TY - THES A1 - Philippi, Nicole T1 - Modellierung von Signalwegen in verschiedenen biologischen Systemen T1 - Modeling of signaling pathways in different biological systems N2 - Die Apoptose der Leberzellen ist abhängig von externen Signalen wie beispielsweise Komponenten der Extrazellulären Matrix sowie anderen Zell-Zell-Kontakten, welche von einer Vielfalt und Vielzahl an Knoten verarbeitet werden. Einige von ihnen wurden im Rahmen dieser Arbeit auf ihre Systemeffekte hin unter- sucht. Trotz verschiedener äußerer Einflüsse und natürlicher Selektion ist das System daraufhin optimiert, eine kleine Anzahl verschiedener und klar voneinander unterscheidbarer Systemzustände anzunehmen. Die verschiedenartigen Einflüsse und Crosstalk-Mechanismen dienen der Optimierung der vorhandenen Systemzustände. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell zeigt zwei apoptotische sowie zwei nicht-apoptotische stabile Systemzustände, wobei der Grad der Aktivierung eines Knotens bis zu dem Moment stark variieren kann, in welchem der absolute Systemzustand selbst verändert wird (Philippi et al., BMC Systems Biology,2009) [1]. Dieses Modell stellt zwar eine Vereinfachung des gesamten zellulären Netzwerkes und seiner verschiedenen Zustände dar, ist aber trotz allem in der Lage, unabhängig von detaillierten kinetischen Daten und Parametern der einzelnen Knoten zu agieren. Gleichwohl erlaubt das Modell mit guter qualitativer Übereinstimmung die Apoptose als Folge einer Stimulation mit FasL zu modellieren. Weiterhin umfasst das Modell sowohl Crosstalk-Möglichkeiten des Collagen-Integrin-Signalwegs, ebenso berücksichtigt es die Auswirkungen der genetischen Deletion von Bid sowie die Konsequenzen einer viralen Infektion. In einem zweiten Teil werden andere Anwendungsmöglichkeiten dargestellt. Hormonale Signale in Pflanzen, Virusinfektionen und intrazelluläre Kommunikation werden semi-quantitativ modelliert. Auch hier zeigte sich eine gute Ubereinstimmung der Modelle mit den experimentellen Daten. N2 - Apoptosis of liver cells is dependent on external signals such as components of the extracellular matrix and cell-cell-contacts, which are processed by a variety of numerous nodes of which several are examined here for their system effects. Despite different input interferences and presumably also due to natural selecti- on, the system nevertheless appears to be optimized to adopt a small number of clear and distinguishable states, and the various inputs and crosstalk mechanisms only optimize the best choice between them. For the model described within this work, two nonapoptotic and two apoptotic states are found, although the degree of activation at a node can differ widely until the absolute system state is altered (Philippi et al., BMC Systems Biology, 2009) [1]. The model is still a simplification of the complete cellular network and its different states, and operates independently of detailed kinetic data and parameters for individual nodes. Nevertheless, it allows modeling the readout of apoptosis after FasL stimulation with qualitative agreement and includes crosstalks from collagen/integrin signa- ling, the effect of genetic deletion of Bid and the consequences of viral infection. The second part of this work deals with other applications using this method. Semi-quantitative models are used for hormonal signaling in plants, viral infec- tions and intra-cellular communication. The simulated results fit to the experi- mental data provided. KW - Systembiologie KW - Modellierung KW - Bioinformatik KW - Apoptose KW - Systems Biology KW - Modeling KW - Bioinformatics KW - Apoptosis Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-57690 ER - TY - THES A1 - Heisig, Julia T1 - Identifizierung neuer Zielgene der Hey bHLH Transkriptionsfaktoren T1 - Identification of novel target genes of Hey bHLH transcription factors N2 - Der Notch Signalweg spielt während der Embryonalentwicklung eine zentrale Rolle in der Spezifizierung des Zellschicksales, der Proliferation und der Kommunikation benachbarter Zellen. Die Hey bHLH Transkriptionsfaktoren sind Zielgene des Notch-Signalweges und besitzen wichtige Funktionen in der kardiovaskulären Entwicklung. Hey2 Knockout (KO) Mäuse und Hey1/HeyL Doppelknockout-Mäuse (DKO) sind gekennzeichnet durch eine fehlerhafte Ausbildung der Herzscheidewand und der Herzklappen und durch eine unzureichende Differenzierung während der Blutgefäßentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, neue Zielgene der Hey Proteine zu finden, um ihre Funktion in der Organentwicklung und die Ausprägung der Hey KO Maus-Phänotypen besser verstehen zu können. Dazu wurde als Methode eine Kombination aus Microarray-Analyse und Chromatinimmunpräzipitation (ChIP) gewählt, um gleichzeitig einen Überblick über die regulierten Zielgene und der direkt gebundenen Promotoren zu gewinnen. Als Zellkulturmodell wurden HEK293-Zellen genutzt, die doxyzyklin-induzierbar Flag-markiertes Hey1, bzw. Hey2 Protein überexprimieren. Eine Microarray-Analyse nach Überexpression von Hey1, bzw. Hey2 ergab insgesamt ca. 100 bis zu 5-fach herunterregulierte Zielgene und nur für Hey2 15 Gene, die stärker als 2-fach hochreguliert waren. Eine ChIP mit αFlag-Antikörper zeigte eine direkte DNA-Bindung von Hey1, bzw. Hey2, im proximalen Promotorbereich von 4 herunterregulierten Zielgenen (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Ist jedoch die DNA-bindende basische Domäne des Hey1-Proteins deletiert, bzw. durch Aminosäureaustausche (3 Arginine zu 3 Lysine) vermutlich nicht mehr DNA-bindend, kann eine Herunterregulation der Zielgene nach Überexpression der Hey1-Mutanten nicht mehr festgestellt werden. Ebenso kann eine Bindung der Hey1-Mutanten an die ausgewählten Promotoren von HEY1, BMP2, KLF10 oder FOXC1 mit ChIP nicht mehr nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass die basische Domäne essentiell für die DNA-Bindung und für die Funktion der Hey Proteine ist. Mit ChIP-PET und anschließender Hochdurchsatz-Sequenzierung wurde ein genomweiter Screen der Hey1- und der Hey2-Bindungsstellen in HEK293-Zellen durchgeführt. Für Hey1 wurden 1453 Zielgene, für Hey2 4288 Zielgene bestimmt, wobei 1147 Gene gemeinsame Zielgene von Hey1 und Hey2 waren. Obwohl die Bindungsstellen in 5'- und 3'-Richtung von kodierenden Sequenzen und auch in Exons und Introns lokalisiert waren, waren 55 %, bzw. 49 % aller Bindungsstellen für Hey1, bzw. Hey2 im proximalen Promotorbereich von -0,5 kb und im ersten Exon lokalisiert. Eine in silico Analyse des Bindemotivs deutete auf eine repetitive GC-haltige Sequenz hin, die vermutlich in CpG Inseln lokalisiert ist. Diese Ergebnisse weisen auf eine direkte Regulation der Transkriptionsmaschinerie durch die Hey Proteine hin. Ein Vergleich der Zielgene aus den Microarray-Analysen mit den ChIP-PET Daten zeigte einen hohen Anteil an herunterregulierten Genen mit Bindestellen, die direkt von Hey gebunden waren. Während 60 % der herunterregulierten Hey2 Zielgene in der ChIP-PET Analyse eine direkte DNA-Bindung zeigen, weisen nur 20 % der hochregulierten Gene Bindestellen für Hey2 auf. Dies spricht für eine überwiegende Repressorfunktion der Hey Proteine. Um zu überprüfen, inwieweit die Hey Proteine zelltypspezifisch verschiedene Zielgene regulieren, wurden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) generiert, die ebenfalls doxyzyklin-induzierbar Hey1, bzw. Hey2 überexprimieren. Diese ES-Zellen konnten effektiv zu Kardiomyozyten differenziert werden, so dass auch in diesen Zellen eine Hey Überexpression induziert und somit eine Genexpressionsanalyse durchgeführt werden konnte. Microarray Analysen der ES-Zellen und Kardiomyozyten ergaben mehr hoch- als herunterregulierte Gene im Vergleich zu HEK293-Zellen. Die Überlappung an gemeinsam regulierten Zielgenen in HEK293, ES-Zellen und Kardiomyozyten war sehr gering. Nur zwei Hey2-Zielgene wurden gleichzeitig in HEK293 und ES-Zellen stärker als 2-fach reguliert (Hes1, Zic2). Diese geringe Überlappung deutet auf ein enges zelltypspezifische Regulationspotential hin. Eine Genontologie-Analyse aller Zielgene zeigte Interaktionen der Hey Proteine mit verschiedenen Signalwegen (z.B. TGFβ-, Id- oder Wnt-Signalweg), die alle unersetzlich in frühen Entwicklungsprozessen sind. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hey Proteine zelltypspezifisch die Expression von Genen aus verschiedenen Signalwegen beeinflussen und modulieren können. Weiterhin eröffnen diese Daten neue Möglichkeiten für zukünftige Forschung, um die Rolle der Hey Proteine in der frühen Organentwicklung genauer ergründen. N2 - During embryonic development, the Notch signaling pathway plays a central role in cell fate specification, proliferation and communication between neighboring cells. Hey basic helix-loop-helix (bHLH) transcription factors are targets of the Notch signaling pathway and show crucial functions in cardiovascular development. Hey2 knock out (KO) mice and Hey1/HeyL double knock out mice (DKO) exhibit incomplete formation of the septum and valves in heart development and defects in the differentiation of blood vessels. The aim of this study was to find new target genes of the Hey proteins to further clarify their function during organ development and to get more insight into the phenotypes of the Hey KO mice. Towards this goal, a combination of microarray analysis and chromatin immunoprecipitation (ChIP) was chosen to get an overview of genes directly regulated by Hey proteins in a cell culture model of HEK293 cells overexpressing doxycycline-inducible Flag-tagged Hey1 or Hey2. Microarray analysis revealed approximately 100 target genes that were downregulated up to 5-fold by both Hey1 and Hey2. Interestingly, 15 genes were upregulated more than 2-fold by Hey2. ChIP with αFlag antibody confirmed direct interaction of Hey1 and Hey2 with the proximal promotor regions of 4 downregulated target genes (HEY1, BMP2, KLF10 und FOXC1). Overexpression of mutant Hey1 proteins with deletion of the DNA-binding basic domain or single amino acid exchanges in the basic domain (3 arginine to lysine), failed to downregulate Hey1 target genes. Additionally, ChIP assay demonstrated that the binding of the Hey mutants to the promotor regions of HEY1, BMP2, KLF10 or FOXC1 is abolished, suggesting an essential role for the basic domain in DNA binding and function of the Hey proteins. We then utilized ChIP-PET in conjunction with highthroughput sequencing to perform a genome-wide screen for Hey1 and Hey2 binding sites in HEK293 cells. 1453 and 4288 target genes were identified for Hey1 and Hey2, respectively, of which 1147 genes were targets of both Hey1 and Hey2. Although the binding sites were located upstream and downstream of coding sequences, or even in exons and introns, 55 % and 49 % of all binding sites for Hey1 and Hey2, respectively, were located in proximal promoter regions between -0.5 kb and the first exon. An in silico binding motif analysis suggests a repetitive GC-rich sequence for Hey binding which is probably located in CpG islands, indicating a direct regulation of the transcriptional machinery by the Hey proteins. A comparison of the target genes from microarray analysis and ChIP-PET sequencing data demonstrates a large number of downregulated genes with binding sites that are directly bound by the Hey proteins. While 60 % of Hey2 downregulated genes contain binding sites, only 20 % of upregulated genes have binding sites for Hey2, invoking a repressor function for Hey proteins. To investigate, whether the Hey proteins regulate different target genes in a cell type specific manner, embryonic stem cells (ES cells) were generated which also overexpress doxycycline-inducible Hey1 or Hey2. These ES cells could be differentiated efficiently into cardiomyocytes and thus could also be used for gene expression analysis after induction of Hey overexpression. Microarray analysis of ES cells and cardiomyocytes resulted in more up- than downregulated genes in comparison to HEK293 cells. The overlap of common regulated genes in HEK293, ES cells and cardiomyocytes was very low. Only two Hey2 target genes were regulated more than 2-fold in both HEK293 and ES cells (Hes1, Zic2). This disparity indicates a narrow cell-type specific gene regulation by Hey proteins. Gene ontology analysis of all target genes demonstrated interactions of Hey proteins with different signaling pathways (e.g. TGFβ, Id or Wnt signaling), which are all indispensable for early developmental processes. These results show that Hey proteins influence and modulate gene expression levels in different signaling pathways in a cell-type specific manner. These data provide new possibilities for future research efforts to elucidate the role of Hey proteins in early organ development. KW - Gen notch KW - Transkriptionsfaktor KW - Embryonalentwicklung KW - Kardiovaskuläres System KW - bHLH KW - Hey KW - Chromatinimmunpräzipitation KW - Microarray KW - bHLH KW - Hey KW - Chromatin Immunoprecipitation Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65053 ER - TY - THES A1 - Dippacher, Sonja T1 - Morphologische und molekularbiologische Untersuchungen zur Bedeutung der Serin-Threonin-Proteinkinase SRPK79D in Drosophila melanogaster T1 - Morphological and molecular biological investigations on the role of serine threonine kinase SRPK779D in Drosophila melanogaster N2 - Die intakte Signalübertragung im animalischen Nervensystem erfordert eine an richtiger Stelle ausgebildete funktionsfähige Synapse zwischen zwei Nervenzellen bzw. zwischen Nerv und Muskel. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Mutante von Drosophila melanogaster untersucht, bei der es zu Veränderungen der Verteilung eines wichtigen Organisationsproteins der synaptischen aktiven Zone kommt. Ein wichtiges Ergebnis der Untersuchungen ist die Beobachtung, dass es in der Mutante zu einer ektopen Ausbildung von Elementen aktiver Zonen in Axonen kommt. In den Arbeitsgruppen von E. Buchner und S. Sigrist ist bereits das Protein Bruchpilot (BRP) charakterisiert worden, das Bestandteil der präsynaptischen Ribbons, bei Drosophila als T-bars bezeichnet, ist. Bei der Suche nach Interaktionspartnern von BRP, ist eine Serin-Arginin-Protein spezifische Kinase SRPK79D entdeckt worden, die offenbar an der Regulation des Aufbaus der Tbars beteiligt ist (Nieratschker et al., 2009). Es gibt vier verschiedene Isoformen der Kinase. Werden nur zwei Isoformen der Kinase (SRPK79D-RB und -RE) exprimiert bzw. das Gen der Kinase komplett ausgeschaltet, findet man Ansammlungen von BRP als immunreaktive Aggregate in der Immunfluoreszenz- Färbung von larvalen Motoneuron-Axonen (Nieratschker, 2008). Es ist unser übergeordnetes Ziel, die Funktion und den molekularen Signalweg der Kinase SRPK79D zu entschlüsseln. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, PB-Protein in Reinform für eine Affinitätsreinigung eines PB-Antikörpers zu gewinnen, um in nachfolgenden Untersuchungen die Lokalisation dieser Kinase-Isoform zu untersuchen. Die Proteinreinigung war erfolgreich, aber es gelang nicht, eine für eine Affinitätsreinigung ausreichende Menge des Proteins zu isolieren. Ein weiterer Versuch, Lokalisationsuntersuchungen zur Expression der Kinase in Drosophila- Embryonen durchzuführen, war ebenfalls nicht erfolgreich. Obwohl die Herstellung einer für die SRPK79D mRNA spezifischen RNA Sonde für die in-Situ-Hybridisierung gelang, war die Sensitivität dieser Sonde nicht hoch genug, um die Lokalisation vornehmen zu können. Eindeutige und aufschlussreiche Ergebnisse dagegen ergab die Untersuchung der Ultrastruktur der BRP-Ansammlungen in den larvalen Motornerven. Als deren Korrelat fanden sich elektronenmikroskopisch charakteristische Ansammlungen elektronendichter intraaxonaler Strukturen, deren Form Ähnlichkeiten zu T-bars aufwies und die von Vesikeln umgeben waren. Die elektronendichten Strukturen zeigten zahlreiche Formvariationen, die wie Ansammlungen von T-bars nebeneinander bzw. „miteinander verklebte“ T-bars oder wie zerstörte T-bars aussahen. In einer nachfolgenden Studie wurde durch eine immun-elektronenmikroskopische Untersuchung gezeigt, dass diese Strukturen in der Tat BRP enthalten (Nieratschker et al., 2009). Ergebnis der Untersuchungen der vorliegenden Arbeit war der Nachweis, dass prinzipiell ähnliche Aggregate auch im Wildtyp gelegentlich gefunden werden, dass sie aber in Mutanten signifikant häufiger vorkommen und auch einen signifikant höheren Durchmesser aufweisen. Doppelimmunreaktionen mit Antikörpern, die den C- bzw. N-terminalen Bereich von BRP erkennen, belegten darüber hinaus, dass in den Aggregaten das vollständige BRP-Protein vorliegt. Angeregt durch die Ultrastrukturbefunde von mit den elektronendichten Strukturen in den Aggregaten assoziierten Vesikeln wurde in weiteren Doppelimmunreaktionen untersucht, ob ein typisches Protein synaptischer Vesikel neuromuskulärer Synapsen in Drosophila, der vesikuläre Glutamattransporter (DVGlut), in den BRP-Ansammlungen nachweisbar ist. Während Kolokalisation von BRP und DVGlut in aktiven Zonen präsynaptischer Boutons nachgewiesen werden konnte, war der Vesikelmarker in BRP-Aggregaten nicht kolokalisiert. Die Ergebnisse belegen, dass die Kinase SRPK79D für die Vermeidung einer ektopen Bildung von BRP-enthaltenden, elektronenmikroskopisch atypischen aktiven Zonen ähnelnden Strukturen in larvalen Motoneuronaxonen notwendig ist. Die in diesen Aggregaten regelmäßig zu beobachtenden Vesikel ähneln morphologisch synaptischen Vesikeln, besitzen aber keine dafür typischen Vesikelmarker. N2 - Intact signal transmission in an animal’s nervous system requires a properly localized and functional synapse between two neurons or between neuron and muscle. This dissertation is part of the investigation of a Drosophila melanogaster mutant which displays alterations in the distribution of a synaptic active zone protein. An important result of the present study is the documentation of an ectopic formation of active zone structural elements in this mutant. Analyses carried out in the laboratories of E. Buchner and S. Sigrist contributed to the characterization of the protein Bruchpilot (BRP), a constituent of the T-bar, the characteristic presynaptic ribbon in Drosophila. Searching for interaction partners of BRP, a serine-arginine-protein specific kinase was identified that apparently regulates T-bar assembly (Nieratschker et al., 2009). There are four kinase isoforms. Knocking out two of these isoforms (SRPK79D-RB and -RE) results in accumulations of BRP-immunoreactive aggregates in the larval ventral nerves (Nieratschker, 2008). Further studies were designed to identify the function and molecular signalling pathways of the kinase SRPK79D. One objective of the present experiments was to produce purified PB-protein in order to enable affinity-purification of an antibody against this isoform of the kinase for subsequent specific immunohistochemical localization analyses. Although production of the antigen was successful, the amount of protein produced was too low to allow efficient affinity purification. An attempt to show the expression pattern of the kinase in Drosophila embryos with in-situ hybridization resulted in production of a SRPK79D specific RNAprobe, however, the probe sensitivity was not high enough to yield conclusive results for mRNA localization. Ultrastructural analyses of the BRP-ir aggregates in the larval ventral nerves, on the other hand, yielded definite and conclusive results. These aggregates corresponded to extensive intraaxonal electron-dense, ribbon-like structures surrounded by vesicles. These electron-dense structures were differently shaped and resembled accumulations of regularly shaped, clotted or dysmorphic T-bars, which in subsequent immuno-electronmicroscopic analyses carried out by another investigator were proven to contain BRP (Nieratschker et al., 2009). An important result of the present study was the observation that similar intraaxonal aggregates were occasionally also present in wild type nerves, however, the aggregates found in the mutants were significantly more frequent and of significantly larger size than those observed in wild-type larvae. Moreover, double-immunostaining using BRP-antibodies recognizing specifically the C- and the N-terminal part of the protein, respectively, provided evidence that the complete BRP protein is localized in the aggregates. Since electron microscopy had showed that numerous vesicles were associated with the electron dense aggregates, we tested whether the vesicular glutamate transporter (DVGlut), a marker protein for synaptic vesicles of motoneurons in Drosophila, could be localized in BRP-ir aggregates. While colocalization of BRP and DVGlut was observed at the presynaptic active zones, no colocalization of the synaptic vesicle marker was observed in the BRP-ir aggregates in the larval nerves. In conclusion, the results provide evidence that the kinase SRPK79D is required for the prevention of ectopic formation of BRP-containing ribbon-like structures in larval ventral nerves. These structures include vesicles resembling synaptic vesicles, which however do not display immunoreactivity for a typical synaptic vesicle marker protein. KW - Bruchpilot KW - BRP KW - Serin-Threonin-Kinase KW - SR-Protein Kinase KW - aktive Zone KW - Cytomatrix der aktiven Zone KW - Elektronenmikroskopie KW - Ultrastruktur KW - Bruchpilot KW - SR-Protein Kinase KW - aktive Zone KW - Cytomatrix der aktiven Zone KW - Ultrastruktur KW - Bruchpilot KW - synaptic active zone cytomatrix KW - SR protein kinase KW - ultrastructure KW - electron microscopy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70937 ER - TY - THES A1 - Schülein, Christina T1 - Die Regulation von Fbw7 durch PI3K-abhängige Phosphorylierung und Charakterisierung eines konditionalen Usp28-Knockout-Mausmodells T1 - Regulation of Fbw7 by PI3K-dependent phosphorylation and Characterization of a Usp28 conditional knockout mouse N2 - Das Proto-Onkoprotein Myc ist an der Entstehung und Aufrechterhaltung einer Vielzahl humaner Tumore entscheidend beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurde Serin 227 in Fbw7 als Ziel für eine PI3K-abhängige Phosphorylierung identifiziert. Diese Phosphorylierung führt zur Stabilisierung von Fbw7 und steigert die Fähigkeit von Fbw7, Substratproteine zu ubiquitinieren und abzubauen. Um die Bedeutung von Usp28 in der Myc-induzierten Tumorentstehung und in der normalen Gewebehomöostase zu untersuchen, wurde ein konditionales Knockout-Mausmodell für Usp28 charakterisiert. Mäuse mit einer Keimbahndeletion von Usp28 sind lebensfähig, fertil und phänotypisch unauffällig. Weder in Organen der Usp28-negativen Tiere, noch in entsprechenden murinen embryonalen Fibroblasten kann eine Destabilisierung von Myc festgestellt werden. Allerdings zeigen Fibroblasten mit heterozygotem Usp28-Verlust einen Proliferationsdefekt und in Eμ-Myc-Lymphomen dieses Genotyps werden tendenziell niedrigere Myc-Proteinmengen gefunden. Das tumorfreie Überleben ist bei den Eμ-Myc; Usp28 +/- Tieren verlängert. N2 - The proto-oncoprotein Myc is involved in the genesis and maintenance of a large fraction of human tumors. In this work, I identified serine 227 in Fbw7 as a target for PI3K-dependent phosphorylation. The phosphorylation leads to stabilization of Fbw7 and enhances its ability to promote ubiquitination and degradation of its substrates. To investigate the role of Usp28 in Myc-dependent tumorigenesis and in tissue homeostasis I characterized a Usp28 conditional knockout mouse model. Mice with a germline deletion of Usp28 are viable, fertile and phenotypically normal. No decrease in Myc protein levels could be detected in organs or embryonic fibroblasts of Usp28- knockout mice. Surprisingly, embryonic fibroblasts with a heterozygous Usp28 deletion showed a proliferative defect and Eμ-Myc lymphomas of this genotype showed a tendency to reduced Myc protein levels, corresponding to a longer tumorfree survival of these animals. KW - Myc KW - Phosphorylierung KW - Ubiquitinierung KW - Fbw7 KW - Usp28 KW - Deubiquitinierung KW - Knockout-Maus KW - PI3K KW - Fbw7 KW - Usp28 KW - deubiquitination KW - knockout mouse KW - PI3K Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70963 ER - TY - THES A1 - Vogel, Benjamin T1 - Organisation von Chromatin durch HMGA1 Proteine T1 - Organisation of chromatin through HMGA1 proteins N2 - HMGA1 Proteine sind kleine, basische, Nicht-Histon Proteine, die in Lösung keine Struktur aufweisen, durch drei AT-Haken, als DNA-Bindungsmotive, gekennzeichnet sind und präferentiell an die kleine Furche der DNA binden. Als differenziell exprimierte Architekturelemente des Chromatins erfüllen sie wichtige Funktionen bei der Regulation DNA abhängiger Prozesse in Zellen und während Entwicklungsprozessen. Aberrante Expressionen führen zu Entwicklungsdefekten und Krebs. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von HMGA1 Proteinen auf die Organisation des Chromatins untersucht. Als Modell diente dabei zunächst die Differenzierung von C2C12 Muskelvorläuferzellen. Wie in einer früheren Arbeit gezeigt wurde, ist die Herunterregulation von HMGA1a essentiell für den Eintritt von C2C12 Zellen in die Myogenese. Eine konstante Überexpression von HMGA1a-eGFP hingegen verhindert die Muskeldifferenzierung durch Beeinflussung der Expression myogenesespezifischer Gene und Etablierung einer stabilen Chromatinstruktur. Wie in der vorliegenden Arbeit herausgefunden wurde, nimmt die differenzielle HMGA1a Expression nicht nur Einfluss auf die Expression muskelspezifischer Gene, sondern auch auf die globale Zusammensetzung des Chromatins durch eine reduzierte Expression von H1 Histonen und einer aberranten Expression von HMGB1, HMGN1 und HP1 Proteinen. HMGA1a wurde zusammen mit ORC Proteinen eine Funktion bei der Definition von Replikationsursprüngen in eukaryotischen Zellen zugesprochen. ORC Proteine wurden auch als Komponenten des Heterochromatins und als Interaktionspartner von HP1α identifiziert. Hier konnte mit Hilfe von Co-Immunpräzipitationen, Pull-down Assays und Verdrängungsexperimenten gezeigt werden, dass HMGA1 ein weiterer, direkter Interaktionspartner von ORC Proteinen im Heterochromatin ist und zusammen mit HP1α kooperiert. Pull-down-, Verdrängungs- und siRNA-Experimente zeigten zudem, dass HMGA1 zwar nicht direkt mit HP1α interagiert, die Kooperation der Proteine über ORC aber dennoch wichtig für die Aufrechterhaltung der Heterochromatinsstruktur ist. Damit erweisen sich HMGA1 Proteine als wichtige Stabilisierungsfaktoren des Heterochromatins. Bislang ging man davon aus, dass HMGA1 Moleküle linear, also eindimensional, an ein DNA Molekül binden. Das Vorhandensein von drei DNA-Bindungsmotiven und die eher struktur- als sequenzabhängige Bindung an die DNA lassen vermuten, dass HMGA1 Proteine auch gleichzeitig an benachbarte DNA-Stränge, also auch dreidimensional, binden könnten. Bekräftigt wurde diese Vermutung durch die Bildung von Chromatinaggregaten in Zellen die HMGA1a-eGFP überexprimierten. Dies wurde mittels konfokaler und hochauflösender Mikroskopie (dSTORM) analysiert. Um das Potential einer DNA-Quervernetzung durch HMGA1 Proteine nachzuweisen, wurde eine neue Methode entwickelt. Mit Hilfe eines neuartigen DNA Cross-linking Assays wurde nachgewiesen, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind, zwei individuelle DNA Stränge zu vernetzen. Zudem wurde eine neue Domäne in HMGA1 entdeckt die maßgeblich zum Cross-linking beiträgt. Elektronenmikroskopische Analysen bestätigten, dass HMGA1 Proteine in der Lage sind Kreuzungen und Schleifen in DNA Molekülen zu erzeugen. Diese Ergebnisse unterstützen die Vermutung, dass HMGA1 Proteine im Zellkern ein DNA Gerüst bilden können, das Einfluss auf die zelltypische Chromatinorganisation nimmt und dadurch DNA abhängige Prozesse beeinflusst. In wie weit eine HMGA1 induzierte DNA Quervernetzung in vivo zum Beispiel in Chromozentren von C2C12 Zellen oder in Krebszellen, in denen HMGA1 Proteine stark überexprimiert sind, eine Rolle spielen, müssen künftige Untersuchungen zeigen. In dieser Arbeit konnte also gezeigt werden, dass HMGA1 Proteine die Chromatinstruktur auf drei Ebenen organisieren können: Durch Beeinflussung der Chromatinzusammensetzung durch Veränderung der Expression von Chromatinproteinen, durch Interaktion mit anderen Architekturelementen des Chromatins und durch Organisation eines potentiellen DNA Gerüsts. N2 - HMGA1 proteins are small basic non-histone proteins characterized by three DNA binding domains, the AT-hooks, which bind to the minor groove of DNA. As differentially expressed architectural chromatin proteins, they perform important functions in the regulation of DNA dependent processes and in development. Aberrant expression leads to developmental defects and cancer. In this thesis the influence of HMGA1 proteins on chromatin organization is investigated. Initially C2C12 myogenic precursor cells were studied, which can be differentiated to myotubes. Previously it had been shown that down-regulation of HMGA1 proteins is crucial for the initiation of myogenic differentiation. Constant over-expression of HMGA1a-eGFP prevents myogenic differentiation by influencing the expression of myogenic genes and by the establishment of a stable chromatin structure. Here it was shown that the differential HMGA1 expression does not only influence the expression of myogenic specific genes but also affects total chromatin composition. This was shown by reduced and aberrant expression of chromatin proteins such as histone H1, HMGB1, HMGN1 and HP1 proteins. Recently it was demonstrated that HMGA1 together with ORC proteins function in origin definition in eukaryotic cells. ORC proteins were also identified as components of heterochromatin and direct interaction partners of HP1α. Here, it was shown by co-immunoprecipitation, pull-down assays, siRNA and displacement experiments that HMGA1 proteins can interact with ORC proteins directly and that they can cooperate with HP1α in heterochromatin. It could be shown that HP1α indeed does not directly interact with HMGA1 but together with ORC proteins is relevant for heterochromatin maintenance. Thus HMGA1 proteins turned out to be important stabilizers of heterochromatin. Until recently it was thought that HMGA1 proteins bind DNA collinearly. In principle the three independent DNA binding AT-hooks of HMGA1 also suggest a concomitant binding to neighboring DNA strands, which could lead to a three dimensional stabilization of DNA. This assumption was affirmed by the occurrence of chromatin aggregates in HMGA1a-eGFP overexpressing cells, which was analyzed by confocal and high resolution (dSTORM) microscopy. By using a newly developed DNA cross-linking assay, which allows the analysis of a DNA crosslinking capability of a protein, it was proven that HMGA1 proteins can bind two individual DNA fibers simultaneously. Furthermore a novel domain in HMGA1 proteins was discovered which is significantly involved in the DNA cross-linking. Electron microscopic analyses confirmed that HMGA1 proteins can specifically generate crossings and loops in DNA molecules. These results support the assumption that HMGA1 proteins can create a DNA scaffold that has influence on cell typical chromatin organization and possibly also affects DNA dependent processes. To what extent HMGA1 induced DNA cross-linking plays a role in vivo, for example in the organization of chromocenters of C2C12 cells or in cancer cells, where HMGA1 proteins are over-expressed, will need to be elucidated in further experiments In summary, this work shows, that HMGA1 proteins influence chromatin structure and composition by affecting the expression of chromatin proteins, by interacting with other architectural chromatin proteins or by producing a higher organization of chromatin on its own. KW - Chromatin KW - HMG-Proteine KW - HMGA1 KW - Chromatin KW - dSTORM KW - HMGA1 KW - Chromatin KW - dSTORM Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-65295 ER - TY - THES A1 - Wende, Elisabeth Sophie T1 - Untersuchungen zur Rolle der melanominduzierenden Rezeptortyrosinkinase Xmrk bei der Migration melanozytärer Zellen T1 - A role for the melanoma-inducing receptor tyrosine kinase Xmrk in the migration of melanocytic cells N2 - Das maligne Melanom ist ein Hauttumor mit steigender Inzidenz und hohen Mortalitätsraten. Da die molekularbiologischen Ereignisse, die der Melanomentwicklung zugrundeliegen, nur unzureichend bekannt sind, gibt es kaum spezifische Therapieansätze. Zur Untersuchung der Melanomentwicklung eignet sich das Xiphophorus-Modell. In diesem System ist die Anwesenheit der RTK Xmrk ausreichend, um durch Aktivierung proliferativer und entdifferenzierender Signalwege und Apoptoseinhibition Melanome zu verursachen. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Xmrk auch die Migration der Melanozytenzellinie Melan a-Hm induzieren kann. Die Migration der durch Xmrk transformierten Zellen ist amöboid und unabhängig von MAPK- und PI3K-Signalwegen. Eine Funktion bei der Migration haben jedoch die Kinasen FAK und Fyn. Sie bilden möglicherweise einen Proteinkomplex, der für FAK und Src aus zahlreichen anderen Systemen bekannt ist und als Signalplattform für die Zellmigration fungiert. Diese Erkenntnisse können dazu beitragen, das Xiphophorus-Modell weiterzuentwickeln und die Grundlagen der Melanomgenese besser zu verstehen. N2 - Malignant melanoma is a tumor of the skin with increasing incidence and high mortality rates. As the biomolecular events underlying melanoma development are poorly understood, specific therapeutics for this disease are few. The Xiphophorus system is suitable for studying melanoma development. In this model, presence of the RTK Xmrk is sufficient to initiate melanoma formation by activating proliferative and anti-apoptotic pathways and interfering with differentiation. This work demonstrates that Xmrk is also able to induce migration of the melanocytic cell line Melan a-Hm. Cells transformed by Xmrk migrate in amoeboid fashion, independently of MAPK or PI3K pathways. However, kinases FAK and Fyn are involved in Melan a-Hm migration, possibly as a signal-integrating protein complex similar to the role that has been described for FAK and Src in various systems. The results from this work serve to extend the Xiphophorus model to other aspects of melanoma development and may help to better understand the molecular basis of melanoma. KW - Epidermaler Wachstumsfaktor-Rezeptor KW - Melanom KW - Zellmigration KW - Src-Proteine KW - Xiphophorus KW - fokale Adhäsionskinase (FAK) Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70945 ER - TY - THES A1 - Schramm, Sabine T1 - SYCE3, ein neues Synaptonemalkomplexprotein: Expression, funktionelle Analyse und Bindungspartner T1 - SYCE3, a novel synaptonemal complex protein:Expression, functional analysis and binding partners N2 - Der Synaptonemalkomplex ist eine evolutionär hoch konservierte Struktur. Er wird spezifisch während der Prophase I der Meiose ausgebildet und ist essentiell für die Segregation der homologen Chromosomen während der Meiose und auch für die Entstehung genetischer Vielfalt. Der Synaptonemalkomplex ist eine proteinöse Struktur, deren Aufbau dem einer Leiter ähnelt. Dabei werden die Leiterholme als Lateralelemente bezeichnet. Sie bestehen unter anderem aus den Proteinen SYCP2 und SYCP3 und assoziieren mit dem Chromatin der homologen Chromosomen. Die Stufen der Leiter bestehen hingegen aus Transversalfilamenten, deren Hauptkomponente parallele Homodimere des meiosespezifische Proteins SYCP1 sind. Dabei wird ein SYCP1 Dimer mit seinem C-Terminus in den Lateralelementen verankert und kann über seine N-terminale Domäne eine schwache Interaktion mit der N-terminalen Domäne eines gegenüberliegenden SYCP1 Dimers eingehen. Um diese Bindung zu stabilisieren werden Proteine des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes benötigt: Während SYCE1 durch seine Interaktion mit SYCP1 die N-terminale Assoziation zweier gegenüberliegender SYCP1 Dimere stabilisiert, verknüpfen die zwei anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE2 und Tex12 lateral benachbarte SYCP1 Filamente und breiten so das SYCP1 Netzwerk entlang der chromosomalen Achsen aus. Dieser Prozess wird als Synapse bezeichnet und stellt eines der Schlüsselereignisse der Meiose dar. Fehler während dieses Prozesses führen meist zu Aneuploidie der entstehenden Gameten oder zum Abbruch der Meiose und somit zu Infertilität des betroffenen Organismus. In dieser Arbeit wurde mit SYCE3 ein neues Protein des murinen Synaptonemalkomplexes charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass SYCE3 meiosespezifisch in Männchen und Weibchen exprimiert wird und Bestandteil des Zentralelements des Synaptonemalkomplexes ist. Hierbei zeigt es dasselbe Verteilungsmuster wie SYCP1 und SYCE1 und kann mit beiden Proteinen interagieren. Eine zusätzliche Interaktion konnte zwischen SYCE3 und SYCE2 nachgewiesen werden. Durch Untersuchungen an entsprechenden Knockout Mausmodellen konnte in dieser Arbeit außerdem gezeigt werden, dass SYCE3 in Abwesenheit von SYCP1 nicht an die chromosomalen Achsen rekrutiert werden kann. Die Ausbildung der Lateralelemente und auch die Anwesenheit der anderen zentralelementspezifischen Proteine SYCE1 und SYCE2 sind hingegen für die Anlagerung von SYCE3 an die chromosomalen Achsen nicht essentiell. Somit steht SYCE3 hinsichtlich seiner Bedeutung für die Paarung und die Synapse der homologen Chromosomen hierarchisch offenbar über den bisher beschriebenen Zentralelementproteinen SYCE1, SYCE2 und Tex12. Die funktionelle Bedeutung von SYCE3 für die Synapse der homologen Chromosomen und für den korrekten Ablauf der homologen Rekombination wurde im Rahmen dieser Arbeit durch die Herstellung und die Charakterisierung einer Syce3-/- Maus detailliert untersucht: Dabei führte der Knockout von SYCE3 zur Infertilität in beiden Geschlechtern, die gleichzeitig mit einer signifikanten Reduktion der Größe der entsprechenden Hoden und Ovarien im Vergleich zum Wildtyp einherging. Weitere Untersuchungen ergaben zudem, dass es in Syce3 defizienten Tieren zu einem Abbruch der Meiose kommt. Dabei hatte das Fehlen von SYCE3 keinen Einfluss auf die Ausbildung der Axialelemente. Die Initiation der Synapse hingegen war sowohl in Oocyten als auch in Spermatocyten in Abwesenheit von SYCE3 stark gestört. Darüber hinaus konnte in der vorliegenden Arbeit nachgewiesen werden, dass das Fehlen von SYCE3 Einfluss auf die homologe Rekombination nimmt: Zwar können sich frühe (DNA Doppelstrangbrüche) und intermediäre (Transitionsknoten) Rekombinationsereignisse in der Abwesenheit von SYCE3 ausbilden, die Prozessierung zu späten Rekombinationsstrukturen (Rekombinationsknoten) und die damit einhergehende Ausbildung von Crossing-over Strukturen fand jedoch nicht statt. Zusammengefasst wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass das neue Synaptonemalkomplexprotein SYCE3 essentiell für die Fertilität von Mäusen ist. Durch den Knockout von Syce3 kann die Synapse zwischen den Homoligen nicht initiiert werden und es findet kein Crossing-over statt. Im Assembly Prozess des Synaptonemalkomplexes agiert SYCE3 oberhalb der anderen zentralelementspezifischen Proteine und unterhalb von SYCP1. N2 - The synaptonemal complex is an evolutionary highly conserved structure. It assembles specifically during prophase I of meiosis and is essential for the segregation of homologous chromosomes and thus represents a major determinant of the genetic diversity of sexually reproducing organisms. The synaptonemal complex is a proteinacious, ladder-like structure. The ladder beams are termed lateral elements and are composed of the meiosis-specific proteins SYCP2 and SYCP3 which are associated with the chromatin of the homologs. The rungs are made up of transverse filaments mainly consisting of the meiosis-specific protein SYCP1. SYCP1 forms parallel homodimers that are anchored via their C-termini to the lateral elements and interact in a head-to-head fashion with an opposing SYCP1 homodimer. For stabilizing this interaction additional proteins are essential. These are components of the so-called central element of the synaptonemal complex: while SYCE1 stabilizes the N-terminal association of opposing SYCP1 homodimers, the two other central element specific proteins SYCE2 and Tex12 connect adjoined SYCP1 filaments and thus elongate the SYCP1 network along the homologs. This process is termed synapsis and is a key feature of meiosis. Errors occurring during this process frequently lead to aneuploidy of the resulting gametes or cause meiotic arrest and infertility. Within the scope of this study a novel protein of the murine synaptonemal complex, we named SYCE3, was characterized. SYCE3 is exclusively expressed during male and female meiosis and is a component of the central element. Its expression pattern resembles that of SYCP1 and SYCE1 and it is able to interact with both of these proteins. Additionally, an interaction between SYCE3 and SYCE2 could be verified. In the context of this dissertation it was found that loading of SYCE3 to the chromosomal axis requires SYCP1. In contrast, chromosome loading of SYCE3 was independent of lateral element assembly and of the presence of the other central element specific proteins, SYCE1, SYCE2 and Tex12. The second thematic complex addressed in this thesis was the relevance of SYCE3 for synapsis and homologous recombination. To this end a Syce3-/- mouse was generated. Syce3-/- mice are infertile and both testes and ovaries are characterized by a significant reduction in size compared to wild-type littermates. Furthermore, depletion of SYCE3 had no influence on the assembly of axial elements and in males alignment of homologs was not affected. However, Syce3-/- oocytes and spermatocytes were unable to initiate synapsis between homologous chromosomes. In addition, homologous recombination was analyzed in the scope of this study and the obtained data strongly points to a central role of SYCE3 during this process: while early (DNA double-strand breaks) and intermediate (transition nodules) recombination events could take place in the absence of SYCE3, structures indicating late recombination events (recombination nodules) and sites of homologous recombination (crossovers) failed to develop. Taken together, this thesis clearly demonstrates that the novel synaptonemal complex protein SYCE3 is essential for fertility in mice. Deletion of Syce3 blocks initiation of synapsis and formation of crossovers. During synaptonemal complex assembly, SYCE3 acts downstream of SYCP1, but upstream of other central element proteins (SYCE1, SYCE2 and Tex12). KW - Meiose KW - Molekularbiologie KW - Fertilität KW - Synaptonemalkomplex KW - Meiosis KW - Synaptonemal complex KW - fertility Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70903 ER - TY - THES A1 - Göb, Eva T1 - Die Kernhülle in Keimzellen: Strukturelle Besonderheiten, dynamische Prozesse und die Umgestaltung des Zellkerns während der Spermatogenese der Maus T1 - The nuclear envelope in germ cells: structural peculiarities, dynamic processes und the reorganization of the cell nucleus during murine spermatogenesis N2 - Die Kernhülle umgibt als geschlossenes Membransystem einen jeden Zellkern und ist damit ein gemeinsames Merkmal aller eukaryotischen Zellen. Sie besteht aus einer inneren und einer äußeren Kernmembran sowie der nukleoplasmatischen Kernlamina, die aufgrund zahlreicher assoziierter Proteine in enger Wechselbeziehung mit der inneren Kernmembran steht. Neben der rein räumlichen Trennung nukleärer und zytoplasmatischer Strukturen hat die Kernhülle bedeutenden regulatorischen Einfluss auf die gesamte Zelle. So ist sie unter anderem an der Steuerung der genomischen Aktivität, an der nukleo- und zytoplasmatischen Signalübertragung und in hohem Maße an der Positionierung und Formerhaltung des Zellkerns beteiligt. Es mehren sich die Hinweise, dass die Kernhülle auch während der Gametogenese, der Differenzierung befruchtungsfähiger Keimzellen, eine zentrale Rolle einnimmt und folglich auch mit bislang ungeklärten Ursachen humaner Infertilität in Kontext stehen könnte. Um die Bedeutung der Kernhülle für die Keimbahn der Säuger generell besser verstehen zu können, wurden in dieser Arbeit ausgewählte Bestandteile der Keimzellkernhülle untersucht. Dadurch sollte der Kenntnisstand erweitert werden, in welcher Weise die Kernhülle dynamische, morphologische und vor allem für die Keimbahn essentielle Prozesse beeinflusst; insbesondere während der meiotischen und der postmeiotischen Differenzierungsphase bei männlichen Mäusen. Im Mittelpunkt stand dabei einerseits Lamin C2, ein meiosespezifisches A-Typ Lamin, dessen Verlust zu einer schwer geschädigten Meiose und infolgedessen zu vollständiger männlicher Infertilität führt. Es zeigte sich, dass Lamin C2-defiziente männliche Mäuse schwerwiegende Defekte bei der Paarung und Synapsis der homologen Chromosomen in der meiotischen Prophase I aufweisen und aufgrund apoptotischer Spermatocyten keine reifen Spermien bilden können. Es wird angenommen, dass die Assoziation homologer Chromosomen bzw. die Abstoßung nicht-homologer durch gerichtete Telomerbewegungen entlang der Kernhüllenperipherie vorangetrieben bzw. verhindert wird. Da Lamin C2 seinerseits diese Wanderung der Telomere durch eine Flexibilisierung der Spermatocytenkernhülle vereinfachen soll, ist es durchaus vorstellbar, dass sein Verlust verlangsamte Telomerbewegungen, eine gestörte Homologenfindung und folglich Fehlpaarungen zur Folge hat. Ein weiteres zentrales Thema war die Erforschung potentieller LINC-Komplexe während der Differenzierungs- und morphologischen Umgestaltungsphase postmeiotischer Keimzellen. LINC-Komplexe sind kernhüllendurchspannende Proteingebilde aus SUN-Proteinen in der inneren und Nesprinen in der äußeren Kernmembran, die nukleäre Strukturen an das Zytoskelett binden. Da sie aufgrund dieser strukturellen Eigenschaft die Kernmorphologie beeinflussen können, erscheinen sie als äußerst geeignet, an der Formierung des Spermienkopfes beteiligt zu sein. Die detaillierte Untersuchung spermiogeneserelevanter LINC-Komplex-Bestandteile ergab, dass während der Spermiogenese tatsächlich zwei neue, strukturell einzigartige LINC-Komplexe gebildet werden, die darüber hinaus auf den entgegengesetzten Seiten differenzierender Spermatiden polarisieren. Da sie den Kern dort an jeweils spezielle Zytoskelettelemente binden könnten, wurde in dieser Arbeit das Modell der LINC-Komplex vermittelten Umformung des Spermienkopfes aufgestellt. Insgesamt trägt diese Arbeit durch die funktionelle Analyse von Lamin C2 und die Identifizierung neuer LINC-Komplexe dazu bei, die Wichtigkeit der Kernhülle für die Spermatogenese zu vertiefen und auszuweiten. N2 - The nuclear envelope is a double membranous structure enclosing the most typical eukaryotic feature, the cell nucleus. It is composed of an inner and an outer nuclear membrane as well as a nucleoplasmic lamina which is closely connected to the inner nuclear membrane by a number of associated proteins. Thus, besides just separating nuclear and cytoplasmic structures the nuclear envelope is functionally involved in many regulatory processes; i.e. controlling of the genomic activity, nucleo- and cytoplasmic signal transduction and, importantly, nuclear positioning and maintenance of nuclear architecture. Evidence emerges that the nuclear envelope also plays a fundamental role in the differentiation process of germ cells, gametogenesis, likely being responsible for yet unexplained human infertility. In order to expand the knowledge concerning impact and functions of the nuclear envelope for the mammalian germ line selected components and special characteristics of the germ cell nuclear envelope have been investigated in this thesis. Thus, this might help to understand germ line specific dynamic, morphological and other essential processes - particularly in course of meiotic and postmeiotic differentiation in male mice. Of great interest was lamin C2, a meiosis-specific A-type lamin essential for accurate meiosis and fertility of male mice. It has been shown that the targeted depletion of lamin C2 results in a severely defective meiosis and consequently in complete male infertility. Lamin C2-deficient male mice exhibit serious defects concerning pairing and synapsis of the homologous chromosomes. Thus, these mice are characterized by apoptotic spermatocytes and the complete absence of postmeiotic stages. It has been proposed that telomere movements along the nuclear periphery during prophase I might promote homologous but prevent heterologous chromosome association. Lamin C2 in turn is suggested to facilitate those meiotic telomere migrations by providing local flexibility to the telomeres attached to the nuclear envelope. Given that loss of lamin C2 causes decelerated telomere movements and defective homologous pairing afterwards, the situation in lamin C2-deficient spermatocytes could be explained. Another central focus was the investigation of potential LINC complexes in differentiating and morphologically reorganizing postmeiotic cells. LINC complexes are proteinaceous structures formed by SUN-proteins at the inner and nesprins at the outer nuclear membrane that tether the cell nucleus to the surrounding cytoskeleton. Since this structural property is suggested to influence nuclear morphology and shaping, LINC complexes appear to be good candidates for participating in mammalian sperm head shaping. Detailed analysis of LINC complex components relevant for spermiogenesis revealed that two novel uniquely assembled LINC complexes are established in the male post meiotic germ line. Moreover, those LINC complexes were shown to polarize to opposite cell poles in differentiating spermatids probably linking to specialized cytoskeletal elements. Therefore, a model for the LINC complex mediated shaping and elongation of the mammalian sperm head has been proposed in this thesis. Together, the functional analysis of lamin C2 as well as the identification of novel LINC complexes described in this thesis substantiates the fundamental role of the nuclear envelope for entire spermatogenesis. KW - Spermatogenese KW - Kernhülle KW - Lamina KW - Maus KW - Meiose KW - meiosis KW - spermiogenesis KW - nuclear envelope KW - lamina KW - LINC complex Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56839 ER - TY - THES A1 - Keidel, Kristina T1 - Charakterisierung des Hfq-Regulons in Bordetella pertussis und Bordetella bronchiseptica T1 - Characterisation of the Hfq regulon in Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica N2 - Bordetellen sind Gram-negative Kokkobazillen, die phylogenetisch zu den β-Proteobakterien zählen und in der Familie der Alcaligenaceae eingeordnet sind. Der bedeutendste Vertreter der Gattung, die nach heutigem Kenntnisstand neun Arten umfasst, ist Bordetella pertussis, der Erreger des Keuchhustens. Der Keim ist obligat humanpathogen und besitzt zahlreiche Virulenzfaktoren, um die Epithelzellen des Respirationstraktes zu besiedeln und zu zerstören, wodurch es zu dem charakteristischen Krankheitsverlauf kommt. Neben B. pertussis werden noch B. bronchiseptica und B. parapertussis dem sogenannten B. bronchiseptica-Cluster zugeteilt. Alle Vertreter des B. bronchiseptica-Clusters sind in der Lage, bei verschiedenen Wirtsspezies respiratorische Erkrankungen mit unterschiedlichem Schweregrad auszulösen. Dabei weist B. bronchiseptica ein breiteres Wirtsspektrum auf und kann Atemwegserkrankungen in einer Vielzahl von Säugetieren auslösen, wohingegen B. parapertussis vornehmlich Schafe und Menschen infiziert und bei letzteren eine schwächere Form des Keuchhustens bewirkt. Das Hfq-Protein wurde ursprünglich als Wirtsfaktor identifiziert, welcher für die Replikation des RNA-Phagen Qβ in Escherichia coli benötigt wird (host factor for Qβ oder HF-1). Es ist in Struktur und Funktion homolog zu den Sm-Proteinen aus Eukaryoten, die am Splicing von mRNAs involviert sind. Die Beteiligung des Hfq-Proteins an regulatorischen Vorgängen, die durch kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) vermittelt werden, wurde erstmals in einer Studie zum Mechanismus der rpoS-Regulation durch die kleine regulatorische RNA OxyS ersichtlich. Seitdem konnte für eine Vielzahl an sRNAs gezeigt werden, dass sie an Hfq gebunden vorliegen und die Hilfe des Proteins bei der post-transkriptionellen Kontrolle ihrer Ziel-mRNAs benötigen. In dieser Hinsicht übernimmt Hfq die Rolle eines RNA-Chaperons, indem es trans-kodierte sRNAs stabilisiert und die Basenpaarung mit ihren Ziel-mRNAs fördert. Dabei beeinflusst die Bindung der sRNA-Regulatoren an ihre Ziel-mRNAs deren Translation, sowohl aktivierend als auch inhibierend. Bislang wurden Hfq-Homologe in der Hälfte aller sequenzierten Gram-positiven und Gram-negativen Bakterienarten gefunden. Eine BLAST-Analyse ergab, dass B. pertussis und B. bronchiseptica Homologe zum Hfq-Protein aufweisen und diese in der veröffentlichten Genomsequenz bereits als Hfq-Protein annotiert sind. Fokus dieser Arbeit war weitestgehend, die Funktion des Hfq-Proteins in B. pertussis und vergleichend in B. bronchiseptica zu charakterisieren. Mittels Primer Extension-Analyse konnte zunächst der Startpunkt des hfq-Transkripts in B. pertussis und B. bronchiseptica unter logarithmischen Wachstumsbedingungen bestimmt werden. Dieser Startpunkt war zudem unter stationären Wachstumsbedingungen und nach Hitzestress aktiv, was in Diskrepanz zur Beobachtung in E. coli steht. Ferner konnte festgestellt werden, dass die hfq-Transkription nach Induktion verschiedener Stressformen in beiden Organismen erhöht war. Nach Generierung der jeweiligen Δhfq-Mutanten in beiden Organismen wurden diese charakterisiert. Die B. pertussis Δhfq-Mutante zeigte ein deutliches Wachstumsdefizit gegenüber dem Wildtyp, im Gegensatz zu B. bronchiseptica Δhfq, die sich im Wachstum wie der Wildtyp verhielt. Beide Mutanten zeigten sich sensitiver gegenüber H2O2-Stress als der Wildtyp, nicht jedoch gegenüber weiteren oxidativen Stressbedingungen oder Membranstress induzierenden Substanzen. Die Δhfq-Mutante in B. pertussis war zudem in ihrer Fähigkeit zur Biofilmbildung beeinträchtigt, was jedoch nicht für B. bronchiseptica Δhfq galt. Da Hfq an sRNA-mRNA-Interaktionen, welche die Translation der mRNAs beeinflussen, beteiligt ist, sollte über 2D-Gelelektrophorese das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica bestimmt werden. Auffällig war, dass viele periplasmatische Transport-bindeproteine von der Δhfq-Mutation betroffen waren. Es zeigten sich aber auch Stoffwechselenzyme und wichtige Housekeeping-Faktoren, wie z. B. der Elongationsfaktor EF-Tu und das Chaperon GroEL, in der Δhfq-Mutante dereguliert. Generell scheint das Hfq-regulierte Proteom in B. pertussis und B. bronchiseptica nur einen kleinen Teil des gesamten Proteoms auszumachen. Zudem ist das Hfq-regulierte Proteom variabel zwischen verschiedenen Wachstumsbedingungen, aber auch zwischen den beiden Organismen trotz der engen Verwandtschaft. Die Expression ausgewählter Virulenzfaktoren zeigte keinen Unterschied zwischen Δhfq-Mutante und B. pertussis-Wildtyp. N2 - Bordetellae are Gram-negative coccobacilli phylogenetically belonging to the β-group of proteobacteria and therein to the family of Alcaligenaceae. The most prominent member of the genus comprising nine species so far is Bordetella pertussis, the etiological agent of whooping cough. This organism is an obligatory human pathogen and expresses a variety of virulence factors in order to colonize and destroy the epithelial cells of the respiratory tract causing the characteristic symptoms of the disease. In addition to B. pertussis, B. bronchiseptica and B. parapertussis are assigned to the so-called B. bronchiseptica-cluster. All members of the B. bronchiseptica-cluster have the ability to cause respiratory symptoms with varying severity. B. bronchiseptica exhibits a broad host range causing respiratory symptoms in a variety of mammals, whereas B. parapertussis infects sheep and humans causing a milder form of whooping cough in the latter. The Hfq protein was originally identified as a host factor necessary for the replication of the RNA-phage Qβ in Escherichia coli (host factor for Qβ or HF-1). It is functionally and structurally homologous to Sm-proteins involved in splicing of mRNAs in eukaryotes. The involvement of Hfq in regulatory processes caused by small non-coding RNAs (sRNAs) was first recognized in a study on the mechanism of rpoS-regulation by the small regulatory RNA OxyS. Since then a variety of sRNAs were shown to be bound to Hfq and require its help for post-transcriptional control of their target-mRNAs. In this regard, Hfq functions as an RNA-chaperone by stabilizing trans-encoded sRNAs and their basepairing to target-mRNAs. Binding of the sRNA-regulators to their target-mRNAs thereby either activates or inhibits their translation. To date Hfq homologues were identified in half of all sequenced Gram-positive and Gram-negative bacterial species. BLAST analysis revealed that B. pertussis and B. bronchiseptica possess an Hfq homologue which has already been annotated as such in the published genome sequence. The main focus of this work was to characterize the function of the Hfq protein in B. pertussis as well as in B. bronchiseptica. By primer extension analysis we could identify the start of the hfq-transcript in B. pertussis and B. bronchiseptica under logarithmic growth conditions. This transcriptional start site was also active under stationary growth conditions and after heat shock which is discrepant from the observations in E. coli. Furthermore, it could be shown that the hfq-transcription was elevated in both B. pertussis and B. bronchiseptica under various stress conditions. Δhfq-mutants were established and characterized in both organisms. The Δhfq-mutant of B. pertussis exhibited a pronounced growth deficit in comparison to the wildtype whereas the Δhfq-mutant of B. bronchiseptica showed the same growth properties as the wildtype. Both Δhfq-mutants expressed a higher sensitivity to stress caused by H2O2 compared to the wildtype. However, there was no increased sensitivity of the Δhfq-mutants to other oxidative stress agents or membrane stress inducing agents. Furthermore, the Δhfq-mutant of B. pertussis but not the Δhfq-mutant of B. bronchiseptica was impaired in its ability to form biofilms. Since Hfq is involved in sRNA-mRNA-interactions affecting the efficient translation of mRNAs, the Hfq-regulated proteome of B. pertussis and B. bronchiseptica was determined by 2D-gelelectrophoresis. Strikingly, a variety of periplasmic binding proteins involved in transport were affected by the Δhfq-mutation. In addition, enzymes of various metabolic pathways and important housekeeping factors, such as elongation factor EF-Tu and the protein chaperone GroEL, were deregulated in the Δhfq-mutant. The Hfq-regulated proteome comprises generally only a small part of the complete proteome in B. pertussis and B. bronchiseptica. Furthermore, this Hfq-regulated proteome differs between certain growth conditions as well as between the two closely related organisms. No difference could be observed in the expression of selected virulence factors between B. pertussis Δhfq and wildtype. KW - Bordetella pertussis KW - Bordetella bronchiseptica KW - Regulon KW - Hfq KW - Bordetella pertussis KW - Bordetella bronchiseptica KW - regulon KW - Hfq Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66677 ER - TY - THES A1 - Heddergott, Niko T1 - Zellbiologische Aspekte der Motilität von Trypanosoma brucei unter Berücksichtigung der Interaktion mit der Mikroumwelt T1 - Cell biological aspects of motility of Trypanosoma brucei in consideration of the interaction with the microenvironment N2 - Trypanosomen sind Protozoen, die Krankheiten bei Mensch und Tier verursachen, die unbehandelt infaust verlaufen. Die Zellen sind hoch motil, angetrieben von einem einzelständigen Flagellum, welches entlang des Zellkörpers angeheftet ist. Selbst in Zellkultur hören Trypanosomen niemals auf sich zu bewegen und eine Ablation funktioneller Bestandteile des Flagellarapparates ist letal für Blutstromformen. Es wurde gezeigt, dass Motilität notwendig ist für die Zellteilung, Organellenpositionierung und Infektiosität. Dies macht Trypanosomen zu besonders geeigneten Modellorganismen für die Untersuchung der Motilität. Dennoch ist erstaunlich wenig über die Motilität bei Trypanosomen bekannt. Dies gilt auch noch genereller für die Protozoen. Unlängst ist dieses Gebiet allerdings in den Fokus vieler Arbeiten gerückt, was bereits erstaunliche, neue Erkenntnisse hervorgebracht hat. Doch Vieles ist noch nicht abschliessend geklärt, so z.B. wie der Flagellarschlag genau reguliert wird, oder wie sich der Schlag des Flagellums entlang des Zellkörpers ausbreitet. Die vorliegende Arbeit befasst sich besonders mit den Einflüssen, die die Mikroumgebung auf die Motilität von Blutstromform-Trypanosomen ausübt. In ihrem natürlichen Lebensraum finden sich Trypanosomen in einer hoch komplexen Umgebung wieder. Dies gilt sowohl für den Blutkreislauf, als auch für den Gewebezwischenraum in ihrem Säugerwirt. Die hohe Konzentration von Zellen, Gewebeverbänden und extrazellulären Netzwerken könnte man als Ansammlung von Hindernissen für die Fortbewegung auffassen. Diese Arbeit zeigt dagegen, dass der Mechanismus der Bewegung eine Adaptation an genau diese Umweltbedingungen darstellt, so z.B. an die Viskosität von Blut. Es wird auch ein Bewegungsmodell vorgestellt, das erläutert, worin diese Adaption besteht. Dies erklärt auch, warum die Mehrheit der Zellen einer Trypanosomenkultur eine ungerichtete Taumel-Bewegung aufweist in nieder-viskosem Medium, das keine solchen “Hindernisse” enthält. Die Zugabe von Methylcellulose in einer Konzentration von ca. 0,5% (w/v) erwies sich als geeigneter Ersatz von Blut, um optimale Bedingungen für gerichtetes Schwimmen von Blutstromform Trypanosomen zu erreichen. Zusätzlich wurden in dieser Arbeit unterschiedliche Arten von Hindernissen, wie Mikroperlen (Beads) oder molekulare Netzwerke, sowie artifizielle, geordnete Mikrostrukturen verwendet, um die Interaktion mit einer festen Matrix zu untersuchen. In deren Anwesenheit war sowohl die Schwimmgeschwindigkeit, als auch der Anteil an persistent schwimmenden Trypanosomen erhöht. Zellen, die frei schwimmend in Flüssigkeiten vorkommen (wie Euglena oder Chlamydomonas), werden effizient durch einen planaren Schlag des Flagellums angetrieben. Trypanosomen hingegen mussten sich evolutionär an eine komplexe Umgebung anpassen, die mit einer zu raumgreifenden Welle interferieren würde. Der dreidimensionale Flagellarschlag des, an die Zelloberfläche angehefteten, Flagellums erlaubt den Trypanosomen eine effiziente Fortbewegung durch die Interaktion mit Objekten in jedweder Richtung gleichermassen. Trypanosomen erreichen dies durch eine hydrodynamisch verursachte Rotation ihres Zellkörpers entlang ihrer Längsachse, entgegen dem Uhrzeigersinn. Der Einfluss der Mikroumgebung wurde in früheren Untersuchungen bisher vernachlässigt, ist zum Verständnis der Motilität von T. brucei jedoch unerlässlich. Ein weiterer, bisher nicht untersuchter Aspekt der Beeinflussung der Motilität durch die Umwelt sind hydrodynamische Strömungseffekte, denen Trypanosomen im kardiovaskulären System ausgesetzt sind. Diese wurden in dieser Arbeit mittels Mikrofluidik untersucht. Um unser Verständnis der Motilität von Trypanosomen von 2D, wie üblich in der Motilitätsanalyse mittels Lebend-Zell-Mikroskopie, auf drei Dimensionen auszudehnen, wurde als bildgebendes Verfahren auch die Holographie eingesetzt. Mikrofluidik und Holographie sind beides aufkommende Techniken mit großem Anwendungspotential in der Biologie, die zuvor noch nie für die Motilitätsanalyse von Trypanosomen eingesetzt worden waren. Dies erforderte daher interdisziplinäre Kooperationen. Zusätzlich wurde in dieser Arbeit auch ein vollständig automatisiertes und Software-gesteuertes Fluoreszenzmikroskopiesystem entwickelt, das in der Lage ist, einzelne Zellen durch entsprechende Steuerung des Mikroskoptisches autonom zu verfolgen und somit eine Bewegungsanalyse in Echtzeit ermöglicht, ohne weitere Benutzerinteraktion. Letztendlich konnte dadurch auch die Bewegung der schlagenden Flagelle und des gesamten Zellkörpers mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung mittels Hochgeschwindigkeits-Fluoreszenzmikroskopie aufgeklärt werden. N2 - Trypanosomes are protozoa causing fatal diseases in livestock and man. The cells show vivid motility, driven by a single flagellum that runs along the cell body, attached to the cell surface. Even in cell culture, trypanosomes never stop moving and ablation of functional components of the flagellum is lethal for bloodstream-forms. Motility has been shown to be essential for cell division, organelle positioning and infectivity. This renders trypanosomes valuable model organisms for studying motility. But, surprisingly little is known about motility in trypanosomes, as well as in protozoa, in general. Recently, motility of trypanosomes therefore has gotten into the spotlight of interest which brought some new insights, but many essential points are still a matter of debate, for example how the flagellar beat is regulated or how it is propagated along the cell body. In this work, the effects of the micro-environment of blood-stream form trypanosomes on motility were investigated. In their natural habitat, trypanosomes find themselves in a crowded environment. This is not only the case in the blood circulatory system, but also in extra-tissue space. The high concentration of cells and extra-cellular networks might be regarded as a kind of obstacle to cellular motion. This work shows that the mode of motility of bloodstream form trypanosomes instead is adapted to the viscosity of blood. Also a mechanistic model is presented which elucidates how this adaptation works. This also explains why most trypanosomes are tumbling in low-viscous cell culture medium, lacking other cellular components. Addition of Methylcellulose at a concentration of about 0.5% (w/v) was found to be a potent substitute for blood, providing optimal conditions for trypanosome motility. Also different types of obstacles like beads and molecular networks, as well as arranged pillar microstructures were used as a tool to mimic interaction with a solid matrix. In presence of these, the swimming speed as well as the percentage of persistent swimming cells was increased. Cells inhabiting an open-ranged environment (like Euglena or Chlamydomonas) are efficiently propelled by a planar flagellar wave. Trypanosomes in contrast, had to evolutionary adapt to a crowded environment, which would infer with any extensive planar wave. The three-dimensional flagellar beat of the attached flagellum allows trypanosomes to harness any rigid matrix for effective propulsion, in all directions equally. Trypanosomes achieve this by a rotational counter-clockwise motion of their whole cell body. Another environmental aspect for trypanosome motility that had not been studied before is the influence of hydrodynamic flow, which trypanosomes are subjected to, when swimming in the blood circulatory system. For studying this, in this work, the motilty of trypanosomes was analyzed in microfluidic devices. To extend our understanding of trypanosomal motility from 2D, like in standard microscopy based live-cell imaging analysis, to 3D, a imaging technique known as holography was used, in addition. Microfluidics as well as Holography both are emerging, high-potential techniques in biology, which had not been used for the motility analysis of trypanosomes before and establishing this therefore only got possible due to interdisciplinary collaborations. In addition, a custom fully automated, software-controlled, fluorescence microscopic system was developed in this work, which is able to track and follow single cells for motility analysis in real-time without the need for user input. The motion of the flagellar beat and the cell itself was investigated at high spatio-temporal resolution using highspeed fluorescence microscopy. KW - Trypanosoma brucei KW - Motilität KW - Blutviskosität KW - Hochgeschwindigkeitsmikroskopie KW - Mikrofluidik KW - Mikroumwelt KW - Mikrostrukturen KW - Trypanosomen KW - Blut KW - Trypanosoma KW - motility KW - blood KW - microfluidics KW - microenvironment Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56791 ER - TY - THES A1 - Schmull, Sebastian T1 - Charakterisierung der pathogenetisch-relevanten Rolle von SF1 beim Nebennierenrindenkarzinom T1 - Characterisation of the pathogenetic-relevant role of SF1 in adrenocortical carcinoma N2 - Tumore der Nebennieren stellen häufige Tumore dar, welche bei mindestens 3 % der Population über 50-Jähriger vorkommen. Im Gegensatz dazu ist das Nebennierenrindenkarzinom mit einer Inzidenz von 1-2 Einwohner pro Million ein sehr seltener Tumor. Da seine Prognose allerdings ungünstig, und diese maßgeblich davon abhängt wie fortgeschritten der Tumor bei Diagnosestellung ist, ist es wichtig, dass die richtige Diagnose frühzeitig gestellt wird. Bis heute ist kein zuverlässiger immunhistochemischer Nebennierenrindenkarzinom-spezifischer Marker etabliert um das Nebennierenrindenkarzinom von anderen retroperitonealen Tumoren zu differenzieren. Sasano et al. schlug bereits 1995 erstmalig den Transkriptionsfaktor Steroidogenic Factor 1 (SF1) als Marker zur Differenzierung von Nebennierenrinden- und Nicht-Nebennierenrindentumoren vor. Allerdings wurde die diagnostische Wertigkeit bisher nur in sehr kleinen Fallserien mit insgesamt nur 17 Nebennierenrindenkarzinomen untersucht. In der vorliegenden Arbeit wurde die SF1 Protein-Expression bei 163 Nebennierenrindenkarzinomen, 52 Nebennierenrinden-Adenomen, 12 normalen steroidogenen Geweben (6 Nebennieren und 6 Ovare), sowie 73 Nicht-Steroidtumoren immunhistochemisch untersucht. Hierbei zeigte sich, das SF1 bei 158 von 161 evaluierbaren Nebennierenrindenkarzinomen und bei allen Proben von normalen und gutartigen Geweben (n=64) nachweisbar war. Im Gegensatz dazu war keine der 73 Nicht-Steroidgeweben SF1 positiv, so dass die diagnostische Genauigkeit extrem gut ist (Sensitivität: 98.6 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value jeweils 100 % und 97.3 %). In einem zweiten Schritt wurde untersucht ob die Protein-Expression von SF1 beim Nebennierenrindenkarzinom auch prognostische Bedeutung hat. Hierbei zeigte sich, dass Patienten mit Tumoren mit starker SF1 Färbung (30 %) ein deutlich schlechteres tumorstadium-adjustiertes Rezidiffreies- und Gesamt-Überleben haben als Patienten mit geringer SF1 Expression (hazard ratio: 2.45). Zusätzlich zu den immunhistochemischen Untersuchungen wurden FISH Analysen durchgeführt. Hierbei zeigte sich allerdings keine signifikante Korrelation zwischen SF1 Gendosis und der SF1 Protein-Expression, so dass zu vermuten ist, dass SF1 maßgeblich auf Transkriptions- und Translationsebene reguliert wird. In einem Versuch diese Frage zu beantworten wurden zwei mutmaßliche SF1 Interaktionspartner, FATE1 und DAX1, genauer immunhistochemisch untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass FATE1 bei 62 von 141 evaluierbaren Nebenierenrindenkarzinomen und 12 von 62 normalen und gutartigen Geweben nachweisbar war. Im Gegensatz hierzu waren alle 9 Nicht-Steroidgewebe FATE1 negativ. Dies zeigt, das FATE1 nicht zur Diagnostik nutzbar ist (Sensitivität: 61 %, Spezifität: 100 %, positive und negative predictive value 100 % bzw. 14 %). Die DAX1 Analyse zeigte, dass alle 20 normalen und gutartigen Gewebe eine positive DAX1 Färbereaktion zeigten. Von 126 Nebennierenrindenkarzinomen waren 71 DAX1 positiv. Von den 8 untersuchten Nicht-Steroidgeweben waren 6 DAX1 positiv. Diese Ergebnisse belegen, dass auch DAX1 keine diagnostische Genauigkeit besitzt (Sensitivität: 56 %, Spezifität: 25 %, positive und negative predictive value 92 % bzw. 4 %). Die Untersuchung der prognostischen Fähigkeiten von FATE1 und DAX1 zeigte, dass Patienten mit Tumoren mit starker FATE1 Färbung (39 %) ein schlechteres tumorstadium-adjustiertes Gesamt- aber nicht Rezidiffreies-Überleben haben als Patienten mit niedriger FATE1 Protein-Expression (hazard ratio: 2.01). Weiterhin wurde deutlich, dass DAX1 keine deutlichen prognostischen Fähigkeiten besitzt. Zusammenfassend läßt sich aus der vorliegenden Arbeit folgern, das SF1 aktuell der beste diagnostische Marker zur Diagnose von Tumoren der Nebennierenrinde ist und damit Eingang in die histopathologische Routine-Diagnostik von Nebennierentumoren finden wird. Zusätzlich ist die SF1 Expression ein sehr guter prognostischer Marker beim Nebennierenrindenkarzinom, wobei sich die prognostische Aussage durch zusätzliche Färbung von FATE1 und DAX1 nur unwesentlich verbessern läßt. N2 - Adrenal tumors are common tumors which are present in at least 3 % in the human population over their 5th decade. However, adrenocortical carcinoma (ACC) is a rare malignancy which shows an approximate anual incidence of 1-2 per million. Prognosis of ACC is generally poor and depends strongly on the tumor stage. Thus, early and correct diagnosis is important. Until now, no reliable immunohistochemical ACC-specific marker has been established for its differentiation from other retroperitoneal tumors. Already in 1995, Sasano et al. suggested the transcription factor Steroidogenic Factor 1 (SF1) as useful marker for differentiation of adrenocortical and non-adrenocortical tumors. Up to now, SF1's value as diagnostic marker for ACC was investigated only in small series of in a total of 17 samples. In our work, SF1 expression was investigated by immunohistochemistry in 163 ACC, 52 adrenocortical adenomas, 12 normal steroidogenic tissues (6 adrenal glands and 6 ovaries), as well as 73 non-steroidogenic tumors. SF1 protein expression was shown in 158 of a total of 161 evaluable ACC, as well as all normal and benign steroidogenic tissues. In contrast, no SF1 protein was detectable in the non-steroidogenic tumors. Thus, SF1 protein expression is a highly specific diagnostic tool (sensitivity: 98.6 %, specificity: 100 %, positive and negative predictive value: 100 % and 97.3 %, respectively). In a second step, SF1 protein expression was investigated as a prognostic tool in ACC. As shown by us, ACCs presenting strong SF1 immunoreactivity (30 %) showed a strong correlation with overall and recurrence-free patients survival than ACCs presenting low SF1 protein expression (hazard ratio: 2.45). Moreover, FISH analyses were performed which revealed no significant correlation of SF1 gene dosis and SF1 protein expression, suggesting a regulatory mechanism at transcriptional and translational level. To investigate the hypothesis, we investigated two putative interaction partners of SF1, namely FATE1 and DAX1 protein, by immunohistochemistry. FATE1 protein was expressed in 62 of a total of 141 evaluable ACC as well as 12 of a total of 62 normal and benign steroidogenic tissues. In contrast, all non-steroidogenic tissues were FATE1 negative (n=9). Thus, FATE1 is no valuable diagnostic tool (sensitivity: 61 %, specificity: 100 %, positive and negative predictive value: 100 % and 14 %, respectively). DAX1 immunohistochemistry showed that all normal and benign steroidogenic tissues (n=20) were DAX1 positive as well as 71 of a total of 126 ACC samples. Furthermore, 6 out of a total of 8 non-steroidogenic tissues stained DAX1 positive, showing that DAX1 protein is no diagnostic tool (sensitivity: 50 %, specificity: 25 %, positive and negative predictive value: 92 % and 4 %, respectively). Investigation of the prognostic value of FATE1 and DAX1 revealed that patients with tumors characterized by strong FATE1 immunoreactivity (39 %) had a worse outcome in overall but not recurrence-free survival than patients showing low FATE1 expression (hazard ratio: 2.01). DAX1 protein expression has no prognostic value in ACC. In summary, we showed that SF1 is currently the best available diagnostic marker for differentiation of adrenocortical tumors from other retroperitoneal tumors, and that it will be suitable for histopathological diagnostic routine. Furthermore, SF1 expression is a well-suited prognostical tool in adrenocortical carcinoma which is only marginally enhanced by subsequent staining of FATE1 and DAX1 protein. KW - Nebennierenrindenkrebs KW - Biomarker KW - Ereignisdatenanalyse KW - Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung KW - Immuncytochemie KW - Adrenocortical carcinoma KW - Biomarker KW - Survival analysis KW - Fluorescence in situ hybridization KW - Immunohistochemistry Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66398 ER - TY - THES A1 - Azzami, Klara T1 - Antibakterielle und antivirale Abwehrreaktionen in unterschiedlichen Entwicklungsstadien der Honigbiene (Apis mellifera) T1 - Antibacterial and antiviral defence reactions in different developmental stages of the honey bee (Apis mellifera) N2 - Das angeborene Immunsystem von Insekten besteht aus einer humoralen Komponente, einer zellulären Komponente und dem Prophenoloxidase-aktivierenden System. Fast alle Erkenntnisse über das angeborene Immunsystem stammen von Arbeiten mit Modellorganismen wie z.B. Drosophila oder Anopheles gambiae. Wie genau das Immunsystem der Honigbiene (Apis mellifera) funktioniert, ist jedoch noch relativ unbekannt. In der vorliegenden Arbeit wurden die unterschiedlichen Immunreaktionen aller drei Entwicklungsstadien der Honigbiene nach artifizieller Infektion mit Gram-negativen und Gram-positiven Bakterien (Escherichia coli und Micrococcus flavus) und dem Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) untersucht und verglichen. Eine E. coli-Injektion zeigt bei Larven und adulten Arbeiterinnen nur wenig Auswirkung auf das äußere Erscheinungsbild und die Überlebensrate. In beiden Entwicklungsstadien wird die humorale Immunantwort stark induziert, erkennbar an der Expression der antimikrobiellen Peptide (AMPs) Hymenoptaecin, Defensin1 und Abaecin. Zusätzlich werden allein in Jungbienen nach bakterieller Infektion vier weitere immunspezifische Proteine exprimiert. Unter anderem eine Carboxylesterase (CE1) und das Immune-Responsive Protein 30 (IRp30). Die Expression von CE1 und IRp30 zeigt dabei den gleichen zeitlichen Verlauf wie die der AMPs. In Jungbienen kommt es zudem nach E. coli-Injektion zu einer raschen Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe, was auf eine Aktivierung der zellulären Immunantwort schließen lässt. Ältere Bienen und Winterbienen zeigen eine stärkere Immunkompetenz als Jungbienen. Selbst nicht-infizierte Winterbienen exprimieren geringe Mengen der immunspezifischen Proteine IRp30 und CE1. Die Expression von IRp30 kann dabei durch Verwundung oder Injektion von E. coli noch gesteigert werden. Eine weitere Besonderheit ist die im Vergleich zu Jungbienen raschere Abnahme an lebenden Bakterien in der Hämolymphe bis hin zur vollständigen Eliminierung. Die Reaktion von Puppen auf eine bakterielle Infektion war völlig unerwartet. Nach Injektion von E. coli-Zellen kommt es innerhalb von 24 h p.i. zu einem tödlichen Kollaps, der sich in einer Graufärbung des gesamten Puppenkörpers äußert. Da keine Expression von AMPs nachzuweisen war, wird die humorale Immunantwort offensichtlich nicht induziert. Auch die zelluläre Immunantwort scheint nicht aktiviert zu werden, denn es konnte keine Abnahme an lebenden E. coli-Zellen beobachtet werden. Aufgrund dieser fehlenden Immunreaktionen vermehrt sich E. coli im Hämocoel infizierter Puppen und scheint damit deren Tod herbeizuführen. Nach viraler Infektion wurden in allen drei Entwicklungsstadien der Honigbiene gänzlich andere Reaktionen beobachtet als nach bakterieller Infektion. Bei dem verwendeten Akuten Bienen Paralyse Virus (ABPV) handelt es sich um ein Picorna-ähnliches Virus, dessen Vermehrung in der Hämolymphe über die massive Synthese der Capsidproteine verfolgt werden kann. Eine Injektion von sehr wenigen ABPV-Partikeln ins Hämocoel hat dramatische Auswirkungen auf Larven. Nach Virusinjektion kommt es innerhalb weniger Stunden zu einer raschen Virusvermehrung und schon 24 h p.i. zum Tod, häufig begleitet von einer Schwarzfärbung der gesamten Larve. Kurz vor dem Ableben kommt es neben dem Abbau hochmolekularer Speicherproteine zur Expression zahlreicher Proteine, die u.a. an der Translation oder dem Schutz vor oxidativem Stress beteiligt sind. Auf Jungbienen hat eine ABPV-Infektion keine so dramatischen Auswirkungen wie auf Larven. Sie zeigen lediglich Zeichen von Paralyse, zudem überleben sie länger bei höheren injizierten Partikelzahlen, die Virusvermehrung ist langsamer und es kommt zu keiner starken Veränderung des Hämolymph-Proteinmusters. Es konnte gezeigt werden, dass es in ABPV-infizierten Larven oder adulten Bienen zu keiner erkennbaren Aktivierung des humoralen Immunsystems in Form von exprimierten AMPs kommt. Zudem scheint die humorale Immunantwort auch nicht unterdrückt zu werden, denn nach gleichzeitiger Injektion von E. coli und ABPV kommt es neben der Expression viraler Capsidproteine auch zur Expression von AMPs. Zusätzlich konnte in Jungbienen nach Infektion mit ABPV eine zelluläre Immunantwort in Form von Nodulation ausgeschlossen werden. Ältere Bienen scheinen nicht nur mit bakteriellen Infektionen, sondern auch mit einer ABPV-Infektion besser zurechtzukommen. Bei einer Menge an ABPV-Partikeln, die in Jungbienen spätestens 72 h p.i. zum Tod führt, ist in Winterbienen eine Virusvermehrung erst ab 96 h p.i. erkennbar und diese beeinträchtigt die Überlebensrate kaum. Puppen sind einer Virusinfektion genauso schutzlos ausgeliefert wie einer Bakterieninfektion. Es kommt zwar zu keiner starken Änderung des äußeren Erscheinungsbildes, jedoch bleiben Puppen in ihrer Entwicklung komplett stehen. Das Virus muss sich daher stark vermehren, allerdings nicht überwiegend - wie bei Larven und adulten Bienen - in der Hämolymphe. N2 - The innate immune system of insects comprises of a humoral component, a cellular component and the prophenoloxidase-activating system. Almost all knowledge about the innate immune system derives from model organisms like Drosophila or Anopheles gambiae. The exact mechanisms of the innate immune system of the honey bee (Apis mellifera) have yet to be discovered. This work investigates and compares the immune reactions of all three developmental stages of the honey bee after artificial infection with Gram-negative (Escherichia coli) and the Acute bee paralysis virus (ABPV). After injection of E. coli neither a change in the outer appearance nor a significant reduction of the survival rate of larvae or adult worker bees can be observed. In both developmental stages, a strong induction of the humoral immune response visible by the expression of the antimicrobial peptides (AMPs) hymenoptaecin, defensin1 and abaecin occurs. However, bacterial challenge of young adult worker bees leads to the expression of additional immune-specific proteins: a carboxylesterase (CE1) and the immune-responsive protein (IRp30). The expressions of CE1 and IRp30 show the same time course as the expression of AMPs. Furthermore, after injection of E. coli-cells into the haemocoel of young adult worker bees a fast decrease of living bacteria in the haemolymph could be observed. Older bees show a stronger immune competence in many ways. In winter bees even non-infected individuals express constitutively low amounts of the immune-responsive proteins IRp30 and CE1. The expression of IRp30 can still be enhanced by wounding or injection of E. coli. Moreover, older bees display a drastic reduction of living bacteria in the haemolymph as compared to young adult worker bees resulting in an almost complete elimination. Pupae in contrast react surprisingly different to a bacterial challenge. Injection of living E. coli-cells leads to a deadly collapse within 24 h p.i. accompanied by a colour change of the whole pupal body from white to grey. Since no visible expression of AMPs could be detected, the humoral immune response obviously was not induced. The same appears to be true for the cellular immune response, as no decrease in living E. coli-cells was observed upon infection. Because of this lack of humoral and cellular immune reactions, E. coli can proliferate in the haemocoel of infected pupae and potentially cause their death. All three developmental stages of the honey bee show completely different reactions to a viral infection than to a bacterial challenge. The Acute bee paralysis virus (ABPV) used in this study is a picorna-like virus with a positive, single-stranded RNA-genome and a non-enveloped protein capsid. Its proliferation in the haemocoel can be monitored by a massive synthesis of capsid proteins in the haemolymph. In contrast to a bacterial challenge, injection of only a few ABPV-particles into the haemocoel has tremendous effects on larvae. Injection of viral particles leads to a strong viral multiplication within hours and to death 24 h p.i. often accompanied by a colour change of the whole larva from pale-white to black. In addition to a visible degradation of high-molecular storage proteins shortly before the larvae die, the expression of proteins involved in translation or protection against oxidative stress can be observed. Young adult worker bees do not show such a tremendous reaction as larvae to a viral infection. They just display signs of paralysis. In contrast to larvae, young adult worker bees show better survival rates for higher numbers of injected virus-particles, the viral multiplication proceeds slower and there is no strong visible change of the haemolymph protein pattern. It could be demonstrated that no expression of AMPs and therefore no detectable activation of the humoral immune system by the virus occurs. But the humoral immune reponse also does not seem to be suppressed, since a simultaneous injection of E. coli and ABPV leads to the expression of viral capsid proteins in concert with the expression of AMPs. Additionally, nodulation, a prominent cellular immune response of young adult worker bees to bacterial infection, is likewise not initiated by ABPV-infection. Older bees apparently are not only capable of better fighting a bacterial infection, but also in surviving an ABPV-infection. Injection of an amount of viral particles leading to death of young adult worker bees within 72 h p.i., only leads to just detectable amounts of virus in winter bees 96 h p.i.. At the same time, the survival rate is not more impaired than after E. coli-injection. Pupae are as susceptible to a viral infection as to bacterial challenge. Although there is no strong visible change in the outer appearance, the pupaes’ development ceases within 3 d p.i.. This is possibly due to a strong multiplication of the virus, but obviously not mainly in the haemolymph, as it can be observed in larvae and adult bees as well. KW - Biene KW - Akute Paralyse KW - Immunsystem KW - Akutes Bienen Paralyse Virus KW - angeborenes Immunsystem KW - honey bee KW - Acute bee paralysis virus KW - innate immune system Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-66452 ER - TY - THES A1 - Donat, Ulrike T1 - Detektion und Therapie von Metastasen des humanen Prostatakarzinoms durch das onkolytische Vaccinia-Virus GLV-1h68 T1 - Detection and therapy of human prostate carcinoma metastases with the oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 N2 - Zurzeit sterben jährlich ca. 11.000 Männer in Deutschland am Prostatakarzinom. Damit stellt dies die zweithäufigste Krebstodesursache von Männern dar. Da das Prostatakarzinom häufig asymptomatisch verläuft, wird die Erkrankung oftmals erst so spät erkannt, dass zum Zeitpunkt der Diagnose bereits eine Metastasierung stattgefunden hat. Durch metastasierende Prostatakarzinomzellen werden Lymphknoten, Knochen und Lungen befallen. Es sind zwei unterschiedliche Verbreitungsarten von metastasierenden Tumorzellen beschrieben. Zum einen kann eine Migration über Lymphgefäße erfolgen, ein Prozess der als lymphatische Metastasierung bezeichnet wird. Zum anderen können Tumorzellen über das Blutsystem im Körper zirkulieren: die hämatogene Metastasierung. In dieser Arbeit wurde die lymphatische Metastasierung der humanen Prostatakarzinomzellline PC-3 im Detail analysiert und Teilaspekte der hämatogenen Verteilung untersucht. Ausgangspunkt der Untersuchungen bildete die Vergrößerung lumbaler und renaler Lymphknoten in PC-3-Tumor-tragenden Mäusen 60 Tage nach der Implantation von PC-3-Zellen. Es wurde daraufhin der zeitliche Verlauf der Vergrößerung untersucht und festgestellt, dass sowohl das Volumen als auch die Anzahl vergrößerter Lymphknoten von Woche zu Woche nach Implantation der PC-3-Tumore zunehmen. Anschließend wurden alle vergrößerten Lymphknoten bezüglich des Vorhandenseins von metastasierenden humanen PC-3-Zellen in den Mäusen untersucht. Dies geschah mit Hilfe einer RT-PCR unter Verwendung von Primern für humanes β-Aktin. Sechs Wochen nach Implantation konnten in 90 % der vergrößerten Lymphknoten PC-3-Zellen nachgewiesen werden. Weiterhin wurde durch lentivirale Transduktion das Gen für das rot fluoreszierende Protein (RFP) in die PC-3-Zellen inseriert, wodurch eine Visualisierung dieser Zellen in der Maus ermöglicht wurde. Es konnten metastasierende PC-3-RFP-Zellen in lumbalen und renalen Lymphknoten PC-3-RFP-Tumor-tragender Mäuse nachgewiesen werden. Ebenso konnte mittels RFP gezeigt werden, dass die Lymphknotenmetastasierung in Abhängigkeit von der Lokalisation des PC-3-RFP-Tumors erfolgt. Es kam zur Metastasierung jener Lymphknoten, in deren Einzugsgebiet sich der PC-3-Tumor befand. Es wurde eine PC-3-RFP-Zellmigration zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen nachgewiesen und bei immunhistologischen Untersuchungen stellte sich heraus, dass PC-3-RFP-Zellen tatsächlich in lymphatischen Bahnen zwischen lumbalen und renalen Lymphknotenmetastasen migrieren. Außerdem wurde gezeigt, dass es von Woche zu Woche nach Implantation von PC-3-Zellen zu einer Zunahme der Anzahl von Lymphgefäßen in PC-3-Tumoren kommt. Die Zunahme der Lymphgefäßdichte korrelierte hierbei positiv mit der Bildung von Lymphknotenmetastasen. Es konnten weiterhin neben Lymphknotenmetastasen hämatogene Mikrometastasen in den Lungen PC-3-RFP-Tumor-tragender Mäuse beobachtet werden. Da die Haupttodesursache von Prostatakarzinompatienten in der Bildung von Metastasen liegt, ist es von herausragender Bedeutung eine effektive Therapie gegen lymphatische und hämatogene Metastasen zu entwickeln. Aus diesem Grund erlangt die onkolytische Virustherapie große Bedeutung. Deshalb wurde als zweiter Aspekt in dieser Arbeit der Einfluss des onkolytischen Vaccinia-Virus GLV-1h68 auf den Prozess der PC-3-Zellmetastasierung untersucht. Dabei konnte zunächst gezeigt werden, dass GLV-1h68 in der Lage ist, erfolgreich sowohl migrierende PC-3-Zellen als auch metastasierende PC-3-Zellen in Lymphknoten zu kolonisieren. In der Folge wurde deshalb ein möglicher Metastasen-inhibierender Effekt von GLV-1h68 untersucht. Hierbei stellte sich heraus, dass GLV-1h68 drei Wochen nach intravenöser Injektion eine signifikante Reduktion der Anzahl der für PC-3-Zellen positiven Lymphknoten bewirkt. Des Weiteren konnte ein inhibierender Effekt von GLV-1h68 auf die im Blut zirkulierenden PC-3-Zellen und auf hämatogene Metastasen in den Lungen beobachtet werden. Durch intravenöse Injektion von GLV-1h68 in PC-3-RFP-Tumor-tragenden Mäusen konnte gezeigt werden, dass es zu einer präferentiellen Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen im Vergleich zu den Tumoren kommt. Auch nach intraperitonealer und intratumoraler Injektion von GLV-1h68 konnte eine präferentielle Virus-Kolonisierung der Lymphknotenmetastasen gezeigt werden. Darüber hinaus wurden die Lymph- und Blutgefäße von PC-3-Tumoren und Lymphknotenmetastasen analysiert. Hierbei wurde gezeigt, dass es sieben Tage nach intravenöser Injektion von GLV-1h68 zu einer signifikanten Abnahme von beiden Gefäßarten kam. Es wurde in dieser Arbeit somit gezeigt, dass GLV-1h68 in der Lage ist, sowohl lymphatische als auch hämatogene Metastasen der Prostatakarzinomzelllinie PC-3 erfolgreich zu eliminieren. Folglich dürften onkolytische Vaccinia-Viren ein vielversprechendes Therapeutikum für die Behandlung des fortgeschrittenen Prostatakarzinoms darstellen. N2 - Every year about 11,000 men in Germany are dying because of prostate carcinoma. Thus, prostate carcinoma represents the second leading cause of cancer related death in men. Since the prostate carcinoma usually proceeds asymptomatically the diagnosis is often made when metastases have already formed. Human prostate cancer usually spreads to lymph nodes, bones and lungs. There are two ways for tumor cells to migrate to other parts of the body: through lymphatic vessels, a process called lymphatic metastasis, or through the blood system, the hematogenous metastasis. In this thesis the lymphatic metastasis of the human prostate carcinoma cell line PC-3 was analyzed in detail while the hematogenous spread was only partially investigated. The initial point of these investigations was the enlargement of lumbar und renal lymph nodes in PC-3 tumor-bearing mice 60 days post implantation of PC-3 cells. Thereafter the time course of the enlargement was assessed. It turned out that the volume as well as the number of enlarged lymph nodes increased from week to week post implantation of PC-3 tumors. Subsequently, all enlarged lymph nodes were tested for the presence of human PC-3 cells in mice. This was done with the help of an RT-PCR using primers for human β-actin. Six weeks post implantation 90% of all enlarged lymph nodes were positive for PC-3 cells. Furthermore, the gene of the red fluorescent protein (RFP) was inserted into PC-3 cells via lentiviral transduction. By using fluorescence microscopy PC-3-RFP cells could be detected in lumbar and renal lymph nodes of PC-3-RFP tumor-bearing mice. With the help of RFP it could also be shown that lymph node metastases depend on the PC-3 tumor location. Metastases occurred in draining lymph nodes next to the tumor. Moreover, a PC-3-RFP cell migration between lumbar and renal lymph node metastases was shown. In the following immunohistochemical analysis it was proven that PC-3-RFP cells are indeed migrating in lymphatic vessels between these lumbar and renal lymph node metastases. Additionally, an increasing number of lymphatic vessels in PC-3 tumors was shown from week to week post implantation of PC-3 cells. This enhancement positively correlates with the formation of lymph node metastases. Besides lymph node metastases hematogenous micro metastases in the lungs of PC-3-RFP-tumor-bearing mice could be detected, too. The major cause of death in prostate cancer patients is the formation of metastases. Therefore, the development of effective therapies for lymphatic and hematogenous metastases is of major importance. One of the most promising novel cancer therapies for humans is oncolytic virotherapy. According to that, the second aspect of this thesis was to investigate the influence of the oncolytic vaccinia virus GLV-1h68 on the process of PC-3 cell metastasis. Thereby, it was initially shown that GLV-1h68 can efficiently colonize both migrating PC-3 cells and metastasized PC-3 cells in the lymph nodes. Ensuing, a possible metastasis inhibiting effect of GLV-1h68 was analyzed. It was shown that GLV-1h68 reduces the volume and the number of enlarged lymph nodes in PC-3 tumor-bearing mice three weeks after intravenous injection. It could also be shown that GLV-1h68 significantly reduces the number of lymph nodes that are positive for PC-3 cells. Additionally, GLV-1h68 has an inhibiting effect on PC-3 cells that are circulating in the blood of PC-3 tumor-bearing mice and on hematogenous metastases of the lungs. In analysing the intravenous injection of GLV-1h68 in PC-3-RFP tumor-bearing mice it turned out that there is a preferential viral colonisation of lymph node metastases compared to the tumors. At early points after injection renal lymph node metastases were colonized more thoroughly by GLV-1h68 than lumbar ones. The same preferential viral colonisation of lymph node metastases was shown upon intraperitoneal und intratumoral viral injection. Further, lymphatic and blood vessels of PC-3 tumors and lymph node metastases were analyzed. There was a significant reduction of lymphatic and blood vessels seven days post intravenous injection of GLV-1h68. This could explain the effect of GLV-1h68 on the reduction of the number of lymph node metastases, because the supply of nutrients as well as of oxygen is reduced due to the decrease of blood vessel density. Also, migration of PC-3 cells is minimized upon the reduction of lymphatic vessels. Thus, it was shown that GLV-1h68 has a great potential in eliminating lymphatic and hematogenous metastases of the human prostate carcinoma PC-3. Therefore, oncolytic vaccinia viruses apparently represent promising therapeutic agents for the treatment of advanced human prostate carcinoma. KW - Prostatakrebs KW - Metastase KW - Vaccinia-Virus KW - Metastasen KW - onkolytische Virustherapy KW - metatsases KW - oncolytic virotherapy Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-56421 ER - TY - THES A1 - Zirkel, Janina T1 - Malaria in Burkina Faso – Chancen für eine neue Strategie mit Hilfe von Methylenblau T1 - Malaria in Burkina Faso - Evaluation of new strategies with methylene blue N2 - Trotz beträchtlicher Anstrengung Malaria zu kontrollieren bzw. zu eradizieren, stellt die Krankheit weiterhin eines der gravierendsten Gesundheitsprobleme unseres Jahrtausends dar. Malaria fordert jährlich zwischen 0,7 und 2,7 Millionen Menschenleben, beeinträchtigt schulische und soziale Entwicklung und hemmt erheblich das Wirtschaftswachstum der betroffenen Länder. In Burkina Faso, einem der ärmsten Länder der Welt, ist Malaria eines der größten Gesundheitsprobleme und ca. ein Drittel aller Todesfälle werden hier Malaria angelastet. Die sich weiter ausbreiteten Resistenzen gegen die gängigen Malariamedikamente machen die Bekämpfung der Malaria zunehmend schwierig. Artemisinin basierende Kombinationstherapien sind aktuell, trotz relativ hoher Therapiekosten und erster Resistenzen, die Erstlinien Behandlung. Effektive und billige neue Kombinationstherapien werden dringend benötigt. In dieser Doktorarbeit wurde das Resistenzpotential von Artemisinin modelliert. Die Homologiemodellierungen unterstützen die These von Krishna und Kollegen von SERCA als einzige Zielstruktur von Artemisinin. Des Weiteren wurde Methylenblau als neues altes Malariamittel evaluiert. Methylenblau ist das erste gegen Malaria eingesetzte Medikament, agiert als ein prooxidatives Agens und inhibiert selektiv und nicht-kompetitiv die P. falciparum Glutathion Reduktase. Die additiven und multiplen Zielprotein Effekte von Methylenblau wurden experimentell untersucht und hier in einem bioinformatischem Modell getestet. Unter dem Einfluss von Methylenblau werden einige Schlüsselenzyme des Redoxstoffwechsels in ihrer Aktivität beeinträchtigt und der Parasit wird verstärkt oxidativem Stress ausgesetzt. Des Weiteren konnte in dieser Dr. Arbeit eine starke Kooperationsbereitschaft der urbanen und ländlichen Bevölkerung an zukünftigen Malaria Projekten gezeigt werden. N2 - Dispite numerous global efforts malaria remains one of the biggest challenges of our millennium. Between 0,7-2,7 million people die from malaria each year. The disease is estimated to be responsible for an annual reduction of economic growth and hampers social und mental development. In Burkina Faso, one of the poorest countries in the world, malaria is the main health challenge and malaria is estimated to be responsible for one third of all death there. The fight against malaria has to cope with more and more resistance. Artemisinin-based combination therapies remain the first line treatment against malaria even when therapy is expensive and resistances are starting to appear. Effective and cheap combination therapies are needed. In this thesis resistance potential of the standard drug Artemisinin was modelled. The structure model data support the results by Krishna and co-workers that this is a principal target for Artemisinins. Furthermore the complementary aspects in order to introduce methylene blue (MB) combination therapies were examined. Methylene blue, the first synthetic drug ever used against malaria, is a subversive substrate and specific inhibitor of P. falciparum glutathione reductase. The additive and multi-target effects of MB are here both modelled and tested regarding redox network attack in the malaria parasite. Under the influence of MB enzyme participating in redox protection are switched of and the parasite is exposed to oxidative stress. Furthermore it could be shown a convincing commitment of rural and urban populations in Burkina Faso to eradicate malaria using a MB combination drug. KW - Methylenblau KW - Malaria KW - Burkina Faso KW - Malaria KW - Burkina Faso KW - methylene blue Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-72583 ER - TY - THES A1 - Schäfer, Ingo T1 - Fremdgenexpression in humanen Mitochondrien T1 - Artificial gene expression in human mitochondria N2 - Bei einer Vielzahl neuromuskulärer und neurodegenerativer Erkrankungen spielen Fehlfunktionen der Mitochondrien eine wichtige Rolle. Da die Proteine der Atmungsketten-komplexe sowohl durch die mitochondriale DNA als auch durch das Kerngenom codiert werden, können Mutationen in beiden Genomen die Auslöser dieser Erkrankungen darstellen. Veränderungen der mitochondrialen DNA lassen sich - im Gegensatz zum Kerngenom - bisher nicht korrigieren, weshalb bei einem großen Teil der Erkrankungen nur die Symptome und nicht die Auslöser behandelt werden können. Das grundlegende Problem stellt dabei der Transport der DNA in die Mitochondrien dar. Ziel dieser Arbeit war es, mit Hilfe von physikalischen Transfektionsmethoden exogene DNA in die Mitochondrien menschlicher Kulturzellen einzubringen. Dazu wurden unterschiedliche Vektoren hergestellt, die in Mitochondrien das an die Mitochondrien angepasste grün fluoreszierende mtEGFP exprimieren sollen. Die Expressionsfähigkeit und Prozessierung dieser Konstrukte konnte in in-vitro-Assays mit einem Mitochondrienextrakt nachgewiesen werden. Bei Transfektionsversuchen mit der Gene Gun gelang es erstmals, exogene Plasmid-DNA in die Mitochondrien menschlicher Zellen einzubringen. Das durch die transfizierten Vektoren exprimierte mtEGFP konnte am Fluoreszenzmikroskop eindeutig in den Mitochondrien der Zellen lokalisiert werden. Eine Transfektion mit Hilfe magnetischer Partikel erwies sich jedoch nicht als zielführend, da die die Partikel eine Eigenfluoreszenz aufwiesen, die eine Detektion der mtEGFP-Expression verhinderten. Eine wichtige Voraussetzung für die Transfektion von Mitochondrien durch mechanische Methoden wie die Mikroinjektion ist die reversible Induktion von Megamitochondrien, da sie erst in diesem Zustand penetriert werden können. Durch eine Ansäuerung des Kulturmediums mit Natriumacetat bzw. Essigsäure konnten Mitochondrien erzeugt werden, die beinahe die Größe des Zellkerns aufwiesen und somit ideale Bedingungen für die Mikroinjektion darstellen. Bei den anschließenden Mikroinjektionsversuchen mit den hergestellten mitochondrialen Expressionsvektoren wurden wiederum Zellen mit eindeutig grün fluoreszierenden Mitochondrien gefunden. Zusammenfassend wurden im Rahmen dieser Arbeit erstmalig menschliche Mitochondrien mit exogener DNA transfiziert. Dies stellt einen grundlegenden Schritt für die Entwicklung neuer Therapieformen bei mitochondrialen Myopathien dar. Zuvor müssen die Transfektionsmethoden jedoch noch weiter optimiert werden, um eine höhere Transfektionseffizienz zu erreichen. N2 - Mitochondrial dysfunctions play an important role in a variety of neuromuscular and neurodegenerative diseases. As the proteins of the respiratory chain complexes are encoded by the mitochondrial DNA as well as the nuclear genome, mutations in both could trigger solely the diseases. Up to now, changes of the mitochondrial DNA could not be corrected, hence, therapies were designed to decrease symptoms in patients. In this context, the limiting factor to cure these disease relies on the DNA transport into the mitochondria. The aim of this work was to insert exogenous DNA into the mitochondria of human cultured cells by physical transfection methods. A variety of different vectors was constructed to express the mitochondrially adapted green fluorescent mtEGFP within mitochondria. The ability of these constructs to be expressed and processed was proved by in vitro assays using a mitochrondrial extract. In the transfection experiments using the gene gun, we succeeded for the first time to introduce exogenous plasmid DNA into human mitochondria. The mtEGFP expressed by the transfected vectors could definitely be localized to the mitochondria of the cells. Transfections using magnetic particles as mediator could not be used, because the particles exhibit an autofluorescence which prevents a detection of the mtEGFP expression. An essential prerequisite for the transfection of mitochondria by mechanical methods like microinjection is the reversible induction of megamitochondria, since they could not be penetrated as small regular organelles. Acidification of the culture medium with sodium acetate or acetic acid led to mitochondria exhibiting almost the size of the nucleus, thus giving ideal conditions for microinjection. In the applied microinjection experiments using the mitochondrial expression vectors, cells displayed mitochondria with distinct green fluorescence. In summary, human mitochondria were transfected successfully for the first time with mitochondrial expression vectors. This is a fundamental step in the development of new therapies targeting mitochondrial myopathies. However, the transfection methods have to be optimized to achieve higher transfection efficiencies. KW - Mitochondrium KW - Heterologe Genexpression KW - Mitochondrien KW - mitochondria KW - gene expression KW - Transfektion KW - Mensch KW - Genexpression Y1 - 2011 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85202 ER - TY - THES A1 - Jahn, Daniel T1 - Die Bedeutung von verkürzten Spleißvarianten des Lamin A-Gens für die Meiose und für die Pathogenese von Laminopathien T1 - The Role of truncated A-Type Lamins for Meiosis and for the Pathogenesis of Laminopathies N2 - Die Lamina ist ein dichtes Netzwerk aus Intermediär-Filamenten, den Laminen, an der nucleoplasmatischen Seite der inneren Kernmembran. Hier interagieren Lamine sowohl mit Transmembran-Proteinen der Kernhülle als auch mit dem Chromatin. Diese Wechselwirkungen mit Interaktionspartnern verschiedener zellulärer Kompartimente macht die Lamina, neben einer Gerüststruktur mit wichtigen mechanische Aufgaben, auch zu einer zentralen Schnittstelle von Signalwegen, die eine intrazelluläre Kommunikation zwischen Nucleus und Cytoplasma ermöglichen. Die Lamina ist somit ein entscheidender Regulator der funktionellen Organisation des Chromatins und der differentiellen Genexpression. Das Expressionsmuster der Lamine während der Spermatogenese von Säugern unterscheidet erheblich von der Lamin-Expression somatischer Zellen und weist einige Besonderheiten auf. Dies schließt unter anderem die spezifische Expression der verkürzten A-Typ Lamin-Spleißvariante C2 während der meiotischen Phase der Spermatogenese ein. Diese und andere Beobachtungen deuteten bereits länger darauf hin, dass der speziellen Zusammensetzung der Lamina und vor allem dem meiosespezifischen Lamin C2 während der Gametogenese im männlichen Organismus eine entscheidende Rolle zukommen könnte. Neuere Studien im Mausmodell bekräftigen diese Hypothese und leisten darüber hinaus einen entscheidenden Betrag dazu, die Funktion der Lamina während der Meiose auf molekularer Ebene präzise zu definieren. Im deutlichen Gegensatz zu den weitreichenden Kenntnissen zur Situation in Männchen lagen zu Beginn der vorliegenden Arbeit keine Daten über die Zusammensetzung der Lamina in weiblichen Keimzellen vor. Konsequenterweise existierten auch keine funktionellen Untersuchungen zur Relevanz der Lamina für die Oogenese. In der vorliegenden Arbeit wurden diese reproduktionsbiologisch hoch interessanten Fragestellungen detailliert untersucht. Dabei zeigte sich unter anderem, dass Lamin C2 auch in weiblichen Keimzellen spezifisch während der Meiose exprimiert wird. Durch Studien an einer Lamin C2-defizienten Mauslinie wurde die Funktion von Lamin C2 in der Meiose in Weibchen genau untersucht. Dabei wurde eine erhebliche Beeinträchtigung der strukturellen Paarung der homologen Chromosomen und der homologen Rekombination in Lamin C2-defizienten Weibchen festgestellt. Da die genannten Prozesse Schlüsselereignisse für die korrekte Segregation der Homologen in späteren Stadien der Meiose sind, deuten die erzielten Ergebnisse auf eine erhebliche qualitative Beeinträchtigung der reifen Gameten in Lamin C2-defizienten Weibchen hin. Ein weiterer zentraler Aspekt der Arbeit war die Analyse der molekularen Eigenschaften des meiosespezifischen Lamin C2 in vitro. Diese Experimente definieren wichtige Unterschiede hinsichtlich seiner Polymerisationseigenschaften im Vergleich zu Laminen somatischer Zellen und tragen, zusammen mit anderen Studien, dadurch erheblich dazu bei, die Funktion von Lamin C2 in der Meiose im mechanistischen Sinne besser zu verstehen. Zudem deckt die vorliegende Arbeit erstmals einen funktionellen Zusammenhang zwischen der Lamina-Zusammensetzung und der Qualität der Keimzellen weiblicher Säuger auf und ermöglicht dadurch zukünftige Studien zur Rolle der Lamine in der Oogenese, die möglicherweise auch für die menschliche Fertilität sehr interessant sein könnte. Der zweite Teil der Dissertation beschäftigt sich mit der Beschreibung einer trunkierten A-Typ Lamin-Spleißvariante in einer Mauslinie, die bislang als A-Typ Lamin-defizient angesehen wurde (Lmna-/-). Die durchgeführten Untersuchungen besitzen vor allem dadurch hohe Relevanz, dass die untersuchte Lmna-/- Mauslinie seit Jahren als das wichtigste Modell zur funktionellen Untersuchung der A-Typ Lamine gilt und bereits in einer Vielzahl von Publikationen eingesetzt wurde. In den hierzu durchgeführten Versuchen konnte das in der Lmna-/- Mauslinie persistierende A-Typ Lamin mittels diverser methodischer Ansätze als C-terminale Deletionsmutante definiert werden, der die Exons 8-11 der insgesamt 12 Exons des Lmna-Gens fehlen. Daher wurde diese Lamin A-Mutante als Lamin AΔ8-11 bezeichnet. Die Konsequenzen der C-terminalen Deletion für die physiologischen Eigenschaften des Lamin Adelta8-11 sowie die Auswirkungen seiner Expression in der Lmna-/- Mauslinie auf aktuelle Modellvorstellungen zur Funktion der A-Typ Lamine und zur Entstehung Lamin-assoziierter, humaner Erkrankungen (Laminopathien) werden in der Arbeit ausführlich diskutiert. N2 - The nuclear lamina is a dense meshwork of intermediate filament proteins termed lamins that lines the nucleoplasmatic face of the inner nuclear membrane. By its interactions with both integral membrane proteins and chromatin the lamina constitutes a cellular hub at the nucleo-cytoplasmatic interface that serves both structural and regulatory functions. With regard to this, lamins have been implicated in basic cellular processes such as transcription, signaling and chromatin organization and are therefore currently considered as major regulators of differential gene expression. Compared to somatic cells, nuclear lamina composition of male mammalian meiocytes is remarkably different. This includes the specific temporal expression of the short A-type lamin splice variant lamin C2 at meiotic stages of male germ cell development. Several lines of evidence indicated that meiosis-specific lamin C2 could serve an essential role for meiosis in males. Recently, this hypothesis has found strong support by in vivo studies in lamin C2-deficient males and these studies substantially contributed to the precise definition of lamin C2 function on a molecular level. In contrast to this, nuclear lamina subtype composition in female meiocytes has never been analyzed and, consequently, its contribution to the formation of viable gametes in females remained elusive. In the present study, these issues have systematically been addressed. Here, detailed immunohistochemical analyses demonstrate that, as in the male, female germ cells (oocytes) undergoing prophase I of meiosis specifically express lamin C2. Following functional studies performed in lamin C2-deficient mice disclosed a pivotal role of lamin C2 for central meiotic processes in females. These include the requirement of lamin C2 for precise pairing of the homologous chromosomes that occurs in meiotic prophase I as well as its contribution to the timely and efficient progression of homologous recombination events in oocytes. Since accurate segregation of paternal chromosomes during first meiotic division is known to be critically dependent on both precise homologous pairing and recombination, these data point to an as yet unanticipated role of lamin C2 for the development of viable gametes in females. Moreover, detailed in vitro experiments were performed to analyze the molecular properties of meiosis-specific lamin C2 compared to somatic lamin variants. This revealed distinct properties of lamin C2 that are compatible with models suggesting that this short lamin variant significantly modifies the structural properties of the nuclear envelope (NE) of mammalian meiocytes. These structural modifications, in turn, are considered to facilitate dynamic repositioning of NE-attached meiotic telomeres which, besides homologous pairing and recombination, is a further most central and evolutionarily conserved hallmark of meiotic prophase I with an essential relevance for accurate genome haploidization. Thus, together with other important observations made in the lamin C2-deficient mouse model, the data presented in this thesis significantly contribute to our understanding of lamin C2 function on a molecular level. The second part of the study is based on a rather unexpected finding in another lamin-deficient mouse model. This finding concerns the Lmna-/- mouse line that was established in 1999 by Sullivan and others by gene targeting of the Lmna gene encoding A-type lamins. Since then, these mice have frequently been used in a multitude of important studies that aimed to analyze various different aspects of A-type lamin function. This thesis now provides compelling evidence that, unexpectedly and contradicting previous reports, a truncated lamin A mutant persist in the Lmna-/- mouse line that was considered as completely devoid of A-type lamins thus far. By the use of various technical approaches, including detailed mass spectrometry, the presented data precisely define the lamin A variant present in Lmna-/- mice (designated lamin Adelta8-11) as a C-terminal lamin deletion mutant that lacks domains with known important functions for protein interactions and posttranslational processing. Based on these findings, implications for the interpretation of previous reports using Lmna-/- mice as well as for our current models of A-type lamin function and the pathophysiology of lamin-associated disorders in humans (laminopathies) are considered in the discussion of the thesis. KW - Meiose KW - Kernhülle KW - Lamine KW - Gamet KW - Laminopathie KW - meiosis . nuclear envelope KW - lamins KW - gamete KW - laminopathy Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-74123 ER - TY - THES A1 - Krüger, Beate T1 - Integration und Kombination bioinformatischer Methoden in Biotechnologie, synthetischer Biologie und Pharmaindustrie T1 - Intgration and combination of bioinformatical methods in biotechnology, synthetic biology and pharmaceutical industry N2 - Die Bioinformatik ist eine interdisziplinäre Wissenschaft, welche Probleme aus allen Lebenswissenschaften mit Hilfe computergestützter Methoden bearbeitet. Ihr Ziel ist es, die Verarbeitung und Interpretation großer Datenmengen zu ermöglichen. Zudem unterstützt sie den Designprozess von Experimenten in der Synthetischen Biologie. Die synthetische Biologie beschäftigt sich mit der Generierung neuer Komponenten und deren Eigenschaften, welche durch die Behandlung und Manipulation lebender Organismen oder Teilen daraus entstehen. Ein besonders interessantes Themengebiet hierbei sind Zweikomponenten-Systeme (Two-Component System, TCS). TCS sind wichtige Signalkaskaden in Bakterien, welche in der Lage sind Informationen aus der Umgebung in eine Zelle zu übertragen und darauf zu reagieren. Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der Beurteilung, Nutzung und Weiterentwicklung von bioinformatischen Methoden zur Untersuchung von Proteininteraktionen und biologischen Systemen. Der wissenschaftliche Beitrag der vorliegenden Arbeit kann in drei Aspekte unterteilt werden: - Untersuchung und Beurteilung von bioinformatischen Methoden und Weiterführung der Ergebnisse aus der vorhergehenden Diplomarbeit zum Thema Protein-Protein-Interaktionsvorhersagen. - Analyse genereller evolutionärer Modifikationsmöglichkeiten von TCS sowie deren Design und spezifische Unterschiede. - Abstraktion bzw. Transfer der gewonnenen Erkenntnisse auf technische und biologische Zusammenhänge. Mit dem Ziel das Design neuer Experimente in der synthetischen Biologie zu vereinfachen und die Vergleichbarkeit von technischen und biologischen Prozessen sowie zwischen Organismen zu ermöglichen. Das Ergebnis der durchgeführten Studie zeigte, dass Zweikomponenten-Systeme in ihrem Aufbau sehr konserviert sind. Nichtsdestotrotz konnten viele spezifische Eigenschaften und drei generelle Modifikationsmöglichkeiten entdeckt werden. Die Untersuchungen ermöglichten die Identifikation neuer Promotorstellen, erlaubten aber auch die Beschreibung der Beschaffenheit unterschiedlicher Signalbindestellen. Zudem konnten bisher fehlende Komponenten aus TCS entdeckt werden, ebenso wie neue divergierte TCS-Domänen im Organismus Mycoplasma. Eine Kombination aus technischen Ansätzen und synthetischer Biologie vereinfachte die gezielte Manipulation von TCS oder anderen modularen Systemen. Die Etablierung der vorgestellten zweistufigen Modul-Klassifikation ermöglichte eine effizientere Analyse modular aufgebauter Prozesse und erlaubte somit das molekulare Design synthetischer, biologischer Anwendungen. Zur einfachen Nutzung dieses Ansatzes wurde eine frei zugängliche Software GoSynthetic entwickelt. Konkrete Beispiele demonstrierten die praktische Anwendbarkeit dieser Analysesoftware. Die vorgestellte Klassifikation der synthetisch-biologischen und technischen Einheiten soll die Planung zukünftiger Designexperimente vereinfachen und neue Wege für sinnverwandte Bereiche aufzeigen. Es ist nicht die Hauptaufgabe der Bioinformatik, Experimente zu ersetzen, sondern resultierende große Datenmengen sinnvoll und effizient auszuwerten. Daraus sollen neue Ideen für weitere Analysen und alternative Anwendungen gewonnen werden, um fehlerhafte oder falsche Ansätze frühzeitig zu erkennen. Die Bioinformatik bietet moderne, technische Verfahren, um vertraute, aber oft mühsame experimentelle Wege durch neue, vielversprechende Ansätze zur Datenstrukturierung und Auswertung großer Datenmengen zu ergänzen. Neue Sichtweisen werden durch die Erleichterung des Testprozederes gefördert. Die resultierende Zeitersparnis führt zudem zu einer Kostenreduktion. N2 - The field of Bioinformatics is an interdisciplinary science focusing on the application of computer science to solve problems in different areas of life sciences. Its scope is to handle and interpret an immense quantity of data and to support computer-aided design approaches of synthetic biological experiments. Synthetic biology deals with the generation of new components and biological characteristics created by manipulation of living organisms or parts of them. Of particular interest are two-component systems (TCS). TCS describe simple and important signalling cascades in bacteria which transfer information from the environment into the cell as a reaction to changes in the environment. The present thesis is focused on the assessment, applicability and enhancement of bioinformatical methods in order to facilitate analysis of protein interactions and biological systems. The scientific efforts within the thesis can be divided into three aspects: - Analysis and assessment of bioinformatical methods and enhancement of results from the preceding diploma thesis dealing with protein-protein interaction predictions. - Analysis of general evolutionary modification possibilities within TCS as well as specific differences and design for the identification of a common approach. - Abstraction and transfer of the results to technical and biological contexts in order to simplify synthetic biological design experiments. Establishment of comparable vocabulary for both, technical and biological processes as well as different organisms. The outcome of this thesis revealed that TCS structure is very conserved but that it nevertheless contained some very specific characteristics. New promotor sites were discovered whilst additionally allowing the analysis of the signal binding sites. Missing elements from known TCS could be discovered and a completely new diverged TCS domain in the organism Mycoplasma could be identified as well as three general modification possibilities for TCS. The combination between technological approaches and synthetic biology simplifies the systematic manipulation of TCS or other modular systems. The established two-staged module classification simplifies the analysis of modular processes and thereby the molecular design of synthetical-biological questions. Concrete examples showed the functionality and usefulness of the classification. A freely accessible software GoSynthetic provided easy access and application of the developed toolbox. Not only new concrete scientific findings were provided by the given thesis but also a general approach to identify and analyse TCS and even to create similar analytic procedures. The established classification of biological and technical modules will ease the design of future experiments and reveals new pportunities applicable to similar scientific areas. It is not the task of Bioinformatics to replace experiments but to analyse the resulting huge amounts of data meaningfully and efficiently. Hence, new ideas for further analysis and alternative cases need to be generated which may finally help to identify erroneous approaches earlier. Bioinformatics offers modern technical methods to amend familiar and sometimes exhausting experimental procedures with promising new approaches for data structuring and analysis of immense quantities of data. New perceptions are encouraged and speedier progress is possible without increasing the experimental coasts. KW - Biotechnologie KW - Synthetische Biologie KW - Bioinformatik KW - Vaccinia-Virus KW - Zweikomponentensystem KW - Zweikomponenten-System KW - Pharmazeutische Industrie KW - biotechnology KW - synthetic biology KW - bioinformatic KW - two-component system KW - vaccinia virus KW - gene ontology Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-70702 ER - TY - THES A1 - Scheller, Katharina T1 - Charakterisierung und Anwendung von humanen, primären mikrovaskulären Endothelzellen mit erweiterter Proliferationsfähigkeit T1 - Characterization and application of human primary microvascular endothelial cells with extended proliferation capacity N2 - Das Arbeitsgebiet Tissue Engineering befasst sich mit der Klärung der Mechanismen, die der Funktionen verschiedener Gewebearten zu Grunde liegen sowie mit der Entwicklung alternativer Strategien zur Behandlung von Organversagen bzw. Organverlusten. Einer der kritischsten Punkte im Tissue Engineering ist die ausreichende Versorgung der Zellen mit Nährstoffen und Sauerstoff. Bioartifizielle Gewebe mit einer Dicke von bis zu 200 µm können mittels Diffusion ausreichend versorgt werden. Für dickere Transplantate ist die Versorgung der Zellen alleine durch Diffusion jedoch nicht gegeben. Hierfür müssen Mechanismen und Strategien zur Prävaskularisierung der artifiziellen Gewebekonstrukte entwickelt werden, damit die Nährstoff- und Sauerstoffversorgung aller Zellen, auch im Inneren des Transplantates, von Anfang an gewährleistet ist. Eine wichtige Rolle bei der Prävaskularisierung spielt die Angiogenese. Dabei ist die Wahl einer geeigneten Zellquelle entscheidend, da die Zellen die Basis für die Angiogenese darstellen. Mikrovaskuläre Endothelzellen (mvEZ) sind maßgeblich an der Angiogenese beteiligt. Das Problem bei der Verwendung von humanen primären mvEZ ist ihre geringe Verfügbarkeit, ihre limitierte Proliferationskapazität und der schnelle Verlust ihrer typischen Endothelzellmarker in-vitro. Der Aufbau standardisierter in-vitro Testsysteme ist durch die geringe Zellausbeute auch nicht möglich. Die upcyte® Technologie bietet hierfür einen Lösungsansatz. In der vorliegenden Arbeit konnten upcyte® mvEZ als Alternative zu primären mvEZ generiert werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Zellen eine erweiterte Proliferationsfähigkeit aufweisen und im Vergleich zu primären mvEZ durchschnittlich 15 zusätzliche Populationsverdopplungen leisten können. Dadurch ist es möglich 3x104-fach mehr upcyte® mvEZ eines Spenders zu generieren verglichen mit den korrespondierenden Primärzellen. Die gute und ausreichende Verfügbarkeit der Zellen macht sie interessant für die Standardisierung von in-vitro Testsystemen, ebenso können die Zellen zur Prävaskularisierung von Transplantaten eingesetzt werden. Upcyte® mvEZ zeigen zahlreiche Primärzellmerkmale, die in der Literatur beschrieben sind. Im konfluenten Zustand zeigen sie die für primäre mvEZ spezifische pflastersteinartige Morphologie. Darüber hinaus exprimieren upcyte® mvEZ typische Endothelzellmarker wie CD31, vWF, eNOS, CD105, CD146 und VEGFR-2 vergleichbar zu primären mvEZ. Eine weitere endothelzellspezifische Eigenschaft ist die Bindung von Ulex europaeus agglutinin I Lektin an die alpha-L-Fucose enthaltene Kohlenhydratstrukturen von mvEZs. Auch hier wurden upcyte® Zellen mit primären mvEZ verglichen und zeigten die hierfür charkteristischen Strukturen. Zusätzlich zu Morphologie, Proliferationskapazität und endothelzellspezifischen Markern, zeigen upcyte® mvEZ auch mehrere funktionelle Eigenschaften, welche in primären mvEZ beobachtet werden können, wie beispielsweise die Aufnahme von Dil-markiertem acetyliertem Low Density Lipoprotein (Dil-Ac-LDL) oder die Fähigkeit den Prozess der Angiognese zu unterstützen. Zusätzlich bilden Sphäroide aus upcyte® mvEZ dreidimensionale luminäre Zellformationen in einer Kollagenmatrix aus. Diese Charakteristika zeigen den quasi-primären Phänotyp der upcyte® mvEZs. Upcyte® mvEZ stellen darüber hinaus eine neuartige mögliche Zellquelle für die Generierung prävaskularisierter Trägermaterialien im Tissue Engineering dar. In der vorliegenden Arbeit konnte die Wiederbesiedlung der biologisch vaskularisierte Matrix (BioVaSc) mit upcyte® mvEZ vergleichbar zu primären mvEZ gezeigt werden. Der Einsatz von upcyte® mvEZ in der BioVaSc stellt einen neuen, vielversprechenden Ansatz zur Herstellung eines vaskularisierten Modells für Gewebekonstrukte dar, wie beispielsweise einem Leberkonstrukt. Zusammenfassend konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass upcyte® mvEZ vergleichbar zu primären mvEZs sind und somit eine geeignete Alternative für die Generierung prävaskulierter Trägermaterialien und Aufbau von in-vitro Testsystemen darstellen. Darüber hinaus wurde ein neues, innovatives System für die Generierung einer perfundierten, mit Endothelzellen wiederbesiedelten Matrix für künstliches Gewebe in-vitro entwickelt. N2 - The scope of tissue engineering includes researching mechanisms underlying the function of different types of tissue, as well as the development of alternative strategies for the treatment of organ failure or organ loss. One of the critical aspects of tissue engineering is the adequate supply of cells with nutrition and oxygen. Bioartificial tissue up to a thickness of 200µm can be supplied sufficiently via diffusion. For thicker transplants, the supply of cells, only via diffusion is not sufficient. For this purpose, mechanisms and strategies for pre-vascularization of artificial tissue constructs need to be developed in order to ensure the supply of nutrition and oxygen to the inside of a transplant from the beginning. An important part of pre-vascularization is angiogenesis. Thereby, the selection of a suitable cell source is crucial, as these cells form the basis of angiogenesis. Microvascular endothelial cells (mvEC) are an important part of angiogenesis. Using human primary mvEC is critical due to the quick loss of their endothelial cell marker in-vitro but their limited availability and capacity of proliferation presents a problem. Additionally, the number of cells is also not sufficient for setup a standardized in-vitro test system. Upcyte® technology provides an approach to solving this problem. This work focused on the generation of upcyte® mvEC as alternative to primary mvEC. It was shown that cells treated with upcyte® technology have an enhanced capability of proliferation, resulting in 15 additional population doublings, compared to primary mvEC. Thus, it is possible to generate 3x104-fold more upcyte® mvEC from one donor compared to corresponding primary cells. The sufficient cell availability is important for the standardization of in-vitro test systems, as well as the usage for pre-vascularization of transplants. Upcyte® mvEC show many primary cell-like characteristics, which are described in literature. In the confluent state, upcyte® mvEC show a primary cell-specific cobblestone-like morphology. Furthermore, upcyte® mvEC express typical endothelial cell markers, such as CD31, vWF, eNOS, CD105, CD146 and VEGFR-2, at a similar level to primary mvEZ. An additional endothelial cell-specific attribute is the linkage of Ulex europaeus agglutinin I lectin to carbohydrate-structures of mvEC, which contain alpha-L-fucose. These data showed that there was a good comparison between the characteristics of upcyte® and primary mvEC. In addition to morphology, proliferation capacity and endothelial cell-specific markers, upcyte® mvEC showed functional characteristics, which are also observed in primary mvEC. Examples include the uptake of Dil-marked acetylated low density lipoprotein (Dil-Ac-LDL) and the ability to support the process of angiogenesis. In addition, spheroids formed from upcyte® mvEC formed three dimensional luminal cell formations in a collagen matrix. These characteristics show the quasi-phenotype of upcyte® mvEC. Upcyte® mvEC also represents a new promising cell source for the generation of pre-vascularized scaffolds in the tissue engineering context. The use of upcyte® mvEC in BioVaSc represents a promising new approach for producing a model for vascularized tissue constructs, such as a liver constructs. In summary, this work focussed on the development of upcyte® mvEC which were shown to be comparable to primary mvEC and therefore represent a sufficient and reliable alternative cell source for the generation of pre-vascularized scaffolds and the construction of in-vitro test systems. Moreover, a new and innovative system for the generation of a perfusable, endothelialized matrix for artificial tissue in-vitro has been developed. KW - Tissue Engineering KW - Angiogenese KW - Endothelzellen KW - Tissue Engineering KW - Angiogenese KW - Endothelial cells KW - tissue engineering KW - angiogenesis Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76577 ER - TY - THES A1 - Göhler, Antonia T1 - Untersuchung Karbohydrat-bindender Proteine mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung T1 - Studying carbohydrate binding proteins with high temporal and spatial resolution N2 - Das menschliche Genom verschlüsselt 30000 bis 40000 Proteine, von denen ein Großteil kovalent gebundene Karbohydrat-Gruppen an Asparagin-, Serin-, Threonin- oder Hydroxylysin-Resten trägt. Diese sogenannten Glykoproteine sind allgegenwärtige Bestandteile der extrazellulären Matrix von Zelloberflächen. Sie steuern Zell-Zell- und Zell-Matrix-Kommunikationen, können bei der roteinfaltung helfen bzw. die Proteinstabilität erhöhen oder Immunantworten regulieren. Die Auslösung von biologischen Prozesse erfordert aber Übersetzer der zuckerbasierten Informationen. Solche Effektoren sind die Lektine, unter ihnen auch die Galektine. Galektine binden spezifisch β-Galaktosen, weisen strukturelle Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz ihrer Zuckererkennungsdomänen (CRDs) auf und zeigen ein „jelly-roll“-Faltungsmuster, bestehend aus einem β-Sandwich mit zwei antiparallelen Faltblättern. Strukturell werden die CRDs in drei verschiedenen, topologischen Formen präsentiert. Proto-Typen existieren als nicht-kovalent verknüpfte Dimere der CRDs, Chimera-Typen besitzen neben der CRD eine Nicht-Lektin-Domäne und bei den Tandem-Repeat-Typen sind zwei verschiedene CRDs über ein kurzes Linker-Peptid kovalent verbunden. Galektine werden sowohl in normalem wie auch pathogenem Gewebe exprimiert und das zunehmende Wissen über die Beteiligung an verschiedenen Krankheiten und Tumorwachstum liefert die Motivation, strukturelle Aspekte und die Vernetzung von Lektinen detailliert, insbesondere im Hinblick auf ihre intrafamiliären Unterschiede, zu untersuchen. Durch die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung, basierend auf der Verwendung von Fluorophoren (intrinsisch und extrinsisch), werden in dieser Arbeit die Eigenschaften von Galektinen näher untersucht. Mit Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie (FCS) und Anisotropie-Messungen wird gezeigt, dass eine Liganden-Bindung bei Proto-Typ-Galektinen mit einer Verringerung des hydrodynamischen Radius einhergeht. Bei Tandem-Repeat- und Chimera-Typen bleibt der Radius konstant. Dafür skaliert die Diffusionskonstante von Tandem-Repeat-Typen anormal mit der molaren Masse. Die Anisotropie-Messungen werden parallel zu den FCS-Messungen durchgeführt, um einen Einfluss des Fluoreszenzmarkers auszuschließen. Mit Hilfe dieser Technik wird außerdem gezeigt, dass unterschiedliche Dissoziationskonstanten und Kinetiken für den Bindungsprozess innerhalb der Proto-Typ-Gruppe möglichweise auf unterschiedliche Konformationsdynamiken zurückgehen. Der Vergleich von hGal-1 und cG-1B verdeutlicht, dass strukturelle Ähnlichkeiten zwar ein identisches Bindungsverhalten hervorrufen können, der Oxidationsprozess der Proteine aber unterschiedlich ablaufen kann. Beide Methoden können so als sehr sensitive Techniken zur Untersuchung von Strukturmerkmalen bei Galektinen etabliert werden, wobei die Übertragbarkeit auf andere Glykoproteine gewährleistet ist. Weiterhin gilt Quervernetzung als eine der wichtigsten Eigenschaften von Galektinen, da durch die Vernetzung von Glykoproteinen auf der Zelloberfläche Signalwege aktiviert und Immunantworten reguliert werden. Um die räumliche organisation und Quervernetzung von hGal-1 auf den Oberflächen von Neuroblastomzellen nachzuweisen, eignet sich das hochauflösende Mikroskopieverfahren dSTORM sehr gut. Durch Verwendung des photoschaltbaren Fluorophors Alexa647 als spezifischem Marker für hGal-1, einem Standard-Weitfeld-Aufbau und verschiedenen Analyseverfahren, kann eine Clusterformation von hGal-1 auf der Zelloberfläche bestätigt werden. hGal-1 bildet Cluster mit einem mittleren Durchmesser von 81±7 nm aus. Der Durchmesser ist unabhängig von der Konzentration, während die Anzahl der Cluster davon abhängt. Für die Clusterausbildung ist ein Startpunkt, also eine minimale Dichte der Galektin-Moleküle, notwendig. Durch Blockierung der CRDs mit Laktose wird die Clusterbildung unterdrückt und die Spezifität der CRDs gegenüber β-Galaktosen erneut herausgestellt. Anders als dimeres hGal-1 binden Monomere deutlich schlechter an die Membranrezeptoren. Es werden keine Cluster ausgebildet, eine Quervernetzung von Membranrezeptoren ist nicht möglich. Außerdem kann es durch die Monomere zu einer vollständigen Markierung und damit Abkugellung der Zellen kommen. Möglicherweise wird der Zelltod induziert. Hochauflösende Mikroskopieverfahren sind durch den Markierungsprozess limitiert. Die bioorthogonale Click-Chemie eröffnet jedoch neue Möglichkeiten zur Markierung und Visualisierung von Biomolekülen, ohne die Notwenigkeit genetischer Manipulationen. Es werden modifizierte Zuckermoleküle in die Zellmembranen eingebaut, über eine 1,3-polare Cycloaddition mit einem Alkin markiert und ihre Verteilung mit Hilfe von dSTORM untersucht. Es wird nachgewiesen, dass die Zuckermoleküle in Clustern auftreten und Click-Chemie trotz dem Katalysator Kupfer an lebenden Zellen durchführbar ist. Die Bewegung der Gesamtcluster wird mittels Mean Square Displacement aufgeschlüsselt und eine Diffusionskonstante für Cluster im Bereich von 40 - 250 nm bestimmt. Zusammenfassend stellt die Kombination verschiedener Spektroskopie-Techniken ein gutes Werkzeug zur Untersuchung von Karbohydrat-bindendenden Proteinen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung dar und ermöglicht einen neuen Einblick in die Biologie der Galektine. N2 - The human genome encodes 30,000 to 40,000 proteins of which the majority have covalently linked carbohydrates at the amino acids asparagine, serine, hreonine and hydroxylysine. These so called glycoproteins are embedded in the extracellular matrix and presented on cell surfaces. Glycoproteins are important membrane proteins, which are involved in cell-cell or cell-matrix interactions, protein folding or missfolding and the regulation of immune responses. The glycan chains harbour ideal properties for high-density storage of biological information; they are the basis of the sugar code. To translate its structural information into physiological effects the interplay with endogenous lectins is important. Lectins, among them the family of galectins, translate the sugarbased information into biosignaling. Galectins are carbohydrate-binding proteins that bind β-galactosides. They share a core sequence consisting of 130 amino acids, and a β-sandwich fold with two antiparallel β-sheets. Structurally, they are divided into three groups: proto-types exist as non-covalent dimers of two carbohydrate-recognition domains (CRD). The chimera-types have a lectin and a non-lectin domain and tandem-repeat-types contain of two different CRDs covalently linked by a short peptide. They are differentially expressed by various normal and pathological tissues. Due to the documented relation between lectins and different diseases (tumour growth, immune responses) it is important to study structural properties and their cross-linking ability in solution, especially in view of their intrafamily diversification. Therefore different spectroscopic techniques are used. Intrinsic and extrinsic fluorophores allow fluorescent measurements with high spatial and temporal resolution. Combining FCS and anisotropy measurements structural information about lectins, glycoproteins and their relations are monitored. For prototype galectins the hydrodynamic radius decrease upon ligand binding. Tandemrepeat- and chimera-types do not change their dimensions whereas their diffusion constants, measured with FCS, scale anomalous with the molar mass. Anisotropy measurements are carried out in parallel. Since an intrinsic fluorophore of the protein (tryptophan) is exploited, no labelling is necessary. With the help of this technique I am able to show that different binding constants and kinetics of the binding process within the galectin-family are caused by various conformational dynamics. Comparing hGal1 and cG-1B, the oxidation processes reveal differences despite of structural and binding similarities. These two techniques are very sensitive and applicable to study structural characteristics of galectins. Cross-linking between galetins and glycoproteins on the cell surface have been proposed to function as an „on-off“-switch that regulates cell proliferation, differentiation and immune responsiveness. Direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) provide an opportunity to study the spatial organization and cross-linking ability of hGal-1 interacting with β-galactose specific receptors on the cell surface of neuroblastoma cells. Alexa647, which can be switched reliable between an on- and a very stable off-state, is used as specific galectin marker. Measurements are done on a standard widefield setup and a spot analysis of single molecules in order to resolve clustering and cross-linking of galectins with a spatial resolution of better than 50 nm. The mean cluster size of hGal-1 molecules on the cell surface of neuroblastoma cells is 81±7 nm. The cluster diameter is independent of the protein concentration, a starting point or minimal galectin density for cluster formation is needed and the specificity of the CRDs for galactosides is underlined. Monomeric hGal-1 molecules show a different binding behaviour. On the one hand there are less localizations detectable and on the other hand I find very densly labelled, spherically shaped cells. This can maybe interpreted as hGal1-induced apoptosis. Existing labeling strategies limitate the value of super-resolution microscopy. The bioorthogonal click-chemistry creates a new field for labeling and visualizing biomolecules in vivo without the requirement of genetic manipulation. By hijacking a cell’s biosynthetic machinery, a metabolic precursor functionalized with a bioorthogonal chemical tag is incorporated into target biomolecules, including glycans, lipids, proteins and nucleic acids. Because of this I combine click-chemistry and the super-resolution technique dSTORM for specific labelling of metabolized sugar molecules. The cluster formation of sugar molecules on living and fixed cells in the presence of copper is being studied. Copper has no negative influence on the living cells. The mean square displacement decode cluster movement and determine cluster diameters in the range of 40 - 250 nm. In summary, we show that a combination of various temporal and spatial highresolution fluorescence techniques can be used advantageously to obatin new insights into the biology of galectins. KW - Fluoreszenz KW - Glykoproteine KW - Fluoreszenzspektroskopie KW - Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie KW - Anisotropie KW - dSTORM-Mikroskopie KW - Galektine KW - Fluorescence KW - Microscopy KW - anisotropy KW - glycoproteins KW - galectins KW - fluorescence correlation spectroscopy KW - dSTORM Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76665 ER - TY - THES A1 - Knaf, Tobias T1 - Spezifische Bindung von Aluminium und Eisen an den kationenselektiven Kanal MppA von Microthrix parvicella T1 - Specific binding of aluminium and iron ions to a cation-selective cell wall channel of Microthrix parvicella N2 - Schwermetallsalze wie beispielsweise Aluminium- oder Eisensalze werden in der Abwasserbehandlung zur Prävention und Bekämpfung von Blähschlamm, Schwimmschlamm und Schaumbildung verwendet. Dadurch kann eine Verbesserung der Schlammabsetzeigenschaften im Nachklärbecken erreicht werden. Übermäßiges Wachstum des grampositiven Bakteriums Microthrix parvicella gilt dabei als Hauptursache von Schlammabsetzproblemen und kann ebenfalls durch die Dosierung von schwermetallhaltigen Flockungs- und Fällungsmitteln vermieden werden. Da diese Verbindungen in Wasser gelöst sind, müssen sie die Außenmembran bestimmter Bakterien passieren. Nur der Einbau von wassergefüllten Kanälen erlaubt den gelösten Salzen das Passieren der durch hydrophobe Fettsäuren aufgebauten zusätzlichen Permeabilitätsbarriere. In dieser Arbeit wurden wassergefüllten Kanäle von Microthrix parvicella isoliert, aufgereinigt und mit Hilfe der Black-Lipid-Bilayer-Technik charakterisiert. Ergänzend wurde der Einfluss und der Durchlass der Flockungs- und Fällungsmittel in Titrationsexperimenten untersucht. Dabei konnte ein wassergefüllter Kanal, der die Bezeichnung MppA erhielt, gefunden werden, welcher eine Leitfähigkeit von 600 pS in 1 M Kaliumchlorid und eine Bindestelle für mehrwertige Kationen wie Eisen oder Aluminium zeigte. Die Bindung dieser mehrwertigen Kationen führte zu einer Änderung der Ionenselektivität. Ohne Bindung mehrwertiger Kationen zeigte der Kanal eine leichte Kationenselektivität. Nach der Bindung wechselte die Ionenselektivität zu einer Anionenselektivität, was auf eine spezifische Ladungsverteilung im Kanal hinweist. Der Kanal MppA zeigte gleichwertige Bindekonstanten für Aluminium und Eisen. Beide Metalle werden als Fällungs- und Flockungsmittel in Kläranlagen zum Verhindern von Schwimm- und Blähschlamm verwendet. Frühere Arbeiten offenbarten bereits, dass hauptsächlich der Aluminiumanteil entscheidend für die Wirkung dieser Mittel ist. Diese Beobachtungen in Verbindung mit den Ergebnissen dieser Arbeit führten zu der Annahme, dass Eisen und Aluminium eine kompetitive Bindung an der Bindestelle im Kanalinneren zeigen könnten. So könnte in manchen Fällen Aluminium anstelle des sonst als Spurenelement benötigten Eisens durch den Kanal transportiert werden und in Enzym-Substrat-Komplexen eingebaut werden. Dadurch könnten toxische Effekte auftreten, die letztlich ein Absterben des Organismus zur Folge hätten. Für die Bindung der Metallsalze konnte zusätzlich eine pH-Abhängigkeit beobachtet werden. Nur eine Zugabe von Metalllösungen mit einem pH-Wert kleiner 6 führte zu einer Bindung im Kanal. Die Zugabe von Metalllösungen mit einem pH-Wert größer 6 zeigte keinen Effekt auf die Leitfähigkeit des Kanals. Diese Ergebnisse bestätigen die auf Kläranlagen und in vorherigen Arbeiten getätigte Beobachtung, dass der pH-Wert für die Wirksamkeit der Verbindungen entscheidend ist. In dieser Arbeit konnte jedoch erstmals gezeigt werden, dass der pH-Wert direkt die Bindung der Metallsalze beeinflusst. N2 - Heavy metal salts like aluminium or iron compounds are used in waste water treatment plants to prevent bulking sludge, floating sludge and foaming and for this reason to enhance the settleability of the sludge flocs in the secondary clarifier. Excessive growth of the Gram-positive bacterium Microthrix parvicella is one of the main origins of sludge settlement problems and can be avoided by the dosage of heavy metal salts containing flocculation and precipitations agents as well. As these agents are dissolved in water, they have to pass the outer membrane of certain bacteria. Only the incorporation of water-filled channels into the membrane allows the solutes to pass this second permeability barrier build out of hydrophobic fatty acids. In this study, the water-filled channels of Microthrix parvicella were characterized with black lipid bilayer assays and the influence and the pass through of the flocculation and precipitations agents were investigated in titration experiments. A water-filled channel called MppA with a conductance of 600 pS in 1 M potassium chloride could be found which has a binding site for polyvalent cations like iron or aluminium. The binding of polyvalent cations to the binding site inside the channel led to a switch in the ion selectivity. Without binding of polyvalent cations, the channel showed slight cation selectivity. After the binding the selectivity switched to an anion selectivity indicating a special charge distribution in the channel. The channel MppA which was found in Microthrix parvicella showed same binding constants for aluminium and iron. Both metals are used as precipitation and flocculation agents and to prevent bulking sludge and floating sludge in waste water treatment plants. Other former works revealed already that only the aluminium part is decisive for the effect of these agents. These observations in addition to the results of this work led to the suggestion that iron and aluminium show a competitive binding to the binding site. In some cases aluminium might be transported through the channel and incorporated to some enzyme-substrate-complexes instead of the iron which usually acts as a micronutrient. This could lead to toxic effects and the dieback of the organism. A pH-dependency could be found for the binding of the metal salts. Only the addition of metal solutions with a pH lower than 6 led to a binding. The addition of solutions with pH-values higher than 6 showed no effect to the conductivity of the channel. These results confirm the observation done on waste water treatment plants and in other former studies that the pH value is generally decisive for the effect of the agents. But this work could show for the first time that the pH directly affects the binding of the metal salts. KW - Aluminium KW - Eisen KW - Porin KW - Microthrix parvicella KW - MppA KW - Zellwandkanal KW - aluminium KW - iron KW - cell wall channel KW - porin KW - Microthrix parvicella KW - Fadenbakterien KW - Abwasserreinigung Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-77011 ER - TY - THES A1 - Mihlan, Sabrina [geb. Jasper] T1 - Identifikation von Zonula Occludens 2 (ZO-2) als neuen LASP-1 Interaktionspartner und Aufklärung der LASP-1/ZO-2 Kern-Zytosol Translokation T1 - Identification of zonula occludens 2 (ZO-2) as a new LASP-1binding partner and the elucidation of LASP-1/ZO-2 nucleo-cytoplasmatic shuttling N2 - LASP-1 (LIM und SH3 Domänen Protein) ist ein in Zellen ubiquitär vorkommendes Protein, welches in verschiedenen Tumorgeweben eine pathophysiologische Überexpression aufweist. Das Protein besitzt eine LIM Domäne, zwei Aktinbindungsregionen sowie eine SH3 Domäne und bindet einerseits an dynamischen Aktinstrukturen wie den fokalen Kontakten, Lamellopodien und Membranfortsätzen, kann andererseits aber auch in den Zellkern translokalisieren. Für Aktinstrukturen wirkt LASP-1 als Gerüstprotein und ist wichtig für die Migration und Proliferation der Zellen. Die Funktion von LASP-1 im Zellkern ist noch nicht bekannt, da aber in Tumorzellen eine erhöhte nukleare Akkumulation von LASP-1 beobachtet werden konnte, deren Intensität mit der Tumorgröße sowie dem Langzeitüberleben der Patientinnen korreliert, ist LASP-1, zusätzlich zu seiner Funktion als Strukturprotein, vermutlich auch ein Transkriptionsfaktor oder ein transkriptioneller Kofaktor. Eine Herunterregulation von LASP-1 in verschiedenen Tumorentitäten führt zur Inhibition der Proliferation und Migration. In dieser Arbeit konnte der bisher unbekannte Zellkernimport und -export von LASP-1 aufgeklärt werden. Maßgeblich daran beteiligt ist ein durch Pulldown Experimente neu identifizierter LASP-1 Bindungspartner: das Zonula Occludens 2 Protein (ZO-2). Mittels Immunpräzipitationen und Immunfluoreszenzen wurde diese Interaktion bestätigt. Nach Phosphorylierung von LASP-1 an Ser-146 durch Aktivierung der cAMP-abhängigen Proteinkinase (PKA) kommt es zu einer partiellen Ablösung des LASP-1/ZO-2 Komplexes aus den fokalen Kontakten hin zu einer vermehrten Kernlokalisation beider Proteine. Dies lässt sich durch Kern/Zytosol Trennungen belegen. Dabei ist die Bindung von LASP-1 an ZO-2 essentiell für die Translokation in den Zellkern, da bei einem ZO-2 Knockdown auch nach PKA Aktivierung LASP-1 zytosolisch lokalisiert bleibt. Wie Mutationsanalysen zeigen, findet die Interaktion zwischen der C-terminalen SH3 Domäne im LASP-1 und der Prolin-reichen SH3-Bindungssequenz im Bereich der Aminosäuren 1103-1121 am C-Terminus im ZO-2 statt. Die Translokation des Komplexes in den Kern erfolgt dabei über das Kernlokalisationssignal im ZO-2, da die LASP-1 Sequenz selbst keine nukleare Importsequenz aufweist. Im Zellkern konnte die direkte Interaktion von LASP-1 und ZO-2 mittels Duolink® Proximity Ligation Assay sichtbar gemacht werden. Der Export der Proteine erfolgt über das Protein CRM1. Eine Inhibition der Kernexportmaschinerie mit Leptomycin B erhöht die Konzentration beider Proteine im Zellkern. Das nukleare Exportsignal (NES) im LASP-1 konnte durch Punktmutationen N-terminal der Leucin-reichen Aminosäuresequenz 70-77 zugeordnet werden (NLRLKQQS). Im letzten Schritt dieses Zyklus erfolgt die Relokalisation von LASP-1 zurück an die Zellmembranstrukturen. Der neu gefundene Signalweg dient wahrscheinlich zur Weiterleitung von externen Stimuli in den Kern und zur Genregulation - mit LASP-1 als Transkriptionsfaktor oder transkriptionellen Kofaktor. N2 - LASP-1 (LIM and SH3 protein) is ubiquitously expressed at basal levels, but was found to be pathophysiologically overexpressed in several cancer entities. LASP-1 exhibits one LIM domain, two actin binding domains and one SH3 domain. On the one hand, LASP-1 is predominantly localized at focal contacts, lamellopodia and membrane ruffles, on the other hand a nuclear localization is observed. LASP-1 works as actin-binding scaffolding protein and is essential for migration and proliferation. Silencing of LASP-1 by RNA- interference in various cancer cell lines results in a strong inhibition of proliferation and migration. However, in tumor cells, an additional striking nuclear localization of the protein was observed, which significantly correlates with tumor size and a poor long term survival of the patients. Therefore, LASP-1 might act additionally as transcription factor or transcriptional co-factor In this work, a novel LASP-1 binding partner, zonula occludens protein 2 (ZO-2), was identified and its role in the signal transduction pathway of LASP-1 nucleo-cytoplasmic shuttling was established. Upon LASP-1 phosphorylation at Ser-146 by activated cAMP-dependent protein kinase A (PKA), LASP-1 binding to Zyxin and F-actin decreases and the protein detaches, in complex with ZO-2, from the plasma membrane and translocates into the nucleus. These results were confirmed by nuclear and cytosolic separation assays. Pull-down assays with mutants revealed that ZO-2 binds with its proline-rich sequence (amino acids 1103-1121) to the SH3 domain in LASP-1. LASP-1 exhibits no nuclear localization signal and requires ZO-2 to shuttle into the nucleus. In situ proximity ligation assay confirmed the direct binding between LASP-1 and ZO-2 and visualized the shuttling. Inhibition of the nuclear export system by Leptomycin B results in an accumulation of both proteins in nuclei. Nuclear export is regulated by the newly identified nuclear export signal in LASP-1 (amino acids 70-77) and mediated by CRM1. Finally LASP-1 relocalizes to focal contacts. This new identified pathway serves presumably as a signal transductor from the focal contacts to the nucleus for gene regulation. KW - Tumorzelle KW - Skleroproteine KW - Transkriptionsfaktor KW - Überexpression KW - Zellkern KW - Kern-Zytosoltranslokation KW - ZO-2 KW - Phosphorylierung KW - LASP-1 KW - nuclear cytosolic translocation KW - ZO-2 KW - phosphorylation Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73442 ER - TY - THES A1 - Oberländer, Uwe T1 - Untersuchung der immunstimulatorischen Effekte von Neuromelanin (NM) auf dendritische Zellen und deren Bedeutung in der Pathogenese von Morbus Parkinson T1 - Investigation of immunostimulatory effects of Neuromelanin on dendritic cells and relevance for Parkinsons disease N2 - Hintergrund: Das Absterben Neuromelanin (NM)-haltiger Zellen in der substantia nigra (SN), und die daraus resultierende Erniedrigung des Dopaminspiegels im striatum, ist ein pathologisches Hauptmerkmal der Parkinsonschen Krankheit. Ein neuerlicher Nachweis von Anti-Melanin-Antikörpern gibt Anlass zur Vermutung, dass NM ein Autoantigen sein könnte. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NM tatsächlich von dendritischen Zellen (DZ), die in vivo hauptverantwortlich für die Auslösung von T- und B-Zellantworten sind, erkannt wird. Die Erkennung von NM durch DZ ist eine unabdingbare Voraussetzung für die Einleitung einer adaptiven Immunantwort. Methoden: Murine dendritische Zellen (mDZ) wurden aus Knochenmarkszellen generiert und mit NM aus humaner SN oder synthetischem Dopaminmelanin (DAM) behandelt, nachdem beide Melanine endotoxinfrei getestet wurden. Die Phagozytose von NM wurde mittels konfokaler Mikroskopie dokumentiert. Die Expression von MHC II und CD86 wurde mittels Durchflusszytometrie (FACS) analysiert. Zytokinkonzentrationen von TNF- und dem Interleukin IL-6 wurden mit ELISA-Assays bestimmt. Abschließend wurde die Funktion der durch NM aktivierten DZ mit einer allogenen mixed lymphocyte reaction (MLR) überprüft. Ergebnisse: NM wurde von den mDZ effektiv phagozytiert, woraufhin die mDZ einen reifen Phenotyp (CD86high/MHC IIhigh) zeigten. Zusätzlich sekretierten durch NM aktivierte mDZ die Zytokine IL-6 and TNF-. Schließlich ließen die mDZ T-Zellen in einer MLR proliferieren, und beweisen so ihre Funktionalität und die Fähigkeit eine primäre T-Zellantwort auszulösen. Im Gegenteil dazu konnte DAM, dem die Protein- und Lipidkomponenten von NM fehlen und nur das Melaninrückrat mit NM gemeinsam hat, nur einen kleinen Effekt bei den mDZ hervorrufen. Diskussion: NM wird von DZ in vitro erkannt und bewirkt deren Reifung. Sollte der Vorgang auch in vivo stattfinden, besteht die Möglichkeit, dass SN-Antigene dem adaptiven Immunsystem präsentiert werden, was in einzelnen Fällen zur Einleitung einer adaptiven Immunantwort führen könnte. NM könnte also der Auslöser für einen autoimmunen Pathomechanismus in der parkinsonschen Krankheit sein. N2 - Background: The degeneration of neuromelanin (NM)-containing dopaminergic cells in the substantia nigra (SN) and a resulting reduction in striatal dopamine is a key feature in Parkinsons´s Disease (PD). Increased anti-melanin antibodies in sera of Parkinson patients had been shown recently, suggesting that NM may act as an autoantigen in PD. In this work it was asserted that NM is being recognized by dendritic cells (DCs), the major cell type for inducing T- and B-cell responses in vivo. This recognition of NM by DCs is a prerequisite to trigger an autoimmune response directed against NM-associated structures. Methods: Murine dendritic cells (mDC), generated from bone marrow, were treated with NM of SN from human subjects or with synthetic dopamine melanin (DAM) after both melanins were tested free of endotoxin contamination. Phagocytosis was documented with confocal microscopy. The expression of MHC II and CD86 was analyzed by flow cytometry. Concentrations of inflammatory cytokines TNF- and interleukin IL-6 were determined by ELISA. Finally the function of activated mDCs was tested by allogeneic mixed lymphocyte reaction (MLR). Results: NM was phagocytized effectively by mDCs, which subsequently developed a mature phenotype (CD86high/MHC IIhigh). In addition, NM-activated mDCs secreted the proinflammatory cytokines IL-6 and TNF-. Finally, they potently triggered T cell proliferation in a mixed lymphocyte reaction, showing that mDC activation was functional to induce a primary T cell response. On the contrary, DAM, which lacks the protein and lipid components of NM but mimics the dopamine-melanin backbone of NM, had only very little effect on mDC phenotype and function. Discussion: NM is recognized by DCs in vitro and triggers their maturation. If this process occurs in vivo, it would allow DCs to transport and present SN antigens to the adaptive immune system, thus leading to autoimmmunity in susceptible individuals. This finding offers a rationale for an autoimmune-based pathomechanism of PD with NM as the initial trigger. KW - Parkinson-Krankheit KW - Melanin KW - dendritische Zellen KW - Autoimmunität KW - Parkinson KW - Neuromelanin KW - dendritische Zellen KW - Autoimmunität KW - Parkinsons Disease KW - Neuromelanin KW - dendritic cells KW - Autoimmunity Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73684 ER - TY - THES A1 - Gätschenberger, Heike T1 - Die Expression humoraler und zellulärer Immunreaktionen bei Drohnenlarven und adulten Drohnen der Honigbiene (Apis mellifera) T1 - Expression of humoral and cellular immune reactions of dronelarvae and adult drones of the honey bee (Apis mellifera) N2 - Soziale Insekten wie die Honigbiene (Apis mellifera) besitzen ein breites Spektrum an Abwehrmechanismen gegen Pathogenbefall, sowohl auf der Ebene der Kolonie (soziale Immunität) als auch auf der Stufe des Individuums (angeborenes Immunsystem). Die Hauptaufgabe der relativ kurzlebigen Drohnen besteht in der Begattung von Jungköniginnen. Daher stellte sich die Frage, ob auch die Drohnen ähnlich den Arbeiterinnen mit energieaufwendigen Immunreaktionen auf Infektionen reagieren. Wie im Folgenden beschrieben, konnte ich nachweisen, dass Drohnen eine ausgeprägte Immunkompetenz besitzen. Das angeborene Immunsystem setzt sich aus humoralen und zellulären Abwehrreaktionen zusammen. Bei der humoralen Immunantwort werden bestimmte evolutionär konservierte Signalkaskaden aktiviert, an deren Ende die Expression einer Vielzahl von antimikrobiellen Peptiden (AMPs) und immunspezifischen Proteinen (IRPs) steht. Zur Analyse der humoralen Immunantwort wurden von mir zum einen Hemmhoftests durchgeführt, um die gesamte antimikrobielle Aktivität der Haemolymphe nach artifizieller Infektion zu ermitteln und zum anderen spezifische AMPs bzw. IRPs identifiziert. Hierzu wurden die Haemolymphproteine in ein- oder zwei-dimensionalen Polyacrylamidgelen aufgetrennt und ausgewählte Proteinbanden bzw. -spots mittels nano HPLC/Massenspektrometrie analysiert. Die Hauptkomponenten des zellulären Immunsystems sind Wundheilung, Phagozytose, Einkapselung und Nodulation. In meiner Arbeit habe ich zum ersten Mal Noduli bei infizierten Drohnen nachweisen können. Frisch geschlüpfte adulte Drohnen (1d) weisen ein breites Spektrum an Immunreaktionen auf, das sowohl humorale als auch zelluläre Immunantworten umfasst. Nach Infektion mit dem Gram-negativen Bakterium E.coli und verschiedenen bakteriellen Zellwandbestandteilen wie Lipopolysaccharid (LPS), Peptidoglycan (PGN) und 1,3ß-Glucan (Bestandteil von Pilzzellwänden), werden die AMPs Hymenoptaecin, Defensin 1 und Abaecin induziert. Desweiteren exprimieren junge adulte Drohnen eine Reihe hochmolekularer immunspezifischer Proteine (IRPs) wie z.B. Carboxylesterase (CE 1), eine Serinprotease, die möglicherweise an der Prozessierung der Prophenoloxidase beteiligt ist, ein Peptidoglycan-interagierendes Protein (PGRP-S2) und zwei Proteine unbekannter Funktion, IRp42 und IRp30. Parallel zu bekannten bienenspezifischen AMPs wurde ein animales Peptidtoxin (APT) in Drohnenlarven, adulten Drohnen und adulten Hummeln nach E.coli Infektion in der Haemolymphe nachgewiesen. Von dem als OCLP 1 (ω-conotoxin-like protein 1) benannten Peptid war bereits bekannt, dass es in Fischen paralytische und damit toxische Effekte auslöst. Meine Beobachtungen lassen vermuten, dass es sich bei OCLP 1 um ein Peptidtoxin mit antimikrobiellen Eigenschaften und damit um eine neue Klasse von AMPs handelt. Die allgemeine humorale Immunkompetenz scheint während der gesamten Lebensspanne adulter Drohnen (~ 7 Wochen) konstant zu bleiben, wie durch die gleichbleibende antimikrobielle Aktivität im Hemmhoftest gezeigt wurde. Junge Drohnen reagieren auf eine E.coli Infektion mit der Bildung zahlreicher Noduli (~1000 Noduli/Drohn), die vor allem entlang des Herzschlauches zu finden sind. Diese zelluläre Immunantwort nimmt mit dem Alter der Drohnen ab, so dass bei 18 d alten Drohnen nur noch rund 10 Noduli/Drohn gefunden werden. Auf der anderen Seite nimmt die phagozytotische Aktivität bei älteren Drohnen scheinbar zu. In einer Reihe von parallel laufenden Versuchsreihen konnte ich eindrucksvoll zeigen, dass zelluläre Immunreaktionen wie Phagozytose und Nodulation unmittelbar nach bakterieller Infektion einsetzen. Hierbei erreicht die Nodulibildung 8-10 h p.i. eine Plateauphase, wohingegen die humorale Immunantwort erst 6 h p.i. schwach einsetzt, danach stetig zunimmt und noch 72 h p.i. nachweisbar ist. Es ist mir gelungen, eine Methode zur künstlichen Aufzucht von Drohnenlarven zu etablieren. Diese ermöglichte konstante und sterile Versuchsbedingungen zur Untersuchung der Immunreaktionen von Larven. Nach Infektion mit E.coli reagieren Drohnenlarven mit einer starken Aktivierung ihrer humoralen Immunantwort durch die Expression von AMPs, jedoch werden keine hochmolekularen IRPs wie in adulten Drohnen hochreguliert. Zudem ist die Nodulibildung in Larven nur schwach ausgeprägt. Völlig unerwartete Beobachtungen wurden beim Studium der Immunkompetenz von Drohnenpuppen gemacht. Nach Injektion lebender E.coli Zellen in Drohnenpuppen stellte ich eine dramatische Veränderung im Aussehen der Puppen fest. Die Puppen verfärbten sich gräulich schwarz. Genauere Untersuchungen haben dann gezeigt, dass die Drohnenpuppen, wie auch die der Arbeiterinnen, offensichtlich keine zelluläre Abwehrreaktion aktivieren können und die humorale Immunantwort nur sehr schwach ausfällt und viel zu spät einsetzt. N2 - Social insects like honey bees (Apis mellifera) possess a wide range of defence mechanisms against pathogens on the colony level (social immunity) as well as on the individual level (innate immunity). In early summer, honey bee colonies consist of about 50.000 workers, a few hundred drones and one queen. The main task of the short-lived drones is to mate with a virgin queen. This raises a question: do drones, similar to workers mount an energy-intense immune reaction to fend off infections? In my thesis I could show that drones exhibit an effective immune competence. The innate immune response is composed of a humoral and a cellular component. In the humoral immune response, evolutionally conserved signalling pathways are activated and lead to the induced synthesis of antimicrobial peptides (AMPs) and immune responsive proteins (IRPs). In order to analyse the humoral immune response, I conducted inhibition zone assays as well as one- and two-dimensional gelelectrophoresis. Afterwards, HPLC/MS was performed in order to identify specific protein spots. Wound healing, phagocytosis, encapsulation and nodulation are the principal components of the cellular immune system. In my work, I could show nodulation reactions in infected drones for the first time. Newly emerged drones (1d) respond to infections with a wide range of immune reactions, including humoral and cellular defence mechanisms. The AMPs hymenoptaecin, defensin 1 and abaecin are induced after infection with gram-negative E.coli, bacterial cell wall components like lipopolysaccharides (LPS), peptidoglycan (PGN) and 1,3ß-glucan (cell wall component of fungi). In addition, young drones express some high molecular immune responsive proteins (IRPs) like carboxylesterase (CE 1), a serine protease, that is potentially part of the prophenoloxidase activating system, further a peptidoglycan recognition protein (PGRP-S2) and with IRp30 and IRp42 two proteins of unknown function. IRp42 possibly belongs to the glycin-rich proteins (GRP) because of its glycin–rich regions. Glycin-rich proteins are known to participate in host defence in plants. IRp30 is a leucine-rich repeat containing protein with a C-terminal leucine zipper, which is common among Hymenopterans. Therefore it is possible for IRp30 to interact with other proteins, like cell wall structures of pathogens. I detected the bee-specific lysozyme 2 in the haemolymph of adult drones after septic infection. It belongs to the chicken (c)-type lysozymes like lysozyme 1, which are potentially active against gram-positive and gram-negative bacteria and fungi in insects. After E.coli infection, an animal peptide toxin (APT) was detected simultaneously to the known AMPs in the haemolymph of larvae, adult drones and adult bumble bees. It is known that this peptide, called OCLP 1 (ω-conotoxin-like protein 1), triggers paralytic and thus toxic effects in fish. My observations suggest that OCLP 1 is probably a peptide toxin with antimicrobial characteristics, and thus could belong to a new class of AMPs. Throughout their whole life (~ 7 weeks), adult drones maintain their immune competence. This was shown by the continuous antimicrobial activity of drone haemolymph in inhibition zone assays. After E.coli infection, young drones react with nodule formation (~1000 noduli/drone), which are mostly attached to the dorsal vessel. With increasing age, this type of cellular immune response weakens, so that 18d old drones only produce 10 noduli/drone. On the other hand, the phagocytic activity seems to increase in older drones In an array of parallel tests, I showed the immediate onset of the cellular immune reactions phagocytosis and nodulation upon septic infections. Nodule formation reaches a plateau 8-10 h p.i., whereas humoral immune response just begins to start 6 h p.i., continuously rises and is still measurable 72 h p.i.. I succeeded in establishing a method for rearing honey bee drone larvae artificially. This enabled constant and sterile conditions for the testing of immune reactions in larvae. A strong activation of humoral immunity with the expression of AMPs resulted from E.coli infection, yet no immune responsive proteins were induced like in adult drones. Moreover, nodule formation in larvae is weak. While studying immune competence of drone pupae, I made a surprising observation. There is a dramatic change in the physical appearance of drone pupae after injecting living E.coli bacteria. They change colour to a greyish black. Precise examinations revealed that there is no cellular immune response in drone pupae as well as in worker pupae, only a weak humoral immune reaction which is initiated too late. KW - Humorale Immunität KW - Zelluläre Immunität KW - Drohne KW - Biene KW - Apis mellifera KW - Drohnen KW - humorales und zelluläres Immunsystem KW - Apsi mellifera KW - drones KW - humoral and cellular Immune reactions Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71960 ER - TY - THES A1 - Schriefer, Eva-Maria T1 - Molekulare und biochemische Charakterisierung der β-Laktamasen von Yersinia enterocolitica und deren Sekretionsverhalten T1 - Molecular and biochemical characterization of β-lactamases in Yersinia enterocolitica and their secretion behaviour N2 - In dieser Arbeit wurden zwei Aspekte der Yersinia β-Laktamasen bearbeitet: (1) Charakterisierung der β-Laktamasen hinsichtlich β-Laktam-Antibiotikaresistenz, Sekretion und Thermostabilität. (2) Untersuchung der Sekretionsfähigkeit von verschiedenen thermostabilen β Laktamasen über das Yersinia T3SS. Im ersten Teil wurden β Laktamase-Deletionsmutanten im Y. enterocolitica Serotyp O:8 Stamm WA-314 hergestellt, um den Einfluss der chromosomalen β Laktamasen auf die in vitro-Resistenz zu untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass WA-314 konstitutiv BlaA produziert und BlaA somit – unter nicht-induzierbaren Bedingungen – der dominante Faktor in der in vitro-Resistenz gegenüber Penicillinen mit erweitertem Wirkungsspektrum (z.B. Ampicillin) und Cephalosporinen der 1. Generation (z.B. Cefazolin) ist. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die zweite chromosomale β Laktamase AmpC (BlaB) unter Zugabe von subinhibitorischen Konzentrationen von Imipenem stark induziert wird. Keine der β Laktamasen ist in der Lage, in vitro-Resistenz gegenüber Carbapenemen und Monobactamen zu vermitteln. Die Konstruktion und Bestimmung der in vitro Antibiotika-Empfindlichkeit der β Laktamase-Deletionsmutanten dient als Grundlage für nachfolgende Untersuchungen im Mausinfektionsmodell. Weiterhin wurden die Transporteigenschaften beider β Laktamasen untersucht. In Gram-negativen Bakterien sind reife β Laktamasen im Periplasma lokalisiert und müssen somit nach der Synthese im Cytosol über die Cytoplasmamembran transportiert werden. Bis auf drei Ausnahmen (β Laktamasen aus Mycobacterium smegmatis, M. tuberculosis und Stenotrophomonas maltophila) sind bisher nur Sec-abhängige β Laktamasen beschrieben worden. Mittels Fusionsproteinen bestehend aus β Laktamase-Signalpeptiden und GFP konnte in dieser Arbeit eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei Yersinia BlaA um ein Tat-Substrat handelt, bei Yersinia AmpC hingegen um ein Sec-Substrat. Somit konnte im Rahmen dieser Arbeit zum ersten Mal eine Tat-abhängige β Laktamase bei einer Bakterienart aus der Familie der Enterobacteriaceae nachgewiesen werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die β Laktamase BlaA nicht diffus im Periplasma, sondern auf bestimmte Bereiche im Periplasma lokalisiert verteilt ist. Allerdings konnte die Art der Lokalisierung bisher nicht genau spezifiziert werden. Die cytosolische Faltung und die Tat-abhängige Translokation von BlaA lassen vermuten, dass eine besondere Thermostabilität von BlaA vorliegt. Deshalb wurde das BlaA-Enzym hinsichtlich seiner Thermostabilität und temperaturabhängigen enzymatischen Aktivität untersucht. Im Vergleich zur E. coli β Laktamase TEM-1 und der hitzestabilen TEM-1-Variante MEGA zeigte BlaA eine erhöhte Thermostabilität und einen starken Anstieg der Aktivität in einem Temperaturbereich zwischen 30 °C und 45 °C. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde geprüft, ob die charakterisierten Yersinia β Laktamasen als Reporterkonstrukte zur Untersuchung des Typ III Sekretionssystems (T3SS) geeignet sind. Y. enterocolitica besitzt ein pYV Virulenzplasmid, auf dem der vollständige Satz der Gene für das Ysc-T3SS und die Effektor-Yops (Yersinia outer protein) lokalisiert sind. Injektion der Yops in eukaryotische Zielzellen ermöglicht das extrazelluläre Überleben der Yersinien im Wirtsorganismus. Bei YopE handelt es sich um ein gut charakterisiertes Effektor-Yop, dessen N Terminus fusioniert an den reifen Teil der β Laktamase TEM-1 bereits vielfach als Reporterkonstrukt eingesetzt wurde. Unter Verwendung des fluoreszierenden β Laktamase-Substrats CCF4-AM kann die Translokation von YopEi-TEM-1 in Zielzellen in Zellkultur-Experimenten und im Mausinfektionsmodell visualisiert werden. In dieser Arbeit sollte deshalb die T3SS-Sekretionsfähigkeit von YopE-β Laktamase-Fusionsproteinen in Abhängigkeit von der „Schmelztemperatur“ (temperaturabhängige Stabilität, TM) untersucht werden. Yop-Substrate werden im ungefalteten Zustand (YscN wirkt dabei vermutlich als ATP-abhängige „Unfoldase“) über das Ysc-„Injektisom“ transloziert. YopEi-TEM-1 wird effizient sekretiert und transloziert (TM (TEM-1) = 50,8 °C). YopE-Fusionsproteine mit thermostabilen TEM-1 Varianten, YopEi-RLT bzw. YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60,4 °C; TM (MEGA) = 69,2 °C) werden hingegen nur schwach bzw. nicht sekretiert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass die Sec-abhängige β Laktamase AmpC als YopE-Fusionsprotein (YopEi-AmpC) effizient T3SS-abhängig sekretiert und transloziert werden kann; das native Tat-Substrat BlaA (YopEi-BlaA) kann jedoch weder sekretiert noch transloziert wird. Eine mögliche Erklärung wäre, dass die ATPase YscN nicht in der Lage ist, BlaA und die thermostabilen TEM-1-Varianten zu entfalten und über das T3SS zu sekretieren und zu translozieren. RLT und MEGA können hingegen mithilfe ihrer nativen Signalsequenz über das Sec-System (und somit im ungefalteten Zustand) transloziert werden. N2 - In this work, two aspects concerning the Yersinia β lactamases have been processed: (1) Characterization of the β lactamases in regard of β lactam antibiotic resistance, secretion and thermostability. (2) Analysis of the secretability of different thermostable β lactamases via the Yersinia T3SS. In the first part of this work we described the β lactam sensitivity pattern of the highly mouse pathogenic Y. enterocolitica strain WA 314 by creating a set of β lactamase deletion mutants and their subsequent characterization in vitro. In accordance to previous studies on biovar 1B, serovar O:8 strains, WA 314 produces both enzymes BlaA and AmpC (BlaB) and latter one is inducible using subinhibitory concentrations of imipenem. BlaA is dominant in providing in vitro-resistance towards extended-spectrum β lactams (e.g. ampicillin) and 1st generation cephalosporins (e.g. cefazolin). None of the β lactamases is able to mediate in vitro-resistance towards carbapenems and monobactams. The construction of β lactamase deletion mutants and their in vitro-characterization is the basis for their subsequent analysis within a murine infection model. Furthermore, we investigated the export mechanism of both β lactamases. In Gram-negative bacteria β lactamases are localized in the periplasmic space to be able to cleave the amide bond of the β lactam ring resulting in inactivation of the antibiotic. Proteins are translocated across the inner membrane either via the general secretory pathway (Sec system) or via the twin arginine pathway (Tat system). To date, only three β lactamases have been described as Tat-dependently translocated namely BlaC from Mycobacterium tuberculosis, BlaS from M. smegmatis and L2 from the plant pathogen Stenotrophomonas maltophila. In silico studies and experimental approaches lead to the assumption that the majority of β lactamases is translocated in a Sec-dependent manner. Analysis of β lactamase signal sequence-GFP fusion proteins revealed that Yersinia AmpC is a Sec-substrate whereas Yersinia BlaA is a Tat-substrate. Thus, BlaA of Y. enterocolitica is the first reported β lactamase within the family of Enterobacteriaceae which is secreted by the Tat system. Interestingly, closely related blaA genes are widely distributed within all Y. enterocolitica biovars and several environmental Yersinia species. It is generally accepted that Tat-dependent substrates rapidly fold in the cytoplasma. To compare the BlaA protein stability with that of the Sec-dependent β-lactamases of the TEM-1 family we determined thermal unfolding transitions and temperature dependent enzymatic activities. In contrast to TEM-1 β lactamase, BlaA shows an entire different activity profile with steep increase of activity in the temperature range of 30 °C to 45 °C and steep decrease between 50 °C to 60 °C. In the second part, the Yersinia β lactamases AmpC and BlaA characterized in this work were tested for suitablility as reporter constructs for analyzing the Ysc-T3SS. Y. enterocolitica harbors a pYV virulence plasmid which encodes genes for components of the Ysc-T3SS secretion machinery and the effector Yops (Yersinia outer protein). Injection of Yops into the eukaryotic host cell enables the extracellular survival of Yersinia within the host organism. YopE is a well described effector Yop and YopE-β lactamase (TEM-1) fusion proteins have been successfully applied to analyze translocation of YopE in cell culture experiments and in the murine mouse infection model by using the fluorescent β lactamase substrate CCF4-AM. In this work, we aimed to analyze the T3SS-dependent secretability of YopE-β-lactamase fusion proteins in dependency on the melting temperature (temperature dependent stability, TM). It has been described that Yop substrates are translocated in an unfolded conformation via the Ysc-“injectisom” (YscN has been discussed as an ATP-dependent unfoldase). YopEi-TEM-1 is efficiently secreted and translocated (TM (TEM-1) = 50.8 °C). However, YopE fusion proteins with heat stable TEM-1 variants, YopEi-RLT and YopEi-MEGA (TM (RLT) = 60.4 °C; TM (MEGA) = 69.2 °C), were weakly secreted or secretion is completely abolished, respectively. Furthermore we could show that a YopE fusion protein with the Sec-dependent β lactamase AmpC (YopEi-AmpC) is efficiently secreted and translocated via the T3SS. In contrast, the Tat-dependent β lactamase BlaA (YopEi-BlaA) can neither be secreted nor translocated T3SS-dependently. A putative explanation for that observation would be that the ATPase YscN is unable to unfold BlaA and the heat stable TEM-1 variants and therefore secretion and translocation is prevented. Interestingly, native RLT and MEGA β lactamases can be translocated in an unfolded conformation via the Sec system. KW - Yersinia enterocolitica KW - Lactamase KW - Typ III Sekretionssystem KW - Yersinia enterocolitica KW - beta-lactamase Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-69580 ER - TY - THES A1 - Cecil, Alexander [geb. Schmid] T1 - Metabolische Netzwerkanalysen für den Weg von xenobiotischen zu verträglichen antibiotischen Substanzen T1 - Metabolic network analysis for the path from xenobiotic to compliant antibiotic substances N2 - Durch das Auftreten neuer Stämme resistenter Krankheitserreger ist die Suche nach neuartigen Wirkstoffen gegen diese, sich ständig weiter ausbreitende Bedrohung, dringend notwendig. Der interdisziplinäre Sonderforschungsbereich 630 der Universität Würzburg stellt sich dieser Aufgabe, indem hier neuartige Xenobiotika synthetisiert und auf ihre Wirksamkeit getestet werden. Die hier vorgelegte Dissertation fügt sich hierbei nahtlos in die verschiedenen Fachbereiche des SFB630 ein: Sie stellt eine Schnittstelle zwischen Synthese und Analyse der Effekte der im Rahmen des SFB630 synthetisierten Isochinolinalkaloid-Derivaten. Mit den hier angewandten bioinformatischen Methoden wurden zunächst die wichtigsten Stoffwechselwege von S. epidermidis R62A, S. aureus USA300 und menschlicher Zellen in sogenannten metabolischen Netzwerkmodellen nachgestellt. Basierend auf diesen Modellen konnten Enzymaktivitäten für verschiedene Szenarien an zugesetzten Xenobiotika berechnet werden. Die hierfür benötigten Daten wurden direkt aus Genexpressionsanalysen gewonnen. Die Validierung dieser Methode erfolgte durch Metabolommessungen. Hierfür wurde S. aureus USA300 mit verschiedenen Konzentrationen von IQ-143 behandelt und gemäß dem in dieser Dissertation vorgelegten Ernteprotokoll aufgearbeitet. Die Ergebnisse hieraus lassen darauf schließen, dass IQ-143 starke Effekte auf den Komplex 1 der Atmungskette ausübt – diese Resultate decken sich mit denen der metabolischen Netzwerkanalyse. Für den Wirkstoff IQ-238 ergaben sich trotz der strukturellen Ähnlichkeiten zu IQ-143 deutlich verschiedene Wirkeffekte: Dieser Stoff verursacht einen direkten Abfall der Enzymaktivitäten in der Glykolyse. Dadurch konnte eine unspezifische Toxizität dieser Stoffe basierend auf ihrer chemischen Struktur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten die bereits für IQ-143 und IQ-238 auf Bakterien angewandten Methoden erfolgreich zur Modellierung der Effekte von Methylenblau auf verschiedene resistente Stämme von P. falciparum 3D7 angewandt werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass Methylenblau in einer Kombination mit anderen Präparaten gegen diesen Parasiten zum einen die Wirkung des Primärpräparates verstärkt, zum anderen aber auch in gewissem Maße vorhandene Resistenzen gegen das Primärpräparat zu verringern vermag. Somit konnte durch die vorgelegte Arbeit eine Pipeline zur Identifizierung der metabolischen Effekte verschiedener Wirkstoffe auf unterschiedliche Krankheitserreger erstellt werden. Diese Pipeline kann jederzeit auf andere Organismen ausgeweitet werden und stellt somit einen wichtigen Ansatz um Netzwerkeffekte verschiedener, potentieller Medikamente aufzuklären. N2 - With the emergence of new strains of resistant pathogens, the search for new compounds against this spreading threat is of utmost importance. The interdisciplinary special research field SFB630 of the University of Würzburg is ready to tackle this task by synthesizing and analysing the effects of xenobiotics. The presented dissertation is seamlessly integrated into the diverse range of special fields of the SFB630: it provides a gateway between synthesis and analysis of the effects of the newly synthesized isoquinoline alkaloid derivatives. The presented bioinformatic methods were used to build a so called metabolic network model of the most important pathways of S. epidermidis RP62A, S. aureus USA300 and human cells. Based on these models it was possible to calculate the enzyme activities for different scenarios of added xenobiotics. The data needed for these calculations were derived directly from gene expression analysis. Validation of this method was done by metabolomic measurements. In order to accomplish this, a strain of S. aureus USA300 was subjected to different concentrations of IQ-143 and processed according to the workflow also published in this dissertation. The results suggest that IQ-143 has very strong effects on the complex 1 of the oxidative phosphorylation – these results are consistent with the results obtained by the metabolic network analysis. Although IQ-238 is structurally a close relative to IQ-143, the effects of this compound are very different: it leads to a drop of the enzyme activities in the glycolysis. Therefore an unspecific toxicity of those compounds based on their chemical structure dould be ruled out. The methods used to model the effects of IQ-143 and IQ-238 on bacteria were furthermore successfully transferred to model the effects of methylene blue on several resistant strains of P. falciparum 3D7. It was shown that a combination of methylene blue and other malaria medications either enhances the effects of the primary medication, or – in the case of a resistant strain – methylene blue was able to mitigate the resistances against the primary medication. The presented dissertation was thus successfully able to build a pipeline to identify the metabolic effects of different compounds on various germs. This pipeline can be expanded to other organisms at any time and therefore yields an important approach to identify network effects of various potential drugs. KW - Stoffwechsel KW - Bioinformatik KW - Mathematisches Modell KW - Enzymaktivität KW - Xenobiotikum KW - Netzwerkanalyse KW - Bioinformatik KW - Metabolische Stoffwechselmodellierung KW - Metabolomik KW - Metabonomik KW - Network analysis KW - Bioinformatics KW - metabolic pathway modeling KW - metabolomics KW - metabonomics Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-71866 ER - TY - THES A1 - Bruder, Jessica T1 - Antigenerkennung bei autoaggressiven Lymphozyten T1 - Antigen recognition of autoaggressive lymphocytes N2 - Millionen Menschen weltweit leiden an den verschiedensten Autoimmunerkrankungen. Diese Krankheiten entstehen, wenn das Immunsystem gesundes körpereigenes Gewebe angreift und zerstört. An der Pathogenese sind sowohl Komponenten des angeborenen Immunsystems als auch Bestandteile des adaptiven Immunsystems, wie Lymphozyten und Antikörper, beteiligt. Da die Ursachen und molekularen Mechanismen der Pathogenese dieser Erkrankungen bis heute weitgehend unbekannt sind, wurden in dieser Arbeit autoaggressive Lymphozyten bei den humanen Autoimmunerkrankungen Polymyositis und Multiple Sklerose näher untersucht. Die Polymyositis ist eine chronisch entzündliche Erkrankung der Skelettmuskulatur. Die Muskelfasern werden dabei von zytotoxischen CD8+ gd-T-Lymphozyten infiltriert, attackiert und schließlich zerstört. In einem seltenen Fall der Polymyositis wurden die Muskelzellen hingegen in ähnlicher Weise von CD8- gd-T-Lymphozyten angegriffen. Die gd-T-Lymphozyten waren monoklonal expandiert und ihr Rezeptor, im Folgenden als M88 bezeichnet, wurde als Vg1.3+Vd2+ identifiziert. Frühere Untersuchungen der Antigenspezifität dieser Zellen zeigten, dass M88 mehrere funktionell und strukturell verschiedene Proteine aus unterschiedlichen Spezies erkennt. Die Bindung erfolgt spezifisch durch die Antigenerkennungsregionen beider Rezeptorketten von M88. In dieser Arbeit wurden verschiedene bakterielle und humane Proteine des Translationsapparates als Antigene von M88 identifiziert. Weitere ausführliche Untersuchungen eines paradigmatischen bakteriellen Antigens, dem Translationsinitiationsfaktor EcIF1, zeigten, dass M88 an Oberflächen-exponierte Konformationsepitope von Proteinen bindet. Interessanterweise erkennt M88 mehrere humane Aminoacyl-tRNA-Synthetasen, Antigene, die in anderen Formen der Myositis von Autoantikörpern angegriffen werden. Diese Beobachtung ergibt eine bemerkenswerte Verbindung zwischen T-Zell- und Antikörper-vermittelten B-Zell-Antworten bei der autoimmunen Myositis. Bei der Multiplen Sklerose ist das zentrale Nervensystem betroffen. Autoaggressive Lymphozyten greifen die Myelinschicht der Nervenzellen im Gehirn und Rückenmark an und zerstören sie. Im Liquor cerebrospinalis von Patienten lassen sich klonal expandierte und affinitätsgereifte B-Zellen sowie „oligoklonale Banden“ (OKB) Antikörper nachweisen. Obwohl diese Merkmale auf eine Antigen-induzierte Immunantwort hindeuten, sind die zugrundeliegenden Antigene und die Rolle der OKB bei der Pathogenese bis heute unbekannt. In dieser Arbeit wurde die Antigenspezifität von fünf IgG OKB-Antikörpern aus drei Patienten untersucht. Durch verschiedene proteinbiochemische Methoden konnten intrazelluläre Kandidatenantigene identifiziert werden. Interessanterweise sind darunter mehrere nukleäre Proteine, die an der Transkriptionsregulation oder der RNA-Prozessierung beteiligt sind. Reaktivitäten gegen intrazelluläre Antigene treten auch bei anderen Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise dem systemischen Lupus erythematodes, auf. Diese Ergebnisse könnten auf einen allgemeinen Mechanismus der Entstehung und Funktion von Autoantikörpern bei diesen humanen Autoimmunerkrankungen hindeuten. N2 - Millions of people worldwide suffer from various autoimmune diseases. These disorders occur if the immune system reacts to and destroys healthy body tissue. Pathogenesis is mediated by components of the innate immune system as well as by constituents of the adaptive immune system, like lymphocytes and antibodies. However, the origin and molecular mechanisms of these diseases remain still largely unknown. Therefore we investigated the role of autoaggressive lymphocytes in the human autoimmune diseases polymyositis and multiple sclerosis. Polymyositis is a chronically inflammatory disease of the skeletal muscles. Cytotoxic CD8+ gd-T lymphocytes invade, attack and finally destroy muscle fibers. However, in a rare variant of polymyositis, muscle fibers are similarly attacked by CD8- gd-T lymphocytes. These gd-T lymphocytes were monoclonally expanded and their receptor, termed M88, was identified as Vg1.3+Vd2+. Previous investigations of the antigen specificity of these cells revealed that M88 recognizes several structurally and functionally different proteins from various species. This recognition is specifically mediated by the antigen recognition sites of both receptor chains of M88. In this work we have identified different bacterial and human proteins of the translation apparatus as antigens of M88. Further detailed investigations of one paradigmatic bacterial antigen, the translation initiation factor EcIF1, have shown that M88 binds to surface-exposed conformational protein epitopes. Interestingly, M88 recognizes several human aminoacyl-tRNA-synthetases. These antigens have been described to be also targeted by autoantibodies in other forms of myositis. This observation reveals a remarkable link between T cell and antibody-mediated B cell responses in autoimmune myositis. In multiple sclerosis the central nervous system is affected. Autoaggressive lymphocytes attack and destroy the myelin sheet of nerve cells of the brain and spinal cord. In the cerebrospinal fluid of these patients clonally expanded and affinity-maturated B cells as well as „oligoclonal band“ (OCB) antibodies can be detected. Although these features indicate an antigen-induced immune response, the underlying antigens and the role of the OCB antibodies in the pathogenesis are still unknown. In this work we describe the antigen specificity of five IgG OCB antibodies from three patients. Through various biochemical methods we have identified intracellular candidate antigens. Interestingly, these include several nuclear proteins involved in transcription regulation and RNA processing. Reactivity against intracellular antigens also occurs in other autoimmune diseases such as systemic lupus erythematosus. These findings suggest a general mechanism for the generation and function of autoantibodies in these human autoimmune diseases. KW - Multiple Sklerose KW - gamma-delta T-Lymphozyten KW - Polymyositis KW - B-Lymphozyten KW - Antikörper KW - Multiple Sklerose KW - gamma-delta T-lymphocytes KW - polymyositis KW - B-lymphocytes KW - antibodies KW - Multiple Sclerosis KW - Polymyositis KW - Lymphozyt KW - Antikörper Y1 - 2012 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-73342 ER - TY - THES A1 - Hillebrand, Frank T1 - Der Einfluss des PI3-Kinase Signalwegs auf die Regulation des alternativen HIV-1 prä-mRNA Spleißens T1 - The influence of the PI3-kinase pathway on the regulation of of alternative HIV-1 pre-mRNA splicing N2 - In der vorliegenden Arbeit wurden ausgehend von HIV-1 basierten Minigenkonstrukten und der proviralen NL4-3 DNA die Einflüsse der PI3K Signalwegmodulation auf das alternative Spleißen der HIV-1 prä-mRNA sowie auf die Virus Replikation untersucht. Mittels RT-PCR Analysen konnte gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition im Falle der HIV-1 basierten Minigenkonstrukte in einer erhöhten Abundanz ungespleißter bzw. intronhaltiger mRNAs resultierte, während im Kontext des Virus die Induktion alternativer Tat Transkriptvarianten nachgewiesen werden konnte. Als Folge der Inhibition des PI3K Signalwegs kam es zu einem vermehrten Einschluss der HIV-1 Leader Exone2/2b und 3. Da der Einschluss dieser Exone durch die hnRNP A/B- und F/H-abhängigen Silencer Elemente ESSV und GI2-1 negativ reguliert wird, wurde vermutet, dass die PI3K Inhibition mit der Funktionalität dieser spleißregulatorischen Aktivität interferiert. Unterstützt wurde diese Hypothese durch Replikationsexperimente mit ESSV und GI2-1 Mutanten in Gegenwart und Abwesenheit des PI3K-Inhibitors. Zusätzlich wurde auch der Einfluss des Inhibitors unter Überexpressionsbedingungen von hnRNP H auf das alternative HIV-1 Spleißen analysiert. In dieser Arbeit konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die PI3K Inhibition ein verändertes hnRNP H Spleißmuster bedingt sowie die SR-Protein Phosphorylierung und Expression beeinflusst. Des Weiteren war es im Verlauf der vorliegenden Arbeit möglich, eine Interferenz der PI3K Modulation mit der Virus Replikation nachzuweisen. Die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase lies hier nur eine sehr geringe Virus Produktion zu während die PI3K Inhibition diese auf ca. die Hälfte reduzierte. Weiterführende Experimente zeigten, dass die Überexpression der aktivierten Akt-Kinase den nuklearen Export Rev-abhängiger HIV-1 mRNAs zu blockieren scheint. Darüber hinaus beeinflusste die PI3K Inhibition neben dem alternativen HIV-1 Spleißen auch die virale Transkription sowie die zelluläre Translation. Zusammen könnten diese Effekte die reduzierte virale Replikation erklären. Der PI3K Signalweg spielt somit eine zentrale Rolle bei dem alternativen HIV-1 Spleißen und der viralen Replikation und bietet so die Möglichkeit der Entwicklung neuer Ansätze einer antiviralen Therapie.   N2 - In this thesis outgoing from HIV-1 based minigenes and the proviral NL4-3 DNA the influences of the PI3K signaling modulation on the alternative HIV-1 pre-mRNA splicing and also the viral replication were investigated. By performing RT-PCR analysis it could be shown that in the case of the minigene experiments the PI3K inhibition displayed an increased amount of unspliced or intron containing mRNAs, while the production of alternative Tat variants was demonstrated in the context of the virus. As a result of the PI3K inhibition an increased inclusion of the HIV-1 leader exons2/2b and 3 was observed. Because the inclusion of these exons is negatively regulated by the hnRNP H/F- and hnRNP A/B-dependent silencere elements ESSV and GI2-1, it was suggested that the PI3K inhibition interferes with the functionality of this splicing regulatory activity. Replication experiments either with GI2-1 or ESSV mutants in the presence or absence of the PI3K-Inhibitior supported this hypothesis. In addition, the influence of the inhibitor on the alternative HIV-1 splicing was analyzed under hnRNP H overexpression conditions. Furthermore, it was shown that the hnRNP H splicing pattern as well as the SR-protein phosphorylation and expression were altered as a consequence of the PI3K inhibition. During this thesis an interference of the PI3K modulation with the viral replication was also shown. The overexpression of the activated Akt kinase nearly prevented viral production while the PI3K inhibition reduced viral production by half. In further experiments it was shown that the overexpression of the activated Akt kinase seems to block the nuclear export of Rev-dependent HIV-1 mRNAs. In addition, beside the effect on the viral splicing pattern the PI3K inhibition also showed an influence on the viral transcription and the cellular translation suggesting that the sum of all these effects could contribute to the reduced virus production. These findings demonstrate that the PI3K signaling pathway has indeed a central influence on the alternative HIV-1 splicing as well as on the viral replication and may offer a new approach for antiviral therapy. KW - RNS-Spleißen KW - HIV KW - Phosphatidylinositolkinase KW - PI3K/Akt pathway KW - HIV-1 KW - alternative splicing KW - Phosphatidylinositol-3-Kinase KW - PI3K/Akt Signalweg KW - alternatives Spleißen Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-76914 ER - TY - THES A1 - Mischnik, Marcel T1 - Systembiologische Analyse der ADP- und Prostaglandin-vermittelten Signaltransduktion humaner Thrombozyten T1 - Systems biological analysis of ADP and prostaglandin mediated signal transduction in human thrombocytes N2 - Thrombozyten (Blutplättchen) sind die Vermittler der zellulären Hämostase. Ihre Fähigkeit zu Aggregieren und sich an das umgebende Gewebe verletzter Blutgefässe anzulagern, wird durch ein komplexes intrazelluläres Signaltransduktionsnetzwerk bestimmt, das sowohl aktivierende, als auch inhibierende Subnetzwerke beinhaltet. Das Verständnis dieser Prozesse ist von hoher medizinischer Bedeutung. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die thrombozytäre Signaltransduktion sowohl mittels eines Boole'schen, als auch verschiedener dynamischer Modelle analysiert. Die Boole'sche Modellierung führte zu interessanten Erkenntnissen über das Zusammenwirken einzelner Subnetzwerke bei der Vermittlung irreversibler Plättchenaktivierung und zeigte Mechanismen der Interaktion mit dem hemmenden Prostaglandinsystem auf. Das Modell beinhaltet unter Anderem wichtige Systemkomponenten wie Calciumsignalgebung, Aktivierung von Schlüsselkinasen wie Src und PKC, Integrin-vermitteltes outside-in sowie inside-out Signalgebung und autokrine ADP- und Thromboxan-Produktion. Unter Verwendung dieses Boole'schen Ansatzes wurde weiterhin das System-eigene Schwellenwertverhalten analysiert. Dabei stellte sich eine umgekehrt proportionale Abhängigkeit des relativen aktivierenden Reizes, der notwendig ist um den Schwellenwert zu überschreiten, vom absoluten hemmenden Input heraus. Das System adaptiert demnach an höhere Prostaglandinkonzentrationen durch eine Erhöhung der Sensitivität für Aktivatoren wie dem van-Willebrandt-Faktor und Kollagen, und ermöglicht somit auch unter lokal hemmenden Bedingungen eine Plättchen-vermittelte Hämostase. Der nächste Schritt bestand in der Implementierung eines Differentialgleichungs-basierten Modells der thrombozytären Prostaglandin-Signaltransduktion, um einen detaillierten Überblick über die Dynamik des inhibierenden Netzwerkteils zu erhalten. Die kinetischen Parameter dieses Modells wurden teilweise der Literatur entnommen. Der andere Teil wurde anhand einer umfassenden Kombination dosis- und zeitabhängiger cAMP und phospho-VASP Messdaten geschätzt. Der Prozess beinhaltete mehrere Iterationen aus Modellvorhersagen einerseits und experimentellem Design andererseits. Das Modell liefert die quantitativen Effekte der Prostaglandinrezeptoren IP, DP1, EP3 und EP4 und des ADP-Rezeptors P2Y12 auf die zugrunde liegende Signalkaskade. EP4 zeigt den stärksten Effekt in der aktivierenden Fraktion, wohingegen EP3 einen stärkeren inhibitorischen Effekt ausübt, als der durch Clopidogrel hemmbare ADP-Rezeptor P2Y12. Weiterhin wurden die Eigenschaften des negativen feedback-loops der PKA auf den cAMP-Spiegel untersucht, und eine direkte Beeinflussung der Adenylatzyklase durch die PKA festgestellt, in Form einer Reduzierung der maximalen katalytischen Geschwindigkeit. Die Identifizierbarkeit der geschätzten Parameter wurde mittels profile-Likelihood-Schätzung untersucht. In einem dritten Schritt wurde ein sowohl die aktivierenden, als auch die hemmenden Netzwerkteile umfassendes dynamisches Modell implementiert. Die Topologie dieses Modells wurde in Anlehnung an die des Boole'schen Modells auf der Basis von a priori Wissen festgelegt. Die Modellparameter wurden anhand von Western-Blot, Calcium- und Aggregationsmessungen geschätzt. Auch hier wurde die Identifizierbarkeit der Modellparameter durch profile-likelihood-Schätzung überprüft. Die bei niedrigen Ligandenkonzentrationen auftretende Reversibilität der Plättchen-Aggregation konnte mittels dieses Modells reproduziert werden. Jedoch zeigte sich bei mittleren ADP-Konzentrationen ein Fließgleichgewicht in einem teilweise aktivierten Zustand, und damit kein bistabiles Schwellenwertverhalten. Inwiefern dieses Verhalten durch einen Umgebungs-basierteren Mechanismus des Alles-Oder-Nichts-Verhaltens begründet wird, bei dem der Übergang von reversibler zu irreversibler Aggregation mehr durch parakrine Effekte des gesammten Thrombus bestimmt wird, als durch spezifische Signaltransduktionseigenschaften der einzelnen Zelle, müssen zukünftige Experimente zeigen. Insgesamt geben die erstellten Modelle interessante Einblicke in die Funktionsweise der Thrombozyten und ermöglichen die Simulation von pharmakologischen und genetischen Einflüssen, wie Rezeptormodulationen und knock-outs. Sie geben damit Implikationen zur Entstehung und Behandlung pathophysiologischer Zustände, und wertvolle Denkanstöße für die weitere Forschung. N2 - Platelets represent the key-players in mammalian wound-healing. Their ability to aggregate and attach to the surrounding tissue of damaged blood vessels is thereby mediated by a complex signal -transduction network that comprises both activatory and inhibitory components. Due to its medical relevance and the lack of profound understanding, the network constitutes a convenient target for modeling. In a first step, a Boolean implementation of platelet signal transduction, comprising both activating and inhibiting networks components was established. This led to important information, on how the function of different subnetworks coalesce to fully activate the platelet and to promote irreversible aggregation. These include calcium signalling, activation of key-kinases like Akt, Src and PKC, Integrin outside-in as well as inside-out signalling and autocrin ADP and thromboxane production. In addition, using this data-free approach, the systems inherent threshold behaviour was analysed. The model revealed, that the relative activating strength, that transgresses the threshold, decreases with elevating PGI inputs and is also dependent on auto- and parakrin effects. Thus, the system adapts for higher prostaglandin-concentrations by increasing its sensitivity for activators like vWF and collagen, and thereby commits thrombocyte-dependent active processes such as wound healing even if subsequently blood prostaglandin-levels are higher in later time points. Secondly, an ordinary-differential-equation based model of platelet prostaglandin signalling was established, to get a detailed view of the dynamics governing the inhibiting network part. The kinetic parameters of the model were partly taken from literature and in part estimated along a comprehensive combination of time-course and dose-response measurements of cAMP and phosphorylated VASP. The process involved an iterative cycle between model predictions and experimental design. The model delivered the quantitative effects of the prostaglandin receptors IP, DP1, EP3, EP4 and the ADP receptor P2Y12 on the underlying signalling cascade. EP4 showed the strongest effect in the activating fraction, whereas EP3 turned out to exert a greater inhibiting impact than the commonly established pharmacological target P2Y12. Furthermore, the nature of the double-negative feedback loop constituted by PKA was examined, which disclosed a direct influence of PKA on adenylate cyclase, reducing its maximum catalytic speed. The identifiablility of all kinetic parameters was analysed via profile likelihood estimation. Finally, a dynamical model comprising both activating ADP-signalling through P2Y1 and P2Y12 receptors, and the inhibiting prostaglandin-pathway was implemented. The topology of this larger model was established on the basis of a priori knowledge. Model parameters were fitted along time-resolved Western-Blot, calcium and aggregation measurements. The identifiability of the model parameters was again check by means of profile likelihood estimation. Reversibility of platelet activation at low ADP concentrations could be reproduced by this model. However, at medium concentrations the system appears to assume a steady-state in a partly activated condition, thus not providing for a bistable threshold behaviour. If this behaviour is based on a more enviroment-based character of the observed point-of-no-return behaviour, in which the transition from reversible to irreversible aggregation is rather due to parakrin effects evoked by the entire cell array, than due to specific network properties present in the single cell, has to be investigated by further experiments. All in all, the models show interesting properties of platelet signal transduction, and give valuable implications for medical treatment and future research. KW - Thrombozyt KW - Modellierung KW - ADP KW - Prostaglandine KW - Signaltransduktion KW - Thrombozyten KW - Modellierung KW - ADP KW - Prostaglandine KW - platelets KW - ADP KW - prostaglandin KW - modeling KW - boolean KW - ODE Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-78807 ER - TY - THES A1 - Willmes, Christoph T1 - Therapie kutaner Tumoren : Identifizierung molekularer Biomarker der ex vivo Chemosensitivität des malignen Melanoms und Evaluierung der Wirkungsweise von Interferonen und Artemisininen auf das Merkelzellkarzinom T1 - Treatment of cutaneous tumors N2 - Für Patienten mit malignem Melanom im Stadium der Fernmetastasierung gibt es bis heute lediglich Therapieoptionen mit sehr eingeschränkten Erfolgsaussichten. Diese Tatsache bestätigt die Notwendigkeit von Biomarkern zur Vorhersage des Erfolgs verschiedener Therapien. Der ATP-basierende ex vivo Chemosensitivitätsassay hat sich als erfolgreiche Methode zur individuellen Vorhersage eines Chemotherapieerfolgs herausgestellt. Tatsächlich zeigte der Assay ein heterogenes Sensitivitätsprofil gegen verschiedene Chemotherapeutika und ließ in getesteten Patienten ein ex vivo wirksames Chemotherapieregime identifizieren, das anschließend auch klinische Therapieerfolge bei Verwendung der Therapie mit dem besten individuellen Chemosensitivitätsindex(BICSI) zeigte. Um diesen sehr aufwendigen Assay zukünftig zu umgehen, sollten in der vorliegenden Arbeit prädiktive molekulare Biomarker der Chemosensitivität identifiziert werden. Hierfür wurden im Voraus durch einen Microarray die Kandidaten Secernin 1 (SCRN1), Lysyl oxidaselike 1 (LOXL1), Thymosin beta 4 X-linked (TMSB4X), Vesicle-associated membrane protein 5 (VAMP5) und Serine protease inhibitor B1 (SERPINB1) als differentiell exprimierte Gene in chemosensitivem gegenüber chemoresistentem Gewebe identifiziert. Die relative Expression dieser Kandidatengene wurde daraufhin in bis zu 128 verschiedenen Melanomgeweben mit dem Chemosensitivitätsindex verschiedener Chemotherapeutika korreliert. Hierbei konnte eine signifikante Korrelation zwischen SerpinB1 mit der Chemosensitivität gegenüber der Therapiekombination mit Paclitaxel und Cisplatin auf Gen- aber nicht auf Proteinebene identifiziert werden. Weiterhin konnte eine differentielle Expression ebenfalls in chemosensitiven und -resistenten Melanomzelllinien nachgewiesen werden, die allerdings im Vergleich mit dem analysierten Gewebe in gegensätzlicher Richtung verlief. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass SerpinB1 ein vielversprechender Marker für die Chemosensitivität gegenüber Paclitaxel und Cisplatin ist, dessen funktionelle Bedeutung aber unklar bleibt. Das Merkelzellkarzinom (MCC) ist ein seltener und hoch aggressiver Tumor der mit dem Merkelzellpolyomavirus (MCV) in Zusammenhang steht. Da MCC Zelllinien zur Aufrechterhaltung ihrer Viabilität die MCV T-Antigene benötigen, könnte der Einsatz von Interferonen (IFN) ein möglicher therapeutischer Ansatz zur Behandlung dieser Krebserkrankung sein. In der vorliegenden Arbeit haben wir daher die Effekte von IFNs auf MCC Zelllinien, mit besonderer Berücksichtigung der MCV+ Linien, untersucht. IFNs vom Typ I (hier Multiferon, ein Mix verschiedener IFN α Subtypen, und IFN β) wirkten stark inhibierend auf die zelluläre Viabilität. Die Zellzyklusanalyse zeigte eine Erhöhung des sub-G Anteils der Zellen nach Behandlung mit IFN, was auf Apoptose als ausschlagebenden Grund schließen ließ. Diese Effekte waren für die Behandlung mit IFN β weniger stark ausgeprägt. Der inhibitorische Effekt von Typ I IFNs auf MCV+ MCC Zelllinien war assoziiert mit einer verringerten Expression des viralen großen T-Antigens (LTA) und einer Erhöhung in der Expression von promyelocytic leukemia protein (PML), das dafür bekannt ist, die Funktion des LTA störend zu beeinflussen. Zusätzlich führte die intratumorale Anwendung von Multiferon in vivo zu einer Regression im Wachstum von MCV+, aber nicht MCV- MCC Xenotransplantaten. Die Ergebnisse zeigen das Typ I IFNs einen starken antitumoralen Effekt haben, der zum Teil durch die Regulierung des LTA herbeigeführt wird. Neben diesen direkten Effekten der IFNs auf die Zellproliferation induzieren diese auch die Expression von MHC Klasse I Molekülen in MCC Zelllinien. Die Durchflusszytometrie zeigte eine Induktion der MHC Klasse I Expression in drei MHC I negativen MCC Zelllinien und eine Erhöhung der Expression, die vor der Behandlung eine geringe Menge an MHC I aufwiesen. Diese Effekte konnten auch in den in vivo Xenotransplantaten beobachtet werden. Die Ergebnisse zeigen, dass die Behandlung mit IFN sowohl direkte als auch indirekte Effekte auf das MCC hat und eine breite Anwendung in Patienten mit MCV+ und MCV- Tumoren finden kann. Neben IFNs sind auch Artemisinin und seine Derivate bekannt für ihre antitumoralen und antiviralen Eigenschaften. Daher haben wir den Effekt des Artemisininderivats Artesunate auf MCV+ und MCV- MCC Zelllinien getestet. Tatsächlich konnten wir auch hier einen antiproliferativen Effekt des Stoffes nachweisen, der stärker auf MCV+ als auf MCV- Zelllinien wirkte und bei ersteren wiederum mit einer reduzierten LTA Expression einherging. Im Vergleich dazu blieben Fibroblasten von der Behandlung unbeeinflusst. Das verringerte Tumorwachstum konnte ebenfalls für in vivo Xenotransplantationsmodelle gezeigt werden. Auf Grundlage dieser Erkenntnis sollte eine genauere Untersuchung dieses alten Naturheilstoffes für die Behandlung von MCC Patienten in Betracht gezogen werden. N2 - For melanoma patients with distant metastases all available therapeutic options demonstrate only very limited efficacy up to date. This fact substantiates the need of predictive markers for therapy response. For example, ex-vivo chemosensitivity testing by an ATP-based luminescence assay is a promising tool to predict the individual outcome of different chemotherapy regimens. Indeed, this assay demonstrates a heterogeneous chemosensitivity against different cytotoxic drugs which correlates with chemotherapy outcome in terms of therapy response and overall survival; for the treatment of the patient the drug with the best individual chemosensitivity index(BICSI) is used. To circumvent this elaborate assay in the future, we want to identify and characterize predictive molecular biomarkers of specific chemosensitivity. Initially, predictive biomarker aspirants were identified by a microarray comparing chemosensitive and chemoresistant melanoma cell lines. To this end, we found Secernin 1 (SCRN1), Lysyl oxidaselike 1 (LoxL1), Thymosin beta 4 X-linked (TMSB4X), Vesicleassociated membrane protein 5 (Vamp 5) and Serine protease inhibitor B1 (SerpinB1) as differential expressed in chemosensitive versus chemoresistant melanoma cells. Furthermore, we correlated the relative expression of our candidates with the chemosensitivity index of different chemotherapy regimes in up to 128 melanoma tissues so far. Importantly, we found a significant correlation between SerpinB1 gene but not protein expression and chemosensitivity towards Paclitaxel and Platin. Moreover, we also detected a differential expression of SerpinB1 in melanoma cell lines which however was running in reverse direction compared to the analyzed tissues. In conclusion, SerpinB1 seems to be a promising biomarker for prediction of Paclitaxel and Platin chemosensitivity. Merkel cell carcinoma (MCC) is a rare and highly aggressive skin cancer associated with the Merkel cell polyomavirus (MCV). As MCC cell lines demonstrate oncogene addiction to the MCV T-antigens, pharmacological interference of the large T-antigen(LTA) may represent an effective therapeutic approach for this deadly cancer. In this study, we investigated the effects of interferons (IFNs) on MCC cell lines, especially on MCV positive (MCV+) lines. Type I IFNs (i.e. Multiferon, a mix of different IFN α subtypes, and IFN β) strongly inhibited the cellular viability. Cell cycle analysis demonstrated increased sub-G fractions for these cells upon IFN treatment indicating apoptotic cell deathν these effects were less pronounced for IFN β. Notably, this inhibitory effect of type I IFNs on MCV+ MCC cell lines was associated with a reduced expression of the MCV LTA as well as an increased expression of promyelocytic leukemia protein (PML), which is known to interfere with the function of the LTA. In addition, the intra-tumoural application of multiferon resulted in a regression of MCV+ but not MCV- MCCs in vivo. Together, our findings demonstrate that type I IFNs have a strong antitumour effect, which is at least in part explained by modulation of the virally encoded LTA. Moreover, in addition to directly affecting MCC cell proliferation, IFNs strongly reinduce MHC class I expression in MCC cells. Flowcytometry demonstrated a re-induction of MHC class I expression upon IFN treatment in three MHC class I- MCV+ cell lines and an increase in MHC class I expression in cell lines that were characterized by a weak expression prior to treatment. Importantly, the increase or induction of MHC class I expression could also be demonstrated in vivo in xenotransplantation models. These results imply that IFN treatment has both a direct and an indirect effect in MCC and should be applicable in a general manner, i.e. irrespective of the MCV status of the patient. Beside IFN, Artemisinins are also known for their antitumoral and antiviral properties. In consequence, we tested the effect of Artesunate, i.e., an Artemisinin drivate, on MCV+ and MCV- MCC cell lines. In this regard, we could demonstrate an antiproliferative effect which was stronger on MCV+ cell lines, and which was associated with a reduced expression of the viral LTA. In contrast, fibroblasts were uneffected by Artenusate treatment. The reduced tumor growth could also be shown in vivo by intra-tumoral injection of Artesunate in MCV+ xenotransplantation models. According to these findings, a more detailed investigation of this ancient natural drug for the treatment of MCC patients should be considered. KW - Interferon KW - Melanom KW - Qinghaosu KW - Chemosensitivität KW - Merkelzellkarzinom KW - Chemosensitivity KW - Merkel cell carcinoma KW - Merkel-Zellkarzinom Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-83470 ER - TY - THES A1 - Melzer, Juliane T1 - Die Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in Neuroblasten während der Entwicklung des zentralen Nervensystems von Drosophila melanogaster T1 - The function of the p21-activated kinase Mbt in neuroblasts during the development of the central nervous system of Drosophila melanogaster N2 - p21-aktivierte Kinasen regulieren zahlreiche zelluläre Prozesse, die während der Entwicklung, aber auch beispielsweise bei der Krebsentstehung, von zentraler Bedeutung sind. Mbt, das einzige Typ II PAK-Protein von Drosophila melanogaster, spielt eine Rolle bei der Gehirnentwicklung. Eine Nullmutation von mbt, mbtP1, bildet kleinere Gehirne mit stark verkleinerten Pilzkörpern aus. In dieser Arbeit wurde die Funktion von Mbt in Neuroblasten untersucht. Mbt wurde als Teil des apikalen Proteinkomplexes in Neuroblasten des Zentralhirns nachgewiesen. Die apikale Lokalisation von Mbt ist Zellzyklus-abhängig und wird über Bindung an Cdc42 reguliert. Sie ist essentiell für die Funktion von Mbt in Neuroblasten. Trotz apikaler Mbt-Lokalisation in Neuroblasten zeigte die mbt Nullmutante keine Defekte des basalen Mechanismus der asymmetrischen Zellteilung. Mud zeigte geringfügige Lokalisationsveränderungen, die auf einen möglichen Einfluss von Mbt hinweisen. Obwohl PAKs zentrale Regulatoren des Zytoskeletts sind, zeigte die mbtP1 Mutante keine offensichtlichen Veränderungen des Aktin- und Tubulin-Zytoskeletts. Armadillo, ein Aktin-assoziiertes Mbt-Substrat, zeigte ebenfalls keine Lokalisationsveränderung in Neuroblasten. Mbt steuert jedoch die apikale Anreicherung von Cno, einem weiteren Aktin-assoziierten Protein, in Neuroblasten. Darüber hinaus beeinflusst Mbt die Zellgröße von Neuroblasten, sowie deren Proliferationspotenzial und Überleben. mbtP1 Neuroblasten sind kleiner als wildtypische Neuroblasten, haben ein geringeres Proliferationsvermögen und eine geringere Überlebenswahrscheinlichkeit. Der Zelltod von Neuroblasten ist jedoch ein sekundärer Effekt. Daher kann eine Blockierung von Apoptose den adulten Pilzkörperphänotyp nicht retten. Signalwege, die Zellgröße und Proliferation regulieren, wurden auf eine Beteiligung von Mbt hin analysiert. mbtP1 induzierte leichte Effekte im Insulin-Signalweg und die Delokalisation eines nukleolären Proteins. Eine genetische Interaktion von mbtP1 mit Mutationen in Genen des klassischen MAPK-Signalweges identifzierte mbt als Positivregulator dieses Signalweges im Auge. Ein ähnlicher, schwächerer Effekt wurde auch bzgl. der Proliferation und Größe von Neuroblasten beobachtet. Eine 2D-Gelanalyse von Larvengehirnen identifizierte Bic und Hsp83 als mögliche von Mbt regulierte Proteine. Diese Arbeit charakterisiert eine bisher unbekannte Funktion der p21-aktivierten Kinase Mbt in neuronalen Stammzellen und liefert damit Ansatzpunkte für eine detaillierte Aufklärung der Funktionsmechanismen von Typ II PAKs bei der Regulation von Zellproliferation und Überleben N2 - p21-activated kinases regulate numerous cellular processes central not only during development, but also for example for cancer pathogenesis. Mbt, the only type II PAK in Drosophila, regulates brain development. The mbt null mutant mbtP1 exhibits reduced brain size, with the mushroom bodies showing the most pronounced reduction. In this work, the function of Mbt in neuroblasts was investigated. Mbt was identified as a component of the apical protein complex in central brain neuroblasts. The apical localization of Mbt was cell cycle dependent and regulated by binding to Cdc42, which is essential for Mbt function in neuroblasts. Despite apical localization of Mbt, the mbtP1 null allel showed no defects in the basic mechanism of asymmetric cell division in larval neuroblasts. However, Mud showed minor localization changes indicating a possible influence of Mbt. Even though PAKs are well-known regulators of the cytoskeleton, no obvious changes in the actin and tubulin cytoskeleton were observed in mbtP1 neuroblasts. The localization of Armadillo, an actin-associated Mbt substrate, was also undisturbed throughout the cell cycle. Mbt controls the apical enrichment of Cno, another actin-associated protein. Moreover, Mbt influences neuroblast cell size, proliferation potential and survival. mbtP1 neuroblasts were smaller than wildtype neuroblasts and showed reduced proliferation activity and survival. However, the apoptotic loss of mbtP1 neuroblasts is a secondary effect. Thus, the adult mushroom body phenotype cannot be rescued by blocking apoptosis. Signalling pathways known to regulate growth and proliferation were analyzed with respect to a possible participation of Mbt. mbtP1 induced slight effects in the insulin pathway and strongly influenced the localization of an unknown nucleolar protein. Genetic interactions of mbtP1 with mutations in genes involved in the classical MAPK pathway identified mbt as a positive regulator of the MAPK pathway. A similar effect was also observed with respect to neuroblast proliferation and size. A 2D gel analysis of larval brains identified Bic and Hsp83 as candidate proteins, that might be regulated by Mbt. This work characterizes a novel function of the p21-activated kinase Mbt in neural stem cells. It provides starting points for a detailed analysis of the mechanisms of type II PAK functions in the control of cell growth, proliferation and survival. KW - Taufliege KW - Auge KW - Ontogenie KW - Pilzkörper KW - Molekularbiologie KW - p21-aktivierten Kinase KW - PAK KW - Neuroblast KW - Pilzkörper KW - Drosophila melanogaster KW - p21 activated kinase KW - PAK KW - neuroblast KW - mushroombody KW - Drosophila melanogaster Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85619 ER - TY - THES A1 - Hartel, Andreas J. W. T1 - Die laterale Diffusion des variablen Oberflächenglykoproteins in Trypanosomen und in artifiziellen Membranen T1 - Lateral diffusion of the variant surface glycoprotein in trypanosomes and artificial membranes N2 - Die Diffusion von Membranproteinen spielt bei einer Vielzahl von zellbiologischen Prozessen eine zentrale Rolle. So hat die Beweglichkeit von Glykosyl-Phosphatidyl-Inositol-(GPI-) verankerten Proteinen zum Beispiel eine tragende Funktion bei der Alzheimer Krankheit, der Creutzfeldt-Jacob Krankheit und der Afrikanischen Schlafkrankheit. Der Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit, Trypanosoma brucei spec., präsentiert auf seiner Zelloberfläche einen dichten Mantel aus identischen GPI-verankerten Proteinen. Diese sogenannten Variant Surface Glycoproteins (VSGs) stellen den zentralen Pathogenitätsfaktor der Trypanosomen im Blutstrom des Wirtes dar und ermöglichen dem Parasiten die Antigene Variation. Während der Antigenen Variation wird der VSGMantel durch einen immunologisch distinkten Mantel ersetzt. Hierfür ist die Diffusion der VSG essentiell. In der vorliegenden Arbeit wird die Diffusion des VSG in lebenden Trypanosomen und in artifiziellen Membranen systematisch untersucht. Auf diese Weise werden der Einfluss der lateralen Proteindichte, der N-Glykosylierung und der Proteingröße auf die Diffusion der GPI-verankerten Proteine charakterisiert. Die Mobilität des VSG auf lebenden Trypanosomen ist an der Grenze zu einem Diffusionsschwellenwert, dieser wird allerdings nicht überschritten. Die Mobilität des VSG in der Nähe des Diffusionsschwellenwertes wird durch die N-Glykosylierung der VSG ermöglicht. Außerdem kann gezeigt werden, dass die Größe der Proteine einen entscheidenden Einfluss auf den Diffusionskoeffizienten der GPI-verankerten Proteine ausübt. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit deutlich, dass der VSG-Mantel der Trypanosomen ein, an seine Anforderungen, hoch-adaptiertes System darstellt. Würde entweder die laterale Dichte, die N-Glykosylierung oder die Größe der Proteine beeinträchtigt werden, so wäre die Funktion der Antigenen Variation gestört und die Pathogenität des Parasiten gefährdet. Da die lokale Verteilung von GPI-verankerten Proteinen in biologischen Membranen ein wichtiges funktionelles Konzept darstellt, ist der Einfluss der untersuchten Faktoren nicht nur für den VSG-Mantel relevant, sondern kann auch für das generelle Verständnis der Dynamik von Proteinen in zellulären Membranen dienen. N2 - The lateral diffusion of membrane anchored proteins plays a crucial role in many cell biological processes. The mobility of glycosylphosphatidylinositol- (GPI-) anchored proteins holds a pivotal function in many diseases such as, Creutzfeld-Jacob, Alzheimer and the African sleeping sickness. The cell surface of the pathogen causing African sleeping sickness, Trypanosoma brucei sp., is covered by a dense layer of identical GPI-anchored proteins. These variant surface glycoproteins (VSGs) are the major pathogenicity factor of the parasites in the circulation of the host and permit antigenic variation. During antigenic variation the VSG-coat has to be replaced by an immunologically distinct coat. For this purpose, the diffusion of VSG is essential. In the present study, the diffusion of VSG is analysed in living trypanosomes and in artificial membranes. By this, the impact of the lateral protein density, the Nglycosylation and the protein size on the lateral diffusion are studied systematically. The diffusion of VSG in the surface coat of the trypanosome is at the edge of a molecular crowding threshold. Importantly, this crowding threshold is not exceeded. N-glycosylation enables the diffusion of the VSG at the edge of the crowding threshold. Further, the diffusion coefficient of GPI-anchored proteins is strongly affected by the size of the proteins. In conclusion, the present study shows, that the VSG-coat of the trypanosomes is a system, which is highly adapted to its requirements. Any interference with either, the lateral density, the N-glycosylation or the VSG-size would hamper the pathogenicity of the parasite. The local distribution of GPI-anchored proteins is an essential component of biological membranes, thus the results of the present work will have an impact not only on the VSG-coat, but also give further understanding on the dynamics of proteins in crowded spaces. KW - Trypanosomen KW - Brownsche Bewegung KW - Diffusion KW - Membranproteine KW - Diffusion KW - GPI-verankerte Proteine KW - Trypanosomen KW - Laterale Dichte KW - N-Glykosylierung Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90997 ER - TY - THES A1 - Dietz, Lena T1 - Die Rolle von NFATc1 und NFATc2 bei der Immunpathogenese von Experimenteller Autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE), dem Tiermodell der Multiplen Sklerose T1 - The role of NFTAc1 and NFATc2 in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the animal model of multiple sclerosis N2 - Multiple Sklerose (MS) ist eine Autoimmunkrankheit, welche durch Infiltration autoreaktiver Immunzellen in das Zentrale Nervensystem (ZNS) gekennzeichnet ist. Hierbei gelten insbesondere Th1- und Th17-Zellen als wichtige Mediatoren der ZNS-Entzündungsreaktion. Beide T-Helfer-Zellarten können durch regulatorische T-Zellen (Tregs) in ihrer Funktion supprimiert werden. NFAT(Nuclear Factors of Activated T cells)-Transkriptionsfaktoren werden nach TCR-Antigen-Stimulation induziert und regeln – als pleiotrope Transkriptionsfaktoren – viele funktionelle Prozesse in T-Zellen. Um die Rolle dieser Faktoren bei der Immunpathogenese von MS zu analysieren, wurden unterschiedliche NFAT-defiziente Mausstämme auf den Krankheitsverlauf des Tiermodells Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) hin untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass sowohl der einzelne Verlust von NFATc1 und NFATc2 in CD4+ T-Zellen als auch das Fehlen einer spezifischen C-terminalen Proteinmodifikation von NFATc1, die SUMOylierung, sich abmildernd auswirkten. Der verminderte klinische Ausgang der EAE beruhte allerdings je nach knock-out auf unterschiedlichen Mechanismen. Im Fall des T-Zell-spezifischen Verlustes von NFATc1 (Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ Mäuse), erwies sich die EAE aufgrund einer stark eingeschränkten Aktivierung und Effektorzellentwicklung von CD4+ T-Zellen als vermindert. Dies konnte durch eine reduzierte Produktion an pathogenen Effektorzytokinen, wie IFNγ, IL-17A, GM-CSF sowie IL-22 und weniger an IL-17A+ IFNγ+ Doppelproduzenten im ZNS gezeigt werden. Der Verlust von NFATc2 resultierte in einer starken Th2-Antwort im ZNS von Nfatc2-/- EAE-Mäusen einhergehend mit protektiven IL-4- und IL-10-Produzenten. Interessanterweise konnten auch mehr nicht-pathogene Th17-Zellen nachgewiesen werden. Nfatc1/CΔSUMO CD4+ T-Zellen sezernierten sowohl nach in vitro als auch nach in vivo Stimulation erhöhte Mengen von IL-2. In vitro Kulturen von Th1- und Th17-Zellen wiesen neben dieser erhöhten IL-2-Sekretion eine verminderte Produktion von IFNγ und IL-17A auf. In Übereinstimmung mit diesen in vitro Befunden zeigte sich auch in der EAE ein reduziertes Krankheitsbild mit weniger Th1- und Th17-Zellen, dafür aber eine IL-2-geförderte Erhöhung der Treg-Population. Anhand der Erkenntnis, dass NFAT-Faktoren die (Auto)-Immunreaktion entscheidend beeinflussen, könnte die Inhibition einzelner NFAT-Faktoren ein neues Ziel für eine MS-Therapie darstellen. N2 - Multiple sclerosis (MS) is an inflammatory autoimmune disease affecting the central nervous system (CNS). T helper cells, in particular Th1 and Th17 cells, are important mediators of this progress and are antagonized by regulatory T cells (Tregs). Members of the transcription factor family “Nuclear Factors of Activated T cells” (NFAT) are induced in response to TCR stimulation and act as pleiotropic regulators of T cell function. To investigate the role of single NFAT factors in the pathophysiology of MS we used several NFAT deficient mice in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), the animal model of the human disease. We could show that not only the deficiency of NFATc1 or NFATc2, but also the absence of the C-terminal (specific) SUMOylation of NFATc1 reduces the clinical severity of EAE. Regardless of a comparable influence on the disease, the reasons are distinct. In case of T cell specific loss of NFATc1 (Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ mice) the clinical score was diminished due to impaired effector functions of CD4+ T cells lacking all NFATc1 isoforms. This was demonstrated by lower levels of pathogenic effector cytokines producing CD4+ T cells, such as IFNγ, IL-17A, GM-CSF, IL-22 producers as well as IL-17A+ IFNγ+ double producers in the CNS of Nfatc1fl/fl x Cd4cre+ mice compared to wild type siblings. Also the course of EAE in Nfatc2-/- mice was found to be ameliorated. The deficiency of NFATc2 resulted in a striking defect of CD4+ T cells in producing IFN-γ, but an enhanced immune responses with Th2-like characteristics. CD4+ T-cells in the ZNS of Nfatc2-/- EAE-diseased mice showed a profound production of protective IL-4 and IL-10 lymphokines. Interestingly, also more non-pathogenic IL-17A producers were found. CD4+ T cells from Nfatc1/CΔSUMO mice produce significantly more IL-2 in vitro and in vivo, whereas cultured Th1 and Th17 cells express less IFNγ and IL-17A, respectively. Consistently, the MOG35-55-induced EAE in Nfatc1/CΔSUMO mice revealed an ameliorated clinical disease severity compared to wild type controls with a robust IL-2-driven increase in Tregs and a reduction in effector T helper cells producing lymphokines. In summary, we could show that individual NFAT factors and their modifications play a distinct role in the pathogenesis of MS. Therefore, targeting or modulating specific NFAT factors could be a therapeutic approach to inhibit undesired NFAT functions in the respective human disease context of MS. KW - Immunologie KW - Autoaggressionskrankheit KW - NFAT in EAE KW - Immunbiologie KW - Transkriptionsfaktor KW - Autoimmunkrankheit Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-94569 ER - TY - THES A1 - Reil, Michael T1 - Essentielle Rollen des LEM-Domänen Proteins MAN1 während der Organentwicklung von Xenopus laevis und überlappende Funktionen von Emerin T1 - Essential roles of LEM domaine protein MAN1 during organogenesis in Xenopus laevis and overlapping functions of emerin N2 - Mutationen in Genen, die für Kernhüllproteine codieren sind mit einer stetig zunehmenden Anzahl menschlicher Erkrankungen verbunden, die als Envelopathien bezeichnet werden. Erstaunlicherweise betrifft die Pathologie dieser Krankheiten spezifische Gewebe und Organe, obwohl entsprechende Proteine meist ubiquitär exprimiert werden. So führen beispielsweise Defekte in Emerin, einem Protein der inneren Kernhülle, zur X-chromosomalen Emery- Dreifuss Muskeldystrophie (EDMD). Diese Krankheit ist durch Muskelschwäche oder – schwund gekennzeichnet. Defekte im Kernhüllprotein MAN1 sind dagegen mit Krankheiten verbunden, die Knochen- und Hautgewebe betreffen. Interessanterweise besitzen beide Proteine eine evolutionär hoch konservierte Domäne, die sog. LEM-Domäne. LEM-Domänen Proteine können mit der Kernlamina interagieren, ebenso mit dem sog. Barrier-to- Autointegration Factor (BAF) sowie mit zahlreichen Transkriptionsfaktoren. Dennoch ist die funktionelle Rolle der LEM-Domänen Proteine bis dato nicht vollständig aufgeklärt. In der vorliegenden Studie sollten daher die Funktionen von MAN1 und Emerin während der Frühentwicklung von Xenopus laevis untersucht werden. Vorangehende Untersuchungen zeigten, dass Mikroinjektionen von XMAN1- Antikörpern in Zwei-Zell-Stadien befruchteter Eizellen zu einem Arrest der Zellteilung in der injizierten Blastomere führten. Da dabei eine Störung der Kernhüllbildung spekuliert wurde, sollte durch Antikörper-vermittelter Inhibition von XMAN1 die Bildung von in vitro Kernen im Xenopus Eiextrakt untersucht werden. Dabei wurden Kerne beobachtet, die dekondensiertes Chromatin zeigten, bei denen jedoch eine Fusion von Membranvesikeln zu einer durchgehenden Kernhülle nicht stattgefunden hatte. Frühere Charakterisierungen von MAN1 und Emerin zeigten unterschiedliche Expressionsmuster während der Entwicklung von X. laevis. Da XMAN1 ubiquitär exprimiert und Xemerin jedoch erstmals ab Stadium 41 nachweisbar ist, war es mittels Mikroinjektion von Xemerin möglich zu zeigen, dass es in der Lage ist den Arrest der Zellteilung zu verhindern. Es wurde daher die These aufgestellt, dass MAN1 und Emerin während der Frühentwicklung von Xenopus überlappende Funktionen besitzen. Um diese These zu prüfen, wurde zunächst unter Verwendung des Proximity Ligation Assays untersucht, ob beide Proteine miteinander interagieren können. Mit Hilfe dieser Methode konnte gezeigt werden, dass Interaktionen beider Proteine innerhalb der Kernhülle lokalisieren. Die Interaktionen blieben während der Mitose bestehen und waren erst wieder zum Ende der Mitose in der Kernhülle nachweisbar. Diese Resultate deuten daher darauf hin, dass XMAN1/Xemerin-Interaktionen während der ... N2 - Mutations in genes encoding for nuclear envelope proteins are linked to an increasing number of human diseases, called envelopathies. Interestingly, pathology of these diseases affects specific tissues and organs, even though the related proteins are expressed ubiquitous. Defects in the inner nuclear membrane protein emerin for example, are leading to X-linked Emery- Dreifuss muscular dystrophy (EDMD), characterized by muscle weakness or wasting. Conversely, defects in the nuclear envelope protein MAN1 are linked to bone and skin disorders. Both proteins share a highly conserved domain, called LEM-domain. LEM proteins are known to interact with the nuclear lamina, the so called Barrier-to-Autointegration Factor (BAF) and several transcription factors. Nevertheless, knowledge of the functional roles of LEM proteins is still unclear. For this reason, this study aimed to investigate the roles of MAN1 and emerin during early Xenopus laevis development and nuclear envelope assembly. ... KW - Organogenese KW - Emerin KW - Kernhülle KW - LEM domaine KW - emerin KW - MAN1 KW - nuclear envelope KW - organogenesis KW - LEM-Domänen KW - Organentwicklung Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-85105 ER - TY - THES A1 - Zovko, Josip T1 - Die E3-Ubiquitinligase HectD1 reguliert die Stabilität des antiapoptotischen Bcl-2-Familienmitglieds A1 T1 - The E3-Ubiquitinligase HectD1 regulates the stabiliy of the anti-apoptotic Bcl-2-protein A1 N2 - Die Bcl-2-Familienmitglieder A1 und sein humanes Homolog Bfl-1 gewährleisten das Überleben der Zelle. Gleichzeitig trägt eine Dysregulation der Expression von A1/ Bfl-1 zur Krebsentstehung bei. Die Stabilität von A1/ Bfl-1 wird durch deren Ubiquitinylierung sowie die anschließende proteosomale Degradation gesteuert. Mit Hilfe eines Yeast-Two-Hybrid-Screens wurde die E3-Ubiquitinligase HectD1 als potentieller Interaktionspartner von A1/ Bfl-1 identifiziert. Die Interaktion von A1 und HectD1 des Yeast-Two-Hybrid-Screens konnte in Säugerzellen bestätigt werden. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass lediglich 87 Aminosäuren für eine Interaktion von HectD1 und A1 nötig sind. Da membrangebundenes HectD1 zu einer Translokation von zytosolischem A1 an die Zellmembran führt, kann man davon ausgehen, dass beide Proteine auch in vivo miteinander interagieren. Eine dominant negative HectD1-Mutante schließlich beeinflusst die Ubiqutinylierung von A1 und führt somit zu dessen Stabilisierung. Diese Daten legen nahe, dass HectD1 ein wichtiger negativer Regulator von A1/ Bfl-1 ist und dass HectD1 für die Regulierung der A1/ Bfl-1-Proteinmenge in (Krebs)zellen sehr wichtig ist. N2 - The Bcl-2 family members A1 and its human orthologue Bfl-1 support survival of cells. Dysregulation of their expression contributes to cancer. Stability of A1/ Bfl-1 is controlled by ubiquitination followed by degradation via the proteasome. Using a yeast two-hybrid screen we identified the E3 ubiquitin-ligase HectD1 as potential A1/ Bfl-1-interacting partner. We confirmed interaction of these two proteins in mammalian cells. Only 87 amino acids of HectD1 are necessary for the interaction of the protein with A1. Membrane-bound HectD1 recruits A1 to the membranes further supporting the notion that the two proteins interact in vivo. Importantly, dominant negative versions of HectD1 interfered with ubiquitination of A1 stabilizing the protein. These findings indicate that HectD1 maybe an important negative regulator of the A1/ Bfl-1 anti-apoptotic protein, providing an important target for interfering with dysregulation of A1/ Bfl-1 in cancer. KW - Zelltod KW - Ubiquitinierung KW - Bcl-2 Familie KW - Bcl-2 family KW - Regeneration KW - Bcl-2-Proteinfamilie KW - Ubiquitination Y1 - 2013 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-87922 ER - TY - THES A1 - Fischer, Peter T1 - Untersuchungen zum Einfluss der Anzahl primordialer Keimzellen auf die Geschlechtsbestimmung von Medaka, Oryzias latipes T1 - Investigations on the influence of Primordial Germ Cell number on the sex determination of Medaka, Oryzias latipes N2 - Die primordialen Keimzellen (PGCs) sind die einzigen Zellen des Embryos, die die genetische Information von einer Generation an die nächste weiter geben können. Es wurde gezeigt, dass in allen bislang untersuchten Knochenfischen die Anzahl der Urgeschlechtszellen während der Embryonalentwicklung der erste sichtbare Unterschied zwischen Männchen und Weibchen ist. Daraus ergibt sich die Frage, ob die Anzahl der primordialen Keimzellen das Geschlecht bestimmt, oder ob die somatischen Zellen je nach sexueller Identität die Urgeschlechtszellen zur Proliferation anregen. Um zu untersuchen, wie die Anzahl der Urgeschlechtszellen mit der Geschlechtsdetermination zusammenhängt, habe ich in dieser Arbeit die Anzahl der Urgeschlechtszellen manipuliert und deren Schicksal im Verlauf der Embryonalentwicklung verfolgt. Weiterhin untersuchte ich, in wieweit die Temperatur einen Einfluss auf die Geschlechtsbestimmung hat und ob sie Auswirkungen auf die Anzahl und die Wanderung der Urgeschlechtszellen hat beim Medaka hat. Durch meine Experimente, in denen ich die Fische während der Embryonalentwicklung bei verschiedenen Temperaturen hielt, konnte ich zeigen, dass beim Medaka der genetische Geschlechtsbestimmungsmechanismus durch erhöhte Temperatur überschrieben werden kann. Die Temperaturerhöhung in der Embryonalentwicklung führt zu einer Weibchen­‐zu­‐Männchen Geschlechtsumkehr. Dabei wird die Anzahl der primordialen Keimzellen im Vergleich zu den Kontrollen reduziert. Zudem wird durch die höhere Temperatur das autosomale dmrt1a viel früher angeschaltet, wa sauf einen alternativenSignalweg deutet, der die männliche Geschlechtsentwicklung in XX geschlechtsumgewandelten Tieren steuert. N2 - Primordial Germ Cells (PGCs) are the only cells, which can transport genetic information from one generation to the next one. In all investigated teleost fish the different number of germ cells is the foist recognizable difference between mal and female. Therefore the question arises, if the number of germ cells is the sex determining mechanism, or if the somatic cells of the gonad stimulate the PGCs to proliferate. To investigate the connection between germ cell number and sex determination in medaka, i manipulated the number of germ calls and followed their fate through embryonic development. Furthermore i investigated the influence of temperature on sex determination and behavior and number of germ cells. I could show, that it is possible to ablate all PGCs by DND morpholino injection. While total absence of PGCs led to infertile male development with string like gonads, increasing the number of PGCs by bucky ball mRNA injection showed no influence on sexual development. Interestingly I observed that even when I increased the number early in embryonic development by more than two-­fold, PGC number after some time went down to the untreated embryo level. This points to a non‐cell autonomous mechanism, which limits PGC number according to the somatic SD process. KW - Geschlechtsbestimmung KW - Gamet KW - Sex determination KW - Sexual development KW - Japankärpfling KW - Gonadenentwicklung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106846 ER - TY - THES A1 - Zdzieblo, Daniela T1 - Das Polycomb group Protein PCGF6 ist ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung und kann in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen T1 - The Polycomb group protein PCGF6 is a new and essential factor for iPS reprogramming that can replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc N2 - Embryonale Stammzellen (ESCs) sind durch zwei charakteristische Eigenschaften definiert. Neben einer kontinuierlichen Selbsterneuerungskapazität weisen ESCs die Fähigkeit auf, in alle Zelltypen der drei Keimblätter differenzieren zu können. Diese Eigenschaften werden unter anderem durch ein Netzwerk wichtiger Pluripotenzfaktoren als auch durch epigenetische Mechanismen reguliert, welche die Transkription von Pluripotenz- und Differenzierungsgenen kontrollieren. In murinen ESCs sind an der Repression von Differenzierungsgenen auch Polycomb group (PcG) Proteine beteiligt. Diese Proteine bauen zwei Chromatin-modifizierende Komplexe auf, die als Polycomb repressive complex 1 bzw. 2 (PRC1 bzw. PRC2) bezeichnet werden. Nach dem klassischen Modell der Polycombfunktion, katalysieren PRC1 und PRC2 gemeinsam zwei charakteristische Histonmodifikationen, die zur Repression PRC-spezifischer Zielgene beitragen. Zahlreiche Studien in den letzten Jahren belegen, dass der Proteinaufbau der PRC1 Komplexe stark variieren kann, wobei die Familie der Polycomb group RING finger (Pcgf) Proteine eine wichtige Rolle spielt. In diesem Zusammenhang definieren einzelne Pcgf Paraloge (Pcgf1 – 6) verschiedene PRC1 Varianten (PRC1.1 – 1.6), die Komplex-spezifische Bindestellen im Genom aufweisen. Diese Erkenntnisse lassen auf unterschiedliche Mechanismen der PRC1 Varianten und Pcgf Paralog-spezifische Funktionen schließen, die zum jetzigen Zeitpunkt nur wenig erforscht sind. Für manche Pcgf Paraloge sind wichtige Rollen in verschiedenen Stammzelltypen und während der iPS Reprogrammierung bekannt. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) und Pcgf4 (Bmi1) zeigen eine Funktion in verschiedenen adulten Stammzellen. Pcgf4 spielt darüber hinaus eine wichtige Rolle in der murinen iPS Reprogrammierung. Für Pcgf6 (Mblr) wird eine Pluripotenz-assoziierte Funktion angenommen, denn Pcgf6 ist das einzige Pcgf Paralog, das eine erhöhte Expression in murinen ESCs aufweist, die jedoch im Verlauf der ESC-Differenzierung absinkt. Außerdem zeigen murine Pcgf6 KD ESCs eine verminderte Expression der Pluripotenzgene Oct4, Sox2 und Nanog, eine De-Repression mesodermaler und Testes-spezifischer Gene als auch eine erhöhte Tendenz zur hämatopoetischen Differenzierung. Wie genau Pcgf6 an der Regulation dieser Prozesse in murinen ESCs beteiligt ist, ist nicht bekannt. In der hier vorliegenden Dissertation wurde die Funktion von Pcgf6 in der murinen iPS Reprogrammierung untersucht. Da bereits für Pcgf4 eine Rolle in der Reprogrammierung somatischer Zellen gezeigt wurde und Pcgf6 eine erhöhte Expression in ESCs aufweist, wurde auch für Pcgf6 eine Funktion in der iPS Reprogrammierung angenommen. Zunächst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass Pcgf6 während der iPS Reprogrammierung verstärkt exprimiert wird und in iPS Zellen eine ESC-ähnliche Expression aufweist. Darüber hinaus konnte Pcgf6 in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 in der iPS Reprogrammierung ersetzen. Zudem wurden für OPKM-induzierte iPS Zellen charakteristische Eigenschaften pluripotenter Zellen nachgewiesen. Außerdem konnte eine Rolle von Pcgf6 als Enhancer-Faktor für die iPS Reprogrammierung ausgeschlossen werden, da die Überexpression von Pcgf6 zusammen mit den OSKM Faktoren keine additiven Effekte auf die Reprogrammierungseffizienz erzielte. Im Gegensatz dazu führte der Knockdown (KD) von Pcgf6 in embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) zu verminderten Effizienzen nach OSKM Reprogrammierung. Darüber hinaus handelte es sich bei der Mehrheit der AP+ Kolonien, die unter Pcgf6 KD Konditionen entstanden, um partiell-reprogrammierte iPS Zellen. Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse der hier vorliegenden Arbeit, dass Pcgf6 ein neuer und essentieller Faktor der iPS Reprogrammierung ist, der in Kombination mit Oct4, Klf4 und c-Myc spezifisch den Transkriptionsfaktor Sox2 ersetzen kann. N2 - Embryonic stem cells (ESCs) are characterized by their ability for continuous self-renewal maintaining the undifferentiated cell state and their capacity to generate all differentiated cell types of the three germ layers. Regulators of these characteristics include a protein interaction network of pluripotency-specific factors and epigenetic mechanisms that together control the transcription of pluripotency- and differentiation-associated genes. Among the interaction partners of the pluripotency-specific protein network in murine ESCs are Polycomb group (PcG) proteins. These proteins assemble in two complexes termed Polycomb group repressive complex 1 and 2 (PRC1 and PRC2). In the classical model, PRC1 and PRC2 act hierarchically together in catalyzing two characteristic histone modifications thereby contributing to the repression of PRC-specific target genes like differentiation-associated genes in ESCs. Recently, it has been shown that there are numerous PRC1 variants that differ in their protein composition. In this context, the family of Polycomb group RING finger (Pcgf) proteins (Pcgf1 – 6) defines distinct PRC1 variants (PRC1.1 – 1.6) that exhibit complex-specific genomic binding sites. Together, this indicates diverse mechanisms of PRC1 variants and Pcgf Paralog-specific functions that are not well understood. Pcgf Paralogs are known to play essential roles in various stem cell types and during iPS reprogramming. Pcgf1 (Nspc1), Pcgf2 (Mel18) and Pcgf4 (Bmi1) function in diverse adult stem cells. Further, Pcgf4 plays a role in murine iPS Reprogramming. For Pcgf6 (Mblr), a pluripotency-associated function is assumed. Pcgf6 is the only Pcgf paralog with an elevated expression in murine ESCs and when ESCs differentiate Pcgf6 expression decreases. In addition, following Pcgf6 KD in ESCs the expression of Oct4, Sox2 and Nanog declines while mesodermal and testes-specific genes become de-repressed. Furthermore, Pcgf6 KD ESCs are more prone for hematopoietic lineage differentiation. The precise mechanisms by which Pcgf6 controls these processes in murine ESCs are not known. In this work, I investigated the function of Pcgf6 in murine iPS reprogramming. I assumed a role for Pcgf6 in iPS reprogramming because it is highly expressed in ESCs and it was recently shown that Pcgf4 plays a role in the reprogramming of somatic cells. The data of my work show that Pcgf6 expression is increased in iPS reprogramming and that Pcgf6 exhibits an ESC-like gene expression pattern in iPS cells. Furthermore, Pcgf6 was able to replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc. In addition, OPKM-induced iPS cells showed pluripotency-specific characteristics. The overexpression of Pcgf6 together with the OSKM factors did not result in significantly increased reprogramming efficiencies indicating that Pcgf6 does not function as an enhancer-factor. However, Pcgf6 knockdown (KD) in mouse embryonic fibroblasts (MEFs) resulted in decreased efficiencies after iPS reprogramming. Additionally, the majority of AP+ colonies formed after OSKM reprogramming of Pcgf6 KD MEFs represented partially reprogrammed iPS cells, as they did not exhibit ESC-like morphologies and reduced expression levels of Oct4, Sox2 and Nanog. Together, the data of my work show that Pcgf6 is a new and essential factor in iPS reprogramming that can specifically replace the transcription factor Sox2 in combination with Oct4, Klf4 and c-Myc. KW - Stammzelle KW - iPS Reprogrammierung KW - Differenzierung KW - Repression KW - Reprogramming Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106870 ER - TY - THES A1 - Andronic, Joseph T1 - Volumenregulatorische Transportwege von anorganischen und organischen Osmolyten in Säugetierzellen T1 - Volume ragulatory pathways of anorganic and organic osmolytes in mammalian cells N2 - Die Aufrechterhaltung des Zellvolumens unter variablen osmotischen Bedingungen stellt für nahezu alle tierischen Zellen eine essenzielle Aufgabe dar. Um regulatorische Volumenanpassungen vorzunehmen besitzen sie daher effektive Mechanismen, mit deren Hilfe der zelluläre Gehalt an organischen und anorganischen Osmolyten erhöht (= regulatorische Volumenzunahme; RVI) oder gesenkt (= regulatorische Volumenabnahme; RVD) werden kann. Trotz langjähriger Forschung auf diesem Gebiet konnten die hieran beteiligten Transportwege für Osmolyte bisher nur unvollständig aufgeklärt werden. Insbesondere bei T-Lymphozyten sind wichtige Zellfunktionen wie die Proliferation, Migration und die T-Zell-Aktivierung eng mit volumenregulatorischen Mechanismen verbunden. Bei all diesen Prozessen sind u. a. unterschiedliche Kaliumkanäle beteiligt, die insbesondere für die pharmakologische Manipulation von Immunsystemprozessen von wissenschaftlichem Interesse sind. Bisherige Modelle der hypotonen Volumenregulation von T-Lymphozyten berücksichtigen lediglich den spannungsabhängigen KV1.3 sowie den Ca2+-aktivierten IKCa1-Kanal, die zur Klasse der 6TM/P-K+-Kanäle gehören. Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit wurde eine potentielle Rolle von kürzlich entdeckten Zwei-Poren Domänen Kaliumkanälen (K2P) am RVD von murinen und humanen primären CD4+-T-Lymphozyten untersucht. In einem kombinierten genetischen und pharmakologischen Ansatz mittels knockout-Tiermodellen und dem Einsatz kanalspezifischer Inhibitoren konnte mithilfe zellvolumetrischer Analysen gezeigt werden, dass die K2P-Vertreter TASK1, TASK2, TASK3 und TRESK maßgeblich am schwellungsaktivierten Efflux von K+ beteiligt sind. Beurteilt an den Ergebnissen dieser Untersuchung sind der spannungsabhängige TASK2- und der Ca2+-aktivierte TRESK-Kanal für die hypotone Volumenregulation in T-Zellen deutlich bedeutender als TASK1 und TASK3. Der Beitrag der Kanäle TASK2 und TRESK am RVD-Prozess war über dies vergleichbar mit dessen des bisher bekannten KV1.3-Kanals. In dieser Arbeit wurde damit erstmals eine Beteiligung der K2P-Kanäle am RVD muriner und humaner CD4+-Lymphozyten identifiziert. Aufgrund der engen Verbindung zwischen T-Zell-Funktion und der Volumenregulation können Zwei-Poren Domänen K+-Kanäle damit in den engeren Kreis potentieller immunmodulierende Angriffspunkte aufgefasst werden. Im zweiten und umfangreicheren Teil dieser Arbeit wurden darüber hinaus die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte (small organic osmolytes; SOOs) untersucht. SOOs stellen chemisch inerte Verbindungen dar, zu denen vor allem Polyole (Sorbitol, myo-Inositol), Methylamine (Betain, α-Glycerophosphocholin) sowie Aminosäuren (α- bzw. β-Alanin und Prolin) und deren Derivate (Taurin) zählen. Da SOOs weder die zelluläre Struktur noch die Funktion von Makromolekülen beeinträchtigen, sind sie wichtige Instrumente der Volumenregulation, die sich in hohen Konzentrationen im Zytosol nahezu aller Zellen wiederfinden. Werden tierische Zellen mit hypotonen Bedingungen konfrontiert, dann ist bei nahezu allen Zellen die Freisetzung organischer Osmolyte zu beobachten, wodurch die zelluläre Osmolarität unabhängig von Elektrolyten angepasst werden kann. Trotz der wichtigen Funktion der SOOs in der Osmoregulation tierischer Zellen konnte die molekulare Identität beteiligter Effluxwege (Kanäle bzw. Transporter) bisher nicht aufgeklärt werden. Ungeachtet der molekularen Identität der SOO-Effluxwege war es aus zahlreichen biotechnologischen Anwendungen zu Beginn dieser Arbeit bekannt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für organische Osmolyte eine größenselektive Permeabilität für eine Reihe monomerer Zucker und verwandter Verbindungen aufweisen. Um diese Größenselektivität näher zu charakterisieren, wurde im ersten Schritt die schwellungsaktivierte Membranpermeabilität für eine Reihe strukturell homogener Polyethylenglykole unterschiedlicher Polymerlänge (PEG200–1500; hydrodynamische Radien zwischen ~0,5-1,5 nm) unter iso- und hypotonen Bedingungen in Jurkat-Lymphozyten untersucht. Unter milden hypotonen Bedingungen (200 mOsm) war die Plasmamembran der untersuchten Lymphozyten für PEG300-1500 undurchlässig, was aus der Fähigkeit der Zellen zur hypotonen Volumenregulation geschlossen werden konnte. Darüber hinaus wurde RVD in stark hypotonen Lösungen (100 mOsm) mit PEG600-1500 beobachtet, während PEG300-400 unter vergleichbaren osmotischen Bedingungen die Volumenregulation der Zellen inhibierten. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass starkes hypotones Zellschwellen der Lymphozyten zur Permeabilisierung der Plasmamembran für PEG300-400, nicht jedoch für PEG600-1500, führt. Anhand der hydrodynamischen Radien Rh der verwendeten PEGs konnte ein cutoff-Radius von ~0,74 nm für schwellungsaktivierte Transportwege organischer Osmolyte bestimmt werden. Da diese schwellungsaktivierten Transportwege vielfältig für Zellbeladungstechniken verwendet werden, könnte dieses Ergebnis für zahlreiche biotechnologische und biomedizinische Anwendungen von Interesse sein. Im zweiten Schritt wurde der Versuch unternommen, potentielle Transportwege für organische Osmolyte im RVD-Prozess molekular zu identifizieren. Da es grundlegend ungeklärt war, wie viele unterschiedliche Transporter bzw. Kanäle am Efflux der zahlreichen organischen Osmolyte beteiligt sind, erfolgte zunächst die vergleichende Analyse des schwellungsaktivierten Membrantransports strukturell verschiedener SOOs einschließlich der Aminosulfonsäure Taurin und des Polyols myo-Inositol. Hierbei wurde erstmals gezeigt, dass die schwellungsaktivierten Transportwege für Taurin und myo-Inositol deutlich unterschiedliche Aktivitätsprofile aufweisen. Während der Taurintransport bereits unter milden hypotonen Bedingungen, d.h. nach einer geringen Absenkung der Osmolalität von 300 auf ~230 mOsm, aktiviert wurde, erfolgte die Aktivierung der Membranpermeabilität für myo-Inositol bei einer viel niedrigeren Osmolalität von ~150 mOsm. Darüber hinaus wiesen die beiden Transportwege unter vergleichbarem hypotonen Stress von 100 mOsm deutlich unterschiedliche Aktivitätsdauern auf (Transport von Taurin ~95 min und myo-Inositol ~40 min). Somit deuteten diese Ergebnisse erstmals auf substrat-spezifische Transportwege für SOOs hin, die voneinander stark abweichende osmotische Aktivierungsprofile besitzen. Als aussichtsreiche Kandidaten für diese Transportwege wurden zwei Mitglieder der Gruppe der Solute Carrier (SLC) untersucht, die klare Übereinstimmungen mit den gesuchten Transportern für SOOs aufweisen. Daher wurde im Weiteren eine RVD-Beteiligung dieser Transportergruppe mit einer Kombination aus molekularbiologischer und konventioneller bzw. hochaufgelöster mikroskopischen Techniken überprüft. Die semiqantitativen RT-PCR-Ergebnisse dieser Arbeit zeigen dabei, dass die Gentranskription der potentiellen SOO-Transporter SLC5A3 und SLC6A6 in den untersuchten Zelllinien Jurkat, HEK wie auch HepG2-Zellen durch hypotone Bedingungen deutlich verstärkt wird. Hierbei nimmt der zelluläre mRNA-Gehalt der Gene SLC5A3 zwischen 20-60% und SLC6A6 um 30-100% innerhalb von 10-20 min zu, was auf eine potentielle RVD-Beteiligung von SLC-Transportern hindeutet. Ausgehend von diesem Ergebnis wurde daraufhin die zelluläre Lokalisation des SLC5A3-Transporters unter isotonen und hypotonen Bedingungen mikroskopisch untersucht. Wie anhand der konfokalen lasermikroskopischen Untersuchung zu erkennen ist, findet unter hypotoner Stimulation eine zelluläre Umverteilung des mit EGFP fluoreszenzmarkierten Proteins SLC5A3 statt. Innerhalb von 10 min wird der Transporter dabei von intrazellulären Regionen in Richtung Plasmamembran verlagert. Darüber hinaus konnte mit Hilfe der hochauflösenden Mikroskopie-Technik dSTORM gezeigt werden, dass der Transporter SLC5A3 unter hypotoner Stimulation verstärkt mit der Plasmamembran assoziiert vorliegt. Diese verstärkte Membranassoziation des SLC5A3-Proteins deutet damit auf einen schwellungsinduzierten exozytotischen Einbau des Transporters hin. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen damit erstmals, dass SLC-Transporter wie SLC5A3, SLC6A6 und vermutlich andere Vertreter der SLC-Superfamilie potentiell am Mechanismus der hypotonen Volumenregulation beteiligt sind. Da SLC-Transporter als wichtige Transportsysteme für Therapeutika angesehen werden und die Mechanismen der Volumenregulation bereits in zahlreichen biotechnologischen Anwendungen implementiert sind, könnte der hier aufgedeckte Zusammenhang einen Erkenntnisgewinn für zahlreiche biomedizinische Forschungsgebiete darstellen. N2 - Cell volume homeostasis is critically important for the functional and structural integrity of mammalian cells. To counteract osmotically induced volume perturbations, cells possess efficient mechanisms that control the intracellular osmolyte composition. The volume regulatory mechanisms operating under hyper- and hypotonic conditions are known, respectively, as regulatory volume increase (RVI) and decrease (RVD). During both, RVI and RVD, cells adjust the cellular content of inorganic ions (most notably Na+, K+ and Cl-) and organic solutes in order to gain or lose osmotically obligated water. These mechanisms counteract osmotic cell damage and enable the adaptation of cells to a wide range of extracellular osmolarities. Despite decades of research in this field, many aspects of the mechanisms underlying RVD and RVI remain poorly understood. In case of T lymphocytes, various cellular functions, including proliferation, migration and T cell activation are closely associated with the cell volume regulatory machinery. Among other mechanisms, all these processes are tightly linked by a network of potassium channels. The identification of this network is of great biomedical interest as it provides a key to pharmacological manipulation of the immune system. Current models of hypotonic volume regulation (RVD) in T-lymphocytes consider primarily the voltage-gated KV1.3 and the calcium-activated IKCa1 channel. The first part of this thesis explores the potential role of two-pore domain (K2P) potassium channels in RVD in murine and human primary CD4+-T lymphocytes. Using a combined genetic and pharmacological approach, time-resolved cell volume analysis revealed an important role of the K2P channels TASK1, TASK2, TASK3 and TRESK in swelling activated K+ efflux from hypotonically swollen T cells. Based on the analysis carried out here, the voltage-gated TASK2 as well as the calcium-activated TRESK channel were found as the most important K2P channels involved in the RVD of both naïve and stimulated T cells. The importance of TASK2 and TRESK in the RVD process was comparable to that of KV1.3. In summary, the data provide first evidence that hypotonic volume regulation of murine and human CD4+-T lymphocytes relies on K2P channels. With respect to the close relationship of T-cell function and volume regulatory mechanisms K2P channels may thus be considered as potential targets for immunomodulation. In the second and major part of this thesis, the swelling-activated transport pathways for small organic osmolytes (SOOs) were investigated. Nearly all eukaryotic cells possess a considerable reservoir of SOOs, such as polyols (e.g. sorbitol, myo-inositol), methylamines (e.g. betaine, α-glycerophosphoryl choline) and small amino acids (e.g. α-/β- alanine, proline and the derivate taurine), which are synthesized within the cells or accumulated from the extracellular medium. Since SOOs do not interfere with the integrity of macromolecules and the membrane potential, cells tolerate great cytosolic fluctuations of these solutes without negative effects on cellular structure or function. Due to these properties, small organic osmolytes are important tools for cell volume regulatory mechanisms, by which the intracellular osmolarity can be adjusted independently of electrolytes. Although the importance of SOOs for hypotonic volume regulation has been known for long time, the molecular identity of participating membrane efflux pathways is far from being clear. Regardless of the involved transporters, swelling-activated pathways have been reported to exhibit a size selective permeability for a wide range of sugars and related compounds. To gain a deeper insight into this issue, in a first step the impact of the molecular size on the permeation of low-molecular-weight polyethylene glycols (PEG200–1500) through the plasma membrane of Jurkat cells under iso- and hypotonic conditions was analyzed. Upon moderate swelling in slightly hypotonic solutions (200 mOsm), the lymphocyte membrane was found to remain impermeable to PEG300–1500, which allowed the cells to accomplish regulatory volume decrease. RVD also occurred in strongly hypotonic solutions (100 mOsm) of PEG600–1500, whereas 100 mOsm solutions of PEG300–400 inhibited RVD. These findings suggest that extensive hypotonic swelling rendered the cell membrane highly permeable to PEG300–400, but not to PEG600–1500. Using the values of hydrodynamic radii Rh for PEGs, the observed size-selectivity of membrane permeation yielded an estimate of ∼0.74 nm for the cut-off radius of the swelling-activated pathway for organic osmolytes. This result may be of interest for many biotechnological and biomedical applications, where swelling-activated SOO-pathways are widely used for cell-loading techniques. As a second step, an attempt was made to elucidate the molecular identity of transporters for organic osmolytes potentially involved in RVD. Since it was not clear whether RVD-related efflux of SOOs is mediated by one common or several distinct transporter(s), at first, the plasma membrane permeability profiles for two structurally dissimilar SOOs, including the amino sulfonic acid taurine and the polyol myo-inositol were analyzed. The results of the time resolved volumetric measurements clearly showed that the membrane permeability to taurine was activated upon moderate cell swelling (by ~15%) in mildly hypotonic solutions (~230 mOsm). In sharp contrast, the membrane permeability to myo-inositol was activated after a much larger swelling (~50%) in strongly hypotonic media (<150 mOsm). Moreover, the swelling-activated permittivity to taurine during RVD in 100 mOsm medium persisted for about twice as long as that for myo-inositol (taurine ~95 min, myo-inositol ~40 min). These findings clearly showed that, taurine and myo-inositol utilized separate, apparently substrate-specific pathways, which were activated at different hypotonic thresholds. Since many members of SLC-family proteins (Solute Carrier) are known for their substrate selectivity and also for their contribution to osmoregulatory mechanisms a participation of SLCs was investigated in the context of RVD. To this end, a combination of molecular biological (semiquantitative RT-PCR) and fluorescence microscopy techniques (confocal and super-resolution microscopy) was used. The semiquantitative RT-PCR data showed a transcriptional upregulation for the SLC proteins SLC5A3 (myo-inositol transporter; SMIT) and SLC6A6 (taurine transporter TauT) in hypotonically stressed Jurkat lymphocytes, HEK293, and HepG2 cells. In all three human cell lines strongly hypotonic solutions (100 mOsm) increased the mRNA level of the genes SLC5A3 and SLC6A6 between 20-60% and 30-100%, respectively, suggesting a potential participation of SLC transporters in RVD. In addition, confocal microscopy images clearly showed the intracellular displacement of EGFP-tagged SLC5A3 expressed in HEK293 cells following strongly hypotonic stress (100 mOsm). Within 10 min the fluorescence of EGFP was shifted from intracellular regions towards the plasma membrane. Furthermore, super-resolution microscopy by means of dSTORM revealed a considerably increased membrane association of SLC5A3 in strongly hypotonic stressed (100 mOsm) HEK293 and Jurkat cells. This finding suggests that SLC5A3 is integrated into the plasma membrane by swelling-induced exocytosis. Taken together, the results of this investigation provided first evidence that transporters such as SLC5A3, SLC6A6 and probably other SLC-proteins participate in the mechanism of hypotonic volume regulation. Due to the relevance of SLC-proteins as potential drug delivery systems the possible role of these transporters might be of great interest for many biomedical research areas. KW - Säugetiere KW - Osmoregulation KW - Zelle KW - Regulatory Volume Decrease KW - Transporter SLC5A3 KW - Transporter SLC6A6 KW - small organic osmolytes KW - Zwei-Poren Domänen Kaliumkanäle KW - two-pore domain potassium channels KW - Zellvolumen KW - Volumenregulation Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-103255 ER - TY - THES A1 - Schwarze, Simone T1 - Untersuchung von Faltungs- und Funktionsdynamik isolierter Proteindomänen mittels Fluoreszenzlöschung T1 - Investigation of folding and function dynamics of isolated Protein Domains using fluorescence quenching N2 - Proteine bestehen aus einer spezifischen Sequenz verschiedener Aminosäuren, die ihre charakteristische Funktion bestimmt. Die große Variabilität an Aminosäuresequenzen ermöglichte die Evolution einer nahezu unbegrenzten Anzahl an Proteinen. Meistens nehmen diese Schlüsselpositionen ein, von robusten Baustoffen bis hin zu molekularen Maschinen. Daher kann eine Fehlfunktion gravierende Auswirkungen auf das Leben haben, z.B. Krankheiten wie Alzheimer oder Epilepsi. Um die Funktionen und Fehlfunktionen zu verstehen, ist eine umfassende Kenntnis der Proteinfaltung, der Protein-Protein Assoziation, sowie den Dynamiken innerhalb von Proteinen erforderlich. Diese Vorgänge wurden in dieser Arbeit an drei isolierten Proteindomänen durch die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers untersucht. Der entfaltete Zustand der Bindungsdomäne BBL, das Teil des 2-oxo-acid Dehydrogenasekomplexes ist, wurde unter physiologischen Bedingungen mit Zirkulardichroismus (CD) und einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie analysiert. Beide Methoden zeigten übereinstimmend anhand von 20 in BBL einzeln eingefügten konservativen Punktmutationen, dass Seitenketteninteraktionen keine Auswirkungen auf die Sekundärstruktur des denaturierten Zustandes, den Ausgangspunkt der Faltung, haben. Mit Hilfe der Dekonvolation der CD-Spektren wurde zudem gezeigt, dass die Reststruktur im denaturierten Zustand der helikalen Proteindomäne von β-Strängen und β-Kehren dominiert wird, die eine entscheidende Funktion bei der Faltung in den nativen Zustand haben könnten. Die N-terminale Domäne (NTD), der für die Materialforschung hochinteressanten Spinnen-seidenfaser, ist für die Polymerisation des Spinnenseidenfadens auf den pH-Wechsel von pH 7 auf pH 6 hin verantwortlich. Dieser für die Proteinfunktion wichtige Prozess wurde durch die Einbringung eines extrinsischen Fluoreszenzschalters, basierend auf der H-Dimerbildung, mit der Stopped-Flow-Technik untersucht. Es wurde gezeigt, dass die NTDs 104 mit einer Rate von 3 x 10^8 M-1 s-1 assoziieren und somit nahezu das Geschwindigkeitslimit der Protein-Protein Assoziation erreicht wird. Zwei geladenen Seitenketten, der D39 und D40, kommt eine entscheidende Funktion in dem Prozess zu, da eine Mutation dieser die Assoziation verhindert. Des Weiteren wurde gezeigt, dass sich die NTD auf eine Erhöhung der Ionenstärke entgegengesetzt zu anderen Proteinen verhält: die Dissoziation wird beschleunigt, die Assoziation nicht beeinflusst. Gleiches Verhalten wurde auf den einzelnen Austausch der übrigen protonierbaren Aminosäureseitenketten hin beobachtet, ausgenommen die Mutation der E119, welche die Dissoziation verlangsamt. Daher scheint der makromolekulare Dipol, der auf Grund der Ladungsverteilung in der NTD entsteht, die Assoziation maßgeblich zu beeinflussen. Glutamatrezeptoren sind an der schnellen synaptischen Signalweiterleitung im Nervensys-tem von Vertebraten beteiligt. Die Konformationen der Ligandenbindungsdomäne (LBD) haben dabei entscheidende Auswirkungen auf die Funktion des Gesamtrezeptors. Diese wurden mit einer Kombination aus photoinduziertem Elektronentransfer und Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie untersucht. Mit dieser Methode wurde ein dynamisches Bild der gebundenen sowie ungebundenen Form der AMPA-spezifischen Glutamatrezeptor 2-LBD gezeigt. Es wurde zudem gezeigt, dass sich die Dynamiken in Abhängigkeit der Bindung von den Agonisten Glutamat und AMPA, dem partiellen Agonisten Kainate oder Cyclothiazid (CTZ), welches eine Dimerisierung der LBDs bewirkt, unterschiedlich verändern. Dies könnte eine Auswirkung auf die Funktion der Rezeptoren haben. Die Anwendung der Fluoreszenzlöschmechanismen der H-Dimerbildung und des photoinduzierten Elektronentransfers in dieser Arbeit hat gezeigt, dass diese die Möglichkeit bieten, unterschiedlichste Fragestellungen zu beantworten und so Einblicke in dynamische Funktionsweisen von Proteinen eröffnen. Kombiniert mit etablierten Fluoreszenzmethoden ist es so möglich quantitativ Kinetiken auf unterschiedlichen Zeitskalen zu untersuchen. N2 - Proteins are composed of a specific sequence of variable amino acids that specify their specific function. The vast variability of possible amino acid sequences allowed for the evolution of a nearly infinite number of different proteins. Mostly these will have key positions, reaching from strong building material to molecular machines. Therefore a malfunction will have an immense effect on life, i.e. diseases like Alzheimer disease or epilepsy. In order to understand the function and malfunction an intense understanding of the protein folding, the protein-protein association, as well as the protein dynamics is essential. These processes have been investigated in this thesis with three isolated protein domains by the application of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer-formation and by the photoinduced electron transfer. The unfolded state of the binding domain BBL, which is part of the 2-oxo-acid-dehydrogenase-complex, was analysed under physiological conditions by circular dichroism (CD), and a combination of photoinduced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Both methods showed accordingly, using 20 singly implanted conservative point mutations in BBL, that side-chain interactions have no effect on the secondary struc-ture of the denatured condition, the initial state of the folding. Using deconvolution on the CD spectra it was shown in addition, that the remaining structure of the helical protein domain in the denatured state is dominated by β-strands and β-turns. These may have a decisive function during the folding in the native state. The N-terminal domain of the spider silk fibre, which is of high interest for the material research, is responsible for the polymerisation of the spider silk fibre during the pH-change from pH 7 to pH 6. This important process for the protein function was investigated with the Stopped-Flow technique by the application of an extrinsic fluorescence switch, based on the H-dimer formation. It was shown, that NTDs associate with a rate of 3 x 10^8 M-1 s-1, and so nearly reach the speed limit of the protein-protein association. In this process two charged side chains, the D39 and D40, have a decisive function, as a mutation of these will 106 avoid the association. Furthermore it was shown, that the NTD will react in opposition to other proteins on the increase of the ionic strength: the dissociation will be speeded up, and the association is not influenced. The identical behaviour was observed with the single ex-change of the other protonable amino acid side chains, except for the mutation of E119, which retards dissociation. Therefore the macromolecular dipol, that is formed by the charge distribution of the NTD, is obviously influencing the association. Glutamate receptors participate in the fast synaptic signal transfer in vertebrates. Here dif-ferent conformations of the ligand binding domain (LBD) have decisive effects on the function of the entire receptor. These have been investigated with a combination of photoin-duced electron transfer and fluorescence correlation spectroscopy. Using this method a dynamic behaviour of the bound and unbound form of the AMPA specific glutamate receptor 2 LBD was shown. Furthermore it was shown, that the dynamics will change differently in dependence of the binding of the agonist glutamate and AMPA, the partial agonist kainate or Cyclothiazide (CTZ), which effects a dimerization of the LBDs. This may have an effect on the function of the receptors. The use of the fluorescence quenching mechanisms of the H-dimer formation and the pho-toinduced electron transfer in this thesis has shown, that these offer the opportunity to an-swer a large range of questions and open a view to the dynamic functionality of proteins. Combined with established fluorescence methods it is possible to quantitatively investigate kinetic rates at different time scales. KW - Protein-Protein-Wechselwirkung KW - Fluoreszenzlöschung KW - Domäne KW - Proteindynamiken KW - H-Dimerbildung KW - Photoinduzierter Elektronentransfer KW - Spinnenseide KW - Glutamatrezeptor KW - BBL KW - protein dynamics KW - fluorescence quenching KW - Proteindomänen Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107080 ER - TY - THES A1 - Schulze, Katja T1 - Automatisierte Klassifizierung und Viabilitätsanalyse von Phytoplankton T1 - Automated classification and viability analysis for phytoplankton N2 - Zentrales Ziel dieser Arbeit war es, Methoden der Mikroskopie, Bildverarbeitung und Bilderkennung für die Charakterisierungen verschiedener Phyotplankter zu nutzen, um deren Analyse zu verbessern und zu vereinfachen. Der erste Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Analyse von Phytoplanktongemeinschaften, die im Rahmen der Überprüfung der Süßwasserqualität als Marker dienen. Die konventionelle Analyse ist dabei sehr aufwendig, da diese noch immer vollständig von Hand durchgeführt wird und hierfür speziell ausgebildetes Personal eingesetzt werden muss. Ziel war es, ein System zur automatischen Erkennung aufzubauen, um die Analyse vereinfachen zu können. Mit Hilfe von automatischer Mikroskopie war es möglich Plankter unterschiedlicher Ausdehnung durch die Integration mehrerer Schärfeebenen besser in einem Bild aufzunehmen. Weiterhin wurden verschiedene Fluoreszenzeigenschaften in die Analyse integriert. Mit einem für ImageJ erstellten Plugin können Organismen vom Hintergrund der Aufnahmen abgetrennt und eine Vielzahl von Merkmalen berechnet werden. Über das Training von neuralen Netzen wird die Unterscheidung von verschieden Gruppen von Planktontaxa möglich. Zudem können weitere Taxa einfach in die Analyse integriert und die Erkennung erweitert werden. Die erste Analyse von Mischproben, bestehend aus 10 verschiedenen Taxa, zeigte dabei eine durchschnittliche Erkennungsrate von 94.7% und eine durchschnittliche Falsch-Positiv Rate von 5.5%. Im Vergleich mit bestehenden Systemen konnte die Erkennungsrate verbessert und die Falsch Positiv Rate deutlich gesenkt werde. Bei einer Erweiterung des Datensatzes auf 22 Taxa wurde darauf geachtet, Arten zu verwenden, die verschiedene Stadien in ihrem Wachstum durchlaufen oder höhere Ähnlichkeiten zu den bereits vorhandenen Arten aufweisen, um evtl. Schwachstellen des Systemes erkennen zu können. Hier ergab sich eine gute Erkennungsrate (86.8%), bei der der Ausschluss von nicht-planktonischen Partikeln (11.9%) weiterhin verbessert war. Der Vergleich mit weiteren Klassifikationsverfahren zeigte, dass neuronale Netze anderen Verfahren bei dieser Problemstellung überlegen sind. Ähnlich gute Klassifikationsraten konnten durch Support Vektor Maschinen erzielt werden. Allerdings waren diese bei der Unterscheidung von unbekannten Partikeln dem neuralen Netz deutlich unterlegen. Der zweite Abschnitt stellt die Entwicklung einer einfachen Methode zur Viabilitätsanalyse von Cyanobakterien, bei der keine weitere Behandlung der Proben notwendig ist, dar. Dabei wird die rote Chlorophyll - Autofluoreszenz als Marker für lebende Zellen und eine grüne unspezifische Fluoreszenz als Marker für tote Zellen genutzt. Der Assay wurde mit dem Modellorganismus Synechocystis sp. PCC 6803 etabliert und validiert. Die Auswahl eines geeigeneten Filtersets ermöglicht es beide Signale gleichzeitig anzuregen und zu beobachten und somit direkt zwischen lebendenden und toten Zellen zu unterscheiden. Die Ergebnisse zur Etablierung des Assays konnten durch Ausplattieren, Chlorophyllbestimmung und Bestimmung des Absorbtionsspektrums bestätigt werden. Durch den Einsatz von automatisierter Mikroskopie und einem neu erstellten ImageJ Plugin wurde eine sehr genaue und schnelle Analyse der Proben möglich. Der Einsatz beim Monitoring einer mutagenisierten Kultur zur Erhöhung der Temperaturtoleranz ermöglichte genaue und zeitnahe Einblicke in den Zustand der Kultur. Weitere Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Kombination mit Absorptionsspektren es ermöglichen können bessere Einblicke in die Vitalität der Kultur zu erhalten. N2 - Central goal of this work was to improve and simplify the characterization of different phytoplankter by the use of automated microscopy, image processing and image analysis. The first part of the work dealt with the analysis of pytoplankton communities, which are used as a marker for the determination of fresh water quality. The current routine analysis, is very time consuming and expensive, as it is carried out manually by trained personnel. Thus the goal of this work was to develop a system for automating the analysis. With the use of automated microscopy different focal planes could be integrated into one image, which made it possible to image plankter of different focus levels simultaneously. Additionally it allowed the integration of different fluorescence characteristics into the analysis. An image processing routine, developed in ImageJ, allows the segmentation of organisms from the image background and the calculation of a large range of features. Neural networks are then used for the classification of previously defined groups of plankton taxa. The program allows easy integration of additional taxa and expansion of the recognition targets. The analysis of samples containing 10 different taxa showed an average recognition rate of 94.7% and an average error rate of 5.5%. The obtained recognition rate was better than those of existing systems and the exclusion of non-plankton particles could be greatly improved. After extending the data set to 22 different classes of (more demanding) taxa a still good recognition (86.9 %) and still improved error rate (11.9 %) were obtained. This extended set was specifically selected in order to target potential weaknesses of the system. It contained mainly taxa that showed strong similarities to each other or taxa that go through various different morphological stages during their growth. The obtained recognition rates were comparable or better than those of existing systems and the exclusion of non-plankton particles could be greatly improved. A comparison of different classification methods showed, that neural networks are superior to all other investigated methods when used for this specific task. While similar recognition rates could be achieved with the use of support vector machines they were vastly inferior for the differentiation of unknown particles. The second part focused on the development of a simple live - dead assay for unicellular cyanobacteria without the need of sample preparation. The assay uses red chlorophyll fluorescence, corresponding to viable cells, and an unspecific green autofluorescence, that can only be observed in non viable cells. The assay was established and validated for the model organism Synechocystis sp. PCC 6803. With the selection of a suitable filter-set both signals could be excited and observed simultaneously, allowing a direct classification of viable and non-viable cells. The results were confirmed by plating/colony count, absorption spectra and chlorophyll measurements. The use of an automated fluorescence microscope and an ImageJ based image analysis plugin allows a very precise and fast analysis. The monitoring of a random mutagenized culture undergoing selection for improved temperature tolerance allowed an accurate and prompt insight into the condition of the culture. Further results indicate that a combination of the new assay with absorption spectra or chlorophyll concentration measurements allows the estimation of the vitality of cells. KW - Bilderkennnung KW - Bioinformatik KW - Phytoplankton KW - Bilderkennung KW - Phytoplankton KW - Viabilität KW - Mikroskopie KW - Bioinformatik Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-107174 ER - TY - THES A1 - Kirscher, Lorenz T1 - Melanogene rekombinante Vaccinia-Viren als diagnostisches und therapeutisches Agenz zur Tumorbehandlung T1 - Melanogenic recombinant Vaccina Viruses as diagnostic and therapeutic agent for tumor treatment N2 - Die gängigen therapeutischen Behandlungsmethoden für die verschiedensten Krebserkrankungen zeigen nach wie vor Mängel bezüglich der Effizienz sowie zahlreiche Nebenwirkungen während und nach der Behandlung. Maßgeblich für diese Defizite ist die teilweise geringe Sensitivität der meisten konventionellen diagnostischen Systeme und damit einhergehend die oftmals zu späte Identifikation entarteter Gewebsbereiche. Zur Lösung dieser Problematik bieten onkolytische Vaccinia-Viren einen Ansatz, sowohl die Effizienz der Therapie wie auch die Diagnostik zu verbessern. In beiden Fällen sind die Tumorzell-spezifische Vermehrung der Viren und die Möglichkeit entscheidend, die Viren als Vektorsystem zur Expression therapeutischer oder diagnostischer Fremdgenkassetten zu nutzen. Um ein auf Vaccinia-Virus-basierendes Reportersystem zum diagnostischen Nachweis von Krebszellen mittels Tiefengewebs-Tomographie bereit zu stellen, wurden die für die murine Tyrosinase (mTyr) und das Tyrosinase-Helferprotein 1 (Tyrp1) kodierenden Gene in das Genom eines onkolytischen Vaccinia-Virus inseriert. Die Tyrosinase ist das Schlüsselenzym der Melaninsynthese. Bereits die solitäre Expression der Tyrosinase führt in der transformierten Zelle zur Melaninproduktion. Das Tyrosinase-Helferprotein 1 ist an der Prozessierung und Stabilisierung der Tyrosinase beteiligt. Bereits in verschiedenen Studien konnte gezeigt werden, dass Melanin als Reportermolekül für die Magnetresonanz sowie für die multispektrale optoakustische Tomographie einsetzbar ist. Es wurde deswegen angestrebt, die Kombination aus dem therapeutischen Potential des onkolytischen Vaccinia-Virus und der diagnostischen Anwendung des Melanins als Reporter auszunutzen. Sämtliche in dieser Arbeit aufgeführten rekombinanten Vaccinia-Viren (rVACV) wurden von der Firma Genelux Corporation zur Verfügung gestellt und in dieser Arbeit hinsichtlich der therapeutischen Effizienz und des diagnostischen Potentials untersucht. In ersten Zellkultur-Versuchen wurde anhand verschiedener konstitutiv melanogener rVACV-Konstrukte festgestellt, dass die Kombination aus dem Vaccinia-Virus-spezifischen synthetic early/late Promotor und dem Enzym Tyrosinase (GLV-1h327) bzw. den Enzymen Tyrosinase und Tyrosinase-Helferprotein 1 (GLV-1h324) die höchste Melaninsynthese-Rate zeigte. Anschließend wurde mittels der Bestimmung der spektralen Absorption und der Enzymaktivität der viral kodierten Melanin synthetisierenden Enzyme sowie mikroskopischer Analysen gezeigt, dass es mit diesen auf 8 Vaccinia-Virus-basierenden melanogenen Reportersystemen möglich ist, die Melaninsynthese in nicht-melanogenen Zellen zu induzieren. Anhand elektronenmikroskopischer Untersuchungen in Zellkultur und ex vivo konnte gezeigt werden, dass die nach rVACV-Infektion stattfindende Melaninsynthese in den Lysosomen der Wirtszelle abläuft. Eine Analyse der atomaren Zusammensetzung des viral vermittelten Melanins ergab, dass es sich um eine Mischform aus Eu- und Phäomelanin handelt. Dieser Melanin-Mix ähnelte dem Melanin aus Haut und Augen, jedoch lagen an Melanin-gebundene Metallionen in erhöhtem Maß vor... N2 - The common therapeutic approaches available to treat various cancers still have deficiencies concerning their efficiency and side effects. Decisive for these deficiencies is the poor sensitivity of most of the conventional diagnostic systems and associated with that the late, sometimes too late, identification of tumorous tissue. The oncolytic vaccinia virus is an opportunity to enhance the efficiency of both the therapy and the diagnosis of tumor tissue. In both cases, the specificity for tumor cells and the simplicity of inserting foreign gene cassettes into the viral genome are key factors. The genes encoding murine tyrosinase (mTyr) and tyrosinase related protein 1 (Tyrp1) were inserted into the genome of an oncolytic vaccinia virus. Tyrosinase is the key enzyme during melanogenesis and expression of this enzyme alone can lead to melanin production. Tyrp1 is involved in processing and stabilizing tyrosinase. Various studies have demonstrated melanin to be an excellent reporter molecule for MRI (magnetic resonance imaging) and MSOT (multispectral optoacoustic tomography). Therefore, melanogenic oncolytic vaccinia viruses were constructed to combine the therapeutic potential of this virus with diagnostic abilities of melanin. All recombinant vaccinia viruses (rVACV) mentioned were kindly provided by Genelux Corporation. In this thesis, we tested for their therapeutic efficiency and diagnostic potential. Initial cell culture experiments have shown that the combination of vaccinia virus-specific synthetic early/late promoter and the melanogenic enzyme tyrosinase (GLV-1h327) or the enzymes mTyr and Tyrp1 (GLV-1h324) have the highest melanin synthesis rate. It was observed that the infection of non-melanin producing cells with an rVACV-based melanogenic reporter system resulted in melanogenesis. Electron microscopy showed that the viral associated melanogenesis is localized in the lysosomes of the infected host cell. The atomic composition analysis of the virus-mediated melanin molecules revealed a mixture of eu- and pheomelanin. The virus-associated melanin is comparable to that in the skin and eye but showed higher amounts of melanin-bound metal ions. ... KW - Melanin KW - Vaccinia Virus KW - Onkolyse KW - MSOT KW - MRT KW - Tyrosinase Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-112074 ER - TY - THES A1 - Bettaga, Noomen T1 - Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl Cyclase bei der Angiogenese und der Arteriogenese in der Maus T1 - Role of NO-sensitive guanylyl cyclase in angiogenesis and arteriogenesis in mice N2 - Stickstoffmonoxid (NO) spielt eine wichtige Rolle bei Gefäßremodelling-Prozessen wie Angiogenese und Arteriogenese. Die NO-Synthese im Gefäßsystem wird hauptsächlich durch die endotheliale NO-Synthase (eNOS) gewährleistet. Sie kann durch verschiedene Faktoren wie Scherkräfte und Zytokine wie der vaskuläre endotheliale Wachstumsfaktor (VEGF) reguliert werden. VEGF ist ein wichtiger Stimulator der Angiogenese und wird während dieses Prozesses hochreguliert. Die meisten physiologischen Effekte von NO werden durch die NO-sensitive Guanylyl-Cyclase (NO-GC) vermittelt. Als Hauptrezeptor für NO produziert die NO-GC den sekundären Botenstoff cyklisches Guanosinmonophosphat (cGMP) und führt dadurch zur Stimulation der verschiedenen Effektoren wie z.B. der PKG. Ob die Wirkung von NO in Angiogenese und Arteriogenese ebenfalls durch NO-GC vermittelt wird, war bis zum Beginn dieser Arbeit noch unklar. Die NO-GC besteht aus zwei Untereinheiten (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einer vollständigen Knockout Maus (GCKO). Mithilfe des Cre-LoxP-Systems wurden zusätzlich zellspezifische Knockout-Mäuse für glatte Muskelzellen (SMC-GCKO) und Endothelzellen (EC-GCKO) generiert. Um die Rolle der NO-GC in der Angiogenese und Arteriogenese zu untersuchen, wurden drei gut etablierte Methoden benutzt. Im ersten Teil des Projekts sollte die Expression der NO-GC in Endothelzellen untersucht werden. Zu diesem Zweck wurde die reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) benutzt. Die Ergebnisse zeigen, dass die NO-GC in Endothelzellen der Lunge nur äußerst gering wenig exprimiert ist. Durch den Aortenring-Assay wurde eine Rolle der NO-GC bei der VEGF-vermittelten Angiogenese festgestellt. Dabei zeigte sich eine stärkere Angiogeneserate bei globaler Abwesenheit der NO-GC. Bei Fehlen der NO-GC ausschließlich in Endothelzellen zeigte sich kein Unterschied in den aussprossenden Aorten im Vergleich zu den Kontroll-Tieren. Dies zeigt, dass die NO-GC in Endothelzellen sehr wahrscheinlich keine Rolle bei der VEGF-vermittelten Angiogenese spielt. Im zweiten Teil wurde die Rolle der NO-GC bei der Angiogenese in einem in vivo-Modell untersucht. In dem Modell der Sauerstoff-induzierten-Retinopathie zeigten die GCKO-Mäuse eine verringerte Vaso-Obliteration, eine verlangsamte Angiogenese und eine erhöhte Tuft-Bildung. Ähnliche Ergebnisse wurden bei den SMC-GCKO-Tieren beobachtet. EC-GCKO-Mäuse zeigten eine gegenüber den Kontroll-Tieren unveränderte Vaso-Obliteration, Angiogeneserate und Tuft-Bildung. Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass die NO-GC in Endothelzellen keine Rolle spielt. Immunfluoreszenz-Aufnahmen zeigten die Expression von NO-GC in Perizyten der Gefäßkapillaren der Mausretina. Daher könnte die NO-GC in diesem Zelltyp letztendlich für die Effekte bei den GCKO- und SMC-GCKO-Tieren verantwortlich sein. Im letzten Teil dieser Arbeit wurde eine Versuchsreihe unter Anwendung des Hinterlauf-Ischämie-Modells durchgeführt. Hierbei entwickelten die Pfoten aller GCKO- und teilweise der SMC-GCKO-Tiere nach der Ligation der Femoralarterie eine Nekrose. Die Regeneration der Hinterläufe der EC-GCKO-Tiere nach der Operation verlief normal. Diese Ergebnisse schließen eine bedeutende Rolle der NO-GC in Endothelzellen aus, zeigen allerdings, dass die NO-GC in den glatten Muskelzellen essentiell für den Arteriogenese-Prozess ist. Zusammengefasst führt die Deletion der NO-GC in glatten Muskelzellen und wahrscheinlich auch in Perizyten zur einer verlangsamten Angiogenese und Inhibierung der Arteriogenese. N2 - Nitric oxide (NO) plays an important role in vascular remodelling processes such as angiogenesis and arteriogenesis. The synthesis of NO in the vascular system is ensured mainly by endothelial NO synthase (eNOS). It can be regulated by a number of factors, such as shear stress and cytokines like the vascular endothelial growth factor (VEGF). VEGF is an important stimulator of angiogenesis and is upregulated during this process. Most of the physiological effects of NO are mediated by the NO-sensitive guanylyl cyclase (NO-GC). As the main receptor for NO, NO-GC produces the second messenger cyclic guanosine monophosphate (cGMP) and thereby leads to a variety of physiological effects. However, whether the effects of NO in angiogenesis and arteriogenesis are also mediated by NO-GC is still unclear. NO-GC consists of two subunits (α and ß). The deletion of the ß1 subunit in mice results in a global knockout mouse (GCKO). Using the Cre-LoxP system we also generated smooth muscle cell-specific (SMC GCKO) and endothelial cell-specific knockout mice (EC GCKO). To investigate the role of NO-GC in angiogenesis and arteriogenesis, three well-established methods have been used. In the first part of the project, the expression of the NO-GC in endothelial cells should be investigated. By using the reverse transcription polymerase chain reaction method (RT-PCR), the results show a very weak expression of the NO-GC in endothelial cells of the lung. A role for NO-GC in the VEGF-mediated angiogenesis was ascertained by the aortic ring assay. The results show an increased angiogenesis in the global absence of NO-GC. However, the EC-GCKO shows no difference compared to control mice. This indicates that NO-GC in endothelial cells is unlikely to play a major role in VEGF-mediated angiogenesis. In the second part of the project, the role of NO-GC in angiogenesis was investigated in an in vivo model. In the oxygen induced-retinopathy model (OIR), GCKO mice showed reduced vaso-obliteration, slowed angiogenesis and increased tuft formation. Similar results were observed in the SMC-GCKO animals. In contrast, EC-GCKO mice showed vaso-obliteration as well as angiogenesis rate and tuft formation similar to those seen in control animals. The results of this experiment suggest that NO-GC in endothelial cells is not involved in vaso-obliteration, physiological angiogenesis and tuft formation. Immunhistochemical analyses showed the expression of NO-GC in pericytes of the vascular capillaries of the mouse retina. Therefore, NO-GC in this cell type could be responsible for the effects in GCKO- and SMC-GCKO animals. In the last part of this thesis, hindlimb-ischemia experiments were performed. For this purpose, the paws of all GCKO- and some SMC-GCKO animals showed necrosis after ligation of the femoral artery. The regeneration of legs from EC-GCKO animals after the operation was normal. These results exclude a major role of NO-GC in endothelial cells, but show that NO-GC in smooth muscle cells is essential in the arteriogenesis process. In summary, the deletion of NO-GC in smooth muscle cells and probably also in pericytes leads to a slowed angiogenesis and inhibits arteriogenesis. KW - Guanylylcyclase KW - cGMP KW - Stickstoffmonoxid KW - Angiogenese KW - Arteriogenese KW - Maus Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-111284 ER - TY - THES A1 - Axmacher, Franz T1 - Die SVM-gestützte Prädiktabilität der Bindungsspezifität ‎von SH3-Domänen anhand ihrer Aminosäuresequenz T1 - The SVM-based predictability of SH3-domain binding specificity by means of its amino-acid-‎sequence. ‎ N2 - Die Identifikation der Bindungsspezifitäten von Proteininteraktionsdomänen und damit letztlich auch ‎die Fähigkeit potentielle Bindungspartner dieser in vivo vorherzusagen bildet ein grundlegendes ‎Element für das Verständnis der biologischen Funktionen dieser Domänen. In dieser Arbeit wurde ‎untersucht, inwieweit solche Vorhersagen bezüglich der SH3-Domäne – als Beispiel für eine ‎Proteininteraktionsdomäne – mithilfe von Support-Vector-Machines (SVMs) möglich sind, wenn ‎diesen als Informationsquelle ausschließlich die innerhalb der Aminosäuresequenz der Domäne ‎konservierten Informationen zur Verfügung stehen. Um den SVM-basierten Klassifikator zu ‎trainieren und zu validieren, wurde ein Satz aus 51 SH3-Domänen verwendet, die zuvor ‎entsprechend ihrer Ligandenpräferenz in ein System aus acht verschiedenen Klassen eingeteilt ‎worden waren. Da die innerhalb der Aminosäuresequenzen konservierten Informationen in ‎abstrakte Zahlenwerte konvertiert werden mussten (Voraussetzung für mathematisch basierte ‎Klassifikatoren wie SVMs), wurde jede Aminosäuresequenz durch ihren jeweiligen Fisher-Score-‎Vektor ausgedrückt. Die Ergebnisse erbrachten einen Klassifikationserror, welcher weit unterhalb des ‎Zufallsniveaus lag, was darauf hindeutet, dass sich die Bindungsspezifität (Klasse) einer SH3-Domäne ‎in der Tat von seiner Aminosäuresequenz ableiten lassen dürfte. Mithilfe klassenspezifisch ‎emittierter, artifizieller Sequenzen, implementiert in den Trainingsprozess des Klassifikators, um ‎etwaigen nachteiligen Auswirkungen von Overfitting zu entgegenzuwirken, sowie durch ‎Berücksichtigung taxonomischer Informationen des Klassensystems während Training und ‎Validierung, ließ sich der Klassifikationserror sogar noch weiter senken und lag schließlich bei lediglich ‎‎35,29% (vergleiche Zufall: 7/8 = 87.50%). Auch die Nutzung von Feature Selections zur Abmilderung ‎Overfitting-bedingter, negativer Effekte lieferte recht vielversprechende Ergebnisse, wenngleich ihr ‎volles Potential aufgrund von Software-Beschränkungen nicht ausgenutzt werden konnte.‎ Die Analyse der Positionen im Sequence-Alignment, welche für den SVM- basierten Klassifikator am ‎relevantesten waren, zeigte, dass diese häufig mit Positionen korrelierten, von denen angenommen ‎wird auch in vivo eine Schlüsselrolle bei der Determination der Bindungsspezifität (Klasse) zu spielen. ‎Dies unterstreicht nicht nur die Reliabilität des präsentierten Klassifikators, es gibt auch Grund zur ‎Annahme, dass das Verfahren möglicherweise auch als Supplement anderer Ansätze genutzt werden ‎könnte, welche zum Ziel haben die Positionen zu identifizieren, die die Ligandenpräferenz in vivo ‎determinieren. Informationen, die nicht nur für ein besseres Verständnis der SH3-Domäne (und ‎möglicherweise auch anderer Proteininteraktionsdomänen) von grundlegender Bedeutung sind, ‎sondern auch aus pharmakologischer Sicht von großem Interesse sein dürften.‎ N2 - Regarding protein-interaction-domains the identification of their binding specificities and ‎eventually ‎also the ability to predict potential binding partners for them in vivo constitutes a fundamental ‎element for the understanding of the biological functions of these domains. In this study it ‎was ‎investigated to what extent such predictions could be made for the SH3-domain – as an ‎example ‎for a protein-interaction-domain – when using support-vector-machines (SVMs) trained ‎exclusively ‎with the information conserved within the amino-acid-sequence of the domain. A set of ‎‎51 SH3-‎domains, pre-classified into a system of eight different classes according to their ligand ‎preference, was used to train and cross-validate the SVM-based classifier. To convert the ‎information ‎conserved within the amino-acid-sequences into abstract numeric values (a ‎prerequisite for a ‎mathematics-based classifier like SVMs) each sequence was represented by its ‎respective Fisher-‎score-vector. The results revealed a classification error level way below chance ‎level, indicating the ‎binding specificity (class) of an SH3-domain can indeed be inferred from its ‎amino-acid-sequence. ‎With the help of class-specific emitted, artificial sequences introduced into ‎the training process of the ‎classifier to counter adverse overfitting effects and by additionally ‎considering taxonomic ‎information of the class system during training and cross-validation, the ‎classification error level of ‎the classifier could be lowered even farther, eventually reaching a level ‎as low as 35.29% (compare ‎chance level: 7/8 = 87.50%). The use feature selections to counter ‎overfitting returned quite ‎promising results, too, however couldn't be exploited to its full potential ‎due to software limitations. ‎ The analysis of those positions in the sequence-alignment being most relevant for the SVM-‎based ‎classifier showed, they frequently correlated with positions considered to also play in vivo a ‎pivotal ‎role in binding specificity (class) determination of the SH3-domain. Not only does this ‎underline the ‎reliability of the presented classifier, it also gives reason to believe, the method could ‎possibly be ‎used as a supplement for other approaches trying to identify positions that determine ‎ligand ‎preference in vivo. Information, not only fundamental for a better understanding of the SH3-‎‎domain (and maybe also other protein-interaction-domains), but also likely to be of great interest ‎from a pharmacological point of view.‎ KW - Support-Vektor-Maschine KW - Alignment KW - Hidden-Markov-Modell KW - Kreuzvalidierung KW - Taxonomie KW - SH3-Domäne KW - Fisher-Score KW - Regularisierung KW - Feature-Selection KW - PyMOL KW - WebLogo KW - e1071 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-113349 ER - TY - THES A1 - Wurster, Sebastian T1 - Die Bedeutung von LIN9 für die Regulation der Genexpression, die genomische Stabilität und die Tumorsuppression T1 - The significance of LIN9 for gene regulation, genomic stability and tumor suppression N2 - Pocket proteins and E2F transcription factors regulate the expression of cell cycle associated genes and play a central role in the coordination of cell division, differentiation, and apoptosis. Disorders of these pathways contribute to the development of various human tumor entities. Despite intensive research in the field of cell cycle regulation many details are not yet understood. The LIN complex (LINC / DREAM) is a recently discovered human multiprotein complex, which dynamically interacts with pocket proteins and E2F transcription factors. An essential component of the LIN complex is the LIN9 protein. In order to obtain a better insight into the function of this protein in cell cycle regulation and tumorigenesis, a conditional Lin9 knockout mouse model was established in our laboratory. The primary objective of this study was the phenotypic characterization of embryonic fibroblasts (MEFs) from these mice. Shortly after inactivation of Lin9 cell proliferation was massively impaired. Multiple types of mitotic defects such as structural abnormalities of the spindle apparatus, aberrant nuclei, failed nuclear segregation and cytokinesis failure have been observed in Lin9-depleted cells leading to a dramatic increase in polyploid and aneuploid cells. Ultimately these serious aberrations result in premature cellular senescence. If the senescence of Lin9-deficient cells is overcome by the Large T antigen the cells can adhere to the loss of Lin9, but show severe genomic instability and grow anchorage-independently in soft-agar as a sign of oncogenic transformation. In the second part of the thesis the gene expression of Lin9-deficient cells was assessed by quantitative real time PCR analyses to determine, whether the mitotic abnormalities are caused by transcriptional defects. Here a significant reduction of mitotic gene expression was observed in Lin9-depleted cells. Additionally chromatin immunoprecipitation experiments were performed to clarify the underlying molecular mechanisms. Compared to control cells epigenetic alterations at the promoters of mitotic target genes with regard to activating histone modifications were found in Lin9-deficient MEFs. In the last section of this study, the effects of Lin9 heterozygosity were analyzed. Lin9 heterozygous MEFs showed normal proliferation, although expression of different mitotic genes was slightly reduced. It appeared, however, that the mitotic spindle checkpoint of Lin9 heterozygous MEFs is weakened and thus over several cell generations an increase in polyploid cells was observed. Soft-agar assays showed that Lin9 heterozygosity contributes to oncogenic transformation. Taken together, these results document a crucial role of LIN9 in the regulation of cell cycle-associated gene expression. LIN9 is an essential factor for cell proliferation on one hand, while at the same time it functions as a tumor suppressor. N2 - Pocket-Proteine und E2F-Transkriptionsfaktoren regulieren die Expression von Zellzyklus-assoziierten Genen und spielen eine zentrale Rolle bei der Koordination der Zellteilung, Differenzierung und Apoptose. Störungen dieser Signalwege tragen zur Entstehung zahlreicher Tumorentitäten beim Menschen bei. Trotz der intensiven Untersuchung der Zellzyklusregulation sind viele Details noch unverstanden. Der LIN-Komplex (LINC / DREAM) ist ein kürzlich entdeckter humaner Multiprotein-komplex, welcher dynamisch mit Pocket-Proteinen und E2F-Transkriptionsfaktoren interagiert. Eine essentielle Komponente des LIN-Komplexes ist das LIN9-Protein. Um die Funktion dieses Proteins bei der Zellzyklusregulation und Tumorentstehung genauer untersuchen zu können, wurde in unserer Arbeitsgruppe ein konditionelles Lin9-Knockout-Mausmodell etabliert. Primäres Ziel der Arbeit war es, den Phänotyp embryonaler Fibroblasten (MEFs) aus diesen Mäusen zu charakterisieren. Bereits kurz nach Inaktivierung von Lin9 konnte ein stark verlangsamtes Zellwachstums beobachtet werden. In Lin9-depletierten MEFs wurden multiple mitotische Defekte detektiert, die u. a. strukturelle Auffälligkeiten des Spindelapparates, aberrante Zellkerne, Störungen der Chromosomensegregation sowie zytokinetische Defekte umfassen und in einer dramatischen Zunahme polyploider und aneuploider Zellen resultieren. Im Langzeitverlauf führen diese erheblichen Aberrationen zu einer vorzeitigen zellulären Seneszenz. Wird diese durch das Large T-Protoonkogen durchbrochen, können sich MEFs an den Verlust von Lin9 adaptieren, zeigen dann jedoch eine hochgradige genomische Instabilität und Substrat-unabhängiges Wachstum im Weichagar als Zeichen onkogener Transformation. Im zweiten Abschnitt der vorliegenden Arbeit wurde die Genexpression in Lin9-defizienten MEFs mittels quantitativer Real Time-PCR untersucht um zu klären, ob die beschriebenen Defekte auf Veränderungen der transkriptionellen Aktivität zurück-zuführen sind. Dabei wurde eine erhebliche Reduktion der Expressionslevel mitotischer Gene nach Verlust von Lin9 beobachtet. Des Weiteren wurden zur Klärung der zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen Chromatin-Immunpräzipitations-Experimente (ChIP) durchgeführt. Im Vergleich zu Kontrollzellen wurden dabei in Lin9-defizienten Zellen signifikante epigenetische Veränderungen bezüglich aktivierender Histon-Modifikationen an den Promotoren mitotischer Lin9-Zielgene festgestellt. Im letzten Abschnitt der Arbeit sollten die Auswirkungen des heterozygoten Verlustes von Lin9 analysiert werden. Dabei zeigte sich, dass Lin9-haploinsuffiziente Zellen normal proliferieren, obwohl die Expression verschiedener G2/M-Gene leicht vermindert war. Es wurde jedoch eine Schwächung des mitotischen Spindelkontrollpunktes und in der Folge über mehrere Zellgenerationen eine Zunahme polyploider Zellen beobachtet. Mit Weichagar-Assays konnte gezeigt werden, dass bereits der heterozygote Verlust des Lin9-Gens zur onkogenen Transformation beiträgt. Zusammengenommen dokumentieren diese Studien, dass LIN9 eine entscheidende Bedeutung bei der Regulation von Zellzyklus-assoziierten Genen spielt und sowohl einen essentiellen Faktor für die Zellproliferation darstellt als auch durch die Gewährleistung genomischer Stabilität tumorsuppressive Eigenschaften aufweist. KW - Zellzyklus KW - Genexpression KW - Mitose KW - Knock-Out KW - LIN9 KW - Mausmodell KW - konditioneller Knockout Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-114967 ER - TY - THES A1 - Herrmann, Alexander Michael T1 - CD8+ Lymphozyten mediierter Angriff auf Neuronen des ZNS: Relevanz von Granzym B und Perforin für akute elektrophysiologische Veränderungen T1 - CD8+ lymphocyte-mediated attack on neurons of the CNS: Relevance on granzyme B and perforin for acute electrophysiological alterations N2 - Zytotoxische CD8+ T-Lymphozyten spielen in vielen inflammatorischen, aber auch primär neurodegenerativen Erkrankungen eine wichtige Rolle. Daher besitzt die Fragestellung inwiefern CD8+ ZTL Neurone direkt schädigen und ggf. welche mechanistischen Aspekte dieser Schädigung zugrunde liegen, eine hohe Relevanz. Um diese Fragestellung eingehender zu beleuchten, wurde mit dem OT-I-System gearbeitet. Dieses gut vorcharakterisierte CD8+ T-Zell-Modell besitzt den Vorteil, dass diese transgenen Zellen nur eine Peptidsequenz des Ovalbumin (OVA) Protein als spezifisches Antigen erkennen. Zunächst wurden in der vorliegenden Arbeit Co-Kultivierungs-Experimente durchgeführt. Hierzu wurden akut isolierte murine Hippokampus-Neurone unter verschiedenen Bedingungen mit OT-I Lymphozyten co-kultiviert. Hierbei konnte gezeigt werden, dass unter Antigenpräsentation der Neurone signifikant mehr Neurone in die Apoptose/Nekrose geführt werden, als unter Kontroll-Bedingungen, in denen entweder kein Antigen oder ein Antigen, das nicht von OT-I Lymphozyten erkannt wird, präsentiert wird. Nachdem die Antigen-abhängigen zytotoxischen Effekte auf Neurone gezeigt werden konnten, wurde mithilfe elektrophysiologischer Techniken die mechanistischen und funktionellen Konsequenzen des direkten neuronalen/OT-I-vermittelten Zellkontakts untersucht. Bei diesem experimentellen Ansatz wurde durch elektrisches Auslenken eines Neurons nach Kontakt mit einem OT-I Lymphozyt die passiven elektrischen Parameter der Neuronenmembran gemessen. In diesen Messungen konnte gezeigt werden, dass nach unmittelbarem Kontakt eines Neurons mit einem OT-I Lymphozyt der neuronale Membranwiderstand reduziert wird bzw. die Leitfähigkeit der Zellmembran erhöht wird. Diese Änderung der neuronalen Membran-Leitfähigkeit findet in einem Zeitraum von 10 min nach dem Zell-Zell-Kontakt statt. Auch hier konnte gezeigt werden, dass dieser Einfluss von OT-I Lymphozyten auf Neurone strikt Antigen-abhängig ist. Zur Untersuchung des Mechanismus der OT-I T-Lymphozyten auf Neurone wurde das Augenmerk auf verschiedene T-Zell-induzierte Apoptosewegegelegt. Es konnte gezeigt werden, dass durch Blockieren der Fas/FasL-Interaktion mittels eines Antikörpers kein Unterschied, weder in der neuronalen Apoptoserate nach Co-Kultivierung, noch eine Änderung der passiven neuronalen Membran-Leitfähigkeit auftritt. Weiterhin wurde die Rolle der von T-Zellen sezernierten Granula Perforin und Granzym B untersucht. Um den Einfluss dieser Granula aufzuklären, wurden OT-I Lymphozyten verwendet, die entweder defizient für Perforin oder Granzym B waren. In diesem experimentellen Ansatz wurde gezeigt, dass ausschließlich Perforin für die Erniedrigung des passiven neuronalen Membran-Widerstandes verantwortlich ist. Diese Erhöhung der neuronalen Membranleitfähigkeit führte aber nicht direkt zum neuronalen Zelltod. Vielmehr wurde durch die einhergehende Depolarisation des Neurons die elektrische Aktivität der Zelle vermindert, sodass es zu einem sogenannten „electrical silencing“ kommt. Dieser Umstand konnte auch in der Betrachtung der spontanen Netzwerkaktivität von Neuronenkulturen gezeigt werden. Hierfür wurden hoch dichte Neuronenkulturen auf MEA-Chips kultiviert. Mit Hilfe dieser MEA konnten die Summenfeldpotentiale der Neuronenkulturen detektiert werden. Hierbei wurde beobachtet, dass nach Beladung der Neuronen mit dem spezifischen OT-I-Antigen und OT-I Zellen eine Verringerung der spontanen Netzwerkaktivität einhergeht. Auch in diesem Effekt konnte eine Antigen-Spezifität nachgewiesen werden. Da der Prozess der zellulären Apoptose mit einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration einhergeht, und Perforin als Ca2+-durchlässiger unselektiver Porenbildner fungiert, wurden zur Überprüfung der Hypothese calcium imaging-Experimente durchgeführt. Analog zu den elektrophysiologischen Messungen wurde gezeigt, dass nach direktem Zell-Zell-Kontakt zwischen Neuron und OT-I Lymphozyt eine Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration zu messen ist. Dass diese Änderung des neuronalen Ca2+-Einstroms durch Perforin-abhängige Membranporen hervorgerufen wird, konnte durch die Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten bewiesen werden. Unter Verwendung von Perforin-defizienten OT-I Lymphozyten wurde keine Änderung der neuronalen Ca2+-Konzentration ermittelt. Weiterhin wurde in diesem experimentellen Ansatz gezeigt, dass auch der OT-I-vermittelte neuronale Ca2+-Anstieg strikt Antigen-abhängig ist.Zusammengefasst konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass MHC-I/Antigen-vermittelte CD8+ Lymphozyten-Interaktion mit einem Neuron zu „electrical silencing“ des Neurons führt. Dieser Prozess ist klar Perforin-abhängig, führt jedoch nicht zum unmittelbaren Zelltod des Neurons. N2 - Cytotoxic CD8+ T cells are considered as important effector cells contributing to neuronal damage in inflammatory and primary degenerative disorders in the CNS. Hence, it is highly relevant to know to what extent CD8+ T-lymphocytes can contribute to neuronal damage in these disorders. To challenge this question, we used the murine OT-I system. The advantage of this well-characterized transgenic model is that OT-I CD8+ T-lymphocytes are restricted to one single antigen – one peptide sequence of Ovalbumin (Ova). In a first set of experiments, OT-I lymphocytes were co-cultured with neurons that presented Ova in a MHC-I specific context on their surface. As control, neurons without any antigen or neurons that presented a scrambled peptide form (SIY) were used. These co-culture experiments indicates that neuronal killing by OT-I lymphocytes is a MHC-I and antigen-dependent mechanism. To clarify the underlying mechanism and the functionally consequences in this OT-I/neuron interaction, we performed electrophysiological patch-clamp analysis to measure the influence from one single OT-I T-cell on a single neuron. For this purpose, we established a special protocol to stimulate the neuronal membrane to measure the passive electrical parameters after a direct OT-I contact. These measurements revealed a significant antigen restricted reduction in neuronal membrane resistance. This effect could be detected within 10 min after the direct cell-cell contact. To challenge the underlying cellular mechanisms we analyzed several known apoptosis pathways. In a first set of experiments, we investigated the Fas/FasL interaction. To answer this question, we used a blocking FasL antibody, to interrupt this pathway. These experiments showed no changes in neuronal apoptosis, neither in co-cultivation experiments nor in the electrophysiological situation. As next step we investigate the role of CD8+ lymphocyte derived granula perforin and granzyme B. Therefore we used OT-I T-cells that are either deficient for perforin or granzyme B. Using these experimental conditions, we could show that only perforin is responsible for changing passive electrical parameters. However, these reductions in neuronal membrane resistance did not lead immediately in neuronal cell death, but rather led to a depolarization and therefore to an electrical silencing of the neuron. This electrical silencing was also shown to occur in the spontaneous network activity in a neuronal network. The network activity was measured on a high density neuron network cultivated on a MEA. These MEA measurements revealed a decrease in the total spike activity after loading of OT-I lymphocytes on an antigen presenting neuronal network. Due to the increase of the intracellular Ca2+ level in the process of cell death and the Ca2+ selectivity of perforin membrane pores, we hypothesized that neuronal silencing and neuronal cell death elicited by perforin pores might lead to an intracellular Ca2+ increase. To proof this hypothesis we established a calcium imaging experiment in an OT-I/neuron contact situation. These measurements were done in the same manner as the electrophysiological measurements. Ca2+ imaging indicated increasing Ca2+ levels in neurons after application of perforin releasing OT-I lymphocytes. Furthermore, these experiments revealed a strictly antigen dependence for Ca2+ increase in target cells. In conclusion, we could show that MHC-I/antigen-mediated CD8+ lymphocyte interactions with neurons led to their electrical silencing. This process was perforin dependent. However this process was not causally linked to neuronal cell death. KW - Antigen CD8 KW - T-Lymphozyt KW - Lymphozyten mediierter Angriff auf Neurone KW - Nervendegeneration KW - Lymphozyten KW - neurone Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109124 ER - TY - THES A1 - Peter, Stefanie T1 - Hemmung der Myc-Funktion durch niedermolekulare Inhibitoren der E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 T1 - Inhibition of Myc function using small molecule inhibitors of the E3 ubiquitin ligase Huwe1 N2 - Die Deregulation des Transkriptionsfaktors Myc ist ein zentraler Mechanismus in der kolorektalen Karzinogenese. Die Myc-Deletion in Tumormodellen hemmt das Wachstum von Kolonkarzinomen, somit stellt die Inaktivierung von Myc einen Ansatzpunkt in der Behandlung von kolorektalen Tumoren dar. Die direkte Inhibition von Myc ist schwierig, da Myc keine katalytische Aktivität besitzt und stattdessen für die Myc-Funktion nötige Protein-Protein- oder Protein-DNA-Interaktionen angegriffen werden müssen. Die E3-Ubiquitin-Ligase Huwe1 interagiert sowohl mit Myc als auch mit dem Myc-interagierenden Protein Miz1 und ist im Kolonkarzinom überexprimiert. Huwe1 ubiquitiniert Myc und induziert darüber dessen Transaktivierungsfunktion. Die Inaktivierung von Huwe1 ist somit eine vielversprechende Möglichkeit für die Inhibition der Myc-Funktion und die Therapie des Kolonkarzinoms. In dieser Arbeit wird mittels shRNA-vermittelter Depletion von Huwe1 in Zellkulturexperimenten gezeigt, dass Huwe1 für die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien und für die Transaktivierung von Myc-Zielgenen benötigt wird. Mit zwei von Boehringer Ingelheim identifizierten niedermolekularen Huwe1-Inhibitoren (BI8622 und BI8626) ist es möglich, die Huwe1-Funktion spezifisch in Zellen zu blockieren. Die Huwe1-Inhibitoren induzieren einen Proliferationsarrest in kolorektalen Karzinomzelllinien, wohingegen die Substanzen auf embryonale Stammzellen keine Auswirkungen haben. Die Inaktivierung von Huwe1 führt zu einer Akkumulation von Miz1 an Promotoren Myc-aktivierter Zielgene und darüber zu einer vermehrten Bildung repressiver Myc/Miz1-Komplexe, was mit einer Deacetylierung von Histon H3 und einer transkriptionellen Repression Myc-gebundener Gene assoziiert ist. Miz1 akkumuliert nach Huwe1-Inhibition ebenso an direkten Miz1-Zielgenen, deren Expression bleibt aber unbeeinflusst. Diese Daten weisen darauf hin, dass eine kontinuierliche Degradierung von Miz1 durch Huwe1 zur Transaktivierung von Myc-Zielgenen in Kolonkarzinomzellen nötig ist. Damit wurde ein neuer Mechanismus identifiziert, über den Huwe1 die Myc-Transaktivierung reguliert und der eine tumorzellspezifische Repression der Myc-Funktion mit Hilfe von Huwe1-Inhibitoren ermöglicht. N2 - Deregulation of the transcription factor Myc is a central driver in colorectal carcinogenesis. Deletion of Myc in murine tumor models inhibits the growth of colon carcinoma, therefore inactivation of Myc is an attractive possibility for treating these types of malignancies. Since Myc does not contain any catalytic activity, protein-protein or protein-DNA interactions necessary for Myc function need to be modified, making direct targeting of Myc difficult. The E3 ubiquitin ligase Huwe1 interacts both with Myc and the Myc-interacting protein Miz1 and is overexpressed in colorectal cancer. Huwe1 ubiquitinates Myc thereby inducing its transactivation function. Hence, inactivation of Huwe1 is a reasonable approach for inhibition of Myc function and treatment of colon cancer. In this work depletion of Huwe1 via shRNA shows that Huwe1 is required for the proliferation of colon carcinoma cell lines and for transactivation of Myc target genes. Two novel small molecule inhibitors of Huwe1 (BI8622 and BI8626), which were identified by Boehringer Ingelheim, block Huwe1 function in cells specifically. The Huwe1 inhibitors induce a proliferation arrest in colorectal cancer cell lines, but not in embryonic stem cells. Inactivation of Huwe1 leads to an accumulation of Miz1 at promoters of Myc-activated target genes and to an increased formation of repressive Myc/Miz1 complexes at these sites. This is associated with deacetylation of histone H3 and transcriptional repression of Myc-bound genes. Additionally, Miz1 accumulates at direct Miz1 target genes upon Huwe1 inhibition but this does not influence expression of these genes. These data suggest that a continuous degradation of Miz1 by Huwe1 is required for transcriptional activation of Myc target genes in colon cancer cells. This identified a new principle how Huwe1 regulates Myc transactivation allowing a tumor cell-specific repression of Myc function via small molecule inhibitors of Huwe1. KW - Myc KW - Ubiquitin KW - Huwe1 KW - Kolonkarzinom KW - Colonkrebs Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-104449 ER - TY - THES A1 - Ok [geb. Hofmann], Claudia Barbara T1 - Isoform-spezifische Analyse der PI3-Kinase (Klasse I) im Multiplen Myelom T1 - Isoform-specific analysis of the PI3-kinase (class I) in multiple myeloma N2 - Das Multiple Myelom (MM) ist eine unheilbare Erkrankung, die aus einer klonalen Proliferation maligner Plasmazellen im Knochenmark hervorgeht. Dabei liegt ein komplexes Signalnetzwerk vor, das zum Überleben und Wachstum der MM-Zellen führt. Das MM ist durch eine enorme genetische und phänotypische Heterogenität gekennzeichnet. Die konstitutive Aktivierung des PI3K/Akt-Signalwegs spielt bei ungefähr der Hälfte der Patienten mit MM eine wichtige Rolle für das Überleben der MM-Zellen und ist daher ein potentieller therapeutischer Ansatzpunkt. Isoform-spezifische Untersuchungen der katalytischen Untereinheiten der Klasse I-PI3K (p110α, p110β, p110γ, p110δ) sollten zur Erkenntnis führen, welche dieser Isoformen für das MM Zellüberleben wichtig sind, um spezifischere Behandlungen mit möglichst geringen Nebenwirkungen zu erlauben. Dafür wurden zunächst Isoform-spezifische Knockdown-Experimente mit MM Zelllinien durchgeführt und sowohl deren Überleben als auch die Aktivierung der nachgeschalteten Komponenten im PI3K Signalweg untersucht. Zur Verifizierung der Ergebnisse wurden sowohl MM Zelllinien als auch Primärzellen mit Isoform-spezifischen PI3K-Inhibitoren behandelt (BYL 719 für p110α, TGX 221 für p110β, CAY10505 für p110γ und CAL 101 für p110δ) und in gleicher Weise untersucht. In beiden Versuchsansätzen stellte sich die katalytische Untereinheit p110α als wichtigste Isoform für das Überleben von MM Zellen mit konstitutiv phosphoryliertem Akt Signal heraus. Weder der Knockdown noch die pharmakologische Inhibition der anderen drei Isoformen (p110β, p110γ, p110δ) führten in MM-Zelllinien zur Beeinträchtigung des Zellüberlebens. Auch reagierten die Primärzellen von MM Patienten größtenteils nicht mit Apoptose auf eine Behandlung mit TGX 221, CAY10505 oder CAL 101. Aufbauend auf der postulierten Bedeutung von p110α, wurde der dafür spezifische Inhibitor BYL 719 mit bereits klinisch etablierten Therapeutika in Kombination verwendet, woraus eine im Vergleich zur Einzelbehandlung verstärkte Apoptose resultierte. Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass PI3K/p110α eine therapeutisch nutzbare Zielstruktur zur Behandlung des Multiplen Myeloms darstellt. Daher scheinen weitergehende prä-klinische Studien mit p110α Inhibitoren erfolgversprechend. N2 - Multiple myeloma (MM) is an incurable disease, which results from clonal proliferation of malignant plasma cells in the bone marrow. Thereby, a complex signaling network regulates the survival and growth of MM cells. This malignant hematological disease is characterized by profound genetic and phenotypical heterogeneity. The PI3K/Akt signaling pathway is constitutively activated in about 50% of patients with MM and therefore plays an important role for the survival of MM cells. Accordingly, treatment of MM patients with the most isoform-specific drugs may be a desirable goal to achieve therapeutic utility with a minimum of undesired side effects. Therefore, an isoform-specific analysis of the catalytic subunits of the PI3K class I (p110α, p110β, p110γ, p110δ) was undertaken to reveal their individual role(s) for MM cell survival. Initially, isoform-specific knockdown experiments in MM cell lines were performed to assess their survival and the activation states of down-stream components of the PI3K pathway. These experiments were then complemented using isoform-specific pharmacological inhibitors (BYL 719 for p110α, TGX 221 for p110β, CAY10505 for p110γ and CAL 101 for p110δ) in MM cells and primary MM cells. Cell lines with constitutively phosphorylated Akt reduced this signal after p110α knockdown or pharmacologic inhibition and these treatments also affected their survival. Conversely, neither knockdown nor drug-mediated inhibition of any of the other three p110 isoforms influenced MM cell survival. In addition, whereas most primary MM samples were sensitive against BYL-719 only a few samples displayed apoptotic effects when treated with TGX 221, CAY10505 or CAL-101. These results showed that p110α is the major contributor of PI3K-mediated cell survival, and therefore the inhibitor BYL 719 was tested in combination with clinically relevant therapeutics for MM. Such treatment led to increased rates of apoptosis in MM cell lines in comparison to the respective single drug treatments. Taken together, we assume that PI3K/p110α is a therapeutically valuable target structure for the treatment of MM that would warrant more extensive pre-clinical studies. KW - Phosphatidylinositolkinase KW - Isomer KW - Signaltransduktion KW - Plasmozytom KW - p110alpha KW - BYL-719 KW - Carfilzomib KW - Melphalan KW - Lenalidomid KW - Pomalidomid KW - Bortezomib KW - synergistische Effekte KW - Phospho-Akt KW - Zellüberleben KW - pi3kinase KW - Multiples Myelom KW - Knochenmark KW - Isoform Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108466 ER - TY - THES A1 - Krüger, Alice T1 - Die Entwicklung regenerativer Implantatmatrices auf der Basis von Kollagen Typ I zur Anwendung bei degenerativen Bandscheibenerkrankungen T1 - The development of regenerative implantatmatrices based on Collagen type 1 for retreatment of degenerative disc deseases N2 - Degenerative Bandscheibenerkrankungen wie Protrusionen oder vorgefallenes Nukle-usgewebe führen häufig zu chronischen Schmerzen und schränken die Bewegungsmo-bilität sehr ein. Operative Behandlungsmöglichkeiten wie die Nukleotomie oder die Fusion von Wirbelkörpern stellen traumatische Eingriffe in das komplexe System der Wirbelsäule dar. Biologische Verfahren, durch die eine Regeneration des geschädigten Gewebes erzielt werden kann, sind klinisch bisher nicht etabliert. Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung, Herstellung und Testung regenerativer azellulä-rer Implantatmatrices auf der Basis von Kollagen Typ I, die den degenerierten Nukleus pulposus ersetzen sollen. Insbesondere eine Höhenminderung der Bandscheibe kann zu Anschlussdegenerationen benachbarter Segmente führen. Dies soll durch die Implan-tatmatrix ausgeglichen werden. Nach der Konstruktion und dem Bau eines Reaktors aus dem Hochleistungskunststoff Polytetrafluorethylen (PTFE), der allen Anforderungen eines CE-Konformitätsbewertungsverfahrens entspricht, wird eine hoch verdichtete Kollagen Typ I Matrix mit einer Stärke von 1 mm hergestellt. Diese kann über den Pro-zess der Lyophilisation auf 0,6 mm weiter reduziert werden. Es gelingt, die Matrix in einer Edelstahlhülse zu platzieren, über die mit Hilfe eines passgenauen Führungssta-bes die endoskopische Implantation in die Nukleuskavität erfolgen soll. Im Rahmen der Interkorporellen Fusionstage des Diakonie Klinikums Stuttgart wird das operative Handling an einem humanem Präparat simuliert. Die Implantation erfolgt offen über einen transforaminalen Zugang in zwei nukleotomierte Segmente der lumbalen Wir-belsäule. Die anwesenden Wirbelsäulenchirurgen beurteilen die Möglichkeit der endo-skopischen Applikation als positiv und machbar. Durch den Zusatz des Polysaccharids Hyaluronsäure gelingt es, die Quelleigenschaften der hoch verdichteten Matrix zu steigern, so dass diese wie natives Nukleusgewebe in der Lage ist, Flüssigkeit in Ruhe wieder aufzunehmen. Das Quellpotential und die da-mit einhergehende Volumenzunahme nach Kompression sind für ein Nukleusersatzma-terial essentiell. Die hier verwendete Hyaluronsäure geht jedoch im offenen System der in vitro Inkubation innerhalb von 11 Tagen verloren. Dennoch zeigen sich weitere Vorteile gegenüber der Matrix ohne Hyaluronsäure-Zusatz innerhalb der Testungen heraus. Diese sind neben dem erhöhten Quellpotential z. B. eine gesteigerte Rate der Zellproliferation der verwendeten bovinen und humanen Bandscheibenzellen (bBSZ und hBSZ) sowie humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSC), die über die Be-stimmung der Zellzahl und Viabilität ermittelt wird. Zudem zeigt sich eine gesteigerte mechanische Stabilität, die über die Spannungs-Kompressions-Messungen evaluiert wird. Über Lebend-/ Totfärbungen und Zytotoxizitätstests an Monolayerkulturen kann zudem nachgewiesen werden, dass die notwendige Endsterilisation durch γ-Bestrahlung zu keinen zytotoxischen Veränderungen der Matrix führt. Da die verdich-tete Implantatmatrix azellulär als Medizinprodukt der Klasse III eingesetzt werden soll, wird als ergänzende Matrix zur Füllung kleinster Hohlräume die zunächst flüssige ChondroFillerliquid Matrix (ein Knorpelersatzmaterial der Firma Amedrix GmbH, Esslin-gen) durch den Zusatz von Hyaluronsäure modifiziert und in der Zellkultur getestet. Da es sich hierbei um ein Zweikammerspritzensystem handelt, ist die Verwendung von Additiva wie z. B. Stammzellen technisch möglich. Die Ermittlung der maximalen Inku-bationszeit von Zellen in verschieden konzentrierten hyperosmotischen Neutralisations-lösungen ergibt eine Dauer von 5 min, bis irreversible Zellschäden auftreten. In Migra-tionsversuchen kann gezeigt werden, dass die ChondroFillerliquid Matrix als Konektiv zwischen nativem Nukleusgewebe und verdichteter Implantatmatrix fungiert. Des Wei-teren synthetisieren bBSZ, hBSZ und hMSC sulfatierte Glykosaminoglykane und behal-ten dabei ihr charakteristisches Genexpressionsprofil. Die chondrogene Differenzie-rung durch die Verwendung eines chondrogenen Differenzierungsmediums gelingt bei den hMSC bereits nach einer Kultivierungsdauer von 14 d. Die Zellverteilung in den Implantatmatrices und deren Morphologie entspricht dem nativen Nukleusgewebe. Die biomechanische Testung an einem international anerkannten Modellsystem für humane Wirbelsäulen – der Kalbswirbelsäule – ergibt, dass die Nukleotomie zu einer Erhöhung des Range of Motion (RoM) in alle Richtungen nach Flexion/Extension, Seit-neigung rechts/links und axiale Rotation rechts/links sowie zu einer Höhenreduktion des Segments im Vergleich zum Intaktzustand führt. Nach der Implantation der ver-dichteten Implantatmatrix wird der RoM deutlich reduziert. Das Segment weist dadurch eine hohe Steifigkeit ähnlich dem Intaktzustand auf. Die Höhenreduktion kann durch die Implantation beinahe vollständig wieder ausgeglichen werden. Im Rahmen der zyklischen Dauerbelastungen treten jedoch Implantatextrusionen auf. Zudem nimmt die Steifigkeit deutlich ab, der RoM hingegen wieder zu. Da das bovine Modell jedoch nicht der in vivo Situation entspricht und beispielsweise eine zunehmende In-tegration des Implantats durch Einwachsen nicht ermöglicht, ist die hohe Extrusionsra-te als nicht realistisch zu werten. Klinische Studien am Tier und Mensch müssen zeigen, inwieweit derartige Extrusionen ohne die Verwendung eines Anulusverschlußsystems auftreten. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist es gelungen, einen geeigneten Reaktor zu ent-wickeln und mit diesem eine biokompatible, stabile und quellfähige Matrix herzustel-len, die den Höhenverlust nach einer Nukleotomie auszugleichen vermag. Die modifi-zierte ChondroFillerliquid Matrix stellt eine ideale Ergänzung dar, da über diese Zellen oder andere Additiva verabreicht werden können und deren konektive Wirkung die Zellbesiedlung der azellulären Matrix begünstigt. N2 - Degenerative disc deseases like the protrusion or slipped disc tissue of the nucleus fre-quently cause chronic pain and restrict the freedom of movement. Surgical therapies like the nucleotomy or spinal fusion are traumatic procedures for the complex system of the spine. Biologic therapies which can lead to a regeneration of the damaged tis-sue were not clinically established until now. The aim of this work is the development, fabrication and testing of regenerative acel-lular implant matrices based on collagen type I, which should replace the degenerated nucleus pulposus. Especially a reduction of the disc height can cause degenerations of the adjacent segments. This should be balanced by the implant matrix. After the reac-tor construction and its fabrication made of a high-performance plastic polytetrafluo-rethylene (PTFE), which corresponds to the requirements of a CE-conformity assess-ment procedure, a highly condensed collagen type I matrix with a thickness of 1 mm is fabricated. Through lyophilisation this thickness can be reduced to 0.6 mm. It succeeds to place the matrix inside a stainless steel sleeve which should permit the endoscopic implantation into the nucleus cavity with the help of custom-fit leading-bar. During the intercorporelle spinal fusion days of the Diakonie Klinikum Stuttgart the surgical han-dling is simulated on a human speciment. The implantation occurs in an open trans-foraminal access into two nucleotomised segments of the lumbar spine. The participat-ing spinal surgeons evaluate the possibility of the endoscopic application as positive and feasible. The addition of polysaccharide hyaluronic acid leads to an increasement of the swell-ing capacities of the highly condensed matrix. At rest, the matrix was subsequently able to absorb fluids the same way as native nucleus tissue. The increased swelling potential and the accompanied increase of volume after compression are essential for a nucleus replacement material. However within 11 days the used hyaluronic acid gets lost in the open system of the in vitro incubation. Nevertheless there are further ad-vantages of this matrix shown in the scope of testing compared to the matrix without the addition of hyaluronic acid. Besides the swelling potential these advantages are e.g. an increased rate of cell proliferation of the used bovine and human disc cells (bBSZ and hBSZ) and human mesenchymal stem cells (hMSC), identified by the num-ber and viability of these cells as well as an increased mechanical stability of the ma-trix, which is shown by tension-compression-measurements. Live/dead staining and cytotoxicity tests on monolayer cultures showed that the required final sterilization through γ-irradiation does not lead to cytotoxic changes of the matrix. Because the condensed matrix should be used as an acellular medical device of classification III the preliminary liquid ChondroFillerliquid matrix (a cartilage replacement material of the company Amedrix GmbH, Esslingen), which is able to fill smallest cavities, is modified by the addition of hyaluronic acid and tested in cell culture experiments. As this matrix comes in a two chamber syringe system the substitution of additives e.g. stem cells is technically feasible. The determination of the maximum cell incubation time in differ-ent concentrated hyperosmotic neutralization solutions showed a maximum incubation time of five min before irreversible cell damages occur. Migration experiments can show that the ChondroFillerliquid matrix acts as a connection between the native nucleus tissue and the condensed implant matrix. Furthermore bBSZ, hBSZ and hMSC synthe-size sulfated glycosaminoglycanes and maintain their characteristic gene expression profile. Also a chondrogenic differentiation of the hMSC takes place followed by the use of a chondrogenic differentiation medium after a cultivation period of 14 d. The cell distribution and their morphology were similar to native nucleus tissue. The bio-mechanical testing which was done in an international accepted model system of the human spine – the calf spine – showed that the nucleotomy leads to an increased range of motion (RoM) of the segment in all directions to flexion/extension, lateral bending right/left and axial rotation left/right as well as a reduction of the height of the segment compared to the intact condition. Subsequently to the implantation of the condensed implant matrix the RoM is clearly reduced. The segment exhibits a high stiffness similar to the intact condition. The height reduction can be corrected almost completely by the implant matrix. During the cyclic compression however implant ex-trusions appear. Moreover the stiffness of the segment decreases clearly while the RoM increases. As the bovine model might not be applicable completely to the in vivo situation e.g it does not facilitate an increasing integration through the ingrowth of the implant, the high extrusion rate is assessed as unrealistic. Clinical studies on animals and humans have to show in which extent extrusions appear without the use of an anu-lar closure device system. Within the scope of this work it succeeds to develop an eligible reactor with which the fabrication of a biocompatible, dimensionally stable and swellable matrix which in turn is able to restore the disc height after a nucleotomy. The modified ChondroFillerliquid matrix represents an ideal supplement to the condensed matrix as it offers the possi-bility to apply cells and other additives and furthermore favours the cell seeding of the acellular condensed matrix by its connective effect. KW - Bandscheibenkrankheit KW - Bandscheibenerkrankung KW - Implantat KW - disc deseases KW - Kollagen KW - Implantatmatrices Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-106504 ER - TY - THES A1 - Proft, Florian Lukas Patrick T1 - Molekulare Wirkmechanismen des Antidepressivums Venlafaxin - genetische Untersuchungen in Maus und Mensch T1 - Molecular mechanisms of effectivness of the antidepressant venlafaxine - genetic investigations in mice and men N2 - Depressive Erkrankungen verursachen sowohl das persönliche Leid der erkrankten Individuen als auch volkswirtschaftlichen Schaden durch krankheitsbedingten Arbeitsausfall und Belastung der Gesundheitsversorgungssysteme. Therapeutische Konzepte wie die Anwendung pharmakotherapeutischer Intervention sind in unterschiedlichem Maß von Erfolg gekrönt. Zahlreiche somatische Faktoren wurden mit der Ätiologie depressiver Störungen in Verbindung gebracht. Die primär verfolgten pharmakologischen Ansätze basieren nach wie vor auf Erkenntnissen aus der Mitte des vergangenen Jahrhunderts. In erster Linie setzt die Pharmakotherapie Substanzen ein, die die Wiederaufnahme monoaminerger Neurotransmitter (Serotonin, Noradrenalin, zum Teil auch Dopamin) aus dem synaptischen Spalt inhibieren und nach einer allerdings meist mehrwöchigen, regelmäßigen Einnahme des Präparates zu einem Rückgang der depressiven Symptomatik führen. Andererseits kann jedoch bei zahlreichen Erkrankten auch nach fortgesetzter Therapie mit verschiedenen Behandlungsansätzen keine Remission verzeichnet werden und es stellt sich die Frage nach der Ursache dieser Diskrepanz. Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand der als Antidepressivum eingesetzte selektive Serotonin- / Noradrenalin-Wiederaufnahme-Inhibitor Venlafaxin. Durch Blockade des präsynaptischen Serotonin- und Noradrenalin-Transporters führt Venlafaxin initial zu einer intensivierten Neurotransmission. Die Zielstrukturen von Venlafaxin sind der präsynaptische Serotonin- und der Noradrenalin-Transporter, wobei aufgrund unterschiedlicher Affinität eine geringe Dosis beziehungsweise Konzentration als rein serotonerg betrachtet wird und bei einer hohen Dosis beziehungsweise Konzentration sowohl die Wiederaufnahme von Serotonin als auch Noradrenalin inhibiert wird. Es wurden in dieser Arbeit zwei Ziele verfolgt. Im ersten Teil wurde mittels Gen-expressionsuntersuchungen nach potentiellen Effektoren von Venlafaxin gesucht, um prinzipielle Mechanismen der antidepressiven Wirkung zu identifizieren und auf ihrer Basis die Entwicklung spezifischerer Intervention zu ermöglichen. Der zweite Teil beinhaltet eine pharmakogenetische Untersuchung am Menschen. Ziel war zu evaluieren, inwieweit die Expressionsaktivität von SLC6A2 und SLC6A4 und damit die präsynaptische Transportkapazität in Kombination mit der Serumkonzentration aktiver Substanz als Prädiktor des therapeutischen Effektes dienen kann. Die Kenntnis dieser Zusammenhänge würde bei Vorliegen eines bestimmten Genotyps eine gezieltere Titration der individuell benötigten Konzentration ermöglichen und könnte die Effektivität der Therapie steigern. Für die Genexpressionsuntersuchungen erhielten DBA/2-Mäuse über einen Zeitraum von 30 Tagen Venlafaxin in verschiedenen Dosierungen über das Trinkwasser. Anschließend wurden die Hippokampi der Tiere mittels genomweiter Microarray-Analyse hypothesenfrei auf zwischen den Dosisgruppen differentiell exprimierte Gene hin untersucht. Der Hippokampus wird als zentrales Element der Steuerung, Ausbildung und Veränderung von Verhaltensmustern gesehen. Signifikant differentiell exprimierte Gene, die in vorherigen Studien mit depressiver Erkrankung beziehungsweise einem Effekt psychiatrischer Medikation assoziiert worden waren, wurden mittels qRT-PCR-Analyse validiert. Im Anschluss an die Analyse im Tier wurden als differentiell exprimiert bestätigte Gene per qRT-PCR analog in humanen Leukozyten untersucht. Die Blutproben waren in einem klinisch-naturalistischen Design während der ersten und der fünften Woche einer Venlafaxin-Pharmakotherapie von Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg gewonnen worden, das heißt vor und nach potentiellem Eintreten der antidepressiven Wirkung. Trotz der unterschiedlichen Herkunft der analysierten Gewebe könnten auf diesem Weg Hinweise auf Vorgänge im menschlichen Gehirn gefunden werden, wie in vergleichenden post mortem Untersuchungen zwischen peripherem und zentralem humanem Material erkannt worden war. Die in der Tierstudie identifizierten Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren sowie Proteine die als Teil von second messenger-Kaskaden bekannt sind. Von statistischer Signifikanz erwies sich in der Analyse der humanen Leukozyten die Expressionsreduktion der mRNA der Transkriptionsfaktor-Untereinheit Fos. Befunde zu einer Funktion von Fos, die eine Interpretation im Bezug auf den antidepressiven Effekt von Venlafaxin ermöglichen, liegen lediglich aus Tierstudien vor. Fos-ko im Hippo-kampus von Mäusen wurde mit reduziertem Angstverhalten und höherer Exzitabilität von hippokampalen Neuronen assoziiert. Auch wurde eine Assoziation mit Vorgängen bei synaptischer Plastizität und damit potentiell bei Lernvorgängen gefunden. Auf der anderen Seite wurde depressions-ähnliches Verhalten bei Ratten mit niedriger hippokampaler Fos-Expression und dessen erfolgreiche pharmakologische "Therapie" mit einer Induktion der Fos-Expression assoziiert. Es scheinen also bereits zwischen nicht-menschlichen Spezies ausgeprägte Unterschiede der Rolle von Fos beziehungsweise Fos zu bestehen. Aufgrund der unterschiedlichen Spezies und Gewebe in den hier durchgeführten Untersuchungen sowie den uneinheitlichen Befunden bezüglich der Rolle von Fos beziehungsweise Fos in vorangegangenen Studien kann abschließend lediglich konstatiert werden, dass Fos vermutlich an der Entstehung depressionsbegünstigender Physiologie beteiligt ist und auch, dass eine antidepressive Pharmakotherapie mit Venlafaxin ihre Wirkung vermutlich unter Beteiligung von Fos entfaltet. Die Entwicklung innovativer Antidepressiva die unter Umgehung der monoaminergen Transmissionssysteme durch gezielte Reduktion der Fos-Abundanz das therapeutische Ziel erreichen lassen, könnte auf Basis der vorliegenden Studie angedacht werden, scheint allerdings aufgrund der ubiquitären Mediatorentätigkeit des Proteins und insbesondere aufgrund seiner nicht endgültig definierten Rolle bei der Entstehung von Krebs nicht praktikabel. Zukünftige Untersuchungen sollten daher auf andere im Microarray differentiell exprimiert gefundene Gene fokussieren. In die Untersuchung der Expressionsaktivität der für die primären Zielstrukturen von Venlafaxin (Serotonin- beziehungsweise Noradrenalin-Transporter) kodierenden Gene (SLC6A4 beziehungsweise SLC6A2) und der Serumkonzentration an aktiver Substanz nach Venlafaxin-Applikation im Hinblick auf deren Prädiktivität des therapeutischen Effektes, wurden in einem klinisch-naturalistischen Design Patienten der Klinik für Psychiatrie, Psychosomatik und Psychotherapie des Universitätsklinikums Würzburg eingeschlossen. Genotypisiert wurden für SLC6A2 der SNP rs28386840 und für SLC6A4 der Polymorphismus 5-HTTLPR. Die Genotypen wurden jeweils in niedrig- und hoch-exprimierend unterteilt und damit auf die phänotypische Transportkapazität der präsynaptischen Membran Bezug genommen. Der therapeutische Erfolg wurde anhand der CGI-I-Skala evaluiert und für die Analysen in "gutes Ansprechen" und "schlechtes Ansprechen" dichotomisiert. Der SLC6A2-Polymorphismus zeigte sich als nicht mit dem therapeutischen Effekt assoziiert. Der hochexprimierende SLC6A4-Genotyp wurde signifikant mit einem schlechteren Ansprechen assoziiert. Dies war in den nach Serumkonzentration aktiver Substanz stratifizierten Unterkollektiven insbesondere in dem Bereich zwischen 200 und 400 ng / ml zu erkennen, wohingegen unter- und oberhalb dieses Bereiches keine Assoziation zu finden war. Aus diesen Resultaten kann gefolgert werden, dass sich aus der Genotypisierung von rs28386840 keine therapeutischen Instruktionen ableiten lassen. Bei Kenntnis des 5-HTTLPR-Genotyps könnte für den klinischen Alltag die Empfehlung ergehen, falls Venlafaxin als sSNRI bei Patienten mit hochexprimierendem Genotyp eingesetzt werden soll, eine Serumsummenkonzentration jenseits des durch die AGNP empfohlenen Bereiches (100 - 400 ng / ml) anzustreben. Da hier jedoch lediglich eine Stichprobe von 56 Patienten untersucht und insbesondere, da zahlreiche potentielle Kofaktoren des therapeutischen Effektes nicht in die Analyse einbezogen werden konnten, ist die Assoziation vor Anwendung in der Therapiesteuerung anhand umfassenderer prospektiver kontrollierter Studien zu validieren. N2 - Depressive disorders not only lead to the suffering of the affected individuals but also to economic losses by incapacitating them to fulfill social demands and by utilization of health care systems. Therapeutic intervention via pharmacotherapy is successful in variabel degrees. Etiological research revealed a diversity of somatic factors to be associated with the illness. Primary pharmacological treatment is using substances that inhibit the reuptake of monoaminergic neurotransmitters (serotonin, norepinephrine, in part also dopamine) into the presynaptic terminals. Continued application, sometimes for weeks, leads to a reduction of depressive symptoms (lag of onset). On the other hand for a number of patients various pharmacotherapeutic drugs do not result in symptomatic relief or remission. A reason for these discrepancies to date has not been determined but it is to assume, that pharmacokinetic and pharmacodynamic variations between patients bear the responsibility. In the thesis at hand venlafaxine, an inhibitor of serotonin- respectively serotonin- and norepinephrine-reuptake, was used. Venlafaxine's pharmacodynamic activity is dependent on its concentration in the target compartment as the affinity for the serotonin-transporter is 30 times that for the norepinephrine-transporter. Two goals were targeted here. Comparative gene expression analysis was performed to identify potential effectors of antidepressive effectiveness. On this basis a more specific pharmacological intervention than increasing monoaminergic transmission might be facilitated. The second part of the thesis was dedicated to pharmacogenetic research. In it the predictiveness of the expression activity of the genes coding for venlafaxine's primary targets (SLC6A2, norepinephrine-transporter; SLC6A4, serotonin-transporter) in combination with serum concentrations of active moiety (venlafaxine and its equally active metabolite o desmethylvenlafaxine) towards the therapeutic effect was investigated. Knowledge on such an association might improve efficacy of future pharmacological intervention with venlafaxine, as serum concentrations necessary for patients' desired improvement in the light of a respective genotype could be individually targeted. For gene expression analysis, first, mice (DBA/2 strain) were given venlafaxine in different dosages via the oral route for one month and their hippocampi were analyzed by hypothesis-free genome wide microarray analysis for genes differentially expressed between treatment groups. For candidate genes identified that way, differential expression was validated via qRT-PCR. In the second step validated genes were investigated via qRT-PCR for differential expression in leucocytes of patients who had received antidepressive venlafaxine treatment for one month. Expression was compared between leucocytes after one week and during the fifth week of treatment, that is, before and after potential onset of antidepressive effect. Post mortem comparison between human central and peripheral tissue had to a certain degree shown congruence of expression patterns and thus leucocyte analysis can give hints towards events in the central nervous system. Candidate genes identified in the animal study code for transcription factors respectively proteins mediating in second messenger cascades. In human leucocytes statistical significance was reached for the reduced mRNA abundance of Fos after one month of treatment. Fos is a transcription factor subunit that after heterodimerization with Jun influences expression of effector genes. Association of Fos with depressive disorder and its role in an antidepressive effect had been shown in animal studies. Hippocampal knock-out (ko) of Fos in mice had been associated with reduced fear behaviour and higher excitability of the neurons in this region. Also an association with synaptic plasticity and thus with learning behaviour had been shown. On the other hand, in rats depression-like behaviour had been associated with low hippocampal Fos expression and following successful pharmacological "therapy" expression had been found to be induced. Thus already between non-human species pronounced differences in the role of Fos respectively Fos can be seen. Regarding the different species and tissues investigated as well as the heterogeneous reports on the role of Fos, it can thus only be concluded that the gene respectively its protein product is part of the development and the venlafaxine-induced relief of depressive symptoms. New antidepressant drugs based on an interaction with Fos, e.g. by decreasing its abundance, might in theory be considered. However, due to its far-reaching activity in a number of various processes throughout the organism and especially its role as a proto-oncogene, systemic inhibition of Fos does not seem a proper basis for innovative therapeutic intervention. Future studies should therefore focus on other differentially expressed genes found in the microarray analysis. For evaluating the predictive power of the expression activity of the genes SLC6A2 respectively SLC6A4 which code for venlafaxine's primary targets (serotonin- respectively norepinephrine-transporter) and the serum concentration of active moiety with regard to the achieved antidepressive effect in a naturalistic clinical design patients from the Department of Psychiatry, Psychosomatics and Psychotherapy (University Hospital of Würzburg) were analyzed. SLC6A2 was genotyped for rs28386840 and SLC6A4 for 5-HTTLPR. To investigate phenotypical conditions, patients were dichotomized into carriers of "low-expressing" and "high-expressing" genotypes. Results of the pharmacological intervention were evaluated using the CGI-I-scale and symptom changes after one month of venlafaxine application were dichotomized into "good response" and "bad response". rs28386840 was found not to be associated with therapeutic outcome. The high-expressing genotype of SLC6A4 was found to be significantly associated with insufficient response. After stratifying the collective for serum concentrations this especially held true in the subcollective with high concentration (200 - 400 ng / ml). Below and above this range 5-HTTLPR was not significantly associated with the response. It can be concluded that genotyping rs28386840 will not be useful for instruction of therapeutic intervention with venlafaxine. However, information on patients' 5-HTTLPR might instruct psychiatrists, if venlafaxine is considered for treatment, to use serum concentrations which exceed the range recommended by the AGNP (> 400 ng / ml) in patients with the high-expressing genotype of SLC6A4. The study at hand analyzed only 56 patients and inclusion of a variety of cofactors as well as regression analysis incorporating both polymorphisms to evaluate their potential and probable synergistic effect was not possible. Thus, before application of the present findings into clinical practice, validation and confirmation of the potentially causal relationship in larger samples using a prospective controlled design is necessary. KW - Wirkmechanismus KW - Venlafaxin KW - Pharmakogenetik KW - Genexpression KW - Maus KW - Mensch Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109201 ER - TY - THES A1 - Kampka, Justyna T1 - Funktionelle Analyse der Histon-Demethylase UTX in hämatopoetisch differenzierenden murinen ES-Zellen T1 - Functional analysis of the histone demethylase UTX during hematopoietic murine ESC differentiation N2 - Murine embryonale Stammzellen (ES-Zellen) stellen mit ihrem Selbsterneuerungs- und Differenzierungspotenzial einen einzigartigen Zelltyp für die Grundlagenforschung und angewandte Wissenschaften dar. Auf Grund ihrer Fähigkeit, in vitro die embryonale Entwicklung eines Organismus nachzuahmen, sind sie für die Untersuchung der Zell-Differenzierung, wie z.B. der embryonalen Hämatopoese geeignet. Während der ES-Zell-Selbsterneuerung und -Differenzierung spielen epigenetischen Modifikationen, unter anderem Histon-Methylierungen, eine wichtige Rolle. Transkriptionell aktivierende (H3K4me2/3, di- bzw. trimethyliertes Lysin 4 an Histon 3) und reprimierende (H3K27me2/3; di- bzw. trimethyliertes Lysin 27 an Histon 3) Histon-Methylierungs-Muster und die epigenetische Gen-Regulierung werden unter anderem durch die entgegenwirkenden PcG- und MLL-Protein-Komplexe koordiniert. Die H3K27me2/3-spezifische Demethylase UTX/KDM6A ist eine Komponente des MLL-Komplexes und somit an aktivierenden Gen-Regulationsmechanismen beteiligt. Im Rahmen dieser Arbeit war es mein Ziel zu untersuchen, inwieweit UTX für die Aufrechterhaltung der ES-Zell-Pluripotenz und für die ES-Zell-Differenzierung, insbesondere die hämatopoetische Differenzierung, von Bedeutung ist. Meine Daten zeigten, dass UTX in undifferenzierten ES-Zellen, während der ES-Zell-Differenzierung und in adulten Geweben ubiquitär exprimiert ist. Um Aufschluss über die UTX-Funktion zu bekommen, wurde UTX in ES-Zellen mittels RNA-Interferenz und Gene-Targeting gezielt ablatiert. Genexpressions-Analysen zeigten, dass die Expression von Pluripotenzgenen, genauso wie die Zellproliferation und die Verteilung der Zellzyklus-Phasen in ES-Zellen durch den Verlust von UTX unbeeinflusst blieben, während globale H3K4me3- sowie H3K27me3-Level reduziert waren. Während der ES-Zell-Differenzierung konnte ich eine verminderte Induktion der mesodermalen und hämatopoetischen Marker Flk1, Brachyury, Runx1 und Gata1 beobachten. Zudem war die Expression von UTY, dem auf dem Y-Chromosom kodierten UTX-Homolog, in ES-Zellen und während der Differenzierung runterreguliert, was auf eine Regulierung durch UTX schließen lässt. Des Weiteren zeigten UTX-Knockdown und –Knockout-Zellen in funktionellen hämatopoetischen in vitro Assays eine verminderte Fähigkeit, Blast-Kolonien und hämatopoetische Vorläuferzellen zu generieren. Interessanterweise zeigten ChIP-Analysen in differenzierenden wt und UTX-Knockout-EBs unveränderte H3K27me3-Level an Promotoren der hämatopoetischen Gene, was auf eine Demethylase-unabhängige Funktion von UTX während der frühen Hämatopoese hindeutet. Um die Funktion von UTX während der Entwicklung in vivo, insbesondere während der embryonalen Hämatopoese, untersuchen zu können, habe ich eine konditionelle UTX-Knockout-Maus hergestellt, die für eine gezielte UTX-Deletion im hämatopoetischen System verwendet wird. Zusammenfassend zeigen meine Daten, dass UTX für die ES-Zell-Proliferation und –Pluripotenz unbedeutend ist und die Reduzierung der H3K27-Trimethylierung auch bei fehlendem UTX weiterhin herbeigeführt werden kann. Im Gegensatz dazu übernimmt UTX eine entscheidende Rolle während der mesodermalen und hämatopoetischen ES-Zell-Differenzierung, vermutlich über eine Histon-Demethylase-unabhängige Funktion. N2 - Mouse embryonic stem cells (ESCs) through their potential to self-renew and to differentiate provide a unique cell type for basic and applied research. Due to their ability to mimic the embryonic development of an organism in vitro, they are suitable for the study of cellular differentiation such as embryonic hematopoiesis. ESC self-renewal and differentiation are associated with epigenetic modifications, including histone methylation. The opposing PcG and MLL protein complexes coordinate transcriptionally repressing (H3K27me2/3, di- and trimethylated histone 3 at lysine 27) and activating (H3K4me2/3; di- and trimethylated histone 3 at lysine 4) histone methylation patterns respectively, and epigenetic gene regulation. The H3K27me2/3-specific demethylase UTX/KDM6A is a component of the MLL complex and thus involved in transcriptional activation of gene expression. Within the scope of my thesis, I aimed to analyze to what extent UTX contributes to the maintenance of ESC pluripotency and differentiation, in particular to the hematopoietic differentiation. My data showed that UTX is ubiquitously expressed in undifferentiated ESCs, during ESC differentiation and in adult tissue. In order to study the UTX specific function, I specifically down-regulated UTX in ESCs via RNA interference and gene targeting. Gene expression profiling of ESCs showed that the expression of pluripotency genes, as well as cell proliferation and cell cycle phase distribution remained unaffected by the loss of UTX. However, global H3K4me3 and H3K27me3 levels were reduced. I observed a decreased induction of the mesodermal and hematopoietic genes Flk1, Brachyury, Runx1 and Gata1 in differentiating ESCs. Furthermore, the expression of UTY, the homologue of UTX encoded on the Y chromosome, was down- regulated in ESCs and in EBs, suggesting a regulatory function of UTX. In addition, using functional hematopoietic in vitro assays, UTX knockdown and knockout cells showed reduced blast colony formation and decreased differentiation of hematopoietic progenitor cells. Interestingly, ChIP analysis of wt and UTX KO EBs revealed comparable enrichment of H3K27me3 at the promoters of the hematopoietic genes, suggesting a demethylase independent role for UTX during early hematopoiesis. In order to investigate the role of UTX during development in vivo, particularly during embryonic hematopoiesis, I generated a conditional UTX knockout mouse, which will be used for a specific deletion of UTX in the hematopoietic system. In conclusion, my data revealed that UTX is insignificant for ESC proliferation and pluripotency and that the loss of H3K27 trimethylation is induced even in the absence of UTX. Furthermore, the data reported in this work suggest that UTX is required for mesodermal and hematopoietic ESC differentiation, presumably via a histone demethylase independent function. KW - Hämatopoese KW - Epigenetik KW - Embryonale Stammzellen KW - Histon-Demethylase UTX Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-108058 ER - TY - THES A1 - Klein, Teresa T1 - Lokalisationsmikroskopie für die Visualisierung zellulärer Strukturen T1 - Localization Microscopy for the visualization of cellular structures N2 - Die Einführung der Fluoreszenzmikroskopie ermöglicht es, Strukturen in Zellen spezifisch und mit hohem Kontrast zu markieren und zu untersuchen. Da die Lichtmikroskopie jedoch in ihrer Auflösung begrenzt ist, bleiben Strukturinformationen auf molekularer Ebene verborgen. Diese als Beugungsgrenze bekannte Limitierung, kann mit modernen Verfahren umgangen werden. Die Lokalisationsmikroskopie nutzt hierfür photoschaltbare Fluorophore, deren Fluoreszenz räumlich und zeitlich separiert wird, um so einzelne Fluorophore mit Nanometer-Genauigkeit lokalisieren zu können. Aus tausenden Einzelmolekül-Lokalisationen wird ein künstliches, hochaufgelöstes Bild rekonstruiert. Die hochauflösende Mikroskopie ist grade für die Lebendzell-Beobachtung ein wertvolles Werkzeug, um subzelluläre Strukturen und Proteindynamiken jenseits der Beugungsgrenze unter physiologischen Bedingungen untersuchen zu können. Als Marker können sowohl photoaktivierbare fluoreszierende Proteine als auch photoschaltbare organische Fluorophore eingesetzt werden. Während die Markierung mit fluoreszierenden Proteinen einfach zu verwirklichen ist, haben organische Farbstoffe hingegen den Vorteil, dass sie auf Grund der höheren Photonenausbeute eine präzisere Lokalisation erlauben. In lebenden Zellen wird die Markierung von Strukturen mit synthetischen Fluorophoren über sogenannte chemische Tags ermöglicht. Diese sind olypeptidsequenzen, die genetisch an das Zielprotein fusioniert werden und anschließend mit Farbstoff-gekoppelten Substraten gefärbt werden. An der Modellstruktur des Histonproteins H2B werden in dieser Arbeit Farbstoffe in Kombination mit chemischen Tags identifiziert, die erfolgreich für die Hochauflösung mit direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in lebenden Zellen eingesetzt werden können. Für besonders geeignet erweisen sich die Farbstoffe Tetramethylrhodamin, 505 und Atto 655, womit der gesamte spektrale Bereich vertreten ist. Allerdings können unspezifische Bindung und Farbstoffaggregation ein Problem bei der effizienten Markierung in lebenden Zellen darstellen. Es wird gezeigt, dass die Beschichtung der Glasoberfläche mit Glycin die unspezifische Adsorption der Fluorophore erfolgreich minimieren kann. Weiterhin wird der Einfluss des Anregungslichtes auf die lebende Zelle diskutiert. Es werden Wege beschrieben, um die Photoschädigung möglichst gering zu halten, beispielsweise durch die Wahl eines Farbstoffs im rotem Anregungsbereich. Die Möglichkeit lebende Zellen mit photoschaltbaren organischen Fluorophoren spezifisch markieren zu können, stellt einen großen Gewinn für die Lokalisationsmikroskopie dar, bei der ursprünglich farbstoffgekoppelte Antikörper zum Einsatz kamen. Diese Markierungsmethode wird in dieser Arbeit eingesetzt, um das Aggregationsverhalten von Alzheimer verursachenden � -Amyloid Peptiden im Rahmen einer Kooperation zu untersuchen. Es werden anhand von HeLa Zellen verschiedene beugungsbegrenzte Morphologien der Aggregate aufgeklärt. Dabei wird gezeigt, dass intrazellulär vorhandene Peptide größere Aggregate formen als die im extrazellulären Bereich. In einer zweiten Kollaboration wird mit Hilfe des photoaktivierbaren Proteins mEos2 und photoactivated localization microscopy (PALM) die strukturelle Organisation zweier Flotillinproteine in der Membran von Bakterien untersucht. Diese Proteine bilden zwei Cluster mit unterschiedlichen Durchmessern, die mit Nanometer-Genauigkeit bestimmt werden konnten. Es wurde außerdem festgestellt, dass beide Proteine in unterschiedlichen Anzahlen im Bakterium vorliegen. N2 - The implementation of fluorescence microscopy enables specific labeling and studying of cellular structures with high contrast. Since light microscopy is limited in its resolution, structural information at the molecular level remains hidden. This barrier, known as diffraction limit, can be circumvented by modern imaging techniques. For this purpose localization microscopy employs photoswitchable fluorophores. The fluorescence of these fluorophores is spatially and temporally separated in order to localize single fluorophores with nanometer precision. From thousands of single-molecule localizations an artificial highresolution image is reconstructed. Super-resolution microscopy is a valuable tool for live-cell observations in order to investigate sub-cellular structures and protein dynamics beyond the diffraction limit under physiological conditions. Both photoactivatable fluorescent proteins and photoswitchable organic fluorophores can be used as labels. Whereas labeling with fluorescent proteins is straightforward to implement, organic fluorophores, however, have the Advantage of a more precise localization due to a higher photon yield. In living cells, labeling of structures with synthetic fluorophores is facilitated by so-called chemical tags. Those are polypeptide sequences that are genetically fused to the target protein and subsequently labeled with dye coupled substrates. In this work, on the basis of the model structure H2B—a histone protein—dyes are identified in combination with chemical tags, that can be successfully used for super-resolution imaging with direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) in living cells. The dyes tetramethylrhodamine, 505 and Atto 655 proved to be particularly suitable, whereby the whole spectral range is represented. However, unspecific binding and dye aggregation can pose a problem for the efficient labeling of living cells. It is shown, that coating the glass surface with glycine successfully minimizes unspecific adsorption of fluorophores. Furthermore the impact of the excitation light on living cells is discussed. Methods are presented to keep photodamage at a minimum, e. g., by choosing a dye within the red excitation range. The feasibility to label living cells with photoswitchable organic fluorophores represents a big asset for localization microscopy, which originally employed dye labeled antibodies. This alternative labeling technique is used in a collaboration to study the aggregation behavior of � -Amyloid peptides, which cause Alzheimer’s disease. By means of HeLa cells, different diffraction limited morphologies of aggregates are revealed. It is thereby shown, that intracellular peptides generate larger aggregates than the ones in the extracellular region. In another collaboration the structural organization of two flotillin proteins in the membrane of bacteria is examined by means of the photoactivatable Protein mEos2 and photoactivated localization microscopy (PALM). These proteins form two clusters with different diameters, which could be determined with nanometer precision. It was also asserted that both proteins exist in unequal numbers within the bacterium. KW - Hochauflösendes Verfahren KW - Zellmarker KW - dSTORM KW - PALM KW - live-cell KW - Hochauflösung KW - Zellmarkierung Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99260 ER -