TY - THES A1 - Hartung, Anke T1 - Localization of BMP receptors in distinct plasma membrane domains and its impact on BMP signaling T1 - Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Plasmamembrandomänen und deren Auswirkung auf den BMP Signalweg N2 - Endocytosis of growth factor receptors plays an important role in the activation and propagation as well as the attenuation of signaling pathways. Its malfunctioning can cause several pathologies, e.g. by controlling the level of receptors at the cell surface. BMPs are members of the TGF-ß superfamily and are involved in the regulation of proliferation, differentiation, chemotaxis and apoptosis. BMP signaling is initiated at two types of transmembrane serine/threonine kinases, BRI and BRII. BMP receptor activation occurs upon ligand binding to preformed complexes (PFCs) or BMP2-induced signaling complexes (BISCs) composed of BRI and BRII. Binding of BMP2 to PFCs results in activation of the Smad pathway, whereas BISCs initiate the activation of Smad-independent pathways via p38 resulting in the induction of Alkaline phosphatase (ALP). BMP receptor endocytosis has not been extensively studied and the potential role of localization to different regions of the plasma membrane in determining the signaling pathways activated by PFCs and BISCs was not explored so far. In the present work, the localization of BMP receptors in distinct membrane domains and the consequential impact on BMP signaling were investigated. By separating detergent-resistant membranes (DRMs) from cell lysates and subsequent gradient ultracentrifugation, it could be demonstrated that BRI and BRII cofractionate with cav-1, the marker protein of caveolae. Moreover, both receptor types interacted with cav-1 and showed a partially colocalization with cav-1 at the plasma membrane. Although these results point to a caveolar localization, BMP receptors cofractionated also with DRMs in cells exhibiting no caveolae, suggesting an additional non-caveolar raft localization. Beyond that, BRII could also be localized to clathrin-coated pits (CCPs) by means of immuno-electronmicroscopy studies. The second part of this thesis demonstrated that both membrane regions influence BMP signaling in distinct ways. Smad1/5 was shown to be phosphorylated independently of endocytic events at the cell surface. On the one hand, disruption of DRM regions by cholesterol depletion inhibited specifically BMP2-mediated ALP production, while Smad signaling was unaffected. On the other hand, inhibition of clathrin-mediated endocytosis by specific inhibitors affected BMP2-induced Smad signaling as well as the induction of ALP, suggesting that both Smad-dependent and Smad-independent signaling pathways are required for BMP2 induced ALP production. These findings propose an important regulatory impact of different endocytic routes and membrane regions on BMP signaling as well as that a distinct membrane localization of BMP receptors account for specific signaling properties initiated at PFCs or BISCs. N2 - Endozytose von Wachstumsfaktor-Rezeptoren spielt eine entscheidende Rolle bei Aktivierung und Übertragung wie auch bei der Schwächung von Signalen. Störungen der Endozytose können schwere Krankheitsbilder hervorrufen, z.B. durch ihren Einfluss auf die Regulation der Rezeptormenge an der Zelloberfläche. BMPs sind Mitglieder der TGF-ß Superfamilie und sind involviert in die Regulation von Proliferation, Differenzierung, Chemotaxis und Apoptose. Zwei Arten von Transmembranproteinen, die Serin/Threonin-Kinase Aktivität besitzen, sind bedeutend für den BMP Signalweg – die BMP Rezeptoren BRI und BRII. Die Aktivierung von BRI und BRII erfolgt durch Ligandenbindung an präformierte Komplexe (PFCs) oder BMP2-induzierte Signalkomplexe (BISCs), die aus beiden Rezeptorarten bestehen. Wenn BMP2 an PFCs bindet, wird die Smad-Signalkaskade initiiert, wohingegen BISCs Smad-unabhängige Signale über p38 weiterleiten, was schließlich zur Produktion von alkalischer Phosphatase (ALP) führt. Das Feld der BMP Rezeptor Endozytose wurde noch nicht sehr ausführlich untersucht, genauso wenig wie die potentielle Rolle, die unterschiedliche Rezeptorlokalisierungen in verschiedenen Plasmamembran-Regionen bei der Initiierung der Signalwege, die durch PFCs bzw. BISCs aktiviert werden, spielen könnten. In der vorliegenden Arbeit wurden die Lokalisierung von BMP Rezeptoren in speziellen Membrandomänen sowie deren Einfluss auf die BMP Signalkaskade untersucht. Mittels Reinigung von Detergenz-resistenten Membranen (DRMs) aus Zelllysaten und anschließender Gradientenultrazentrifugation konnte gezeigt werden, dass BRI und BRII mit dem caveolären Markerprotein cav-1 kofraktionieren. Darüber hinaus interagieren beide Rezeptorarten mit cav-1 und kolokalisieren auch teilweise mit cav-1 an der Plasmamembran. Obwohl diese Ergebnisse auf ein eindeutiges Vorkommen der Rezeptoren in Caveolae schließen lassen, kofraktionieren sie auch mit DRMs in Zellen, die von Natur aus keine Caveolae ausbilden, woraus man eine zusätzliche nichtcaveoläre Raft-Lokalisierung schlussfolgern kann. Des Weiteren konnte BRII mittels Immun- Elektronenmikroskopie in „clathrin-coated pits“ (CCPs) lokalisiert werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde gezeigt, dass beide untersuchten Membranregionen die BMP Signalkaskade auf unterschiedliche Art und Weise beeinflussen. Es wurde bewiesen, dass Smad1/5 unabhängig von endozytotischen Vorgängen an der Plasmamembran phosphoryliert wird. Einerseits führte die Zerstörung von DRM-Regionen durch Cholesterindepletion zur spezifischen Inhibierung der BMP2-vermittelten ALP Produktion, ohne gleichzeitig die BMP Signalkaskade über Smads zu beeinflussen. Andererseits bewirkte eine spezifische Blockierung der Clathrin-vermittelten Endozytose eine Inhibition des BMP2-induzierten Smad-Signalwegs und auch der ALP Produktion, was auf ein Zusammenspiel von Smad-unabhängigen und Smad-abhängigen Signalwegen bei der ALP-Induzierung schließen lässt. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie lassen die Schlussfolgerung zu, dass verschiedene endozytotische Wege und Membranregionen einen bedeutenden, regulatorischen Einfluss auf die BMP Signalkaskade ausüben. Weiterhin wurde festgestellt, dass die Membranlokalisierung von BMP Rezeptoren für das Einschlagen verschiedener Signalwege ausgehend von PFCs und BISCs verantwortlich ist. KW - Knochen-Morphogenese-Proteine KW - Rezeptor KW - Endocytose KW - BMP KW - Rezeptoren KW - Endozytose KW - Lipid Raft KW - Caveolae KW - BMP KW - receptors KW - endocytosis KW - lipid raft KW - caveolae Y1 - 2006 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18360 ER - TY - THES A1 - Bergmann Borges, Alyssa T1 - The endo-lysosomal system of \(Trypanosoma\) \(brucei\): insights from a protist cell model T1 - Das Endo-lysosomale System von \(Trypanosoma\) \(brucei\): Erkenntnisse aus einem Protisten-Zellmodell N2 - Most of the studies in cell biology primarily focus on models from the opisthokont group of eukaryotes. However, opisthokonts do not encompass the full diversity of eukaryotes. Thus, it is necessary to broaden the research focus to other organisms to gain a comprehensive understanding of basic cellular processes shared across the tree of life. In this sense, Trypanosoma brucei, a unicellular eukaryote, emerges as a viable alternative. The collaborative efforts in genome sequencing and protein tagging over the past two decades have significantly expanded our knowledge on this organism and have provided valuable tools to facilitate a more detailed analysis of this parasite. Nevertheless, numerous questions still remain. The survival of T. brucei within the mammalian host is intricately linked to the endo-lysosomal system, which plays a critical role in surface glycoprotein recycling, antibody clearance, and plasma membrane homeostasis. However, the dynamics of the duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation and its potential relationship with plasma membrane growth remain poorly understood. Thus, as the primary objective, this thesis explores the endo-lysosomal system of T. brucei in the context of the cell cycle, providing insights on cell surface growth, endosome duplication, and clathrin recruitment. In addition, the study revisits ferritin endocytosis to provide quantitative data on the involvement of TbRab proteins (TbRab5A, TbRab7, and TbRab11) and the different endosomal subpopulations (early, late, and recycling endosomes, respectively) in the transport of this fluid-phase marker. Notably, while these subpopulations function as distinct compartments, different TbRabs can be found within the same region or structure, suggesting a potential physical connection between the endosomal subpopulations. The potential physical connection of endosomes is further explored within the context of the cell cycle and, finally, the duplication and morphological plasticity of the lysosome are also investigated. Overall, these findings provide insights into the dynamics of plasma membrane growth and the coordinated duplication of the endo-lysosomal system during T. brucei proliferation. The early duplication of endosomes suggests their potential involvement in plasma membrane growth, while the late duplication of the lysosome indicates a reduced role in this process. The recruitment of clathrin and TbRab GTPases to the site of endosome formation supports the assumption that the newly formed endosomal system is active during cell division and, consequently, indicates its potential role in plasma membrane homeostasis. Furthermore, considering the vast diversity within the Trypanosoma genus, which includes ~500 described species, the macroevolution of the group was investigated using the combined information of the 18S rRNA gene sequence and structure. The sequence-structure analysis of T. brucei and other 42 trypanosome species was conducted in the context of the diversity of Trypanosomatida, the order in which trypanosomes are placed. An additional analysis focused on Trypanosoma highlighted key aspects of the group’s macroevolution. To explore these aspects further, additional trypanosome species were included, and the changes in the Trypanosoma tree topology were analyzed. The sequence-structure phylogeny confirmed the independent evolutionary history of the human pathogens T. brucei and Trypanosoma cruzi, while also providing insights into the evolution of the Aquatic clade, paraphyly of groups, and species classification into subgenera. N2 - Die meisten Studien in der Zellbiologie konzentrieren sich in erster Linie auf Modelle aus der Opisthokont-Gruppe der Eukaryonten. Die Opisthokonten umfassen jedoch nicht die gesamte Vielfalt der Eukaryonten. Daher ist es notwendig, den Forschungsschwerpunkt auf andere Organismen auszuweiten, um ein umfassendes Verständnis grundlegender zellulärer Prozesse zu erlangen, die im gesamten Lebensbaum vorkommen. In diesem Sinne stellt Trypanosoma brucei, ein einzelliger Eukaryote, eine brauchbare Alternative dar. Die gemeinsamen Anstrengungen bei der Genomsequenzierung und der Markierung von Proteinen in den letzten zwei Jahrzehnten haben unser Wissen über diesen Organismus erheblich erweitert und wertvolle Instrumente für eine detailliertere Analyse dieses Parasiten bereitgestellt. Dennoch bleiben noch zahlreiche Fragen offen. Das Überleben von T. brucei im Säugetierwirt ist eng mit dem endo-lysosomalen System verknüpft, das eine entscheidende Rolle beim Recycling von Oberflächenglykoproteinen, der Antikörper-Clearance und der Homöostase der Plasmamembran spielt. Die Dynamik der Verdoppelung des endo-lysosomalen Systems während der Vermehrung von T. brucei und seine mögliche Beziehung zum Wachstum der Plasmamembran sind jedoch noch wenig bekannt. In dieser Arbeit wird daher das endo-lysosomale System von T. brucei im Kontext des Zellzyklus untersucht, um Erkenntnisse über das Wachstum der Zelloberfläche, die Verdopplung der Endosomen und die Clathrin-Rekrutierung zu gewinnen. Darüber hinaus wird in der Studie die Ferritin-Endozytose erneut untersucht, um quantitative Daten über die Beteiligung der TbRab-Proteine (TbRab5A, TbRab7 und TbRab11) und der verschiedenen endosomalen Subpopulationen (frühe, späte bzw. Recycling-Endosomen) am Transport dieses Flüssigphasenmarkers zu erhalten. Bemerkenswert ist, dass diese Subpopulationen zwar als unterschiedliche Kompartimente fungieren, aber verschiedene TbRabs in derselben Region oder Struktur gefunden werden können, was auf eine mögliche physische Verbindung zwischen den endosomalen Subpopulationen hindeutet. Die potenzielle physikalische Verbindung von Endosomen wird im Zusammenhang mit dem Zellzyklus weiter erforscht, und schließlich werden auch die Verdopplung und die morphologische Plastizität des Lysosoms untersucht. Insgesamt bieten diese Ergebnisse Einblicke in die Dynamik des Plasmamembranwachstums und die koordinierte Verdopplung des endo-lysosomalen Systems während der Proliferation von T. brucei. Die frühe Verdoppelung der Endosomen deutet auf ihre mögliche Beteiligung am Plasmamembranwachstum hin, während die späte Verdoppelung der Lysosomen auf eine geringere Rolle in diesem Prozess hindeutet. Die Rekrutierung von Clathrin- und TbRab-GTPasen an der Stelle der Endosomenbildung unterstützt die Annahme, dass das neu gebildete endosomale System während der Zellteilung aktiv ist, und deutet folglich auf seine potenzielle Rolle bei der Homöostase der Plasmamembran hin. In Anbetracht der enormen Vielfalt innerhalb der Gattung Trypanosoma, die etwa 500 beschriebene Arten umfasst, wurde die Makroevolution der Gruppe anhand der kombinierten Informationen der 18S rRNA-Gensequenz und Struktur untersucht. Die Sequenz-Struktur-Analyse von T. brucei und anderen 42 Trypanosomen-Arten wurde im Zusammenhang mit der Vielfalt der Trypanosomatida, der Ordnung, in die Trypanosomen eingeordnet werden, durchgeführt. Eine zusätzliche Analyse, die sich auf Trypanosoma konzentrierte, hob Schlüsselaspekte der Makroevolution dieser Gruppe hervor. Um diese Aspekte weiter zu erforschen, wurden zusätzliche Trypanosomenarten einbezogen und die Veränderungen in der Topologie des Trypanosoma-Baums analysiert. Die Sequenz-Struktur-Phylogenie bestätigte die unabhängige Evolutionsgeschichte der humanen Krankheitserreger T. brucei und Trypanosoma cruzi, während sie gleichzeitig Einblicke in die Evolution der aquatischen Klade, die Paraphylie von Gruppen und die Klassifizierung der Arten in Untergattungen lieferte. KW - 18S rRNA KW - Endocytose KW - Zellzyklus KW - Phylogenie KW - Endocytosis KW - Cell cycle KW - Trypanosoma KW - Phylogeny KW - Sequence-Structure KW - Endosomes KW - Lysosome Y1 - 2023 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-329248 ER -