TY  - THES
A1  - Gnamlin, Prisca
T1  - Use of Tumor Vasculature for Successful Treatment of Carcinomas by Oncolytic Vaccinia Virus
T1  - Die Tumorvasulatur in der erfolgreichen Therapie von Carcinomen durch onkolytische Vaccinia Viren
N2  - Tumor-induced angiogenesis is of major interest for oncology research. Vascular endothelial growth factor (VEGF) is the most potent angiogenic factor characterized so far. VEGF blockade was shown to be sufficient for angiogenesis inhibition and subsequent tumor regression in several preclinical tumor models. Bevacizumab was the first treatment targeting specifically tumor-induced angiogenesis through VEGF blockade to be approved by the Food and Drugs Administration (FDA) for cancer treatment. However, after very promising results in preclinical evaluations, VEGF blockade did not show the expected success in patients. Some tumors became resistant to VEGF blockade. Several factors have been accounted responsible, the over-expression of other angiogenic factors, the noxious influence of VEFG blockade on normal tissues, the selection of hypoxia resistant neoplastic cells, the recruitment of hematopoietic progenitor cells and finally the transient nature of angiogenesis inhibition by VEGF blockade. The development of blocking agents against other angiogenic factors like placental growth factor (PlGF) and Angiopoietin-2 (Ang-2) allows the development of an anti-angiogenesis strategy adapted to the profile of the tumor. 
Oncolytic virotherapy uses the natural propensity of viruses to colonize tumors to treat cancer. The recombinant vaccinia virus GLV-1h68 was shown to infect, colonize and lyse several tumor types. Its descendant GLV-1h108, expressing an anti-VEGF antibody, was proved in previous studies to inhibit efficiently tumor induced angiogenesis. Additional VACVs expressing single chain antibodies (scAb) antibodies against PlGF and Ang-2 alone or in combination with anti VEGF scAb were designed.
In this study, VACV-mediated anti-angiogenesis treatments have been evaluated in several preclinical tumor models. The efficiency of PlGF blockade, alone or in combination with VEGF, mediated by VACV has been established and confirmed. PlGF inhibition alone or with VEGF reduced tumor burden 5- and 2-folds more efficiently than the control virus, respectively. 
Ang-2 blockade efficiency for cancer treatment gave controversial results when tested in different laboratories. Here we demonstrated that unlike VEGF, the success of Ang-2 blockade is not only correlated to the strength of the blockade. A particular balance between Ang-2, VEGF and Ang-1 needs to be induced by the treatment to see a regression of the tumor and an improved survival. We saw that Ang-2 inhibition delayed tumor growth up to 3-folds compared to the control virus. These same viruses induced statistically significant tumor growth delays. This study unveiled the need to establish an angiogenic profile of the tumor to be treated as well as the necessity to better understand the synergic effects of VEGF and Ang-2. In addition angiogenesis inhibition by VACV-mediated PlGF and Ang-2 blockade was able to reduce the number of metastases and migrating tumor cells (even more efficiently than VEGF blockade). 
 
VACV colonization of tumor cells, in vitro, was limited by VEGF, when the use of the anti-VEGF VACV GLV-1h108 drastically improved the colonization efficiency up to 2-fold, 72 hours post-infection. These in vitro data were confirmed by in vivo analysis of tumors. Fourteen days post-treatment, the anti-VEGF virus GLV-1h108 was colonizing 78.8% of the tumors when GLV-1h68 colonization rate was 49.6%. These data confirmed the synergistic effect of VEGF blockade and VACV replication for tumor regression. 
Three of the tumor cell lines used to assess VACV-mediated angiogenesis inhibition were found, in certain conditions, to mimic either endothelial cell or pericyte functions, and participate directly to the vascular structure. The expression by these tumor cells of e-selectin, p-selectin, ICAM-1 and VCAM-1, normally expressed on activated endothelial cells, corroborates our findings. These proteins play an important role in immune cell recruitment, and there amount vary in presence of VEGF, PlGF and Ang-2, confirming the involvement of angiogenic factors in the immuno-modulatory abilities of tumors.
In this study VACV-mediated angiogenesis blockade proved its potential as a therapeutic agent able to treat different tumor types and prevent resistance observed during bevacizumab treatment by acting on different factors. First, the expression of several antibodies by VACV would prevent another angiogenic factor to take over VEGF and stimulate angiogenesis. Then, the ability of VACV to infect tumor cells would prevent them to form blood vessel-like structures to sustain tumor growth, and the localized delivery of the antibody would decrease the risk of adverse effects. Next, the blockade of angiogenic factors would improve VACV replication and decrease the immune-modulatory effect of tumors. Finally the fact that angiogenesis blockade lasts until total regression of the tumor would prevent the recovery of the tumor-associated vasculature and the relapse of patients.
N2  - Ein Hauptinteresse der onkologischen Forschung liegt auf dem Verständnis der Tumor-induzierten Angiogenese. Es wurde bereits festgestellt, dass die meisten Tumortypen eine abnorme Expression angiogener Faktoren zeigen. Der vascular endothelial growth factor (VEGF) wurde als der effektivste angiogene Faktor beschrieben. Es wurde gezeigt, dass die Hemmung des VEGF zur Inhibition der Angiogenese führt, das wiederum zu Tumorregression in vorklinischen Tumormodellen führte. Bevacizumab ist das erste FDA  zugelassene Krebs-Therapeutikum, welches spezifisch auf die Tumor-induzierte Angiogenese durch VEGF-Inhibition abzielt. Der erwartete Erfolg durch VEGF-Hemmung konnte im Patienten allerdings nicht erzielt werden. Die Entwicklung von neuen Angiogenese hemmenden Stoffen wie gegen den  placental growth factor (PIGF) oder Angiopoietin-2 (Ang-2), ermöglichen eine an das Tumor-Profil angepasste anti-angiogene Strategie.
Die onkolytische Virustherapie die natürliche Eigenschaft der Viren Tumore zu kolonisieren. Das Vaccinia-Virus (VACV) gehört zur Familie der Poxviridae und wurde bereits lange Zeit als Vakzin zur Immunisierung gegen Pocken eingesetzt. Es konnte
 
gezeigt werden, dass das rekombinante VACV GLV-1h68 effizient verschiedene Tumortypen infiziert, kolonisiert und lysiert. Das VACV GLV-1h108, welches auf der Basis des GLV-1h68 generiert wurde, kodiert einen anti-VEGF Antikörper. Dieses Virus ist in der Lage ist die Tumor-induzierte Angiogenese effizient zu inhibieren. Zusätzlich zu diesem VACV wurden weitere Konstrukte kloniert, welche für Antikörper gegen PIGF und Ang-2 kodieren. Zusätzlich wurden Virusstämme konstruiert, die gleichzeitig zwei Angiogenesefaktoren anzielen. 
Es wurde verschiedene VACV-vermittelte anti-Angiogenese Therapien in vorklinischen Tumormodellen wie Lungenadenokarzinome, KolonKarzinom, Melanom und Lungenadenokarzinome evaluiert. Die Effizienz der VACV-vermittelten Hemmung von PIGF und Ang-2, singulär oder in Kombination mit VEGF, wurde mit Tumor-Xenotransplantaten ermittelt. Die Inhibition von PlGF alleine oder in Kombination mit VEGF reduzierten die Tumorbelastung bis zu fünf, beziehungsweise zwei mal effizienter als GLV-1h68. 
Weiterhin wurde gezeigt, dass anders als VEGF, der Erfolg der Ang-2 Hemmung nicht nur mit der Stärke der Hemmung korreliert. Um Tumorregression sowie eine verbesserte Überlebensrate zu verursachen muss eine Balance zwischen Ang-2, VEGF und Ang-1 induziert werden. GLV-1h68 behandelte Tumore waren drei mal gröβer als Tumore, die mit den anti-Ang2 exprimierenden Viren behandelt wurden. Dieselben Virusstämme verursachten eine erhebliche Verspätung des Wachstums der Tumoren.  Ausserdem hat diese Arbeit die Notwendigkeit enthüllt, ein angiogenes Profil des zu behandelnden Tumors zu etablieren sowie den Bedarf die synergistischen Effekte von VEGF und Ang-2 besser zu verstehen.  Durch die Inhibition der Angiogenese durch VACV-verursachte PIGF und Ang-2 Hemmung  wurde die Anzahl der Metastasen und der migrierenden Tumorzellen reduziert. Es wurde gezeigt, dass VEGF die VACV-Kolonisierung von Tumorzellen limitiert, da der Einsatz eines anti-VEGF VACV zu einer Verbesserung der Kolonisierung führt. In vivo Analysen bestätigten diese in vitro Daten. Nach vierzehn Tagen kolonisierte das anti-VEGF Virus 78,85% der Tumoren während die Kolonizationsquote des Kontrollviruses 49,64 % war. Dies resultierte in Tumorregression. 
Drei der getesteten Tumorzelllinien, in welchen die VACV-vermittelte Angiogenese-Inhibition untersucht wurde, waren in der Lage als Teil der Vaskulatur zu fungieren. Die Expression von Adhäsionsproteinen in diesen Tumorzellen untermauert die Ergebnisse. Weiterhin konnte ein unterschiedliches Expressionsmuster in Anwesenheit von VEGF, PIGF und Ang-2 festgestellt werden, wodurch die Beteiligung angiogener Faktoren bei den immunmodulatorischen Eigenschaften von Tumoren gezeigt werden konnte.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine VACV-vermittelte anti-angiogene Behandlung für verschiedene Tumorvarianten erfolgsversprechend ist. Die Möglichkeit verschiedene Antikörper gegen unterschiedliche angiogene Faktoren zu exprimieren würde verhindern, dass diese die Angiogenese stimulierende Wirkung des VEGF übernehmen. Die Eigenschaft von VACV Tumorzellen zu infizieren verhindert, dass diese Blutgefäß-ähnliche Strukturen bilden, welche das Tumorwachstum gewährleisten würde. Weiterhin würde die lokal begrenzte Antikörper-Freisetzung das Risiko von Nebenwirkungen senken. Die Inhibition angiogener Faktoren würde die VACV Replikationsrate steigern und den immunmodulatorischen Effekt der Tumore abschwächen. Letztlich würde die Hemmung der Angiogenese bis zur völligen Regression des Tumors aufrechterhalten, die Neubildung Tumor-assoziierter Vaskulatur verhindern und somit den Rückfall des Patienten.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - cancer
KW  - vaccinia virus
KW  - virotherapy
KW  - tumor vascularization
KW  - oncolytic virotherapy
KW  - Onkolyse
KW  - Angiogenese
Y1  - 2015
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-119019
ER  - 
TY  - THES
A1  - Reinboth, Jennifer
T1  - Cellular Factors Contributing to Host Cell Permissiveness in Support of Oncolytic Vaccinia Virus Replication
T1  - Beteiligung zellulärer Faktoren an der Permissivität von Wirtszellen in Unterstützung der onkolytischen Vaccinia Virus Replikation
N2  - In initial experiments, the well characterized VACV strain GLV-1h68 and three wild-type LIVP isolates were utilized to analyze gene expression in a pair of autologous human melanoma cell lines (888-MEL and 1936 MEL) after infection. Microarray analyses, followed by sequential statistical approaches, characterized human genes whose transcription is affected specifically by VACV infection. In accordance with the literature, those genes were involved in broad cellular functions, such as cell death, protein synthesis and folding, as well as DNA replication, recombination, and repair. In parallel to host gene expression, viral gene expression was evaluated with help of customized VACV array platforms to get better insight over the interplay between VACV and its host. Our main focus was to compare host and viral early events, since virus genome replication occurs early after infection. We observed that viral transcripts segregated in a characteristic time-specific pattern, consistent with the three temporal expression classes of VACV genes, including a group of genes which could be classified as early-stage genes. In this work, comparison of VACV early replication and respective early gene transcription led to the identification of seven viral genes whose expression correlated strictly with replication. We considered the early expression of those seven genes to be representative for VACV replication and we therefore referred to them as viral replication indicators (VRIs). To explore the relationship between host cell transcription and viral replication, we correlated viral (VRI) and human early gene expression. Correlation analysis revealed a subset of 114 human transcripts whose early expression tightly correlated with early VRI expression and thus early viral replication. These 114 human molecules represented an involvement in broad cellular functions. We found at least six out of 114 correlates to be involved in protein ubiquitination or proteasomal function. Another molecule of interest was the serine-threonine protein kinase WNK lysine-deficient protein kinase 1 (WNK1). We discovered that WNK1 features differences on several molecular biological levels associated with permissiveness to VACV infection. In addition to that, a set of human genes was identified with possible predictive value for viral replication in an independent dataset. A further objective of this work was to explore baseline molecular biological variances associated with permissiveness which could help identifying cellular components that contribute to the formation of a permissive phenotype. Therefore, in a subsequent approach, we screened a set of 15 melanoma cell lines (15-MEL) regarding their permissiveness to GLV-1h68, evaluated by GFP expression levels, and classified the top four and lowest four cell lines into high and low permissive group, respectively. Baseline gene transcriptional data, comparing low and highly permissive group, suggest that differences between the two groups are at least in part due to variances in global cellular functions, such as cell cycle, cell growth and proliferation, as well as cell death and survival. We also observed differences in the ubiquitination pathway, which is consistent with our previous results and underlines the importance of this pathway in VACV replication and permissiveness. Moreover, baseline microRNA (miRNA) expression between low and highly permissive group was considered to provide valuable information regarding virus-host co-existence. In our data set, we identified six miRNAs that featured varying baseline expression between low and highly permissive group. Finally, copy number variations (CNVs) between low and highly permissive group were evaluated. In this study, when investigating differences in the chromosomal aberration patterns between low and highly permissive group, we observed frequent segmental amplifications within the low permissive group, whereas the same regions were mostly unchanged in the high group. Taken together, our results highlight a probable correlation between viral replication, early gene expression, and the respective host response and thus a possible involvement of human host factors in viral early replication. Furthermore, we revealed the importance of cellular baseline composition for permissiveness to VACV infection on different molecular biological levels, including mRNA expression, miRNA expression, as well as copy number variations. The characterization of human target genes that influence viral replication could help answering the question of host cell response to oncolytic virotherapy and provide important information for the development of novel recombinant vaccinia viruses with improved features to enhance replication rate and hence trigger therapeutic outcome.
N2  - Die Replikationseffizienz von VACVs spielt eine maßgebliche Rolle für deren antitumorale Wirkung und onkolytische Effizienz. Ferner hängt die Permissivität einer Wirtszelle gegenüber der Behandlung mit onkolytischen VACVs maßgeblich von einer erfolgreichen viralen Replikation und Vermehrung ab. Darauf basierend, war der Fokus der vorliegenden Arbeit, zelluläre Eigenschaften zu erforschen, welche die VACV-Replikation beeinflussen und die Wirtszell-Permissivität gegenüber einer Behandlung mit VACV prognostizieren können. Für initiale Genexpressionsanalysen wurden zwei autologe, humane Melanom-Zelllinien (888-MEL und 1936 MEL), sowie der ausgiebig charakterisierte VACV-Stamm GLV-1h68 und drei wildtypische LIVP Isolate verwendet. Mit Hilfe von Microarray Analysen und einem sequenziellen statistischen Ansatz konnten humane Gene charakterisiert werden, deren Transkription eigens durch VACV-Infektion beeinflusst wird. Erwartungsgemäß zeigten diese Gene eine Anreicherung in globalen zellulären Signalwegen und Funktionen. Die frühe virale Gentranskription kann als repräsentative Bestimmungsgröße für virale Replikation betrachtet werden. Darauf basierend resultierte der Vergleich von früher VACV Replikation und entsprechender früher Gentranskription in der Identifikation von sieben viralen Genen, deren Expression und Replikation stark korrelierten. Aus diesem Grund wurde die frühe Expression der sieben VACV-Gene als kennzeichnend für virale Replikation angesehen und diese Gene als virale Replikations-Indikatoren (VRIs) definiert. Zur Aufklärung von Zusammenhängen zwischen Wirts-Transkription und viraler Replikation wurde die frühe virale VRI-Expression mit der frühen humanen Genexpression in Beziehung gesetzt. Mit Hilfe von Vergleichsanalysen wurden 114 humane Transkripte identifiziert, deren frühes Expressionsmuster eng mit demjenigen der VRIs korrelierte und dementsprechend ebenso mit der viralen Replikation. Von den 114 Korrelaten spielen mindestens sechs eine Rolle in der Protein-Ubiquitinierung oder in der proteasomalen Signalgebung. Ein weiteres Molekül, welches besonderes Interesse weckte, war die Serin-Threonin Proteinkinase WNK Lysin-defizientes Protein 1 (WNK1). Für WNK1 wurden Unterschiede, die mit der VACV-Infektions-Permissivität zusammenhängen, auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen nachgewiesen. Desweiten wurde in dieser Arbeit eine Anzahl humaner Gene identifiziert, welche virale Replikation in einem unabhängigen Datensatz prognostizieren konnten. Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit war es, molekularbiologische Unterschiede, welche mit Infektions-Permissivität von Zellen assoziiert sind, auf Basisebene zu ergründen. Diese könnten dabei helfen, zelluläre Komponenten zu identifizieren, welche einen so genannten permissiven Phänotyp kennzeichnen. Aus diesem Grund wurden in einem weiteren Versuchsansatz 15 Melanom-Zelllinien (15-MEL) bezüglich ihrer Permissivität gegenüber GLV-1h68 anhand von GFP Expression untersucht. Die vier Zelllinien mit der höchsten und diejenigen vier mit der niedrigsten Permissivität wurden je einer Gruppe zugeordnet (hochpermissive und niedrigpermissive Gruppe). Die Gruppen hoher und niedriger Permissivität wurden bezüglich ihrer Basislevel-Transkription verglichen. Unterschiedlich exprimierte Gene waren, zumindest zum Teil, in globale zelluläre Prozesse involviert. Darüber hinaus wurde microRNA (miRNA) Basislevel-Expression von hoch- und niedrigpermissiver Gruppe untersucht. In dieser Arbeit wurden sechs miRNAs identifiziert, deren Basislevel-Expression zwischen niedrig und hochpermissiver Gruppe differiert. Abschließend wurden Veränderungen der Kopienzahl von Genen (copy number variations, CNVs) im Vergleich zwischen niedrig- und hochpermissiver Gruppe untersucht. Betrachtung chromosomaler Veränderungen zeigte eine Anreicherung von Segment-Amplifikationen in der niedrigpermissiven Gruppe, während gleiche Abschnitte der hochpermissiven Gruppe größtenteils keine Veränderungen aufwiesen. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit eine mutmaßliche Korrelation zwischen viraler Replikation, früher Genexpression und der entsprechenden Wirtsantwort gezeigt werden und somit eine mögliche Beteiligung humaner Wirtsfaktoren an der viralen Replikation. Zusätzlich wurden wichtige Aspekte der Basiskomposition von Zellen für die Permissivität gegenüber VACV-Infektion auf verschiedenen molekularbiologischen Ebenen aufgedeckt, einschließlich mRNA-Expression, miRNA-Expression sowie Kopienzahl-Variationen. Die Charakterisierung humaner Zielgene, welche die virale Replikation beeinflussen, könnte dabei helfen, die Wirtszellantwort auf onkolytische Virotherapie aufzuklären und wichtige Informationen zu liefern für die Entwicklung neuartiger rekombinanter Vaccinia-Viren mit verbesserten Eigenschaften und verbesserter Replikationseffizienz und somit einem gesteigerten Therapieerfolg.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Microarray
KW  - Melanom
KW  - onkolytische Virotherapie
KW  - Vaccinia Virus Replikation
KW  - vaccinia virus
KW  - microarray
KW  - malignant melanoma
KW  - oncolytic virotherapy
KW  - vaccinia virus replication
KW  - Onkolyse
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85392
ER  - 
TY  - THES
A1  - Buckel, Lisa
T1  - Evaluating the combination of oncolytic vaccinia virus and ionizing radiation in therapy of preclinical glioma models
T1  - Evaluierung der Kombination von onkolytischem Vaccinia Virus und ionisierender Strahlung in vorklinischen Gliomamodellen
N2  - Glioblastoma multiforme (GBM) represents the most aggressive form of malignant brain tumors and remains a therapeutically challenge. Intense research in the field has lead to the testing of oncolytic viruses to improve tumor control. Currently, a variety of different oncolytic viruses are being evaluated for their ability to be used in anti-cancer therapy and a few have entered clinical trials. Vaccinia virus, is one of the viruses being studied. GLV-1h68, an oncolytic vaccinia virus engineered by Genelux Corporation, was constructed by insertion of three gene cassettes, RUC-GFP fusion, β-galactosidase and β- glucuronidase into the genome of the LIVP strain. Since focal tumor radiotherapy is a mainstay for cancer treatment, including glioma therapy, it is of clinical relevance to assess how systemically administered oncolytic vaccinia virus could be combined with targeted ionizing radiation for therapeutic gain. In this work we show how focal ionizing radiation (IR) can be combined with multiple systemically delivered oncolytic vaccinia virus strains in murine models of human U-87 glioma. After initial experiments which confirmed that ionizing radiation does not damage viral DNA or alter viral tropism, animal studies were carried out to analyze the interaction of vaccinia virus and ionizing radiation in the in vivo setting. We found that irradiation of the tumor target, prior to systemic administration of oncolytic vaccinia virus GLV-1h68, increased viral replication within the U-87 xenografts as measured by viral reporter gene expression and viral titers. Importantly, while GLV-1h68 alone had minimal effect on U-87 tumor growth delay, IR enhanced GLV-1h68 replication, which translated to increased tumor growth delay and mouse survival in subcutaneous and orthotopic U-87 glioma murine models compared to monotherapy with IR or GLV-1h68. The ability of IR to enhance vaccinia replication was not restricted to the multi-mutated GLV-1h68, but was also seen with the less attenuated oncolytic vaccinia, LIVP 1.1.1. We have demonstrated that in animals treated with combination of ionizing radiation and LIVP 1.1.1 a strong pro-inflammatory tissue response was induced. When IR was given in a more clinically relevant fractionated scheme, we found oncolytic vaccinia virus replication also increased. This indicates that vaccinia virus could be incorporated into either larger hypo-fraction or more conventionally fractionated radiotherapy schemes. The ability of focal IR to mediate selective replication of systemically injected oncolytic vaccinia was demonstrated in a bilateral glioma model. In mice with bilateral U-87 tumors in both hindlimbs, systemically administered oncolytic vaccinia replicated preferentially in the focally irradiated tumor compared to the shielded non- irradiated tumor in the same mouse We demonstrated that tumor control could be further improved when fractionated focal ionizing radiation was combined with a vaccinia virus caring an anti-angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF). Our studies showed that following ionizing radiation expression of VEGF is upregulated in U-87 glioma cells in culture. We further showed a concentration dependent increase in radioresistance of human endothelial cells in presence of VEGF. Interestingly, we found effects of vascular endothelial growth factor on endothelial cells were reversible by adding purified GLAF-1 to the cells. GLAF-1 is a single- chain antibody targeting human and murine VEGF and is expressed by oncolytic vaccinia virus GLV-109. In U-87 glioma xenograft murine models the combination of fractionated ionizing radiation with GLV-1h164, a vaccinia virus also targeting VEGF, resulted in the best volumetric tumor response and a drastic decrease in vascular endothelial growth factor. Histological analysis of embedded tumor sections 14 days after viral administration confirmed that blocking VEGF translated into a decrease in vessel number to 30% of vessel number found in control tumors in animals treated with GLV-164 and fractionated IR which was lower than for all other treatment groups. Our experiments with GLV-1h164 and fractionated radiotherapy have shown that in addition to ionizing radiation and viral induced tumor cell destruction we were able to effectively target the tumor vasculature. This was achieved by enhanced viral replication translating in increased levels of GLAF-2 disrupting tumor vessels as well as the radiosensitization of tumor vasculature to IR by blocking VEGF. Our preclinical results have important clinical implications of how focal radiotherapy can be combined with systemic oncolytic viral administration for highly aggressive, locally advanced tumors with the potential, by using a vaccinia virus targeting human vascular endothelial growth factor, to further increase tumor radiation sensitivity by engaging the vascular component in addition to cancer cells.
N2  - Glioblastoma multiforme (GBM) verkörpert die aggressivste Form von bösartigen Gehirntumoren und seine Therapie gestaltet sich schwierig. Weitläufige Forschung hat dazu geführt, dass onkolytische Viren zur Verbesserung der Tumorbehandlung untersucht wurden. Gegenwärtig wird eine Vielzahl an verschiedenen onkolytischen Viren untersucht und einige wenige befinden sich bereits in klinischen Studien. Eines der Viren die untersucht werden, ist das Vaccinia-Virus. GLV-1h68, ein onkolytisches Vaccinia- Virus, wurde durch die Einfügung von drei Genkasseten, RUC-GFP Fusion, β- Galaktosidase und β- Glucuronidase in das Genom des LIVP Stammes hergestellt. Da fokale Bestrahlungstherapie aus der Behandlung von Krebs, nicht nur im Falle von Glioblastomen, nicht wegzudenken ist, ist es klinisch relevant, zu untersuchen, wie ein systemisch verabreichtes Vaccinia-Virus mit gezielter ionisierender Strahlung (IR) kombiniert werden könnte, um Therapiechancen zu verbesseren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, wie gezielte IR mit verschiedenen sytemisch injizierten Vaccinia-Virus Stämmen in einem Mausmodell für humane U-87-Glioma kombiniert wurde. Nachdem einleitende Versuche bestätigten, dass IR die virale Erbinformation nicht beschädigt und auch nicht den viralen Tropismus verändert, wurden Tierstudien durchgeführt, die die Interaktion des Vaccinia-Virus mit Bestrahlungtherapie in vivo untersuchten. Wir konnten zeigen, dass eine vorherige Bestrahlung des Tumors, bevor das GLV-1h68-Virus systemisch injiziert wurde, eine erhöhte viraler Replikation im Tumor zur Folge hatte, wie wir durch gesteigerte virale Titer und Markergenexpression belegen konnten. Von wesentlicher Bedeutung ist, dass eine Verabreichung von ausschliesslich GLV-1h68 einen minimalen Einfluss auf das U-87 Tumorwachstum hatte, während die durch die Bestrahlung ausgelöste erhöhte Vermehrung von Virus im Tumor eine Verzögerung des Tumorwachstums sowie ein verlängertes Überleben von Mäusen mit U-87-Xenografts zur Folge hatte. Die Fähigkeit von IR virale Vermehrung zu erhöhen, wurde auch für das weniger attenuierte LIVP 1.1.1-Virus gezeigt. Wenn die Bestrahlung in einem klinisch relevanten fraktionierten Bestrahlungsschema verabreicht wurde, war virale Replikation ebenfalls erhöht. Dies verdeutlicht, dass das Vaccinia-Virus klinisch entweder in eine Bestrahlung mit einer einzelnen Dosis oder in eine konventionelle fraktionierte Bestrahlung integriert werden kann. Die Fähigkeit von fokaler IR, eine selektive Vermehrung von systemisch injizierten onkolytischen Vaccinia-Viren zu ermöglichen, wurde in einem bilateralen Gliomamausmodell bestätigt. In Mausen mit Tumoren an beiden Hinterbeinen, vermehrte sich das systemisch gespritzte Vaccinia-Virus bevorzugt im bestrahlten Tumor. Wir konnten zeigen, wie die Tumorkontrolle darüber hinaus weiter verbessert werden kann, wenn fraktionierte fokale Bestrahlung mit einem Vaccinia-Virus kombiniert wird, das eine anti-angiogenetische Ladung, die den vaskulaeren endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) inhibiert, exprimiert. Unsere Studien konnten zeigen, dass durch die Bestrahlung von U-87 Gliomazellen eine Hochregulation von VEGF-Expression ausgelöst wurde, die Radioresistenz von Endothelzellen konzentrationsabhängig induzierte. Wir konnten zeigen, dass die durch VEGF verursache Radioresistenz umkehrbar ist, wenn zusätzlich aufgereinigtes GLAF-1, einen Vaccinia Virus exprimierten Antikörper, zu den Zellen gegeben wurde. In einem Mausmodell zeigte die Kombination aus fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164, ein Vaccinia-Virus, das ebenfalls einen VEGF Antikörper mit Ähnlichkeit zu GLAF-1 exprimiert, resultierte in der stärksten volumetrischen Tumorantwort. Es wurde ebenfalls eine drastische Abnahme an VEGF im Tumor bereits 3 Tagen nach Virus- Injektion nachgewiesen. Histologische Analyse bestätigte, dass die Blockade von VEGF eine Erniedrigung der Anzahl von Tumorblutgefäßen, zu 30% von Kontrolltumoren, zur Folge hatte. Dieser Wert war niedriger als in allen anderen Behandlungsgruppen. Unsere Versuche mit fraktionierter Bestrahlung und GLV-1h164 konnten zeigen, dass zusätzlich zu der durch Virus und Bestrahlung ausgelösten Tumorzellzerstörung, eine effiziente Degeneration der Tumorblutgefäße möglich war. Dies wurde durch eine erhöhte Virus-Vermehrung als Folge der Bestrahlung, sowie durch Sensitiveren der tumoralen Endothelzellen durch Blockierung von VEGF-A erreicht. Die Ergebnisse, die in dieser Arbeit zeigen, wie fokale Bestrahlungstherapie mit systemisch verabreichten onkolytische Vaccinia-Viren für aggressive, fortgeschrittene Tumore kombiniert werden kann. Es ist denkbar, dass die Tumortherapie weiter verbessert werden kann, wenn ein Vaccinia-Virus benutzt wird, das sich zusätzlich gegen VEGF richtet, so werden zu den Krebszellen zusätzlich Tumorblutgefäße in die Therapie miteinbezogen, um die Sensitivität von Endothelzellen gegen Bestrahlung weiter zu erhöhen.
KW  - Gliom
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Strahlentherapie
KW  - Kombinationstherapie
KW  - onkolytische Virotherapie
KW  - Glioma
KW  - vaccinia virus
KW  - ionizing radiation
KW  - combination therapy
KW  - oncolytic virotherapy
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85309
ER  - 
TY  - THES
A1  - Donat, Ulrike
T1  - Detektion und Therapie von Metastasen des humanen Prostatakarzinoms durch das onkolytische Vaccinia-Virus GLV-1h68
T1  - Detection and therapy of human prostate carcinoma metastases with the oncolytic vaccinia virus GLV-1h68
N2  - Zurzeit sterben jährlich ca. 11.000 Männer in Deutschland am Prostatakarzinom. Damit stellt dies die zweithäufigste Krebstodesursache von Männern dar. Da das Prostatakarzinom häufig asymptomatisch verläuft, wird die Erkrankung oftmals erst so spät erkannt, dass zum Zeitpunkt der Diagnose bereits eine Metastasierung stattgefunden hat. Durch metastasierende Prostatakarzinomzellen werden Lymphknoten, Knochen und Lungen befallen. Es sind zwei unterschiedliche Verbreitungsarten von metastasierenden Tumorzellen beschrieben. Zum einen kann eine Migration über Lymphgefäße erfolgen, ein Prozess der als lymphatische Metastasierung bezeichnet wird. Zum anderen können Tumorzellen über das Blutsystem im Körper zirkulieren: die hämatogene Metastasierung. In dieser Arbeit wurde die lymphatische Metastasierung der humanen Prostatakarzinomzellline PC-3 im Detail analysiert und Teilaspekte der hämatogenen Verteilung untersucht. Ausgangspunkt der Untersuchungen bildete die Vergrößerung lumbaler und renaler Lymphknoten in PC-3-Tumor-tragenden Mäusen 60 Tage nach der Implantation von PC-3-Zellen. Es wurde daraufhin der zeitliche Verlauf der Vergrößerung untersucht und festgestellt, dass sowohl das Volumen als auch die Anzahl vergrößerter Lymphknoten von Woche zu Woche nach Implantation der PC-3-Tumore zunehmen. Anschließend wurden alle vergrößerten Lymphknoten bezüglich des Vorhandenseins von metastasierenden humanen PC-3-Zellen in den Mäusen untersucht. Dies geschah mit Hilfe einer RT-PCR unter Verwendung von Primern für humanes β-Aktin. Sechs Wochen nach Implantation konnten in 90 % der vergrößerten Lymphknoten PC-3-Zellen nachgewiesen werden. Weiterhin wurde durch lentivirale Transduktion das Gen für das rot fluoreszierende Protein (RFP) in die PC-3-Zellen inseriert, wodurch eine Visualisierung dieser Zellen in der Maus ermöglicht wurde. Es konnten metastasierende PC-3-RFP-Zellen in lumbalen und renalen Lymphknoten PC-3-RFP-Tumor-tragender Mäuse nachgewiesen werden. Ebenso konnte mittels RFP gezeigt werden, dass die Lymphknotenmetastasierung in Abhängigkeit von der Lokalisation des PC-3-RFP-Tumors erfolgt. Es kam zur Metastasierung jener Lymphknoten, in deren Einzugsgebiet sich der PC-3-Tumor befand. Es wurde eine PC-3-RFP-Zellmigration zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen nachgewiesen und bei immunhistologischen Untersuchungen stellte sich heraus, dass PC-3-RFP-Zellen tatsächlich in lymphatischen Bahnen zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen migrieren. Außerdem wurde gezeigt, dass es von Woche zu Woche nach Implantation von PC-3-Zellen zu einer Zunahme der Anzahl von Lymphgefäßen in PC-3-Tumoren kommt. Die Zunahme der Lymphgefäßdichte korrelierte hierbei positiv mit der Bildung von Lymphknotenmetastasen. Es konnten weiterhin neben Lymphknotenmetastasen hämatogene Mikrometastasen in den Lungen PC-3-RFP-Tumor-tragender Mäuse beobachtet werden. Da die Haupttodesursache von Prostatakarzinompatienten in der Bildung von Metastasen liegt, ist es von herausragender Bedeutung eine effektive Therapie gegen lymphatische und hämatogene Metastasen zu entwickeln. Aus diesem Grund erlangt die onkolytische Virustherapie große Bedeutung. Deshalb wurde als zweiter Aspekt in dieser Arbeit der Einfluss des onkolytischen Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf den Prozess der PC-3-Zellmetastasierung untersucht. Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass GLV-1h68 in der Lage ist, erfolgreich sowohl migrierende PC-3-Zellen als auch metastasierende PC-3-Zellen in Lymphknoten zu kolonisieren. In der Folge wurde deshalb ein möglicher Metastasen-inhibierender Effekt von GLV-1h68 untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass GLV-1h68 drei Wochen nach intravenöser Injektion eine signifikante Reduktion der Anzahl der für PC-3-Zellen positiven Lymphknoten bewirkt. Des Weiteren konnte ein inhibierender Effekt von GLV-1h68 auf die im Blut zirkulierenden PC-3-Zellen und auf hämatogene Metastasen in den Lungen beobachtet werden. Durch intravenöse Injektion von GLV-1h68 in PC-3-RFP-Tumor-tragenden Mäusen konnte gezeigt werden, dass es zu einer präferentiellen Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu den Tumoren kommt. Auch nach intraperitonealer und intratumoraler Injektion von GLV-1h68 konnte eine präferentielle Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen gezeigt werden. Darüber hinaus wurden die Lymph- und Blutgefäße von PC-3-Tumoren und Lymphknotenmetastasen analysiert. Hierbei wurde gezeigt, dass es sieben Tage nach intravenöser Injektion von GLV-1h68 zu einer signifikanten Abnahme von beiden Gefäßarten kam. Es wurde in dieser Arbeit somit gezeigt, dass GLV-1h68 in der Lage ist, sowohl lymphatische als auch hämatogene Metastasen der Prostatakarzinomzelllinie PC-3 erfolgreich zu eliminieren. Folglich dürften onkolytische Vaccinia-Viren ein vielversprechendes Therapeutikum für die Behandlung des fortgeschrittenen Prostatakarzinoms darstellen.
N2  - Every year about 11,000 men in Germany are dying because of prostate carcinoma. Thus, prostate carcinoma represents the second leading cause of cancer related death in men. Since the prostate carcinoma usually proceeds asymptomatically the diagnosis is often made when metastases have already formed. Human prostate cancer usually spreads to lymph nodes, bones and lungs. There are two ways for tumor cells to migrate to other parts of the body: through lymphatic vessels, a process called lymphatic metastasis, or through the blood system, the hematogenous metastasis. In this thesis the lymphatic metastasis of the human prostate carcinoma cell line PC-3 was analyzed in detail while the hematogenous spread was only partially investigated. The initial point of these investigations was the enlargement of lumbar und renal lymph nodes in PC-3 tumor-bearing mice 60 days post implantation of PC-3 cells. Thereafter the time course of the enlargement was assessed. It turned out that the volume as well as the number of enlarged lymph nodes increased from week to week post implantation of PC-3 tumors. Subsequently, all enlarged lymph nodes were tested for the presence of human PC-3 cells in mice. This was done with the help of an RT-PCR using primers for human β-actin. Six weeks post implantation 90% of all enlarged lymph nodes were positive for PC-3 cells. Furthermore, the gene of the red fluorescent protein (RFP) was inserted into PC-3 cells via lentiviral transduction. By using fluorescence microscopy PC-3-RFP cells could be detected in lumbar and renal lymph nodes of PC-3-RFP tumor-bearing mice. With the help of RFP it could also be shown that lymph node metastases depend on the PC-3 tumor location. Metastases occurred in draining lymph nodes next to the tumor. Moreover, a PC-3-RFP cell migration between lumbar and renal lymph node metastases was shown. In the following immunohistochemical analysis it was proven that PC-3-RFP cells are indeed migrating in lymphatic vessels between these lumbar and renal lymph node metastases. Additionally, an increasing number of lymphatic vessels in PC-3 tumors was shown from week to week post implantation of PC-3 cells. This enhancement positively correlates with the formation of lymph node metastases. Besides lymph node metastases hematogenous micro metastases in the lungs of PC-3-RFP-tumor-bearing mice could be detected, too. The major cause of death in prostate cancer patients is the formation of metastases. Therefore, the development of effective therapies for lymphatic and hematogenous metastases is of major importance. One of the most promising novel cancer therapies for humans is oncolytic virotherapy. According to that, the second aspect of this thesis was to investigate the influence of the oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 on the process of PC-3 cell metastasis. Thereby, it was initially shown that GLV-1h68 can efficiently colonize both migrating PC-3 cells and metastasized PC-3 cells in the lymph nodes. Ensuing, a possible metastasis inhibiting effect of GLV-1h68 was analyzed. It was shown that GLV-1h68 reduces the volume and the number of enlarged lymph nodes in PC-3 tumor-bearing mice three weeks after intravenous injection. It could also be shown that GLV-1h68 significantly reduces the number of lymph nodes that are positive for PC-3 cells. Additionally, GLV-1h68 has an inhibiting effect on PC-3 cells that are circulating in the blood of PC-3 tumor-bearing mice and on hematogenous metastases of the lungs. In analysing the intravenous injection of GLV-1h68 in PC-3-RFP tumor-bearing mice it turned out that there is a preferential viral colonisation of lymph node metastases compared to the tumors. At early points after injection renal lymph node metastases were colonized more thoroughly by GLV-1h68 than lumbar ones. The same preferential viral colonisation of lymph node metastases was shown upon intraperitoneal und intratumoral viral injection. Further, lymphatic and blood vessels of PC-3 tumors and lymph node metastases were analyzed. There was a significant reduction of lymphatic and blood vessels seven days post intravenous injection of GLV-1h68. This could explain the effect of GLV-1h68 on the reduction of the number of lymph node metastases, because the supply of nutrients as well as of oxygen is reduced due to the decrease of blood vessel density. Also, migration of PC-3 cells is minimized upon the reduction of lymphatic vessels. Thus, it was shown that GLV-1h68 has a great potential in eliminating lymphatic and hematogenous metastases of the human prostate carcinoma PC-3. Therefore, oncolytic vaccinia viruses apparently represent promising therapeutic agents for the treatment of advanced human prostate carcinoma.
KW  - Prostatakrebs
KW  - Metastase
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Metastasen
KW  - onkolytische Virustherapy
KW  - metatsases
KW  - oncolytic virotherapy
Y1  - 2011
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56421
ER  - 
TY  - THES
A1  - Cook, Vanessa Janine
T1  - Protection of healthy tissues from infection with systemically administered vaccinia virus strains
T1  - Schutz gesunder Gewebe vor Infektion systemisch verabreichter Vaccinia-Virus Stämme
N2  - Oncolytic virotherapy using recombinant vaccinia virus strains is a promising approach for the treatment of cancer. To further improve the safety of oncolytic vaccinia viruses, the cellular microRNA machinery can be applied as the host’s own security mechanism to avoid unwanted viral replication in healthy tissues. MicroRNAs are a class of small single-stranded RNAs which due to their ability to mediate post-transcriptional gene-silencing, play a crucial role in almost every regulatory process in cellular metabolism. Different cancers display unique microRNA expression patterns, showing significant up- or downregulation of endogenously expressed microRNAs. Furthermore, the behavior of cancer cells can be altered by either adding microRNAs known to inhibit cancer cell spread and proliferation or suppressing cancer promoting microRNAs (oncomirs) making microRNAs promising targets for cancer gene therapy. The cell’s own RNAi machinery can also be utilized to control viral replication due to the virus dependence on the host cell replication machinery, a process controlled by microRNAs. GLV-1h68 is a replication-competent recombinant oncolytic vaccinia virus constructed and generated by Genelux Corp., San Diego, CA, USA which carries insertions of three reporter gene cassettes for detection and attenuation purposes and is currently being evaluated for cancer treatment in clinical trials. Though there are hardly any side effects found in GLV-1h68 mediated oncolytic therapy an increased tropism for replication exclusively in cancer cells is desirable. Therefore it was investigated whether or not further cancer cell specificity of a recombinant vaccinia virus strain could be obtained without compromising its oncolytic activity using microRNA interference. Let-7a is a well characterized microRNA known to be expressed in high levels in healthy tissues and strongly downregulated in most cancers. To control vaccinia virus replication rates, four copies of the mature human microRNA let-7a target sequence were cloned behind the stop codon in the 3’end of the vaccinia virus D4R gene, using a GLV-1h68 derivative, GLV-1h190, as parental strain yielding the new recombinant virus strain GLV-1h250. The D4R gene belongs to the group of early transcribed vaccinia genes and encodes an essential enzyme, uracil DNA glycosylase, which catalyzes the removal of uracil residues from double-stranded DNA. A defect in D4R prevents vaccinia virus from entering into the intermediate and late phase of replication, leading to an aborted virus replication. After expression of the microRNA target sequence from the vaccinia virus genome, the endogenously expressed microRNA-let-7a should recognize its target structure within the viral mRNA transcript, thereby binding and degrading the viral mRNA which should lead to a strong inhibition of the virus replication in healthy cells. GLV-1h250 replication rates in cancerous A549 lung adenocarcinoma cells, which show a strong down-regulation of microRNA let-7a, was comparable to the replication rates of its parental strain GLV-1h190 and the control strain GLV-1h68. In contrast, GLV-1h250 displayed a 10-fold decrease in viral replication in non-cancerous ERC cells when compared to GLV-1h190 and GLV-1h68. In A549 tumor bearing nude mice GLV-1h250 replicated exclusively in the tumorous tissue and resulted in efficient tumor regression without adverse effects leading to the conclusion that GLV-1h250 replicates preferentially in cancerous cells and tissues, which display low endogenous let-7a expression levels.
N2  - Die onkolytische Virotherapie mit rekombinanten Vaccinia Virusstämmen stellt einen vielversprechenden Ansatz zur Behandlung von Krebs dar. Um die Sicherheit von onkolytischen Vaccinia Viren zu erhöhen wird die zelluläre MikroRNA Maschinerie als körpereigener Abwehrmechanismus genutzt um ungewollte virale Replikation in gesundem Gewebe zu verhindern MikroRNAs sind kurze, einzelsträngige RNA-Moleküle die aufgrund Ihrer Fähigkeit des Posttranscriptional Gene Silencing (RNA Interferenz) eine entscheidende Rolle in fast jedem regulativen Prozess im Zellmetabolismus spielen. Diverse Arten von Krebs zeigen spezifische MicroRNA-Expressionsmuster, welche sich als signifikante „Up“-oder „Down“-Regulation der Expression dieser microRNA(s) darstellt. Weiterhin kann das Verhalten von Krebszellen verändert werden, entweder durch Wiedereinbringen von in bestimmten Krebsarten „down“-regulierten MikroRNAs oder durch Unterdrückung der Expression von MikroRNAs, die als krebsfördernd gelten (Oncomirs). Die RNA-Interferenz Maschinerie der Zelle kann des Weiteren auch als Replikationskontrolle z.B. von Viren genutzt werden, da Viren für Ihre eigene Vermehrung auf die Replikationsmaschinerie der Zelle angewiesen sind, ein Prozess welcher von MikroRNAs kontrolliert wird. GLV-1h68 ist ein replikationskompetentes Vaccinia Virus, konstruiert und hergestellt von Genelux Corp., San Diego, CA, USA, welches drei verschiedene Reportergene enthält, welche zu Erkennungs- und Attenuierungszwecken genutzt werden. Obwohl eine Behandlung mit GLV-1h68 kaum Nebenwirkungen zeigt, wäre eine Replikation des Virus ausschliesslich in Krebszellen wünschenswert. Aufgrund dessen wurde versucht ein rekombinantes Vaccinia Virus zu generieren welches, unter Zuhilfenahme der RNA Interferenzmaschinerie der Zelle, ohne Einbusse seiner onkolytischen Fähigkeit ausschliesslich in Krebszellen repliziert. Let-7a ist eine gut charakterisierte MikroRNA die eine hohe Expression in gesunden Geweben und eine starke „Down“-Regulation in Krebszellen zeigt. Um die Replikation von Vaccinia zu kontrollieren wurden 4 Komplementärsequenzwiederholungen der humanen microRNAlet- 7a der 3‘-UTR des Vaccinia Virus D4R-Gens folgend kloniert, wobei GLV-1h190, ein GLV-1h68 Derivat, als parentaler Virusstamm verwendet wurde. D4R gehört zu der Gruppe der frühen Gene von Vaccinia und kodiert ein essentielles Enzym, Uracil- DNA-Glykosylase, welches das Entfernen von Uracilresten aus doppelsträngiger DNA katalysiert. Ein Defekt im D4R Gen verhindert den Eintritt von Vaccinia Viren in die intermediäre und späte Phase der Replikation, was zu einem Abbruch der viralen Replication führt. Nach der Expression der MikroRNA-komplementären Sequenzen durch das Virusgenom sollte die zellulär exprimierte let-7a MikroRNA Ihre Zielstruktur auf der viralen mRNA erkennen und diese degradieren. Dies sollte eine starke Hemmung der viralen Replikation in gesunden Zellen zur Folge haben.GLV-1h250 zeigte keine Beeinträchtigung in der Replikationsrate nach Infektion von A549 Lungenkarzinomzellen, welche eine starke „Down“-Regulation von MikroRNA let-7a aufweisen, im Vergleich zu dem parentalen Virus GLV-1h190 und dem Kontrollvirus GLV-1h68. Im Kontrast dazu zeigte GLV-1h250 eine 10-fache Verringerung in der Replikationsrate nach Infektion der Nicht-Krebszellline ERC im Vergleich zu Virus GLV-1h190 und GLV-1h68. In A549 Lungenkarzinom-tragende Nacktmäusen replizierte GLV-1h250 ausschliesslich im Tumorgewebe und zeigte effiziente Tumorregression ohne Nebenwirkungen im Vergleich zu den Virus Stämmen GLV-1h190 und GLV-1h68. Dies führt zur Vermutung, dass GLV-1h250 bevorzugt in Tumorzellen und –Geweben repliziert, welche geringe let-7a Konzentrationen aufweisen.
KW  - Vaccinia-Virus
KW  - Krebs <Medizin>
KW  - Therapie
KW  - vaccinia virus
KW  - microRNA
KW  - oncolytic virotherapy
Y1  - 2012
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69654
ER  -