TY  - THES
A1  - Biswas, Kajal
T1  - Analysis of Nitrogen starvation induced filamentous growth and characterization of putative essential genes in the human fungal pathogen, Candida albicans
N2  - 1. Zusammenfassung Candida albicans ist ein opportunistisch pathogener Hefepilz, der sowohl oberflächliche Infektionen der Schleimhaut als auch lebensbedrohliche systemische Infektionen hervorrufen kann. Obwohl die Fähigkeit von C.albicans Infektionen auszulösen weitgehend vom Immunstatus des Wirts abhängt, besitzt der Pilz doch auch spezifische Eigenschaften, die eine Kolonisierung, Disseminierung und Anpassung an unterschiedliche Wirtsnischen ermöglichen und ihn vom harmlosen Kommensalen zum gefährlichen Krankheitsserreger werden lassen. Unter bestimmten Umweltbedingungen geht C.albicans vom Wachstum als sprossende Hefe zum invasiven, filamentösen Wachstum über, das eine wichtige Rolle in der Pathogenität des Pilzes spielt. Stickstoffmangel ist eines der Signale, die das filamentöse Wachstum in C.albicans induzieren, und die Kontrolle der Morphogenese durch die Verfügbarkeit von Stickstoff wurde in dieser Arbeit detailliert untersucht. Ammonium ist für Hefepilze eine bevorzugte Stickstoffquelle, die über spezifische Transporter in die Zelle aufgenommen wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass C.albicans zwei Ammoniumpermeasen besitzt, deren Expression durch Stickstoffmangel induziert wird. Während die Deletion von CaMEP1 oder CaMEP2 keinen Einfluss auf das Wachstum bei limitierenden Ammoniumkonzentrationen hatte, konnten mep1 mep2 Doppelmutanten bei Ammoniumkonzentrationen unter 5 mM nicht mehr wachsen. Im Gegensatz zu mep1 Mutanten bildeten mep2 Mutanten unter Stickstoffmangel keine Hyphen mehr und wuchsen ausschließlich in der Hefeform. CaMep2p hat also nicht nur eine Funktion als Ammoniumtransporter, sondern spielt auch eine Rolle bei der Induktion des filamentösen Wachstums. Weitere Experimente zeigten, dass CaMep2p ein weniger effizienter Ammoniumtransporter als CaMep1p ist, dafür aber stärker exprimiert wird, und dass dieser Unterschied wichtig für die Signalfunktion von CaMep2p ist. Durch Deletionsanalysen konnte bewiesen werden, dass die C-terminale, cytoplasmatische Domäne von CaMep2p essentiell für die Induktion des Hyphenwachstums ist, für den Ammoniumtransport jedoch nicht benötigt wird, und diese beiden Funktionen von CaMep2p daher voneinander getrennt werden können. In C.albicans gibt es mindestens zwei Signalwege die das filamentöse Wachstum steuern, eine MAP-Kinase-Kaskade und einen cAMP-abhängigen Signalweg, die in den Transkriptionsfaktoren Cph1p bzw. Efg1p enden. Bei Inaktivierung des einen oder des anderen Signalwegs induziert Stickstoffmangel kein filamentöses Wachstum mehr. Ein hyperaktives CaMEP2 Allel konnte den filamentösen Wachstumsdefekt sowohl von cph1 als auch efg1 Mutanten aufheben, nicht jedoch den einer cph1 efg1 Doppelmutante oder einer Mutante, der das G-Protein Ras1p fehlte, das beide Signalwege aktiviert. Umgekehrt wurde der filamentöse Wachstumsdefekt von mep2 Mutanten durch ein dominant-aktives RAS1 Allel bzw. durch die Zugabe von cAMP aufgehoben. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass CaMep2p bei Stickstoffmangel sowohl den MAP-Kinase- als auch den cAMP-abhängigen Signalweg aktiviert, um filamentöses Wachstum zu induzieren. In genügend hohen Konzentrationen reprimierte Ammonium das filamentöse Wachstum selbst wenn die Signalwege artifiziell aktiviert waren. Die bevorzugte Stickstoffquelle Ammonium ist deshalb ein Inhibitor der Morphogenese, der durch denselben Transporter in die Zelle aufgenommen wird, der bei Stickstoffmangel das filamentöse Wachstum von C.albicans induziert. Obwohl ein genaues Verständnis der Virulenzmechanismen von C.albicans auch neue Ansätze zur Bekämpfung von Infektionen durch diesen Pilz liefern kann, ist doch die Identifizierung und Charakterisierung von essentiellen Genen als potentielle Ziele für die Entwicklung neuer Antimykotika eine Strategie, die von der pharmazeutischen Industrie favorisiert wird. Aus diesem Grund wurden in Zusammenarbeit mit einem Industriepartner drei Gene von C.albicans ausgewählt, die in anderen Pilzen als essentiell beschrieben wurden, und im Rahmen dieser Arbeit funktionell charakterisiert. RAP1 codiert für das Repressor/Aktivator Protein 1, ein Transkriptionsfaktor und Telomerbindeprotein, das in der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae essentiell ist. Die Deletion des RAP1 Gens in C.albicans beeinträchtigte jedoch nicht die Lebensfähigkeit der Mutanten, so dass RAP1 kein vielversprechendes Ziel darstellt. CBF1 (centromere binding factor 1) ist in S.cerevisiae wichtig für die korrekte Chromosomenverteilung während der Mitose und außerdem auch für die transkriptionelle Aktivierung der Methioninbiosynthesegene; in den verwandten Hefen Kluyveromyces lactis und Candida glabrata ist CBF1 sogar essentiell. C.albicans cbf1 Mutanten wiesen jedoch keinen erhöhten Chromosomenverlust auf, so dass CBF1 hier offensichtlich keine Rolle bei der Chromosomensegregation spielt. Allerdings waren die Mutanten auxotroph für schwefelhaltige Aminosäuren und generell stark im Wachstum beeinträchtigt, was zeigte, dass Cbf1p für das normale Wachstum von C.albicans wichtig ist. YIL19 ist in S.cerevisiae ein essentielles Gen und hat eine Funktion bei der Reifung der 18S rRNA. YIL19 stellte sich auch in C.albicans als essentiell heraus. Konditionale Mutanten, in denen YIL19 durch induzierbare, FLP-vermittelte Rekombination aus dem Genom deletiert wurde, waren nicht lebensfähig und akkumulierten rRNA Vorstufen. Durch diese Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass YIL19 essentiell für diesen wichtigen zellulären Prozess und für die Lebensfähigkeit von C.albicans ist und sich möglicherweise als Ziel für die Entwicklung antifungaler Substanzen eignet.
N2  - 1. Summary Candida albicans is an opportunistic human fungal pathogen that causes a variety of infections, ranging from superficial mucosal to deep-seated systemic infections, especially in immunocompromised patients. Although the ability of C.albicans to cause disease largely depends on the immune status of the host, the fungus also exhibits specific characteristics that facilitate colonization, dissemination, and adaptation to different host niches and thereby turn C.albicans from a harmless commensal to an aggressive pathogen. In response to various environmental stimuli C.albicans switches from growth as a budding yeast to invasive filamentous growth, and this morphogenetic switch plays an important role in C.albicans pathogenesis. Nitrogen limitation is one of the signals that induce filamentous growth in C.albicans, and the control of the morphogenetic transition by nitrogen availability was studied in detail in the present work. Ammonium is a preferred nitrogen source for yeasts that is taken up into the cells by specific transporters. It was found in this study that C.albicans possesses two major ammonium transporters, encoded by the CaMEP1 and CaMEP2 genes, expression of which is induced by nitrogen starvation. Whereas mep1 or mep2 single mutants grew as well as the wild-type strain on limiting concentrations of ammonium, deletion of both transporters rendered C.albicans unable to grow at ammonium concentrations below 5 mM. In contrast to mep1 mutants, mep2 mutants failed to filament and grew only in the yeast form under nitrogen starvation conditions, indicating that in addition to its role as an ammonium transporter CaMep2p also has a signaling function in the induction of filamentous growth. CaMep2p was found to be a less efficient ammonium transporter than CaMep1p and to be expressed at much higher levels, a distinguishing feature important for its signaling function. By the construction and analysis of serially truncated versions of CaMep2p, the C-terminal cytoplasmic tail of the protein was shown to be essential for signaling but dispensable for ammonium transport, demonstrating that these two functions of CaMep2p are separable. In C.albicans at least two signal transduction pathways, a MAP kinase cascade and a cAMP-dependent pathway ending in the transcriptional regulators Cph1p and Efg1p, respectively, control filamentous growth, and mutants defective in either one of these pathways are defective for filamentation under nitrogen starvation conditions. A hyperactive CaMEP2 allele rescued the filamentation defect of a cph1 or a efg1 mutant, but not of a cph1 efg1 double mutant or a mutant deleted for RAS1, which acts upstream of and activates both signaling pathways. Conversely, a dominant active RAS1 allele or addition of exogenous cAMP rescued the filamentation defect of mep2 mutants. These results suggest that CaMep2p activates both the MAP kinase and the cAMP pathway in a Ras1p dependent manner to promote filamentous growth under nitrogen starvation conditions. At sufficiently high concentrations, ammonium repressed filamentous growth even when the signaling pathways were artificially activated. Therefore, C.albicans has established a regulatory circuit in which a preferred nitrogen source, ammonium, serves as an inhibitor of morphogenesis that is taken up into the cell by the same transporter that induces filamentous growth in response to nitrogen starvation. Although a detailed understanding of virulence mechanisms of C.albicans may ultimately lead to novel approaches to combat infections caused by this pathogen, the identification and characterization of essential genes as potential targets for the development of antifungal drugs is a strategy favoured by most pharmaceutical companies. Therefore, C.albicans homologs of three genes that are essential in other fungi were selected in collaboration with an industrial partner and functionally characterized in this work. RAP1 encodes the repressor/activator protein 1, a transcription factor and telomere binding protein that is essential for viability in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. However, deletion of the C.albicans RAP1 homolog did not affect viability or growth of the mutants, suggesting that it is not a promising target. CBF1 (centromere binding factor 1) is necessary for proper chromosome segregation and transcriptional activation of methionine biosynthesis genes in S.cerevisiae and is essential for viability in the related yeasts Kluyveromyces lactis and Candida glabrata. Deletion of CBF1 in C.albicans did not result in an increased frequency of chromosome loss, indicating that it has no role in chromosome segregation in this organism. However, the C.albicans cbf1 mutants exhibited severe growth impairment, temperature sensitivity at 42°C, and auxotrophy for sulphur amino acids, suggesting that Cbf1p is a transcription factor that is important for normal growth of C.albicans. YIL19 is an essential gene in S.cerevisiae that is involved in 18S rRNA maturation. YIL19 was found to be an essential gene also in C.albicans. Conditional mutants in which the YIL19 gene could be excised from the genome by inducible, FLP-mediated recombination were non-viable and accumulated rRNA precursors, demonstrating that YIL19 is essential for this important cellular process and for viability of C.albicans and could serve as a target for the development of antifungal drugs.
KW  - Candida albicans
KW  - Pathogenität
KW  - Stickstoff
KW  - Candida albicans
KW  - ammonium permease
KW  - nitrogen regulation
KW  - essential gene
Y1  - 2005
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-11554
ER  - 
TY  - THES
A1  - Grozdanov, Lubomir Assenov
T1  - Analysis of the genome organization and fitness traits of non-pathogenic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H1)
T1  - Untersuchungen zur Genomorganisation und zur Fitness des apathogener Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (O6:K5:H1)
N2  - In the last years more than one hundred microbial genomes have been sequenced, many of them from pathogenic bacteria. The availability of this huge amount of sequence data enormously increases our knowledge on the genome structure and plasticity, as well as on the microbial diversity and evolution. In parallel, these data are the basis for the scientific “revolution” in the field of industrial and environmental biotechnology and medical microbiology – diagnostics and therapy, development of new drugs and vaccines against infectious agents. Together with the genomic approach, other molecular biological methods such as PCR, DNA-chip technology, subtractive hybridization, transcriptomics and proteomics are of increasing importance for research on infectious diseases and public health. The aim of this work was to characterize the genome structure and -content of the probiotic Escherichia coli strain Nissle 1917 (O6:K5:H31) and to compare these data with publicly available data on the genomes of different pathogenic and non-pathogenic E. coli strains and other closely related species. A cosmid genomic library of strain Nissle 1917 was screened for clones containing the genetic determinants contributing to the successful survival in and colonization of the human body, as well as to mediate this strain’s probiotic effect as part of the intestinal microflora. Four genomic islands (GEI I-IVNissle 1917) were identifed and characterized. They contain many known fitness determinants (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), as well as novel genes of unknown function, mobile genetic elements or newly identified putative fitness-contributing factors (Sat, Iha, ShiA-homologue, Ag43-homologues). All islands were found to be integrated next to tRNA genes (serX, pheV, argW and asnT, respectively). Their structure and chromosomal localization closely resembles those of analogous islands in the genome of uropathogenic E. coli strain CFT073 (O6:K2(?):H1), but they lack important virulence genes of uropathogenic E. coli (hly, cnf, prf/pap). Evidence for instability of GEI IINissle 1917 was given, since a deletion event in which IS2 elements play a role was detected. This event results in loss of a 30 kb DNA region, containing important fitness determinants (iuc, sat, iha), and therefore probably might influence the colonization capacity of Nissle 1917 strain. In addition, a screening of the sequence context of tRNA-encoding genes in the genome of Nissle 1917 was performed to identify genome wide potential integration sites of “foreign” DNA. As a result, similar “tRNA screening patterns” have been observed for strain Nissle 1917 and for the uropathogenic E. coli O6 strains (UPEC) 536 and CFT073. I. Summary 4 The molecular reason for the semi-rough phenotype and serum sensitivity of strain Nissle 1917 was analyzed. The O6-antigen polymerase-encoding gene wzy was identified, and it was shown that the reason for the semi-rough phenotype is a frame shift mutation in wzy, due to the presence of a premature stop codon. It was shown that the restoration of the O side-chain LPS polymerization by complementation with a functional wzy gene increased serumresistance of strain Nissle 1917. The results of this study show that despite the genome similarity of the E. coli strain Nissle 1917 with the UPEC strain CFT073, the strain Nissle 1917 exhibits a specific set of geno- and phenotypic features which contribute to its probiotic action. By comparison with the available data on the genomics of different species of Enterobacteriaceae, this study contributes to our understanding of the important processes such as horizontal gene transfer, deletions and rearrangements which contribute to genome diversity and -plasticity, and which are driving forces for the evolution of bacterial variants. At last, the fim, bcs and rfaH determinats whose expression contributes to the mutlicellular behaviour and biofilm formation of E. coli strain Nissle 1917 have been characterized.
N2  - Bislang wurden die kompletten Genomsequenzen von mehr als 100 Bakterien ermittelt. Mehr als ein Drittel dieser Organismen wird als pathogen eingestuft. Die Verfügbarkeit dieser Sequenzinformation vergrößert unser Wissen über die bakterielle Genomstruktur und – plastizität sowie über mikrobielle Diversität und Evolution. Diese Daten bilden die Grundlage für viele Fortschritte auf dem Gebiet der Biotechnologie, der industriellen-, Umwelt- und medizinischen Mikrobiologie: neuartige Typisierung-, Diagnostik- und Therapieansätze sowie die Entwicklung neuer Medikamente und Impfstoffe basieren auf und profitieren von der ständig zunehmenden Menge an DNA-Sequenzen. Genomanalysen sind zusammen mit anderen molekularbiologischen Methoden wie PCR, DNA-Chiptechnologie, subtraktive Hybridisierung und Proteomanalysen von zunehmender Bedeutung für die Erforschung von Infektionskrankheiten und das öffentliche Gesundheitswesen. Ziel dieser Arbeit war die Analyse der Genomstruktur und des Genominhaltes des apathogenen Escherichia coli Stammes Nissle 1917 (O6:K5:H1) und der Vergleich mit verfügbaren Daten verschiedener pathogener und apathogener E. coli Stämme sowie anderer eng-verwandter Spezies. Eine Cosmid-Genbank des Stammes Nissle 1917 wurde nach Klonen durchsucht, die für Fitnessfaktoren kodieren, welche zur erfolgreichen Kolonisierung des menschlichen Verdauungstraktes und zum probiotischen Charakter dieses Stammes beitragen. Vier genomische Inseln (GEI I-IVNissle 1917) wurden nachgewiesen und charakterisiert. Auf diesen GEIs befinden sich verschiedene bekannte Fitness-Determinanten (mch/mcm, foc, iuc, kps, ybt), bislang nicht charakterisierte ORFs, mobile genetische Elemente und bislang für den Stamm Nissle 1917 nicht beschriebene Gene, die möglicherweise zur Fitness und Adaptabilität dieses Stammes beitragen. Die GEIs I-IVNissle 1917 sind jeweils mit einem tRNAGen assoziiert und ähneln hinsichtlich ihrer Struktur und chromosomalen Lokalisation entsprechenden Inseln im Genom des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 (O6:K2(?):H1). Interessanterweise fehlen auf diesen wichtige Virulenzgene uropathogener E. coli (hly, cnf, prf/pap). Eine etwa 30 kb große Region der GEI IINissle 1917, die von IS2 Elementen flankiert wird, kann spontan deletieren, was zum Verlust verschiedener Fitnessdeterminanten (iuc, sat, iha) führt. Darüber hinaus wurde der chromosomale Sequenzkontext von tRNA-Genen mittels PCR auf die Integration von „Fremd-DNA“ hin untersucht, die durch horizontalen Gentransfer erworben wurde (tRNA Screening), und mit denen anderer apathogener und pathogener E. coli Stämme verglichen. Der genomweite Anteil an tRNA-Gen-assoziierter, möglicherweise horizontal erworbener DNA, die im I. Summary 2 apathogenen E. coli K-12 Stamm MG1655 fehlt, unterschied sich dabei nicht bedeutend im Stamm Nissle 1917 und den uropathogenen E. coli O6 Stämmen CFT073 und 536. Die Verbreitung von DNA-Regionen der GEIs des Stammes Nissle 1917 wurde mittels PCR bei apathogenen E. coli-Isolaten sowie bei uropathogenen E. coli O6:K5-Isolaten untersucht. Nur zwei UPEC O6:K5-Isolate enthielten alle GEI-Bereiche, die in diese Untersuchung einbezogen waren, unterschieden sich jedoch vom Stamm Nissle 1917 durch ihre Phänotypen. Die Makrorestriktionsanalyse der Genomstruktur des E. coli Stammes Nissle 1917 zeigte, daß letztere der des uropathogenen E. coli Stammes CFT073 sehr ähnelt. Um die Ursache für den semi-rauhen Phänotyp des Stammes Nissle 1917 zu untersuchen, wurden die wa* und wb* Determinanten dieses Stammes, die für die LPS-Biosynthese verantwortlich sind, kloniert und sequenziert. Das bislang unbekannte Serotyp O6-spezifische O-Antigenpolymerase-kodierende Gen wzy des Stammes Nissle 1917 wurde charakterisiert und mit dem des rauhen O6 Stammes 536 verglichen. Eine Punktmutation, die zu einem vorzeitigen Translationsstop der wzy-Transkripte des Stammes Nissle 1917 führt, wurde als Ursache für den semi-rauhen Phänotyp und damit auch die Serumsensitivität dieses Stammes verantwortlich gemacht. Zur Untersuchung der Kolonisierungsfähigkeit des E. coli Stammes Nissle 1917 wurden verschiedene Faktoren, die an der Biofilmbildung bzw. am multizellulären Verhalten beteiligt sind, sequenziert und näher analysiert. Die Seqenzierung der fim Determinante zeigte, daß das fimB Gen, das für die Expression der Typ 1-Fimbrien benötigt wird, durch die Insertion eines IS-Elementes inaktiviert wurde. Untersuchungen zum multizellulären Verhalten zeigten, daß der Stamm Nissle 1917 den sogenannten „rdar“ Morphotyp, hervorgerufen durch Expression von Curli-Fimbrien und Cellulose, bei 30 °C und bei 37 °C exprimiert, nicht jedoch die uropathogenen E. coli Stämme 536 und CFT073. Das Cellulosebiosynthese-Operon (bcs) sowie das Gen rfaH, das für einen Transkriptionsantiterminator kodiert, wurden im Stamm Nissle 1917 inaktiviert, um deren Bedeutung für den „rdar“ Morphotyp zu untersuchen. Während Cellulose für die Expression des „rdar“ Morphotyps benötigt wird, hatte die rfaHInaktivierung keinen Einfluß auf dieses mulizelluläre Verhalten des E. coli Stammes Nissle 1917. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß der apathogene E. coli Stamm Nissle 1917 durch eine spezifische Kombination phänotypischen Eigenschaften gekennzeichnet ist, die ihn von anderen bislang untersuchten E. coli Stämmen unterscheidet. An der Evolution dieses Stammes, möglicherweise aus einem pathogenen „Vorfahren“, waren vielfältige Gentransfer- und Deletionsprozesse sowie Punktmutationen beteiligt.
KW  - Escherichia coli
KW  - Genanalyse
KW  - Escherichia coli
KW  - Genomorganisation
KW  - Escherichia coli
KW  - genome organization
Y1  - 2004
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-9304
ER  - 
TY  - THES
A1  - Ramirez Pineda, José Robinson
T1  - Dendritic cells activated by CpG motifs are potent inducers of a Th1 immune response that protects mice against leishmaniasis
T1  - CpG-aktivierte dendritische-Zellen induzieren eine Th1 immunantwort die Mäuse gegen Leishmaniose schütz
N2  - The present investigation report a protocol to obtain dendritic cells (DC) that protects mice against fatal leishmaniasis. DC were generated from bone marrow precursors, pulsed with leishmanial antigen and activated with CpG oligodeoxinucleotides. Mice that were vaccinated with these cells were strongly protected against the clinical and parasitological manifestations of leishmaniasis and developed a Th1 immune response. protection was solid and long-lasting, and was also dependent of the via of administration. Whe the mechanism of protection was studied, it was observed that the availability of the cytokine interleukin-12 at the time of vaccination was a key requirement, but that the source of this cytokine is not the donor cells but unidentified cells from the recipients.
N2  - En esta tesis se reporta un prtocolo para obtener celulas dendriticas (CD) que inducen una respuesta protectora contra la leishmaniasis en ratones susceptibles. Las CD se generaron de precursores de medula osea, se pulsaron con antigeno de Leishmania y se activaron con oligonucleotidos que contienen motivos CpG. Cuando los ratones se vacunan con estas celulas se observa una fuerte proteccion clinica y parasitologica contra la leishmaniasis. Los ratones se protegen debido a que desarrollan una respuesta inmune de tipo Th1, en contraste con la respuesta Th2 desarrollada por los ratones control. La proteccion fue solida y duradera y fue dependiente de la via de administracion de las CD. Cuando se estudio el mecanismo de proteccion, se encontro que se requiere la presencia de la citokina interleukina 12 en el momento de la vacunacion, y que la fuente de esta citokina no son las celulas donadoras, sino celulas de los ratones recipientes.
KW  - Leishmaniose
KW  - Dendritische Zelle
KW  - Immunreaktion
KW  - Dendrtitischer Zellen
KW  - Th1 immunantwort
KW  - leishmaniose
KW  - CpG
KW  - Dendritic cells
KW  - Th1 response
KW  - leishmaniasis
KW  - CpG
Y1  - 2003
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-8410
ER  -