from other flagellins of pathogenic bacteria in terms of immune-stimulatory activity. From amino acid sequence comparisons, we found that some regions in the terminal D0D1 protein domains of H. pylori flagellins are different from flagellins of other pathogenic bacteria. D0D1 is the domain which is known to interact with TLR5 in Salmonella FliC. To examine whether the differences endow H. pylori flagellins with low immune-stimulatory properties, we created several mutated H. pylori flagellins (FlaA and FlaB) by site-directed mutagenesis that contain one to four epitopes of Salmonella flagellin D0D1 domain amino acid sequences. The mutant flagellins expressed both in H. pylori and E. coli were used to determine their influence on TLR5-signaling mediators and cytokines, such as MAPkinases, (ERK, p38), NF-B, IL-8, and MIP-3. Salmonella FliC expressed in E. coli induced activation of p38, IB and NF-B leading to IL-8 and MIP-3 production in gastric epithelial cells. However, none of the H. pylori flagellin mutants activated MAP kinases or induced those cytokines. In a co-immunoprecipitation assay none of the recombinant wild type or mutated H. pylori flagellins showed any direct physical interaction with TLR5, while Salmonella FliC significantly co-precipitated with TLR5. Interestingly, we found H. pylori flagellins bind to the surface of gastric epithelial cells like FliC, although they do not bind to or stimulate TLR5. Based on the physical interaction of H. pylori flagellins and FliC with human gastric epithelial cells, we further analyzed transcriptional regulation by H. pylori flagellin in these host cells using microarray analysis. The result showed that H. pylori flagellins modulate host cell gene expression, and many of the identified regulation events overlap with the genes regulated by FliC. These findings imply that H. pylori flagellins do play a role in gene regulation of host cells probably through still unknown factors or receptors, although they do not trigger TLR5-related signaling pathways. The results of our study suggest that, in addition to the low immune-stimulatory activity of H. pylori LPS, the evolutionary reduction in stimulating activity of H. pylori flagellins on the local innate immune responses in the stomach in vivo might be a further strategy of this chronic mucosal pathogen to evade and minimize deleterious host responses, thereby promoting life-long persistence in the host, and possibly contributing to cancerogenesis.
N2  - Helicobacter pylori (H. pylori) ist ein gram-negatives, mikroaerophiles, spiralförmiges Bakterium. Es besiedelt die Schleimschicht und die Epitheloberfläche des Magens, wobei es sich besonders an den Kontaktstellen der Epithelzellen anlagert. Die Kolonisation mit H. pylori erfolgt normalerweise während der Kindheit und bleibt, wenn sie nicht behandelt wird, im allgemeinen während der gesamten Lebenszeit des Wirtes bestehen. Die persistierende H. pylori-Infektion kann chronische oberflächliche Gastritis und Zwöffingerdarmgeschwüre verursachen. Die Infektion kann auch zur Entwicklung von Magenkrebs und Lymphomen des Mukosa-assoziierten Lymphgewebes (MALT-Lymphom) führen. H. pylori ist seit 1994 als Typ I-Karzinogen klassifiziert. Die durch eine H. pylori-Infektion induzierte Entzündungsreaktion der Magenschleimhaut ist charakterisiert durch eine Infiltration der Schleimhaut mit neutrophilen Granulozyten, T- und B-Zellen, Plasmazellen und Makrophagen. Diese Reaktion wird ausgelöst durch die Anheftung von H. pylori gefolgt von der Freisetzung von Cytokinen durch die Magenepithelzellen. Epidemiologische Studien haben ergeben, dass weltweit mehr als 50% aller Erwachsenen mit H. pylori infiziert sind. Jedoch entwickelt interessanterweise nur eine Teilgruppe der infizierten Individuen eine ernsthafte H. pylori-assoziierte Krankheit, während die meisten Infizierten keine klinischen Symptome zeigen. Magenepithelzellen exprimieren, genauso wie Darmepithelzellen, eine Reihe von TOLL-like Rezeptoren (TLRs) und ähnliche Musterekennungsrezeptoren, die wichtig für die Aktivierung des angeborenen Immunsystems sind. Bakterielle Komponenten, wie z. B. Lipopeptide, Peptidoglycan, LPS, Flagellin und CpG-DNA sind die Liganden der TLRs. Auf diese Weise könnten die TLRs in den Magenepithelzellen in der Lage sein, zu der angeborenen Immunreaktion auf eine H. pylori-Infektion beizutragen. Jedoch ist bisher nur wenig über die Mechanismen der angeborenen Immunreaktion auf eine akute und chronische H. pylori-Infektion bekannt. Diese Studie befasst sich mit den Zellinteraktionen mit und den Antworten des Wirtsimmunsystems auf H. pylori-Flagelline, stark exprimierte Proteine des Flagellenapparats. Der Flagellenapparat ist essentiell für die Fähigkeit der Bakterien, im Magenschleim (Mukus) beweglich zu sein, und befähigt die Bakterien dazu, während des gesamten Infektionszyklus im Mukus und an der Magenmukosa zu überleben. Flagellin ist für viele pathogene Bakterien im Intestinaltrakt oder auch in der Lunge des Säuger-Wirts ein sehr wichtiger Faktor, der durch Bindung an TLR5 proinflammatorische Signalvorgänge, einschließlich der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-B, herbeiführt. Im ersten Teil der vorliegenden Studie haben wir die Wirkungen von H. pylori-Flagellinen (FlaA, FlaB) auf TLR5-Expression, NF-B-Aktivierung und IL-8-Produktion in verschiedenen menschlichen Darm- und Magenepithelzelllinien mittels Western Blot, semi-quantitativer RT-PCR und ELISA untersucht. IL-8 ist ein hochwirksames Neutrophilen-aktivierendes Chemokin, welches von den Magenepithelzellen sezerniert wird und als ein Marker für die Zellaktivierung durch H. pylori, seine löslichen Produkte und Kontrollen diente. Nach Stimulation verschiedener Epithelzellen und humaner Makrophagen mit nativen oder in E. coli rekombinant hergestellten H. pylori-Flagellinen FlaA und FlaB wurde in keinem Fall IL-8 gebildet, während S. typhimurium-Flagellin (FliC) IL-8-Bildung und -Sekretion in signifikanter Menge induzierte. H. pylori war in der Lage, TLR5-Protein-Expression und die NF-B-Aktivierung in Epithelzellen zu modulieren, unabhängig von dem Vorhandensein von Flagellinen. Nachdem wir gezeigt hatten, dass H. pylori-Flagelline ungewöhnlich geringe immunstimulierende Eigenschaften besitzen, setzten wir unsere Untersuchungen fort, um mögliche Gründe herauszufinden, warum H. pylori-Flagelline sich von anderen Flagellinen pathogener Bakterien hinsichtlich der das Immunsystem stimulierenden Aktivitäten unterscheiden. Bei Vergleichen von Aminosäuresequenzen fanden wir heraus, dass einige Regionen in den terminalen D0D1-Domänen der H. pylori-Flagelline sich von Flagellinen anderer pathogener Bakterien unterscheiden. D0D1 ist der Funktionsbereich des Flagellins, von dem bekannt ist, dass er bei Salmonellen-FliC mit TLR5 interagiert. Um zu untersuchen, ob diese Unterschiede für die geringe immunstimulierende Wirkung von H. pylori-Flagellinen verantwortlich sind, generierten wir durch eine zielgerichtete Mutagenese mehrere mutierte H. pylori-Flagelline (FlaA und FlaB), die ein bis vier Epitope der Aminosäuresequenzen der D0D1-Domäne des Salmonella-Flagellins enthielten. Die mutierten Flagelline, die sowohl in H. pylori als auch in E. coli exprimiert wurden, wurden genutzt, um ihren Einfluss auf TLR5-Signal-Mediatoren und Cytokine, wie z. B. MAP-Kinasen (ERK, p38), NF-B, IL-8 und MIP-3α herauszufinden. In E. coli exprimiertes Salmonella-FliC bewirkte die Aktivierung von p38, IB, NF-B und ERK und führte zur Produktion von IL-8 und MIP-3α in den Magenepithelzellen. Im Gegensatz dazu aktivierte keine der H. pylori-Flagellinmutanten MAP-Kinasen oder induzierte diese Cytokine. Wir konnten durch Koimmunpräzipitationstechniken zeigen, dass wildtypische oder mutierte H. pylori-Flagelline nicht physisch mit TLR5 interagieren, während Salmonella-FliC spezifisch an TLR5 bindet. Interessanterweise fanden wir heraus, dass H. pylori-Flagelline wie FliC an die Oberfläche verschiedener humaner Epithelzellen binden, obwohl sie nicht TLR5 stimulieren oder an TLR5 binden. Basierend auf der physischen Interaktion von H. pylori-Flagellinen und FliC mit menschlichen Magenepithelzellen haben wir weiterhin die Transkriptionsregulation durch H. pylori-Flagellin in den Wirtszellen mit Hilfe der Microarray-Analyse untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass H. pylori-Flagelline die Gene der Wirtszelle modulieren, und viele der identifizierten Regulationsereignisse überschnitten sich mit den durch FliC regulierten Genen. Diese Ergebnisse implizieren, dass H. pylori-Flagelline doch eine Rolle bei der Genregulierung von Wirtszellen spielen, wahrscheinlich durch noch unbekannte Faktoren und Rezeptoren, obwohl sie keine mit TLR5 in Zusammenhang stehenden Signaltransduktionsketten auslösen. Die Resultate unserer Studien lassen darauf schließen, dass zusätzlich zu der das Immunsystem nur gering stimulierenden Aktivität von H. pylori-LPS die evolutionäre Reduzierung der stimulierenden Aktivität von H. pylori-Flagellinen auf lokale angeborene Immunreaktionen im Magen in vivo eine weitere Strategie dieses chronischen Schleimhautpathogens sein könnte, um schädliche Wirtsreaktionen zu verhindern und zu minimieren und hierdurch seine lebenslange Persistenz, jedoch auch die Krebsentstehung im Wirt zu fördern.
KW  - Helicobacter pylori
KW  - TLR5
KW  - Helicobacter
KW  - Flagellin
KW  - angeborene Immunität
KW  - TLR5
KW  - Helicobacter
KW  - Flagellin
KW  - Innate immunity
Y1  - 2006
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-19917
ER  - 
TY  - THES
A1  - Konrad, Christian
T1  - Molecular analysis of insulin signaling mechanisms in Echinococcus multilocularis and their role in the host-parasite interaction in the alveolar echinococcosis
T1  - Molekulare Analyse der Insulin-Signalmechanismen in Echinococcus multilocularis und ihre Rolle in der Wirt-Parasiten-Interaktion in der Alveolären Echinokokkose
N2  - The insulin receptor ortholog EmIR of the fox-tapeworm Echinococcus multilocularis displays significant structural homology to the human insulin receptor (HIR) and has been suggested to be involved in insulin sensing mechanisms of the parasite’s metacestode larval stage. In the present work, the effects of host insulin on Echinococcus metacestode vesicles and the proposed interaction between EmIR and mammalian insulin have been studied using biochemical and cell-biological approaches. Human insulin, exogenously added to in vitro cultivated parasite larvae, (i) significantly stimulated parasite survival and growth, (ii) induced DNA de novo synthesis in Echinococcus, (iii) affected overall protein phosphorylation in the parasite, and (iv) specifically induced the phosphorylation of the parasite’s Erk-like MAP kinase orthologue EmMPK1. These results clearly indicated that Echinococcus metacestode vesicles are able to sense exogenous host insulin which induces a mitogenic response. To investigate whether EmIR mediates these effects, anti-EmIR antibodies were produced and utilized in biochemical assays and immunohistochemical analyses. EmIR was shown to be expressed in the germinal layer of the parasite both on the surface of glycogen storing cells and undifferentiated germinal cells. Upon addition of exogenous insulin to metacestode vesicles, the phosphorylation of EmIR was significantly induced, an effect which was suppressed in the presence of specific inhibitors of insulin receptor-like tyrosine kinases. Furthermore, upon expression of EmIR/HIR receptor chimera containing the extracellular ligand binding domain of EmIR in HEK 293 cells, a specific autophosphorylation of the chimera could be induced through the addition of exogenous insulin. These results indicated the capability of EmIR to sense and to transmit host insulin signals to the Echinococcus signaling machinery. The importance of insulin signaling mechanisms for parasite survival and growth were underscored by in vitro cultivation experiments in which the addition of an inhibitor of insulin receptor tyrosine kinases led to vesicle degradation and death. Based on the above outlined molecular data on the interaction between EmIR and mammalian insulin, the parasite’s insulin receptor orthologue most probably mediates the insulin effects on parasite growth and is, therefore, a potential candidate factor for host-parasite communication via evolutionary conserved pathways. In a final set of experiments, signaling mechanisms that act downstream of EmIR have been analyzed. These studies revealed significant differences between insulin signaling in Echinococcus and the related cestode parasite Taenia solium. These differences could be associated with differences in the organo-tropism of both species.
N2  - Der orthologe Insulinrezeptor EmIR des Fuchsbandwurmes Echinococcus multilocularis weist signifikante strukturelle Homologie zum humanen Insulinrezeptor (HIR) auf. Es wurde schon seit geraumer Zeit vermutet, dass EmIR an den Mechanismen beteiligt sein könnte, die es dem Metacestoden Larvenstadium des Parasiten erlauben Insulin zu detektieren. In dieser Arbeit wurden die Effekte von Wirtsinsulin auf Echinococcus Metacestoden-Vesikel und die vermutete Interaktion zwischen EmIR und Insulin von Säugern mittels biochemischer und zellbiologischer experimenteller Ansätze untersucht. Die exogene Zugabe von humanem Insulin zu in vitro kultivierten Parasitenlarven hatte folgende Effekte: (i) das Überleben und das Wachstum des Parasiten wurde signifikant stimuliert; (ii) die DNA de novo Synthese in Echinococcus wurde induziert; (iii) die generelle Proteinphosphorylierung des Parasiten wurde beeinflusst; (iv) die Phosphorylierung der orthologen Erk-like MAP Kinase, EmMPK1, des Parasiten wurde spezifisch induziert. Diese Beobachtungen zeigen deutlich, dass Echinococcus Metacestoden-Vesikel exogenes Insulin des Wirtes detektieren können und dass dieses Insulin einen mitogenischen Effekt auf den Parasiten hat. Um zu untersuchen, ob diese Effekte durch EmIR vermittelt werden, wurden anti-EmIR Antikörper hergestellt und in biochemischen experimentellen Ansätzen und immunohistochemischen Analysen eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass EmIR in der Germinalschicht des Parasiten expremiert wird, sowohl an der Oberfläche von Glykogen-Speicherzellen als auch von undifferenzierten Germinalzellen. Nach der Zugabe von exogenem Insulin konnte eine signifikante Zunahme der Phosphorylierung von EmIR festgestellt werden. Diese Stimulierung konnte durch die Zugabe eines spezifischen Inhibitors für Insulinrezeptor-ähnliche Tyrosinkinasen unterdrückt werden. Desweiteren konnte mittels der Expression eines chimären EmIR/HIR-Rezeptors, der die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne von EmIR enthielt, in HEK293 Zellen gezeigt werden, dass die Zugabe von exogenem Insulin eine spezifische Autophosphorylierung der Chimäre induziert. Diese Ergebnisse bezeugen die Fähigkeit von EmIR Insulin-abhängige Signale des Wirtes einerseits zu detektieren und andererseits an die Echinococcus Signalwege weiter zu leiten. Die Bedeutung von Insulin-Signalmechanismen für das Überleben und das Wachstum des Parasiten konnte durch in vitro Kultivierungsexperimente aufgezeigt werden. Die Zugabe eines Inhibitors spezifisch für Insulinrezeptor Tyrosinkinasen verursachte die Degradation und den Tod der Metacestoden-Vesikel. Basierend auf den dargelegten molekularen Daten bezüglich der Interaktion zwischen EmIR und Insulin von Säugern erscheint es sehr wahrscheinlich, dass der orthologe Insulinrezeptor des Parasiten die Effekte von Insulin auf das Wachstum des Parasiten vermittelt. Aus diesem Grund ist EmIR ein potentieller Kandidat für die Kommunikation zwischen Wirt und Parasiten mittels evolutionär konservierten Signalwegen. Die Signalmechanismen unterhalb von EmIR wurden in abschließenden Experimenten untersucht. Diese offenbarten deutliche Unterschiede in der Weiterleitung von Insulin induzierten Signalen zwischen Echinococcus und dem verwandten parasitären Zestoden Taenia solium. Diese Unterschiede könnten mit dem unterschiedlichen Organtropismus beider Arten in Verbindung stehen.
KW  - Fuchsbandwurm
KW  - Insulin
KW  - Echinokokkus
KW  - Insulin
KW  - Helminth
KW  - EmERK
KW  - Echinococcus
KW  - insulin
KW  - helminth
KW  - EmERK
Y1  - 2007
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-22636
ER  - 
TY  - THES
A1  - Swiderek, Halina
T1  - Typing and genome comparison of Neisseria meningitidis by DNA-microarrays
T1  - Typisierung und Genom-Vergleich of Neisseria meningitidis mit DNA-microarrays
N2  - In the present thesis, two projects on the use of microarray technology for molecular epidemiology of Neisseria meningitidis have been followed. The first one evaluated microarrays based on polymorphism-directed oligonucleotide design for typing of N. meningitidis adopting the multilocus sequence typing (MLST) concept. The number of oligonucleotides needed to cover all known polymorphisms was much lower compared to the number needed if a tiling strategy would have been chosen. Initial experiments using oligonucleotides 28-32 nucleotides in length, revealed that the applied hybridisation protocols were highly specific. However, despite of several optimisation steps, the rate of misidentification of oligonucleotides remained >1.8% in consecutive validation experiments using arrays representing the genetic diversity at three MLST loci. This finding led to the assumption that the high density of polymorphic sites and extensive GC-content variations at N. meningitidis MLST loci hindered the successful implementation of MLST microarrays based on polymorphism-directed oligonucleotide design. In the 1980s, the ET-15 clone emerged within the ST-11 complex of N. meningitidis. This new clone was associated with severe meningococcal disease and outbreaks world-wide. Therefore, the goal of the second project was to identify genetic differences between ET-15 strains and other ST-11 strains using whole genome microarray technology. Three genes encoding hypothetical proteins were identified to be present in all ET-15 strains but absent in other ST-11 strains. This finding together with unpublished observation from our group suggested that several genome alterations occurred before the clonal expansion of the ET-15 clone started. The role that these three genes play in the pathogenicity of the ET-15 clone is unclear. The genome comparisons revealed furthermore that studies of the ET-15 clone displayed approximately two-fold less gene content variation than ST-11 strains not belonging to the ET-15 clone. This finding is in accordance with the recent emergence and clonal expansion of the ET-15 variant.
N2  - In der vorliegenden Doktorarbeit wurden zwei Projekte zum Einsatz der microarray-Technologie in der molekularen Epidemiologie von Neisseria meningitidis bearbeitet. Im Rahmen des ersten Projektes wurde die Einsatzmöglichkeit der microarray-Technologie unter Verwendung von Oligonukleotiden, die von bekannten Polymorphismen abgeleitet waren, für die Typisierung von N. meningitidis nach dem Prinzip der Multilokus-Sequenztypisierung (MLST) untersucht. Um alle bekannten Polymorphismen abzudecken, wurde im Vergleich zu der so genannten tiling-Methode eine deutlich geringere Anzahl an Oligonukleotiden benötigt. Vorversuche mit Oligonukleotiden einer Länge von 28-32 Nukleotiden zeigten, dass unter den angewandten Hybridisierungsbedingungen eine hohe Spezifität erzielt werden konnte. Dennoch lag die durchschnittliche Fehlidentifikationsrate der Oligonukleotide von microarrays, die die genetische Diversität von drei MLST-Loci repräsentierten, trotz mehrerer Optimierungsschritte der Oligonukleotide über 1,8%. Es ist anzunehmen, dass die hohe Dichte an Polymorphismen und die große Variation des GC-Gehaltes der MLST-Loci von N. meningitidis den erfolgreichen Einsatz eines MLST-microarrays mit Oligonukleotiden, die von bekannten Polymorphismen abgeleitet waren, verhinderten. In den achtziger Jahren des letzten Jahrhunderts tauchte der ET-15-Klon als Abkömmling des Sequenztyp (ST-) 11-Komplexes von N. meningitidis auf. Dieser neue Klon ist assoziiert mit schweren Meningokokkenerkrankungen und weltweiten Erkrankungsausbrüchen. Deshalb war es das Ziel des zweiten Projektes dieser Arbeit, genetische Unterschiede zwischen ET-15-Stämmen und anderen ST-11-Stämmen mit Hilfe von Gesamtgenom-microarrays zu identifizieren. Drei Gene, die hypothetische Proteine kodieren, waren in allen ET-15-Stämmen vorhanden, während sie in den anderen ST-11-Stämmen fehlten. Dieses Ergebnis, zusammen mit weiteren bisher nicht publizierten Beobachtungen aus unserer Arbeitsgruppe, deutet daraufhin, dass vor der klonalen Ausbreitung des ET-15-Klons mehrere Veränderungen im Genom auftraten. Die Bedeutung dieser drei Gene für die Pathogenität des ET-15-Klons ist unklar. Die Genomvergleiche zeigten weiterhin, dass Stämme des ET-15-Klons eine nur halb so große genetische Variabilität aufwiesen wie die ST-11-Stämme, die nicht zum ET-15-Klon gehörten. Dieses Ergebnis steht in Einklang mit der erst kürzlich erfolgten klonalen Expansion der ET-15-Meningokokken.
KW  - Neisseria meningitis
KW  - Typisierung
KW  - Genanalyse
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - MLST
KW  - Typisierung
KW  - Genom-Vergleich
KW  - ET-15 clone
KW  - Neisseria meningitidis
KW  - MLST
KW  - typing
KW  - genome comparison
KW  - ET-15 clone
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-13374
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ye, Fang
T1  - The role of DNA supercoiling in the coordinated regulation of gene expression in Helicobacter pylori
N2  - Summary Mechanisms of global gene regulation in bacteria are not well characterized yet. Changes in global or local supercoiling of chromosomal DNA are thought to play a role in global gene silencing and gene activation. In Helicobacter pylori, a bacterium with few dedicated transcriptional regulators, the structure of some promoters indicates a dependency on DNA topology. For example, the promoter of the major flagellar subunit gene flaA (ó28-dependent) has a shorter spacing of 13 nucleotides (nt) in comparison to the consensus promoter (15 nt). Supercoiling changes might be a mechanism of gene-specific and global transcriptional regulation in this bacterium. The aim of this study was to elucidate, if changes in global supercoiling have an influence on global gene regulation in H. pylori, and on the temporal regulation of the flagellar biosynthesis pathway in this organism. In the present work, global DNA supercoiling in H. pylori was visualized for the first time, by determining the supercoiling state of plasmids under different growth conditions. Using this method, we showed that cellular supercoiling was clearly growth phase-dependent in H. pylori. Coinciding with increased supercoiling during the growth phases, transcription of the flaA gene was increased, while the transcription of a second ó28-dependent gene with regular promoter spacing (HP0472) was reduced, supporting the hypothesis that growth phase-dependency of promoters might be mediated by changes of DNA topology. Supercoiling in H. pylori could be influenced in a reproducible fashion by inhibition of gyrase using novobiocin, which led to DNA relaxation and to a concomitant decrease of flaA transcript levels. Promoter spacer mutagenesis of the flaA promoter was performed. With flaA promoters of increased or reduced length, transcription of flaA was reduced, less susceptible to supercoiling changes, and, under specific conditions, inverted as compared to the wild type promoter. Transcriptional interdependence between the coupled topA-flaB genes and flaA was found by analysis of the flaA promoter mutants. Chromosomally linked gyrA-flgR, and topA-flaB genes were all dependent on supercoiling and coregulated with each other. Comprehensive transcript profiling (DNA microarrays) of wildtype H. pylori with and without novobiocin treatment identified a number of genes (10% of total genes), including flagellin, virulence and housekeeping genes, which were strongly dependent on and appeared to be synchronized by supercoiling changes (transcriptional up- or downregulation). These findings indicate a tightly coupled temporal regulation of flagellar biogenesis and metabolism in H. pylori, dependent on global supercoiling. A specific group of genes was also regulated in H. pylori by overexpression of Topoisomerase I, as detected by genome-wide analysis (DNA microarray). The DNA-bending protein HU is thought to be responsible for influencing the negative supercoiling of DNA, through its ability to wrap DNA. HU is encoded by the hup single gene in H. pylori, and constitutively expressed during the whole growth curve. An H. pylori hup mutant was constructed. H. pylori cells lacking HU protein were viable, but exhibited a severe growth defect. Our data indicate that the lack of HU dramatically changes global DNA supercoiling, indicating an important function of HU in chromosome structuring in H. pylori. Transcriptome analyses were performed and demonstrated that a total of 66 genes were differentially transcribed upon hup deletion, which include virulence genes and many other cell functions. The data indicate that HU might act as further important global regulator in H. pylori. Increased gene expression of heat shock proteins and a decreased transcription of the urease gene cluster may indicate a co-ordinated response of H. pylori to changes of environmental conditions in its specific ecological niche, mediated by HU. After the whole genomic sequences of H. pylori strains 26695 and J99 were published, two ORFs (HP0116 and HP0440) were presumptively annotated as topoisomerase I orthologs. HP0116 is the functional H. pylori topoisomerase I (TopA). HP0440 (topA2) was found in only few (5 of 43) strains. Western blot analysis indicated that TopA2 is antigenically different from TopA. TopA2 is transcribed in H. pylori, but the protein must be functionally different from TopA, since it is lacking one functionally essential zinc finger motif, and was not able to functionally complement a TopA-deficient E. coli. Like topA, topA2 was also transcribed in a growth phase-dependent manner. We did not find a function of TopA2 in DNA structuring or topology, but, in the present study, we were able for the first time to establish a unique function for TopA2 in global gene regulation, by comprehensive transcriptome analysis (DNA microarray). Transcriptome analysis showed that a total of 46 genes were differentially regulated upon topA2 deletion, which included flagellar genes and urease genes. These results suggest that TopA2 might act as a novel important regulator of both flagellar biosynthesis and urease in H. pylori.
N2  - Zusammenfassung Die Mechanismen der globalen Kontrolle der Genregulation bei Bakterien sind bisher noch wenig charakterisiert. Unterschiede in der globalen oder lokalen Topologie der chromosomalen DNA spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der globalen Kontrolle der Genexpression. Bei Helicobacter pylori, einem Bakterium mit wenigen funktionell definierten Transkriptionsregulatoren, spricht die Struktur einiger Promotoren dafür, daß sie durch die DNA-Topologie kontrolliert werden. Der Promotor des Hauptflagellingens flaA, ein Sigma-28 abhängiger Promotor, hat ein gegenüber dem Konsensuspromotor (15 Nukleotide) verkürztes Spacing von 13 Nukleotiden. Veränderungen der DNA-Superhelizität könnten ein Mechanismus der genspezifischen und globalen transkriptionellen Kontrolle in diesem Bakterium sein. Ziel dieser Untersuchungen war es zu zeigen, ob Veränderungen des globalen Supercoiling-Niveaus einen Einfluß auf die globale Genregulation von H. pylori haben und ob sie sich auf die zeitlich gesteuerte Regulation der Geißelbiosynthese (Beweglichkeitsorganell; essenzieller Virulenz- und Persistenzfaktor von H. pylori) in diesem Organismus auswirkt. In der vorliegenden Arbeit wurde das Niveau der DNA-Superspiralisierung bei H. pylori erstmals durch Visualisierung des Supercoilingzustands von Plasmiden unter unterschiedlichen Wachstumsbedingungen dargestellt. Wir konnten mit dieser Methode zeigen, daß das zelluläre Supercoiling-Niveau bei H. pylori in Abhängigkeit von der Wachstumsphase stark variiert. In Wachstumsphasen mit erhöhtem Supercoiling war auch die Transkription des flaA-Gens erhöht, während die Transkription eines zweiten Sigma-28-abhängigen Gens mit normalem Promotorabstand (HP0472) reduziert war. Dieser Befund stützte die Hypothese, daß die wachstumsphasenabhängige Aktivität dieser Promotoren durch Veränderungen der DNA-Topologie bewirkt wird. Das Supercoiling-Niveau konnte reproduzierbar durch Hemmung der Gyrase mit Novobiocin beeinflusst werden. Die Gegenwart von Novobiocin führte zur DNA-Relaxation und zu einem gleichzeitigen Absinken der Transkription von flaA. Es wurde eine gerichtete Mutagenese der Promotor-Spacer-Region des flaA-Promotors durchgeführt. Die Verlängerung oder Verkürzung des H.pylori flaA-Promotors führte zu einer verminderten Transkription von flaA, sowie zu reduzierter Empfindlichkeit der Promotoraktivität gegenüber Veränderungen des Supercoiling-Niveaus. Unter spezifischen Bedingungen war die Supercoiling-Abhängigkeit umgekehrt im Vergleich zum Wildtyppromotor. Es konnte weiterhin eine inverse transkriptionelle Abhängigkeit zwischen dem gekoppelten Genpaar topA-flaB und flaA durch Analyse der flaA-Promotormutanten nachgewiesen werden. Auch die chromosomal gekoppelten Gene gyrA und flgR sowie topA und flaB waren abhängig vom Supercoiling-Zustand und miteinander koreguliert. Die Analyse des Transkriptoms von H.pylori-Wildtypbakterien mit DNA-Microarrays mit und ohne Novobiocinbehandlung führte zur Identifizierung von zahlreichen Genen (etwa 10% des Gesamttranskriptoms), deren Expression Supercoiling-abhängig war und durch Veränderungen des Supercoilings synchronisiert verändert werden konnte. Unter diesen waren Flagellin-, andere Virulenz-, sowie Grundstoffwechsel-Gene. Diese Befunde weisen auf eine enge Verbindung zwischen der chronologischen Kontrolle der Flagellen-Biogenese und des Metabolismus bei H. pylori, die gemeinsam durch das Supercoiling-Niveau gesteuert werden. Eine definierte Gruppe von Genen konnte bei H.pylori durch Überexpression von Topoisomerase-1 reguliert werden. Das Protein HU beeinflusst ebenfalls das Supercoiling-Niveau von DNA durch seine Fähigkeit, DNA zu biegen. HU wird bei H. pylori durch das Gen hup kodiert und ist während sämtlicher Wachstumsphasen konstitutiv exprimiert. Eine HU-defiziente Mutante wurde konstruiert. Zellen, die kein HU-Protein exprimierten, waren lebensfähig, zeigten aber einen deutlichen Wachstumsdefekt. Unsere Daten weisen daraufhin, daß der Mangel von HU sich dramatisch auf das globale DNA-Supercoiling-Niveau auswirkt, und sprechen für eine wichtige Funktion von HU bei der Kontrolle der DNA-Struktur von H. pylori. Mittels DNA-Microarray-Hybridisierung wurden die Transkriptome von H. pylori-Wildtyp und HU-Mutante miteinander verglichen. Die Ergebnisse zeigen, daß insgesamt 66 Gene in der HU-Mutante differentiell transkribiert werden, darunter Virulenzgene und Gene für viele andere Zellfunktionen. Diese Daten deuten darauf hin, daß auch HU eine wichtige Rolle in der Kontrolle der globalen Genexpression bei H. pylori spielt. Die erhöhte Expression von Hitzestress-Proteinen, verbunden mit einer verminderten Transkription des Ureasegenclusters, könnte auf eine koordinierte Antwort der Bakterien auf Veränderungen der Umweltbedingungen in ihrer spezifischen ökologischen Nische hinweisen. Nach der Publikation der Gesamtgenomsequenzen von H.pylori 26695 und J99 wurden 2 ORFs (HP 0116 und HP 0440) als Topoisomerase-1-Orthologe annotiert. HP 0116 ist das funktionelle H.pylori Topoisomerase-1-Gen. HP 0442 (topA2) wurde nur in wenigen (5 aus 43) Stämmen nachgewiesen. topA2 ist trotz seines seltenen Vorkommens kein Pseudogen und wird in H.pylori transkribiert. Westernblot-Analysen sprechen dafür, daß TopA2 sich antigenetisch von TopA unterscheidet. Das TopA2-Protein unterscheidet sich ebenfalls funktionell von TopA, da ihm ein funktionell essentielles Zinkfingermotiv fehlt. TopA2 konnte außerdem eine TopA-defiziente E.coli-Mutante nicht funktionell komplementieren. Wie bei topA war auch die Transkription von topA2 von der Wachstumsphase abhängig. Eine Funktion von TopA2 bei der Kontrolle der DNA-Topologie konnte bisher nicht nachgewiesen werden, Transkriptomanalysen zeigten aber, dass TopA2 eine klare Regulationsfunktion hat, da die topA2-Mutante gravierende Veränderungen des Transkriptoms gegenüber dem Wildtyp aufwies. Diese Untersuchungen zeigten, daß 46 Gene in der TopA2-Mutante differentiell reguliert wurden, darunter Flagellengene und Ureasegene. Die Ergebnisse sprechen dafür, daß TopA2 ein weiterer wichtiger Regulator von sowohl Flagellenbiosynthese als auch Ureasebildung bei H.pylori sein könnte.
KW  - Helicobacter pylori
KW  - Genexpression
KW  - Flagelline
KW  - Supercoiling
KW  - regulation
KW  - flagella
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9878
ER  -